TWI777336B - 用於偵測***dna片段化的方法以及套組 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：令該***樣品包埋於一具有2 nm以上且小於60 nm之孔徑的凝膠，而得到一包埋有***的凝膠；以一裂解液來對該包埋有***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有尿素以及十二烷基硫酸鈉；令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中光暈形成的存在是***DNA片段化存在之表徵。本發明亦揭示一種用於進行該方法的套組。

Description

用於偵測***DNA片段化的方法以及套組
本發明是有關於用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法。本發明亦有關於用於進行該方法的套組。
***DNA (sperm DNA)的完整性是影響胚胎品質(embryo quality)、胚胎著床(embryo implantation)以及胚胎發育(embryo development)的主要因素之一。當***DNA因***形成(spermiogenesis)發生錯誤、***凋亡(sperm apoptosis)、氧化性壓力(oxidative stress)或輻射(radiation)等因素而斷裂成片段(包括單-與雙-股DNA斷裂)，亦即***DNA片段化(sperm DNA fragmentation, SDF)，會造成男性***症(male infertility)、體外人工授精(IVF)失敗[ in vitrofertilization (IVF) failure]以及流產(miscarriage)的發生。因此，***DNA片段化的偵測已在生育力的篩檢以及人工生殖治療(artificial reproduction treatments)中扮演重要的角色。
在過去，彗星試驗(comet assay, CA){又被稱為單細胞凝膠電泳(SCGE)分析[single cell gel electrophoresis (SCGE) assay]}被視為是用於評估***中DNA片段化的標準方法之一，它主要是令***包埋於瓊脂糖凝膠(agarose gel)中，並在高鹽度的條件下使用裂解液(lysis solution)來裂解***的核蛋白(nuclear proteins)[包括魚精蛋白(protamine)]，而使得原本完整的DNA與核基質(nuclear matrix)形成一類核(nucleoid)，亦即呈染色質分散的狀態。接著對該瓊脂糖凝膠進行電泳(electrophoresis)與DNA染色，而使得片段化的DNA由於往陽極的方向移動而形成彗星尾(comet tail)，並且使用軟體予以分析來計算出***DNA片段化的程度。然而，CA試驗因需要搭配電泳(通常需花費約20分鐘)以及分析軟體的使用才可判讀出***DNA片段化的程度，而存在有操作較為繁瑣與耗時的缺點，不敷產業上的實際應用。
為了改善上面所提之CA試驗的缺點，本領域的相關研究人員開發出***染色質擴散(SCD)試驗[Sperm Chromatin Dispersion (SCD) Test]。SCD試驗主要是在對***進行瓊脂糖凝膠的包埋之後，使用DNA變性溶液(DNA denaturing solution)來將***中的雙股DNA轉化成單股DNA，繼而再裂解***的核蛋白(包括魚精蛋白)，此時DNA會因魚精蛋白的裂解而鬆開形成DNA環(DNA loops)，DNA環的大小與DNA的完整程度呈正相關。接著，在進行DNA染色之後，這些DNA環會形成大小不一的光暈(halo)，其中當光暈寬度大於或等於***頭部直徑的1/3，代表無DNA片段化，而當無光暈或光暈寬度小於***頭部直徑的1/3，代表有DNA片段化。雖然SCD試驗省去了CA試驗所需的電泳步驟以及分析軟體的使用，但藉由觀察光暈大小的判別方式容易因檢測人員的不同而存在有判讀結果上的差異。
發明概要
為了發展出一種在操作上更加方便快速、容易判讀且兼具準確度的DNA片段化的偵測方法，以供臨床推廣應用，申請人開發了一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，並將該方法稱為***DNA片段釋放(SDFR)試驗[sperm DNA fragment release (SDFR) assay]。
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟： (a)   令該***樣品包埋於一具有2 nm以上且小於60 nm之孔徑的凝膠，藉此而得到一包埋有***的凝膠，其中該凝膠包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分：丙烯醯胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、N-異丙基丙烯醯胺、海藻酸鹽以及聚乙二醇； (b)   以一裂解液來對該包埋有***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉； (c)   令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及 (d)   觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中光暈形成的存在是***DNA片段化存在之表徵。
在第二個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟： (a)   令該***樣品包埋於一具有丙烯醯胺含量範圍落在3至24% (w/v，g/mL)內的聚丙烯醯胺凝膠，藉此而得到一包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠； (b)   以一裂解液來對該包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉； (c)   令該經裂解處理的聚丙烯醯胺凝膠進行一DNA染色；以及 (d)   觀察在該經染色的聚丙烯醯胺凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中光暈形成的存在是***DNA片段化存在之表徵。
在第三個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的套組，其包含有： 一膠體形成配方，其包含有具有一濃度範圍落在10至70% (w/v，g/mL)內的成分，該成分是選自於由下列所構成的群組：丙烯醯胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、N-異丙基丙烯醯胺、海藻酸鹽以及聚乙二醇； 一裂解液，其包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；以及 一DNA染色試劑。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了簡化習知用於偵測***DNA片段化(sperm DNA fragmentation)的方法並使其更易於判讀，申請人經戮力研究結果發現，在以具有丙烯醯胺濃度為4至22% (w/v，g/mL)的聚丙烯醯胺凝膠來對***樣品進行包埋之後，只需要進行核蛋白(nuclear proteins)的裂解處理(lysis treatment)以及DNA染色(DNA staining)，即能夠藉由觀察光暈形成的存在與否來簡易地且準確地判斷該***樣品是否具有DNA片段化。申請人據此而推論：在使用具有2 nm以上且小於60 nm之孔徑的凝膠來包埋***樣品並接而對核蛋白進行裂解處理的條件下，完整性較高的DNA片段1會因其環狀結構的體積大於凝膠的孔徑而不會從頭部3擴散出來並形成光暈，只有完整性較低的DNA片段2才會(參見圖1的示意圖)，故本發明的方法可直接藉由觀察是否有光暈形成於***的頭部3外圍來判別是否有***DNA片段化的存在。相對地，在使用具有60 nm以上之孔徑的凝膠來包埋***樣品並接而對核蛋白進行裂解處理的條件下，完整性較高與較低的DNA片段1與2皆會從頭部3擴散出來並形成光暈(參見圖2的示意圖)，而無法直接藉由觀察是否有光暈形成於***的頭部3外圍來判別是否有***DNA片段化的存在，還需要進一步分析光暈的大小。
於是，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟： (a)   令該***樣品包埋於一具有2 nm以上且小於60 nm之孔徑的凝膠，藉此而得到一包埋有***的凝膠，其中該凝膠包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分(component)：丙烯醯胺(acrylamide)、丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、N-異丙基丙烯醯胺(N-isopropylacrylamide, NIPAM)、海藻酸鹽(alginate)以及聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)； (b)   以一裂解液(lysis solution)來對該包埋有***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素(urea)以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)； (c)   令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及； (d)   觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成(halo formation)於各個***的頭部外圍，其中光暈形成的存在是***DNA片段化存在之表徵。
依據本發明，在步驟(a)中，該凝膠具有3 nm以上且小於60 nm的孔徑。較佳地，該凝膠具有一範圍落在2.5至25 nm內的孔徑。更佳地，該凝膠具有一範圍落在3至10 nm內的孔徑。
較佳地，該凝膠是聚丙烯醯胺凝膠。
本發明亦提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟： (a)   令該***樣品包埋於一具有丙烯醯胺含量範圍落在3至24% (w/v，g/mL)內的聚丙烯醯胺凝膠，藉此而得到一包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠； (b)   以一裂解液來對該包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉； (c)   令該經裂解處理的聚丙烯醯胺凝膠進行一DNA染色；以及 (d)   觀察在該經染色的聚丙烯醯胺凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中光暈形成的存在是***DNA片段化存在之表徵。
較佳地，在步驟(a)中，該聚丙烯醯胺凝膠具有一範圍落在4至22% (w/v，g/mL)內的丙烯醯胺含量。
依據本發明，在步驟(a)中，該聚丙烯醯胺凝膠具有一範圍落在3至10 nm內的孔徑。
依據本發明，該***樣品可以在任何時間下收集自一個體。較佳地，該***樣品是收集自一經歷至少2-3天但不超過10天的禁慾(abstinence)的個體。
依據本發明，該***樣品可以是新鮮的或者經冷凍保存[例如，以液態氮(-196℃)予以冷凍]的樣品。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的動物，諸如，靈長類動物：人類(humans)、猿(ape)以及猴(simia)；以及非靈長類的哺乳類動物：豬(pigs)、牛(cows)、綿羊(sheeps)、馬(horses)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)；魚類；以及兩棲類動物。在本發明的一個較佳具體例中，該個體為一人類。
依據本發明，該***樣品被拿來進行偵測之前可先以稀釋液(diluent)予以稀釋，而使得***濃度範圍落在4×10 6至2.8×10 7個細胞/mL內。適用於本發明的稀釋液包括，但不限於：Earle’s 培養液(Earle’s medium)、人類輸卵管液(HTF)培養液[Human Tubal Fluid (HTF) medium](又被稱為生殖細胞培養液)、Tris-緩衝生理鹽水(Tris-buffered saline, TBS)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)以及生理鹽水(saline)。
在本發明的一個較佳具體例中，該***樣品被拿來進行偵測之前是先以HTF培養液予以稀釋，而得到具有一為1×10 7個細胞/mL的***濃度。
依據本發明，在步驟(a)中，該聚丙烯醯胺凝膠是藉由在一起始劑(initiator)的存在下使用丙烯醯胺與雙丙烯醯胺(bis-acrylamide)而被形成。
較佳地，丙烯醯胺與雙丙烯醯胺是呈一範圍落在19：1 (w/w)至199：1 (w/w)內的比例，更佳地，24：1 (w/w)至99：1 (w/w)。在某些具體例中，丙烯醯胺與雙丙烯醯胺是呈一為29：1 (w/w)的比例。在某些具體例中，丙烯醯胺與雙丙烯醯胺是呈一為37.5：1 (w/w)的比例。
依據本發明，該起始劑可選自於由下列所構成的群組：過硫酸銨(ammonimum persulfate, APS)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine, TEMED)、維生素B2-5’-磷酸鈉(riboflavin-5’-phosphate sodium)、3-(二甲胺基)丙腈[3-(Dimethylamino)propionitrile]，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該起始劑是APS與TEMED的組合。特別地，使用聚丙烯醯胺凝膠以及APS與TEMED的組合來進行***之包埋的步驟可完全於室溫下操作，無須使用任何加熱或低溫處理的設備，令檢測更加方便快速。
如本文中所使用的，術語“裂解液(lysis solution)”、“細胞裂解液(cell lysis solution)”與“蛋白質裂解液(protein lysis solution)”可被交替地使用。
依據本發明，該裂解液所添加的十二烷基硫酸鈉以及尿素分別是一離子界面活性劑(ionic surfactant)以及一蛋白質變性劑(protein denaturant)，它們作用於促進魚精蛋白(protamine)的裂解，進而使原本與魚精蛋白相互纏繞的DNA可加速分離並進而使得DNA片段釋放至***的頭部外圍以形成光暈，藉此縮短裂解處理的時間(例如，5分鐘以內)，而可避免***的尾部呈現捲曲。
依據本發明，該裂解液進一步包含有其他的界面活性劑(surfactant)，且該界面活性劑可以是離子界面活性劑或非離子界面活性劑(nonionic surfactant)。較佳地，該離子界面活性劑是選自於由下列所構成的群組：脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)、膽酸鈉(sodium cholate)、月桂醯肌胺酸鈉(sodium lauroyl sarcosinate)，以及它們的組合。較佳地，該非離子界面活性劑是選自於由下列所構成的群組：聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、壬苯醇醚-40 (Nonoxynol-40, NP-40)、泊洛沙姆(Pluronic F-127, F-127)、聚山梨醇酯-20 (Tween-20)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該非離子界面活性劑是Triton X-100。
依據本發明，該裂解液進一步包含有其他的蛋白質變性劑。較佳地，該蛋白質變性劑是選自於由下列所構成的群組：3-[(3-膽胺丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸水合物{3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate}、胍鹽酸鹽(guanidinium chloride)，以及它們的組合。
依據本發明，該裂解液進一步包含有還原劑(reducing agent)、鹽類以及用於調整pH值的滴定液(titrant)。
較佳地，該還原劑是選自於由下列所構成的群組：二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、二硫赤糖醇(dithioerythritol, DTE)、三丁基膦(tributylphosphine, TBP)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該還原劑是DTT。
較佳地，該鹽類是選自於由下列所構成的群組：氯化鈉(sodium chloride, NaCl)、氯化鉀(Potassium chloride, KCl)，以及它們的組合。
較佳地，該滴定液是選自於由下列所構成的群組：氫氧化鈉(sodium hydroxide, NaOH)、鹽酸(hydrochloric acid, HCl)，以及它們的組合。
更佳地，該裂解液進一步包含有具有一濃度範圍落在0.15至3 M內的NaCl、具有一濃度範圍落在0.05至0.2 M內的DTT、具有一濃度範圍落在0.1至5%內的Triton X-100以及具有一濃度範圍落在0.01至0.02 M內的NaOH。特別地，DTT與高濃度的NaCl的使用有利於令DNA在與魚精蛋白分離後形成光暈。
在某些具體例中，該裂解液包含有1 M的尿素、0.05%的SDS、2.5 M的NaCl、0.1 M的DTT、1%的Triton X-100以及0.02 M的NaOH。在某些具體例中，該裂解液包含有4 M的尿素、0.05%的SDS、0.15 M的NaCl、0.2 M的DTT、0.5%的Triton X-100以及0.01 M的NaOH。在某些具體例中，該裂解液包含有0.5 M的尿素、0.5%的SDS、3 M的NaCl、0.05 M的DTT、5%的Triton X-100以及0.015 M的NaOH。
依據本發明，該裂解液可藉由該滴定液而被調整成具有所欲pH值的溶液。較佳地，該裂解液具有一範圍落在7至9內的pH值。更佳地，該裂解液具有一範圍落在7至8.2內的pH值。在本發明的一個較佳具體例中，該裂解液具有一為7.5的pH值。
依據本發明，該DNA染色可使用一選自於由下列所構成之群組的方法來進行：Diff-Quik染色、Wright-Giemsa染色、碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色、SYBR Green染色、DAPI染色以及吖啶橙(acridine orange)染色。
本發明亦提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的套組，其包含有： 一膠體形成配方(gel-forming formulation)，其包含有具有一濃度範圍落在10至70% (w/v，g/mL)內的成分，該成分是選自於由下列所構成的群組：丙烯醯胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、N-異丙基丙烯醯胺、海藻酸鹽以及聚乙二醇； 一裂解液，其包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的SDS；以及 一DNA染色試劑(DNA staining reagent)。
如本文中所使用的，術語“套組(kit)”意指一包裝的產品，其中包含有用於偵測一疾病(disease)或其臨床徵兆(clinical sign)的試劑(reagents)或材料(material)。該套組可包含一或多個用於容納上述試劑或材料的盒或容器，以及用於指示該套組所包含的內容物之用途的標籤和/或說明書。
較佳地，該成分是丙烯醯胺。
依據本發明，該膠體形成配方進一步包含有一如上所述的起始劑。較佳地，丙烯醯胺以及該起始劑是被放置於分開的容器(例如，微量離心管、玻璃瓶或塑膠瓶)中。
依據本發明，該套組進一步包含有一用於承載該***樣品的載體(carrier)，作用於讓該膠體形成配方所形成的凝膠能夠固定於其表面上，以利於進行上面所述方法的各個處理步驟(包括裂解處理與DNA染色)。適用於本發明的載體包括，但不限於：載玻片(slide)以及孔盤(well-plate)。
依據本發明，該載體可被覆蓋以含有0.25至1.5% (w/v，g/L)的瓊脂糖(agarose)之薄膜(film)，以利於該凝膠較易於固定於載體上。在本發明的一個較佳具體例中，該載體是一被覆蓋以含有1% (w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜的載玻片。
依據本發明，該裂解液的配方與pH值是如上面所述者。
依據本發明，該DNA染色試劑是選自於由下列所構成的群組：Diff-Quik染料、Wright-Giemsa染料、碘化丙錠、SYBR Green、DAPI以及吖啶橙。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 實驗 個體以及材料 ： 1.  實驗個體及其***樣品(semen sample)：
參與本發明的臨床實驗個體共計有36位年齡介於22歲至40歲的男性受試者參加，其中有18位受試者被診斷帶有***症(infertility)。
從各個受試者所收集到的***經充分液化(liquefy)後各取30 μL，繼而以一***品質分析檢測儀(型號為X1 PRO，廠牌為LensHooke)來測定***所含有的***數目，然後以人類輸卵管液(HTF)培養液[Human Tubal Fluid (HTF) medium]予以稀釋，而得到具有所欲濃度的***樣品。 2.  在下面實施例中所使用的裂解液(lysis solution)具有：2.5 M的氯化鈉(sodium chloride, NaCl)、0.2 M的二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、4 M的尿素(urea)、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.5%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)以及0.005 M的氫氧化鈉(sodium hydroxide, NaOH)，其中NaOH被使用來將該裂解液的pH值調整至7.5-8.2。 實施例1. 使用聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel, PAG) 包埋***樣品來進行***DNA 片段化(sperm DNA fragmentation) 的偵測 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出1位健康受試者的***樣品，並將該***樣品分成1個對照組以及1個實驗組(每組為5-10×10 5個***/70 μL)。對各組的***樣品添加以69.2 μL之30% (w/v，g/mL)丙烯醯胺/雙丙烯醯胺溶液(acrylamide/bis-acrylamide solution)(Bio-Rad)以及30.8 μL的0.01 M PBS並予以混合，繼而加入1.5 μL的10%過硫酸銨(ammonimum persulfate, APS)以及1.5 μL的四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine, TEMED)。接著，對所形成之各組的混合物各取20 μL並分別置於載玻片[其被覆蓋以含有1% (w/v，g/L)的瓊脂糖(agarose)之薄膜(film)，以令混合物能夠穩固地固定於載玻片上]上，然後於室溫下靜置歷時3-5分鐘，而使得各組的***樣品分別被包埋於含有12% (w/v，g/mL)丙烯醯胺的聚丙烯醯胺凝膠中並且被固定於載玻片上，藉此而得到各組包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠(下稱PAG凝膠)。
之後，依照下列步驟來對實驗組進行DNA切割處理[亦即DNA水解(DNA hydrolysis)]，至於對照組則不作任何處理：對實驗組的PAG凝膠處理以0.1%的Triton X-100，而使得該等***之細胞膜(plasma membrane)被通透化(permeabilized)，然後以H 2O予以清洗2次約歷時3分鐘，接著使用2 U的核酸內切酶(endonuclease) DNase I (貨號為E1010，廠牌為Zymo Research)來進行DNA水解歷時30分鐘，而使得DNA雙-股斷裂(double-strand breaks, DSBs)與單-股斷裂(single-strand breaks, SSBs)發生，進而造成DNA片段化。
然後，依照下列步驟來對各組進行裂解處理(lysis treatment)：對各組之PAG凝膠添加以200-300 μL之上面“實驗個體以及材料”的第2項的裂解液並於室溫下進行作用歷時5-20分鐘，而使得該等***被裂解，並且***中的核蛋白(nuclear proteins)[包括魚精蛋白(protamine)]被裂解，而使得***的片段化DNA從與核蛋白複合形成的***染色質(sperm chromatin)中被釋放出。
在以H 2O予以清洗2次之後，DNA染色(DNA staining)是使用***形態快速染色液(Diff-Quik法)並依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行約歷時1分鐘，繼而使用一光學顯微鏡(型號為BX-53，廠牌為Olympus)並在一為100倍與200倍的放大倍率下來對經染色的PAG凝膠進行觀察以及拍照。 結果：
圖3顯示各組的PAG凝膠藉由DNA染色而被觀察到的結果。從圖3可見，在實驗組的經裂解的***處中大多數皆有光暈形成(halo formation)(亦即呈現粉紅色之處)，而對照組的經裂解的***處幾乎沒有光暈形成。
為了再次驗證上述的結果，申請人另外選用另一種會造成DNA雙-股斷裂的核酸內切酶Alu I (貨號為R0137S，廠牌為NEB)來取代DNase I以進行相同的測試，並且亦有觀察到相似的結果(數據未顯示)。
這些實驗結果顯示：本發明使用聚丙烯醯胺凝膠包埋***樣品來進行***DNA片段化之偵測的方法能夠有效地偵測到由核酸內切酶處理所造成之***DNA片段化的***樣品，而此偵測的方法被申請人命名為“***DNA片段釋放(SDFR)試驗[Sperm DNA fragment release (SDFR) assay]”。 實施例2. 本發明使用聚丙烯醯胺凝膠的***DNA 片段化偵測方法與習知方法的比較
為了瞭解本發明SDFR試驗使用聚丙烯醯胺凝膠來進行***DNA片段化的偵測方法與習知使用瓊脂糖凝膠(agarose gel)的偵測方法之效用差異，申請人使用***染色質擴散(SCD)試驗[sperm chromatin dispersion (SCD) test]以及彗星試驗(comet assay, CA)這兩種習知的偵測方法來進行比較。 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出1位健康受試者的***樣品，並將該***樣品分成1個實驗組、1個SCD組以及1個CA組，分別依據下面表1中所示之不同操作步驟來進行DNA片段化之偵測。 表1. 各組偵測DNA片段化所使用的操作步驟與結果判讀方式
組別 凝膠 包埋 變性處理 裂解處理 電泳 DNA染色 DNA片段化的判讀
有片段化 無片段化
實驗組 聚丙烯醯胺凝膠 － ＋ － ＋ 有光暈 無光暈
SCD組 瓊脂糖凝膠 ＋ ＋ － ＋ 無光暈或光暈寬度小於***頭部直徑的1/3 光暈寬度大於***頭部直徑的1/3
CA組 － ＋ ＋ ＋ 有彗星尾(comet tail) 無彗星尾
有關實驗組的***DNA片段化的偵測是依序參照上面實施例1中所述之聚丙烯醯胺凝膠包埋、核蛋白的裂解處理以及DNA染色的步驟而被進行。
有關SCD組的***DNA片段化的偵測是依照下面所示的步驟而被進行：首先，對SCD組的***樣品混合以經加熱液化之0.7% (w/v，g/mL)低熔點的瓊脂糖凝膠(low melting agarose gel)[亦即配於100 mL PBS中的瓊脂糖(購自於Alfa Aesar)]，繼而將所形成之混合物置於載玻片[其被覆蓋以含有1% (w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜]上，然後於4℃下靜置歷時5分鐘，而使得該***樣品被包埋於瓊脂糖凝膠中並且被固定於該載玻片上，藉此而得到一包埋有***的瓊脂糖凝膠(下稱AG凝膠)。接著，對該AG凝膠添加以200-300 μL之含有0.1 N鹽酸(hydrochloric acid, HCl)的變性溶液(denaturing solution)並於室溫下進行DNA變性處理，而使得該等***中的雙股DNA限制性地轉化成單股DNA，繼而對該經變性處理的AG凝膠添加以200-300 μL之上面“實驗個體以及材料”的第2項的裂解液並於室溫下進行核蛋白的裂解處理歷時5-20分鐘。在以H 2O予以清洗2次之後，DNA染色是使用***形態快速染色液(Diff-Quik法)並依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行，繼而使用一光學顯微鏡並在一為100倍與200倍的放大倍率下來對經染色的AG凝膠進行觀察以及拍照。
有關CA組的***DNA片段化的偵測大體上是參照SCD組的步驟而被進行，差異處在於：沒有進行DNA變性處理，並且在進行DNA染色之前，有先將經過裂解處理的瓊脂糖凝膠拿來進行電泳(約20分鐘)並以0.01 M PBS (pH 7.4)予以清洗(約5分鐘)。
最後，實驗組、SCD組以及CA組分別依據各自不同的結果判讀方式來計算在***樣品的所有***中具有DNA片段化的***所佔的比率，亦即，DNA片段化指數(DNA fragmentation index, DFI)(%)。 結果：
圖4顯示實驗組的PAG凝膠以及SCD組與CA組的AG凝膠藉由DNA染色而被觀察到的結果。從圖4可見，實驗組可輕易地藉由觀察有無光暈來判別有無DNA片段化，SCD組需要比較光暈的大小較不易判讀，而CA組則需仔細觀察有無彗星尾亦相對不容易，需進一步搭配軟體分析。再者，從這三組的DNA染色結果看來，它們大致上具有相似的DFI指數。由此可見，相較於習知使用瓊脂糖凝膠的偵測方法，本發明SDFR試驗操作步驟較少(沒有進行DNA變性處理以及電泳)，卻較容易判讀且能獲得相近的偵測效能。
此外，申請人另有參照第五版《世界衛生組織人類***分析實驗室技術手冊》將該***樣品配於冷凍保護液中並保存於液態氮(liquid nitrogen)中歷時72小時，接著再參照上面實驗組來進行***DNA片段化的偵測。而實驗結果發現，所測得的DFI指數與上面實驗組所測得者之間沒有明顯的差異存在(數據未顯示)，這表示：本發明SDFR試驗不會因為***樣品有經過冷凍保存而降低其偵測效能，因而可供用於***樣品的重複檢測。 實施例3. 本發明偵測方法的準確性分析 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出14位受試者(包含健康與帶有***症的受試者)的***樣品，並將該等***樣品拿來進行使用本發明方法的***DNA片段化的偵測，亦即依序參照上面實施例1中所述之聚丙烯醯胺凝膠包埋、核蛋白的裂解處理以及DNA染色的步驟來進行，並且依據上面實施例2中所述來計算DFI指數。
另外，該14個***樣品亦被拿來進行彗星試驗，亦即大體上參照上面實施例2的CA組的步驟來進行，差異處在於：以聚丙烯醯胺凝膠包埋來替代瓊脂糖凝膠包埋。為了解決彗星尾不易觀察的問題，使用ImageJ分析軟體來計算在***樣品中呈現出彗星尾的***所佔的比率，藉此而得到DFI指數。
之後，使用線性迴歸(linear regression)和皮爾森氏相關分析(Pearson’s correlation analysis)來對依據本發明偵測方法以及習知的彗星試驗所得到的DFI指數進行相關性的分析。 結果 ：
圖5顯示由本發明的方法所測得的DFI指數與習知的彗星試驗所測得者之間的相關圖。從圖5可見，本發明的方法與彗星試驗在偵測***DNA片段化上具有高達0.9479的決定係數(coefficient of determination, R 2)。這個實驗結果顯示：本發明SDFR試驗的偵測效能是相同於彗星試驗所具者。 實施例4. 本發明偵測方法 在使用具有不同丙烯醯胺濃度的聚丙烯醯胺凝膠 下的效用評估 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出1位受試者的***樣品，並參照上面實施例1中所述之使用DNase I 的DNA切割處理的步驟來對該***樣品進行DNA水解，繼而將該經DNA水解的***樣品分成8個組別，接著，將各組的***樣品拿來進行使用本發明方法的***DNA片段化的偵測。
有關各組的***DNA片段化的偵測大體上是依序參照上面實施例1中所述之聚丙烯醯胺凝膠包埋、核蛋白的裂解處理以及DNA染色的步驟而被進行，並且依據上面實施例2中所述來計算DFI指數，而不同之處在於：各組的***樣品分別依據下面表2中所示的配方而被包埋於含有4至25% (w/v，g/mL)丙烯醯胺的聚丙烯醯胺凝膠中，藉此而得到含有不同丙烯醯胺濃度的PAG凝膠。 表2. 含有不同丙烯醯胺濃度的PAG凝膠的配方
丙烯醯胺濃度(%，w/v，g/mL) ***樣品(μL) 30% (w/v，g/mL)丙烯醯胺/雙丙烯醯胺溶液 (μL) PBS (μL) APS (μL) TEMED (μL) ***濃度(個細胞/mL)
4 70 23.1 76.9 1.5 1.5 1×10 7
7 70 40.4 59.6 1.5 1.5 1×10 7
10 70 57.7 42.3 1.5 1.5 1×10 7
13 70 75.0 25 1.5 1.5 1×10 7
16 70 92.3 7.7 1.5 1.5 1×10 7
19 35 109.6 25.4 1.5 1.5 2×10 7
22 35 126.9 8.1 1.5 1.5 2×10 7
25 25 144.2 0.8 1.5 1.5 2.8×10 7
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表3中。從表3可見，使用4至22% (w/v，g/mL)丙烯醯胺所測得的結果皆可得到相似的DFI指數，相對地，使用25% (w/v，g/mL)丙烯醯胺所測得的DFI指數則呈現出明顯的偏差。這個實驗結果顯示：本發明偵測方法所使用的聚丙烯醯胺凝膠需具有一濃度範圍落在4至22% (w/v，g/mL)內的丙烯醯胺。 表3. 含有不同丙烯醯胺濃度的PAG凝膠所測得之DFI指數
丙烯醯胺濃度(%，w/v，g/mL) DFI (%)
4 81
7 84
10 84
13 82
16 82
19 85
22 85
25 55
另外，依據B.M.A. Carvalho, et al. (2014), Sep. Purif. Rev., 43:241-262，丙烯醯胺濃度為4至22% (w/v，g/mL)的聚丙烯醯胺凝膠所具有之孔徑大小被預期約落在3.2至8.8 nm的範圍內。相對地，依據Janaky Narayanan, et al. (2006), J. Phys. Conf. Ser., 28:83-86，習知SCD試驗與CA試驗中所使用的瓊脂糖凝膠的孔徑大小約落在70至600 nm的範圍內。
基於上述，申請人據此而推論：在以具有2 nm以上且小於60 nm之孔徑的凝膠[特別是具有丙烯醯胺濃度為3至24% (w/v，g/mL)的聚丙烯醯胺凝膠]來對***樣品進行包埋之後，只需要進行核蛋白的裂解處理以及DNA染色，即能夠藉由觀察光暈形成的存在與否來清楚地判斷該***樣品是否具有DNA片段化。因此，本發明的方法被預期可供應用於快速地偵測一人類個體體內的***DNA片段化，進而能夠用於男性***症(male infertility)的評估。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
1:完整性較高的DNA片段 2:完整性較低的DNA片段 3:頭部
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1是本發明使用具有2 nm以上且小於60 nm之孔徑的凝膠來包埋***樣品的DNA片段化偵測方法的一示意圖； 圖2是使用具有60 nm以上之孔徑的凝膠來包埋***樣品的DNA片段化偵測方法的一示意圖； 圖3顯示各組的PAG凝膠藉由DNA染色而被觀察到的結果； 圖4顯示實驗組的PAG凝膠以及SCD組與CA組的AG凝膠藉由DNA染色而被觀察到的結果，其中箭頭指示代表有光暈形成；以及 圖5顯示由本發明的方法所測得的DFI指數與習知的彗星試驗所測得者之間的相關圖。
1:完整性較高的DNA片段 2:完整性較低的DNA片段 3:頭部

Claims (11)

  1. 一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：(a)令該***樣品包埋於一具有丙烯醯胺含量範圍落在3至24%(w/v，g/mL)內的聚丙烯醯胺凝膠，藉此而得到一包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠；(b)以一裂解液來對該包埋有***的聚丙烯醯胺凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5%(w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；(c)令該經裂解處理的聚丙烯醯胺凝膠進行一DNA染色；以及(d)觀察在該經染色的聚丙烯醯胺凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中光暈形成的存在是***DNA片段化存在之表徵，其中，該方法不包含DNA變性處理的步驟。
  2. 如請求項1的方法，其中在步驟(a)中，該聚丙烯醯胺凝膠具有一範圍落在4至22%(w/v，g/mL)內的丙烯醯胺含量。
  3. 如請求項1的方法，其中在步驟(a)中，該聚丙烯醯胺凝膠是藉由使用呈一範圍落在19：1(w/w)至199：1(w/w)內之比例的丙烯醯胺與雙丙烯醯胺而被形成。
  4. 如請求項3的方法，其中在步驟(a)中，該聚丙烯醯胺凝膠是藉由使用呈一範圍落在24：1(w/w)至99：1(w/w)內之比例的丙烯醯胺與雙丙烯醯胺而被形成。
  5. 如請求項1的方法，其中該裂解液進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的蛋白質變性劑：3-[(3-膽胺丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸水合物、胍鹽酸鹽，以及它們的組合。
  6. 如請求項1的方法，其中該裂解液進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的離子界面活性劑：脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、月桂醯肌胺酸鈉，以及它們的組合。
  7. 如請求項1的方法，其中該DNA染色是使用一選自於由下列所構成之群組的方法來進行：Diff-Quik染色、Wright-Giemsa染色、碘化丙錠染色、SYBR Green染色、DAPI染色以及吖啶橙染色。
  8. 一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的套組，其包含有：一膠體形成配方，其包含有具有一濃度範圍落在3至24%(w/v，g/mL)內的丙烯醯胺；一裂解液，其包含有具有一濃度範圍落在0.5至4M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5%(w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；以及一DNA染色試劑，其中，該套組不包含DNA變性溶液。
  9. 如請求項8的套組，其中該膠體形成配方進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的起始劑：過硫酸銨、四甲基乙二胺、維生素B2-5’-磷酸鈉、3-(二甲胺基)丙腈，以及它們的組合。
  10. 如請求項8的套組，其中該DNA染色試劑是選自於由下列所構成的群組：Diff-Quik染料、Wright-Giemsa染料、碘化丙錠、SYBR Green、DAPI以及吖啶橙。
  11. 如請求項8的套組，其進一步包含有一用於承載該***樣品的載體，該載體被覆蓋以含有0.25至1.5%(w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜。
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