TWI775252B - 用於偵測***dna片段化的方法以及套組 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：對該***樣品進行凝膠包埋處理、DNA變性處理與裂解處理，而使得該等***的DNA被變性以及核蛋白被裂解，其中該裂解處理是藉由使用一包含有尿素與十二烷基硫酸鈉的裂解液而被進行；令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。本發明亦揭示一種用於進行該方法的套組。
Description
本發明是有關於用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法。本發明亦有關於用於進行該方法的套組。
***DNA (sperm DNA)的完整性是影響胚胎品質(embryo quality)、胚胎著床(embryo implantation)以及胚胎發育(embryo development)的主要因素之一。當***DNA因***形成(spermiogenesis)發生錯誤、***凋亡(sperm apoptosis)、氧化性壓力(oxidative stress)或輻射(radiation)等因素而斷裂成片段(包括單-與雙-股DNA斷裂)，亦即***DNA片段化(sperm DNA fragmentation, SDF)，會造成男性***症(male infertility)、體外人工授精(IVF)失敗[
in vitrofertilization (IVF) failure]以及流產(miscarriage)的發生。因此，***DNA片段化的偵測已在生育力的篩檢以及人工生殖治療(artificial reproduction treatments)中扮演重要的角色。
目前已知可用來偵測***DNA片段化的方法包括：***染色質結構分析(sperm chromatin structure assay, SCSA)、末端去氧核糖核苷酸轉移酶調節的dUTP切口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)分析、DNA斷裂偵測-螢光原位雜交(DBD-FISH)試驗[DNA Breakage Detection-Fluorescence in Situ Hybridization (DBD-FISH) test]、彗星試驗(comet assay, CA)以及***染色質擴散(SCD)試驗[sperm chromatin dispersion (SCD) test]，其中又以SCD試驗最廣為人使用。
SCD試驗主要是在對***進行瓊脂糖凝膠(agarose gel)的包埋之後，使用DNA變性溶液(DNA denaturing solution)來限制性地將***中的雙股DNA轉化成單股DNA，繼而再裂解***中的核蛋白(nuclear proteins)[包括魚精蛋白(protamine)]，此時DNA會因魚精蛋白的裂解而鬆開形成DNA環(DNA loops)，DNA環的大小與DNA的完整程度呈正相關。接著，在進行DNA染色之後，這些DNA環會形成大小不一的光暈(halo)，其中當光暈寬度大於或等於***頭部直徑的1/3，代表無DNA片段化，而當無光暈或光暈寬度小於***頭部直徑的1/3，代表有DNA片段化。然而，SCD試驗存在有操作較為繁雜並且費時之缺點。此外，若試驗時間過長，***的尾部可能會呈現捲曲，並且會隨著時間的增加而更趨於明顯，且因有些***樣品中存在有白血球，白血球在經過SCD試驗之後亦會有光暈形成，而容易與尾部呈現捲曲的***混淆，導致在結果判讀上變得困難。
因此，本技藝中仍然存在有一需要去發展出一種操作方便快速且可靠的偵測方法來供產業界之所需。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：
(a) 令該***樣品包埋於一凝膠，藉此而得到一包埋有***的凝膠，其中該凝膠包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分：瓊脂糖、丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯；
(b) 以一DNA變性溶液來對該包埋有***的凝膠進行一DNA變性處理，而使得該等***的DNA被變性；
(c) 以一裂解液來對該經DNA變性處理的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；
(d) 令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及
(e) 觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
在第二個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：
(a) 令一瓊脂糖進行一加熱處理，接而混合以一DNA變性溶液與該***樣品，繼而對所形成的混合物進行一凝膠聚合作用，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的凝膠；
(b) 以一裂解液來對該包埋有經DNA變性之***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；
(c) 令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及
(d) 觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
在第三個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：
(a) 令該***樣品、一DNA變性溶液以及一膠體形成成分進行混合，繼而對所形成的混合物進行一凝膠聚合作用，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的凝膠，其中該膠體形成成分是選自於由下列所構成的群組：丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯；
(b) 以一裂解液來對該包埋有經DNA變性之***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；
(c) 令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及
(d) 觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
在第四個方面，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的套組，其包含有：
一膠體形成配方，其包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分：瓊脂糖、丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯；
一DNA變性溶液；
一裂解液，其包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；以及
一DNA染色試劑。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了改良習知用於偵測***DNA片段化(sperm DNA fragmentation)的方法，申請人經戮力研究結果發現，將***樣品、DNA變性溶液(DNA denaturing solution)以及經加熱液化之瓊脂糖(agarose)混合以進行凝膠包埋，可以在包埋的過程中同時對***樣品進行DNA變性處理，而再進一步使用添加有尿素(urea)與十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)的裂解液(lysis solution)來進行裂解處理(lysis treatment)，則可以加速核蛋白(nuclear proteins)的裂解，而能夠有效地縮短總偵測時間。此外，申請人發現，在該瓊脂糖在加熱液化前預先混合以酸鹼指示劑(acid-base indicator)，能夠藉由觀察顏色變化來確認是否有加入DNA變性溶液，而使得檢測人員在操作上更為便利，且部分的酸鹼指示劑具有消毒與抑菌的作用，能使凝膠在保存上較不易受到汙染。
於是，本發明提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：
(a) 令該***樣品包埋於一凝膠，藉此而得到一包埋有***的凝膠，其中該凝膠包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分(component)：瓊脂糖(agarose)、丙烯醯胺(acrylamide)、海藻酸鹽(alginate)以及氯乙烯(vinyl chloride)；
(b) 以一DNA變性溶液來對該包埋有***的凝膠進行一DNA變性處理，而使得該等***的DNA被變性；
(c) 以一裂解液來對該經DNA變性處理的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；
(d) 令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色(DNA staining)；以及
(e) 觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成(halo formation)於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
依據本發明，在步驟(a)中，該凝膠進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的酸鹼指示劑：酚紅(phenol red)、甲基紫(methyl violet)、甲基橙(methyl orange)、甲基紅(methyl red)、剛果紅(congo red)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該酸鹼指示劑是酚紅。
較佳地，該凝膠是瓊脂糖凝膠。
依據本發明，該瓊脂糖凝膠可具有一範圍落在1至3% (w/v，g/mL)內的瓊脂糖濃度。在本發明的一個較佳具體例中，該瓊脂糖凝膠具有一為1.25% (w/v，g/mL)的瓊脂糖濃度。
依據本發明，該瓊脂糖凝膠被拿來包埋***樣品之前有先置於微波爐或恆溫槽中並在一為95至100°C的溫度範圍下進行加熱液化。在本發明的一個較佳具體例中，該加熱液化所使用的溫度為95°C。
依據本發明，該***樣品可以在任何時間下收集自一個體。較佳地，該***樣品是收集自一經歷至少2-3天但不超過10天的禁慾(abstinence)的個體。
依據本發明，該***樣品可以是新鮮的或者經冷凍保存[例如，以液態氮(-196℃)予以冷凍]的樣品。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的動物，諸如，靈長類動物：人類(humans)、猿(ape)以及猴(simia)；非靈長類的哺乳類動物：豬(pigs)、牛(cows)、綿羊(sheeps)、馬(horses)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)；魚類；以及兩棲類動物。在本發明的一個較佳具體例中，該個體為一人類。
依據本發明，該***樣品被拿來進行偵測之前可先以稀釋液(diluent)予以稀釋，而使得***濃度範圍落在4×10
6至1.5×10
7個細胞/mL內。適用於本發明的稀釋液包括，但不限於：Earle’s 培養液(Earle’s medium)、人類輸卵管液(HTF)培養液[Human Tubal Fluid (HTF) medium](又被稱為生殖細胞培養液)、Tris-緩衝生理鹽水(Tris-buffered saline, TBS)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)以及生理鹽水(saline)。
在本發明的一個較佳具體例中，該***樣品被拿來進行偵測之前是先以HTF培養液予以稀釋，而得到具有一為1×10
7個細胞/mL的***濃度。
依據本發明，該DNA變性溶液可以是酸(acid)或鹼(alkali)，並且可以呈一範圍落在0.05至0.08 N內的當量濃度來限制性地進行該DNA變性處理。在某些具體例中，該當量濃度是落在0.06至0.07 N的範圍內。
較佳地，該DNA變性溶液是一選自於由下列所構成之群組中的酸：鹽酸(hydrochloric acid)、乙酸(acetic acid)、硝酸(nitric acid)、硫酸(sulfuric acid)，以及它們的組合。在某些具體例中，該DNA變性溶液是鹽酸。
較佳地，該DNA變性溶液是一選自於由下列所構成之群組中的鹼：氫氧化鈉(sodium hydroxide)、氫氧化鉀(potassium hydroxide)、氫氧化鈣(calcium hydroxide)，以及它們的組合。在某些具體例中，該DNA變性溶液是氫氧化鈉。
如本文中所使用的，術語“裂解液(lysis solution)”、“細胞裂解液(cell lysis solution)”與“蛋白質裂解液(protein lysis solution)”可被交替地使用。
依據本發明，該裂解液所添加的十二烷基硫酸鈉以及尿素分別是一離子界面活性劑(ionic surfactant)以及一蛋白質變性劑(protein denaturant)，它們作用於促進魚精蛋白(protamine)的裂解，進而使原本與魚精蛋白相互纏繞的DNA片段可加速分離並釋放至***的頭部外圍以形成光暈，藉此縮短裂解處理的時間(例如，5分鐘以內)，而可避免***的尾部呈現捲曲。
依據本發明，該裂解液進一步包含有其他的界面活性劑(surfactant)，且該界面活性劑可以是離子界面活性劑或非離子界面活性劑(nonionic surfactant)。較佳地，該離子界面活性劑是選自於由下列所構成的群組：脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)、膽酸鈉(sodium cholate)、月桂醯肌胺酸鈉(sodium lauroyl sarcosinate)，以及它們的組合。較佳地，該非離子界面活性劑是選自於由下列所構成的群組：聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、壬苯醇醚-40 (Nonoxynol-40, NP-40)、泊洛沙姆(Pluronic F-127, F-127)、聚山梨醇酯-20 (Tween-20)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該非離子界面活性劑是Triton X-100。
依據本發明，該裂解液進一步包含有其他的蛋白質變性劑。較佳地，該蛋白質變性劑是選自於由下列所構成的群組：3-[(3-膽胺丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸水合物{3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate}、胍鹽酸鹽(guanidinium chloride)，以及它們的組合。
依據本發明，該裂解液進一步包含有還原劑(reducing agent)、鹽類以及用於調整pH值的滴定液(titrant)。
較佳地，該還原劑是選自於由下列所構成的群組：二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、三(2-羧乙基)膦[Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP]、二硫赤糖醇(dithioerythritol, DTE)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol, β-ME)、麩胱甘肽(glutathione, GSH)、二硫丙醇(dimercaprol)、肝素(heparin)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該還原劑是DTT。
較佳地，該鹽類是選自於由下列所構成的群組：氯化鈉(sodium chloride, NaCl)、氯化鉀(Potassium chloride, KCl)，以及它們的組合。
較佳地，該滴定液是選自於由下列所構成的群組：氫氧化鈉(sodium hydroxide, NaOH)、鹽酸(hydrochloric acid, HCl)，以及它們的組合。
更佳地，該裂解液進一步包含有具有一濃度範圍落在0.15至3 M內的NaCl、具有一濃度範圍落在0.05至0.2 M內的DTT、具有一濃度範圍落在0.1至5%內的Triton X-100以及具有一濃度範圍落在0.01至0.02 M內的NaOH。特別地，DTT與高濃度的NaCl的使用有利於令DNA在與魚精蛋白分離後形成光暈。
在某些具體例中，該裂解液包含有1 M的尿素、0.05%的SDS、2.5 M的NaCl、0.1 M的DTT、1%的Triton X-100以及0.02 M的NaOH。在某些具體例中，該裂解液包含有4 M的尿素、0.05%的SDS、0.15 M的NaCl、0.2 M的DTT、0.5%的Triton X-100以及0.01 M的NaOH。在某些具體例中，該裂解液包含有0.5 M的尿素、0.5%的SDS、3 M的NaCl、0.05 M的DTT、5%的Triton X-100以及0.015 M的NaOH。
依據本發明，該裂解液可藉由該滴定液而被調整成具有所欲pH值的溶液。較佳地，當該DNA變性溶液是酸時，該裂解液被調整成具有一範圍落在7.5至9.0內的pH值。較佳地，當該DNA變性溶液是鹼時，該裂解液被調整成具有一範圍落在5.5至7.0內的pH值。在本發明的一個較佳具體例中，該裂解液具有一範圍落在8.2至8.5內的pH值。
依據本發明，該DNA染色是使用一選自於由下列所構成之群組的方法來進行：Diff-Quik染色、Wright-Giemsa染色、碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色、SYBR Green染色、DAPI染色以及吖啶橙(acridine orange)染色。
本發明亦提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：
(a) 令一瓊脂糖進行一加熱處理，接而混合以一DNA變性溶液與該***樣品，繼而對所形成的混合物進行一凝膠聚合作用(gel polymerization)，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的凝膠；
(b) 以一裂解液來對該包埋有經DNA變性之***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；
(c) 令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及
(d) 觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
依據本發明，在步驟(a)中，瓊脂糖在被進行加熱處理之前有被預混合以一如上所述的酸鹼指示劑。
依據本發明，該加熱處理可在一範圍落在95至100°C內的溫度下被進行。較佳地，該加熱處理是在95°C溫度下被進行。
依據本發明，該***樣品、該DNA變性溶液、該裂解液以及該DNA染色是如上面所述者。
本發明亦提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的方法，其包含下列步驟：
(a) 令該***樣品、一DNA變性溶液以及一膠體形成成分進行混合，繼而對所形成的混合物進行一凝膠聚合作用，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的凝膠，其中該膠體形成成分是選自於由下列所構成的群組：丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯；
(b) 以一裂解液來對該包埋有經DNA變性之***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；
(c) 令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及
(d) 觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
依據本發明，在步驟(a)中，該混合物進一步包含有一如上所述的酸鹼指示劑。
依據本發明，該***樣品、該DNA變性溶液、該裂解液以及該DNA染色是如上面所述者。
本發明亦提供一種用於偵測一***樣品中的***之DNA片段化的套組，其包含有：
一膠體形成配方(gel-forming formulation)，其包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分：瓊脂糖、丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯；
一DNA變性溶液；
一裂解液，其包含有具有一濃度範圍落在0.5至4 M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5% (w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；以及
一DNA染色試劑(DNA staining reagent)。
如本文中所使用的，術語“套組(kit)”意指一包裝的產品，其中包含有用於偵測一疾病(disease)或其臨床徵兆(clinical sign)的試劑(reagents)或材料(material)。該套組可包含一或多個用於容納上述試劑或材料的盒或容器，以及用於指示該套組所包含的內容物之用途的標籤和/或說明書。
較佳地，該成分是瓊脂糖。
較佳地，該成分是丙烯醯胺。例如，該膠體形成配方包含有一丙烯醯胺/雙丙烯醯胺溶液(acrylamide/bis-acrylamide solution)與一起始劑(initiator)，且它們是被放置於分開的容器(例如，微量離心管、玻璃瓶或塑膠瓶)中。
適用於本發明的起始劑包括，但不限於：過硫酸銨(ammonimum persulfate, APS)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine, TEMED)、維生素B2-5’-磷酸鈉(riboflavin-5’-phosphate sodium)以及3-(二甲胺基)丙腈[3-(Dimethylamino)propionitrile]。
依據本發明，該膠體形成配方可進一步包含有一如上所述的酸鹼指示劑。
依據本發明，該DNA變性溶液可以是一如上所述的酸或鹼。
依據本發明，該DNA變性溶液與該膠體形成配方是被放置於分開的容器(例如，微量離心管、玻璃瓶或塑膠瓶)中。
依據本發明，該套組進一步包含有一用於承載該***樣品的載體(carrier)，作用於讓該膠體形成配方所形成的凝膠能夠固定於其表面上，以利於進行上面所述方法的各個處理步驟(包括裂解處理與DNA染色)。適用於本發明的載體包括，但不限於：載玻片(slide)以及孔盤(well-plate)。
依據本發明，該載體可被覆蓋以含有0.25至1.5% (w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜(film)，以利於該凝膠較易於固定於載體上。在本發明的一個較佳具體例中，該載體是一被覆蓋以含有1% (w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜的載玻片。
依據本發明，該裂解液的配方與pH值是如上面所述者。
依據本發明，該DNA染色試劑是選自於由下列所構成的群組：Diff-Quik染料、Wright-Giemsa染料、碘化丙錠、SYBR Green，DAPI以及吖啶橙。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 實驗 個體以及材料 ： 1. 實驗個體及其***樣品(semen sample)：
參與本發明的實驗個體共計有36位年齡介於22歲至40歲的男性受試者參加。
對從各個受試者所收集到的***各取100 μL，繼而以一***品質分析檢測儀(型號為X1 PRO，廠牌為Lenshooke)來測定***所含有的***數目，然後以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)予以稀釋，而得到具有所欲濃度的***樣品。
2. 在下面實施例中所使用的裂解液(lysis solution)具有：2.5 M的氯化鈉(sodium chloride, NaCl)、0.2 M的二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、4 M的尿素(urea)、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、0.05%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)以及0.01 M的氫氧化鈉(sodium hydroxide, NaOH)，其中NaOH被使用來將該裂解液的pH值調整至8.2至8.5。
實施例1. 使用包含有尿素與 SDS 的裂解液來對***進行裂解處 理(lysis treatment) 對於***DNA 片段化(sperm DNA fragmentation) 之偵測的影響 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出1位受試者的***樣品，並將該***樣品分成1個對照組以及4個實驗組(亦即實驗組1至4)(每組為2.5×10
5個***/25 μL)。對各組的***樣品添加以100 μL之經加熱液化之1.25% (w/v，g/L)瓊脂糖(agarose)(廠牌Uniregion Bio Tech Inc.)(配於H
2O中)[預混合有0.02 mg/mL的酚紅(phenol red)]並予以混合，繼而對所形成的混合物各取25 μL並分別置於載玻片[其被覆蓋以含有1% (w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜(film)，以令混合物能夠穩固地固定於載玻片上]上，然後於4℃下靜置歷時5分鐘，而使得各組的***樣品分別被包埋於瓊脂糖凝膠中並且被固定於該載玻片上，藉此而得到各組包埋有***的瓊脂糖凝膠(下稱AG凝膠)。
接著，對各組的AG凝膠添加以200-300 μL之含有0.1 N鹽酸(hydrochloric acid, HCl)的DNA變性溶液(DNA denaturing solution)並於室溫下進行DNA變性處理歷時7分鐘，而限制性地使得該等***中的雙股DNA轉化成單股DNA。之後，對實驗組1至4之經DNA變性處理的AG凝膠添加以200-300 μL之上面“實驗個體以及材料”的第2項的裂解液並分別於室溫下進行核蛋白(nuclear proteins)的裂解處理歷時2、5、10以及20分鐘，而使得該等***被裂解，並且***中的核蛋白[包括魚精蛋白(protamine)]被裂解，而DNA因魚精蛋白的裂解而鬆開形成DNA環(DNA loops)。至於對照組之經DNA變性處理的AG凝膠大體上是參照上面實驗組4來進行裂解處理歷時20分鐘，不同之處在於：使用不含有尿素與SDS的裂解液[亦即含有2.5 M NaCl、0.2 M DTT、0.2 M Tris以及1% Triton X-100]，相當於習知SCD試驗所使用的裂解液。
在以H
2O予以清洗2次之後，以70%的乙醇來進行脫水(dehydration)。接著，使用Wright-Giemsa並依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行DNA染色(DNA staining)，繼而使用一光學顯微鏡(型號為BX-53，廠牌為Olympus)並在一為100倍與200倍的放大倍率下來對經染色的AG凝膠進行觀察以及拍照。
之後，計數無光暈或光暈寬度小於***頭部直徑的1/3之***數目(亦即，具有DNA片段化的***數目)，並進一步計算出在***樣品的所有***中具有DNA片段化的***所佔的比率，亦即，DNA片段化指數(DNA fragmentation index, DFI)(%)。
結果：
圖1顯示各組的AG凝膠藉由DNA染色而被觀察到的結果。從圖1可見，實驗組1至4與對照組所測得的DFI指數之間沒有明顯的差異存在。依據這個實驗結果，申請人認為：使用添加有尿素與SDS的裂解液來對***進行核蛋白的裂解處理能夠有效地加速核蛋白的裂解，進而縮短試驗所需的時間，同時亦能夠獲得與習知方法相近的偵測效能。
實施例2. 混合經加熱液化之瓊脂糖與 DNA 變性溶液來對***樣品同時進行凝膠包埋與 DNA 變性處理對於*** DNA 片段化之偵測的影響 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出1位受試者的***樣品，並將該***樣品分成1個對照組以及2個實驗組(亦即實驗組1與2)(每組為2.5×10
5個***/25 μL)。接著，對各組的***樣品進行下面所述的***DNA片段化的偵測。
有關對照組的***DNA片段化的偵測是依序參照上面實施例1的對照組所述之瓊脂糖凝膠包埋、DNA變性處理、核蛋白的裂解處理以及DNA染色的步驟而被進行。
有關實驗組1的***DNA片段化的偵測是依序參照上面實施例1的實驗組2所述之瓊脂糖凝膠包埋、DNA變性處理、核蛋白的裂解處理以及DNA染色的步驟而被進行。
有關實驗組2的***DNA片段化的偵測是依照下面所示的步驟而被進行：首先，將50 μL之經加熱液化之1.25% (w/v，g/L)瓊脂糖(預混合有0.02 mg/mL的酚紅)混合以25 μL之含有0.28 N鹽酸的DNA變性溶液，接著添加至實驗組2的***樣品中並予以混合，繼而將所形成之混合物置於載玻片[其被覆蓋以含有1% (w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜]上，然後於4℃下靜置歷時6分鐘，而使得該***樣品在進行DNA變性處理的同時被包埋於瓊脂糖凝膠中並且被固定於該載玻片上，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的瓊脂糖凝膠(下稱經DNA變性處理的AG凝膠)。之後，對該經DNA變性處理的AG凝膠添加以200-300 μL之上面“實驗個體以及材料”的第2項的裂解液並於室溫下進行核蛋白的裂解處理歷時5分鐘。在以H
2O予以清洗2次之後，以70%的乙醇來進行脫水。接著，使用Wright-Giemsa並依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行DNA染色，繼而使用一光學顯微鏡並在一為100倍與200倍的放大倍率下來對經染色的AG凝膠進行觀察以及拍照。
最後，依據上面實施例1中所述來計算各組的DFI指數。
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表1中。從表1可見，實驗組1與2與對照組所測得的DFI指數之間沒有明顯的差異存在。這個實驗結果顯示：在使用添加有尿素與SDS的裂解液來對***進行裂解處理之外，進一步合併瓊脂糖凝膠包埋與DNA變性處理這兩個步驟能夠進一步縮短試驗所需的時間，並且能夠獲得與習知方法相近的偵測效能。
表1. 各組的AG凝膠所測得之DFI指數
| 組別 | DFI (%) |
| 對照組 | 19 |
| 實驗組1 | 18 |
| 實驗組2 | 19 |
此外，申請人有嘗試大體上參照實驗組2的方法來進行試驗，但不添加尿素與SDS，而實驗結果發現：在使用不含有尿素與SDS的裂解液來對***進行裂解處理所形成的光暈變得較小而不易識別(數據未顯示)。申請人據此而認為：尿素與SDS的添加能夠有助於鬆開DNA結構以及擴散，而更利於觀測。
實施例3. 本發明偵測方法的準確性分析 實驗方法：
首先，從上面“實驗個體以及材料”的第1項中隨機地選出22位受試者的***樣品，並將該等***樣品拿來進行使用本發明方法的***DNA片段化的偵測，亦即依序參照上面實施例2中的實驗組2所述之瓊脂糖凝膠包埋與DNA變性處理的合併處理、核蛋白的裂解處理以及DNA染色的步驟，並且依據上面實施例1中所述來計算DFI指數。
另外，該22個***樣品亦被拿來進行SCD試驗，亦即參照上面實施例1的對照組的步驟來進行。
之後，使用線性迴歸(linear regression)和皮爾森氏相關分析(Pearson’s correlation analysis)來對依據本發明偵測方法以及習知的SCD試驗所得到的DFI指數進行相關性的分析。
結果：
圖2顯示由本發明的方法所測得的DFI指數與習知的SCD試驗所測得者之間的相關圖。從圖2可見，本發明的方法與SCD試驗在偵測***DNA片段化上具有高達0.9523的決定係數(coefficient of determination, R
2)。這個實驗結果顯示：本發明偵測方法的偵測效能是相同於SCD試驗所具者。
綜合以上的實驗結果，申請人認為：將***樣品、DNA變性溶液以及經加熱液化之瓊脂糖混合來對該***樣品同時進行凝膠包埋與DNA變性處理，並使用添加有尿素與SDS的裂解液來進行核蛋白的裂解處理，能夠在達致相似於習知方法之偵測效能的前提下，有效地縮短***DNA片段化的偵測時間。因此，本發明的方法被預期可供應用於快速地偵測一人類個體體內的***DNA片段化，進而能夠用於男性***症(male infertility)的評估。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：
圖1顯示各組的AG凝膠藉由DNA染色而被觀察到的結果；以及
圖2顯示由本發明的方法所測得的DFI指數與習知的SCD試驗所測得者之間的相關圖。
Claims (13)
- 一種用於對一***樣品中的***之DNA同時進行包埋與變性處理並偵測DNA片段化的方法，其包含下列步驟：(a)令一瓊脂糖進行一加熱處理，接而混合以一DNA變性溶液與該***樣品，繼而對所形成的混合物進行一凝膠聚合作用，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的凝膠，其中該DNA變性溶液是酸和/或鹼；(b)以一裂解液來對該包埋有經DNA變性之***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5%(w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；(c)令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及(d)觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
- 如請求項1的方法，其中在步驟(a)中，瓊脂糖在被進行加熱處理之前有被預混合以一選自於由下列所構成之群組中的酸鹼指示劑：酚紅、甲基紫、甲基橙、甲基紅、剛果紅，以及它們的組合。
- 一種用於對一***樣品中的***之DNA同時進行包埋與變性處理並偵測DNA片段化的方法，其包含下列步驟：(a)令該***樣品、一DNA變性溶液以及一膠體形成成分進行混合，繼而對所形成的混合物進行一凝膠聚合作用，藉此而得到一包埋有經DNA變性之***的凝膠，其中該膠體形成成分是選自於由下列所構成的群組：丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯，以及該DNA變性溶液是酸和/或鹼；(b)以一裂解液來對該包埋有經DNA變性之***的凝膠進行一裂解處理，而使得該等***的核蛋白被裂解，其中該裂解液包含有具有一濃度範圍落在0.5至4M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5%(w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；(c)令該經裂解處理的凝膠進行一DNA染色；以及(d)觀察在該經染色的凝膠上是否有光暈形成於各個***的頭部外圍，其中無光暈存在或光暈寬度小於該***頭部直徑的1/3是***DNA片段化存在之表徵。
- 如請求項3的方法，其中在步驟(a)中，該混合物進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的酸鹼指示劑：酚紅、甲基紫、甲基橙、甲基紅、剛果紅，以及它們的組合。
- 如請求項1至4中任一項的方法，其中該DNA變性溶液是一選自於由下列所構成之群組中的酸：鹽酸、乙酸、硝酸、硫酸，以及它們的組合。
- 如請求項1至4中任一項的方法，其中該DNA變性溶液是一選自於由下列所構成之群組中的鹼：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣，以及它們的組合。
- 如請求項1至4中任一項的方法，其中該裂解液進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的蛋白質變性劑：3-[(3-膽胺丙基)二甲胺基]-1-丙磺酸水合物、胍鹽酸鹽，以及它們的組合。
- 如請求項1至4中任一項的方法，其中該裂解液進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的離子界面活性劑：脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、月桂醯肌胺酸鈉，以及它們的組合。
- 一種用於對一***樣品中的***之DNA同時進行包埋與變性處理並偵測DNA片段化的套組，其包含有：用於同時進行包埋與變性處理的一膠體形成配方以及一DNA變性溶液，其中該膠體形成配方包含有一選自於由下列所構成之群組中的成分：瓊脂糖、丙烯醯胺、海藻酸鹽以及氯乙烯，以及該DNA變性溶液是酸和/或鹼；一裂解液，其包含有具有一濃度範圍落在0.5至4M內的尿素以及具有一濃度範圍落在0.05至0.5%(w/v，g/mL)內的十二烷基硫酸鈉；以及 一DNA染色試劑。
- 如請求項9的套組，其中該膠體形成配方進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的酸鹼指示劑：酚紅、甲基紫、甲基橙、甲基紅、剛果紅，以及它們的組合。
- 如請求項9的套組，其中該DNA變性溶液是一選自於由下列所構成之群組中的酸：鹽酸、乙酸、硝酸、硫酸，以及它們的組合。
- 如請求項9的套組，其中該DNA變性溶液是一選自於由下列所構成之群組中的鹼：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣，以及它們的組合。
- 如請求項9的套組，其進一步包含有一用於承載該***樣品的載體，該載體被覆蓋以含有0.25至1.5%(w/v，g/L)的瓊脂糖之薄膜。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101525670A (zh) * | 2009-03-23 | 2009-09-09 | 刘瑜 | 一种检测***dna碎片的方法及装置 |
| US20130224737A1 (en) * | 2010-11-04 | 2013-08-29 | Universidad Autonoma De Barcelona | Method For Determining The Production Of Reactive Oxygen Species In A Cellular Population |
Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101525670A (zh) * | 2009-03-23 | 2009-09-09 | 刘瑜 | 一种检测***dna碎片的方法及装置 |
| US20130224737A1 (en) * | 2010-11-04 | 2013-08-29 | Universidad Autonoma De Barcelona | Method For Determining The Production Of Reactive Oxygen Species In A Cellular Population |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Pratap H, Hottigoudar SY, Nichanahalli KS, Chand P.Assessment of Sperm Deoxyribose Nucleic Acid Fragmentation Using Sperm Chromatin Dispersion Assay. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics 8 Wolters Kluwer - Medknow 2017 Apr 1 45-49 * |
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| Martínez-Rodríguez et al. | Head morphology of ram spermatozoa is associated with their ability to migrate in vitro and correlates with fertility | |
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| Riveros et al. | Sperm head morphometry and chromatin alterations in bulls with different conception rates | |
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| US20230075204A1 (en) | Methods and kits for detecting sperm dna fragmentation | |
| Zhou et al. | Fluorescent enzyme-based biosensor for sensitive analysis of DNA damage in cryopreserved sperm | |
| Li et al. | The correlation between sperm percentage with a small acrosome and unexplained in vitro fertilization failure | |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GD4A | Issue of patent certificate for granted invention patent |