TWI770036B - 包含經修飾核苷之寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

提供包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶之聚核苷酸，諸如適體，其中該等第一及第二5位修飾嘧啶不同。亦提供選擇及使用諸如適體之該等聚核苷酸之方法。

Description

包含經修飾核苷之寡核苷酸
本發明大體而言係關於包含經修飾核苷之寡核苷酸領域，諸如能夠結合於靶標分子之適體。在一些實施例中，本發明係關於包含超過一種類型之鹼基經修飾核苷之寡核苷酸，諸如適體，及製備及使用該等適體之方法。
經修飾核苷已用作治療劑、診斷劑及用於併入至寡核苷酸中以改良其特性(例如穩定性)。
用於指數富集之配位體系統進化(SELEX)為用於鑒別選擇性地結合靶標分子之寡核苷酸(稱作「適體」)之方法。該SELEX方法描述於例如美國專利第5,270,163號中。該SELEX方法涉及自寡核苷酸之隨機混合物選擇及鑒別寡核苷酸以實際上實現結合親和力及選擇性之任何所需準則。藉由將特定類型之經修飾核苷引入至在該SELEX方法之過程中鑒別的寡核苷酸中，可改變核酸酶穩定性、靜電荷、親水性或親脂性以提供寡核苷酸之三維結構及靶標結合能力的差異。
在一些實施例中，提供包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶之適體，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾 嘧啶不同。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。在某些實施例中，該部分經由連接體共價連接至鹼基之5位，該連接體包含選自醯胺連接體、羰基連接體、丙炔基連接體、炔連接體、酯連接體、脲連接體、胺基甲酸酯連接體、胍連接體、脒連接體、亞碸連接體及碸連接體之基團。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由KOD DNA聚合酶併入。
在一些實施例中，該適體結合選自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28及PPIB之靶標蛋白。
在一些實施例中，該適體在該適體之5’末端處包含至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長、或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長之區域，其中在該適體之5’末端處的該區域缺乏5位修飾嘧啶。在一些實施例中，該適體在該適體之3’末端處包含至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長、或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長之區域，其中在該適體之3’末端處的該區域缺乏5位修飾嘧啶。在一些實施例中，該適體為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
在一些實施例中，與具有相同長度及包含替代各第一5位修飾嘧啶之未經修飾嘧啶及/或替代各第二5位修飾嘧啶之未經修飾嘧啶的核鹼基序列之適體相比，該適體具有改良之核酸酶穩定性。在一些實施例中，與具有相同長度及包含替代各第一5位修飾嘧啶之未經修飾嘧啶或替代各第二5位修飾嘧啶之未經修飾嘧啶的核鹼基序列之適體相比，該適體在人類血清中具有較長半衰期。
在一些實施例中，提供包含複數種聚核苷酸之組合物，其中各聚核苷酸包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶不同。在一些實施例中，各聚核苷酸在該聚核苷酸之5’末端處包含固定區域。在一些實施例中，在各聚核苷酸之5’末端處的固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。在一些實施例中，各聚核苷酸在該聚核苷酸之3’末端處包含固定區域。在一些實施例中，在該聚核苷酸之3’末端處的固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、色胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。在某些實施例中，該部分經由連接體共價連接至鹼基之5位，該連接體包含選自醯胺連接體、羰基連接體、丙炔基連接體、炔連接體、酯連接體、脲連接體、胺基甲酸酯連接體、胍連接體、脒連接體、亞碸連接體及碸連接體之基團。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、PPdU、 MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由KOD DNA聚合酶併入。
在一些實施例中，該組合物之各聚核苷酸包含無規區域。在一些實施例中，該無規區域為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或20至40個、或30至100個、或30至90個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或30至40個核苷酸長。在一些實施例中，各聚核苷酸為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含第一適體、第二適體及靶標，其中該第一適體包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶或其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶及至少一種第四5位修飾嘧啶； 其中該第一適體、第二適體及該靶標能夠形成三聚體複合物；且其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。在某些實施例中，該部分經由連接體共價連接至鹼基之5位，該連接體包含選自醯胺連接體、羰基連接體、丙炔基連接體、炔連接體、酯連接體、脲連接體、胺基甲酸酯連接體、胍連接體、脒連接體、亞碸連接體及碸連接體之基團。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由KOD DNA聚合酶併入。
在一些實施例中，該第三5位修飾嘧啶選自5位修飾胞嘧啶核苷及5位修飾嘧啶。在一些實施例中，該第三5位修飾嘧啶及該第四5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。在一些實施例中，第三5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且第四5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，第三5位修飾胞嘧啶核苷選自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC及TyrdC。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷選自BNdU、NapdU、PEdU、IbdU、FBndU、2NapdU、NEdU、MBndU、BFdU、BTdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
在一些實施例中，該靶標選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
在一些實施例中，提供一種方法，其包含：(a)使能夠結合於靶標分子之適體與樣品接觸；(b)用該樣品培育該適體以允許適體-靶標複合物形成；(c)在該樣品中富集該適體-靶標複合物及(c)偵測該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之存在，其中該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之偵測指示該靶標分子存在於該樣品中，且其中該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之偵測的缺乏指示該靶標分子不存在於該樣品中；其中該適體為本文所提供之雙重修飾適體。在一些實施例中，該方法包含至少一個選自以下之額外步驟：添加競爭分子至該樣品中；在固體支撐物上捕捉該適體-靶標複合物；及添加競爭分子且稀釋該樣品；其中該至少一個額外步驟發生於步驟(a)或步驟(b)之後。在一些實施例中，該競爭分子選 自聚陰離子競爭劑。在一些實施例中，該聚陰離子競爭劑選自寡核苷酸、聚右旋糖苷、DNA、肝素及dNTP。在一些實施例中，聚右旋糖苷為硫酸右旋糖苷；且DNA為鯡精DNA或鮭魚精DNA。在一些實施例中，該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。在一些實施例中，該樣品選自全血、白血球、外周血單核細胞、血漿、血清、唾液、氣息、尿液、***、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽吸液、支氣管抽吸液、滑液、關節抽吸液、細胞、細胞提取物、糞便、組織、組織生檢及腦脊髓液。
在一些實施例中，提供一種用於偵測樣品中之靶標之方法，該方法包含a)使該樣品與第一適體接觸以形成混合物，其中該第一適體能夠結合於該靶標以形成第一複合物；b)在允許該第一複合物形成之條件下培育該混合物；c)使該混合物與第二適體接觸，其中該第二適體能夠結合該第一複合物以形成第二複合物；d)在允許該第二複合物形成之條件下培育該混合物；e)偵測該混合物中第一適體、第二適體、靶標、第一複合物或第二複合物之存在或不存在，其中第一適體、第二適體、靶標、第一複合物或第二複合物之存在指示該靶標存在於該樣品中；其中該第一適體包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶； 其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶，或其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶及至少一種第四5位修飾嘧啶；其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。在某些實施例中，該部分經由連接體共價連接至鹼基之5位，該連接體包含選自醯胺連接體、羰基連接體、丙炔基連接體、炔連接體、酯連接體、脲連接體、胺基甲酸酯連接體、胍連接體、脒連接體、亞碸連接體及碸連接體之基團。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第 二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由KOD DNA聚合酶併入。
在一些實施例中，該第三5位修飾嘧啶選自5位修飾胞嘧啶核苷及5位修飾嘧啶。在一些實施例中，該第三5位修飾嘧啶及該第四5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。在一些實施例中，第三5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且第四5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，第三5位修飾胞嘧啶核苷選自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC及TyrdC。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷選自BNdU、NapdU、PedU、IbdU、FbndU、2NapdU、NedU、MbndU、BfdU、BtdU、PpdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
在一些實施例中，該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。在一些實施例中，該第一適體、第二適體及該靶標能夠形成三聚體複合物。
在一些實施例中，提供一種用於鑒別一或多種能夠結合於靶標分子之適體之方法，該方法包含：(a)使適體之文庫與該靶標分子接觸以形成混合物，且允許形成適體-靶標複合物，其中當適體對該靶標分子具有親和力時，該適體-靶標複合物形成；(b)自該混合物之剩餘部分分配該適體-靶標複合物(或富集該適體-靶標複合物)；(c)解離該適體-靶標複合物；及(d)鑒別一或多種能夠結合於靶標分子之適體； 其中該適體之文庫包含複數種聚核苷酸，其中各聚核苷酸包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。在一些實施例中，步驟(a)、(b)及/或(c)重複至少一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
在一些實施例中，使該一或多種能夠結合於靶標分子之適體擴增。在一些實施例中，該混合物包含聚陰離子競爭分子。在一些實施例中，該聚陰離子競爭劑選自寡核苷酸、聚右旋糖苷、DNA、肝素及dNTP。在一些實施例中，聚右旋糖苷為硫酸右旋糖苷；且DNA為鯡精DNA或鮭魚精DNA。
在一些實施例中，該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
在一些實施例中，各聚核苷酸在該聚核苷酸之5’末端處包含固定區域。在一些實施例中，在各聚核苷酸之5’末端處的固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。在一些實施例中，各聚核苷酸在該聚核苷酸之3’末端處包含固定區域。在一些實施例中，在該聚核苷酸之3’末端處的固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。在一些實施例中，該 第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。在某些實施例中，該部分經由連接體共價連接至鹼基之5位，該連接體包含選自醯胺連接體、羰基連接體、丙炔基連接體、炔連接體、酯連接體、脲連接體、胺基甲酸酯連接體、胍連接體、脒連接體、亞碸連接體及碸連接體之基團。在一些實施例中，該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。在一些實施例中，該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。在一些實施例中，該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。在一些實施例中，該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由KOD DNA聚合酶併入。
在一些實施例中，各聚核苷酸包含無規區域。在一些實施例中，該無規區域為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或20至40個、或30至100個、或30至90個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或30至40個核苷酸長。 在一些實施例中，各聚核苷酸為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
在一些實施例中，各聚核苷酸為結合靶標之適體，且其中該文庫包含至少1000種適體，其中各適體包含不同核苷酸序列。
在一些實施例中，提供結合PCSK9蛋白之適體。在一些該等實施例中，該適體包含序列5’-yGpppG-3’，其中各y為TyrdU且各p為NapdC。在一些實施例中，該適體進一步包含序列5’-yEAyGAnpAp-3’，其中E選自y、A及G；且n為0或1。在一些實施例中，n為0。在一些實施例中，序列5’-yEAyGAnpAp-3’位於序列5’-yGpppG-3’之5’。在一些實施例中，E為y。
在一些實施例中，提供結合PCSK9之適體，其中該適體包含序列5’-FnpppAAGRJrpRppWm-3’(SEQ ID NO：81)，其中F選自r及G；各R獨立地選自G及A；J選自r及A；W選自r、G及A；n為0或1；m為0或1；r為PpdC；且p為NapdU。在一些實施例中，m為1。在一些實施例中，F為r。在一些實施例中，J為r。在一些實施例中，W為G。
在一些實施例中，提供結合PCSK9之適體，其中該適體包含序列5’-TTppGGpp-3’，其中各p為NapdC。
在一些實施例中，結合PCSK9之適體為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或 30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
在一些實施例中，該適體抑制PCSK9結合於LDL-R。在一些實施例中，該適體抑制PCSK9結合於LDL-R，其中IC50小於30nM、小於20nM或小於15nM。
在一些實施例中，提供一種降低個體中之膽固醇的方法，該方法包含向有需要之個體投與結合PCSK9之適體。在一些實施例中，結合PCSK9之適體為本文所提供之適體。在一些實施例中，該膽固醇為低密度脂蛋白(LDL)膽固醇(LDL-C)。在一些實施例中，該個體具有雜合家族性高膽固醇血症或臨床動脈粥樣硬化性心血管疾病(CVD)。
本發明之前述內容及其他目標、特徵及優勢將由以下實施方式變得更明顯，該實施方式參考附圖繼續進行。
圖1。用含有C5位修飾尿嘧啶核苷及胞嘧啶核苷三磷酸酯之DNA文庫修飾的核酸適體之選擇。具有兩種經修飾鹼基之選擇的示意圖。其中使用30N隨機化化學合成之主反義生物素化模板文庫藉由引子延伸反應酶促合成多個經修飾及未經修飾文庫之選擇方法的概述。
圖2。使用多個經修飾文庫產生之40聚體(30N+5+5)適體對PCSK9之結合親和力。具有
Figure 106121878-A0202-12-0014-170
1nM之親和力的適體以灰色陰影突出顯示且以320nM親和力顯示之適體表示在結合曲線上在32nM最高濃度下無可偵測結合。各文庫上之黑線指示關於彼文庫中之所有適體的中值。
圖3。關於單一經修飾dU或dC之親和力及百分比複本數對具有dU之兩種經修飾dC。各點表示具有在Y軸上顯示之親和力值及在X軸上之其百分比複本數的適體之一。紅點為單一經修飾適體且綠點(空心及經填充)為兩種經修飾適體。經填充綠點表示一些Nap-dC/Tyr-dU及PP-dC/Tyr-dU適體。
圖4A-B。單一鹼基經修飾及兩種鹼基經修飾適體之可截短性。(A)所有高親和力40聚體序列均進一步截短至30聚體至其無規區域長度，僅自各5’及3’末端移除5個核苷酸。保持或具有改良之對PCSK9之結合親和力的適體之百分比在Y軸上繪製曲線。(B)來自各個別文庫之單一鹼基經修飾及兩種鹼基經修飾適體之親和力比較及可截短性。具有
Figure 106121878-A0202-12-0015-171
1nM之親和力的適體以灰色陰影突出顯示，最高平均親和力係針對具有PP-dC與PP-dU、Nap-dU及Tyr-dU之兩種經修飾鹼基組合之適體。
圖5。來自各文庫之三種高親和力適體對其他前蛋白轉化酶(PC)之靶標結合特異性。關於總計三十三種適體(40聚體)進行溶液親和力量測，其中十一種適體具有單一經修飾鹼基(亦即，三種適體具有Nap-dC/dT；三種適體具有dC/Nap-dU；三種適體具有dC/Pp-dU且兩種適體具有dC/Ty-dU)且二十二種適體具有雙重經修飾鹼基(亦即，三種適體具有Nap-dC/Nap-dU；三種適體具有Nap-dC/Pp-dU；三種適體具有Nap-dC/Moe-dU；三種適體具有Nap-dC/Tyr-dU；三種適體具有Pp-dC/Pp-dU；三種適體具有Pp-dC/Nap-dU；三種適體具有Pp-Ty-dU，且一種適體具有Pp-dC/Moe-dU)。在100nM親和力處之虛線下方的適體指示在100nM濃度下無可偵測結合。未測試與剩餘PC(PCSK5、PCSK6及PCSK8)之親和力。
圖6。單一鹼基及兩種鹼基經修飾適體之物種交叉反應性。單一經修飾(三種適體)及兩種經修飾(38種適體)之經截短30聚體適體(Kd值
Figure 106121878-A0202-12-0016-172
1nM)與來自人類、猴、小鼠及大鼠之PCSK9的親和力。單一經修飾之適體結合於人類及猴PSCKS9，但不結合於小鼠或大鼠PSKC9。相比之下，兩種經修飾之適體結合於人類、猴、小鼠及大鼠。來自各物種之PCSK9蛋白之百分比一致性相對於人類PSCK9經提供。
圖7A-C。在基於珠粒之Luminex®分析中的夾心對篩選。(A)適體夾心對篩選之示意圖。(B)在10nM PCSK9濃度下顯示大於或等於50倍之信號的夾心對未與緩衝液中之蛋白相比較。該夾心分析中測試之所有適體均為Kd
Figure 106121878-A0202-12-0016-173
1nM之40聚體。總計70對顯示
Figure 106121878-A0202-12-0016-174
50倍之信號。當各對之各適體自單一經修飾文庫進行選擇時，鑒別三種夾心對(3種夾心適體對/3個單一鹼基經修飾文庫)。相比之下，當各對之一種適體自三個單一鹼基經修飾文庫進行選擇且該等對之另一適體自四個雙重鹼基經修飾文庫進行選擇時鑒別22種夾心對(亦即，22種夾心適體對/3個單一鹼基經修飾文庫及4個雙重鹼基經修飾文庫)且當各對之兩種適體均自雙重經修飾文庫進行選擇時鑒別45種夾心對(45種夾心適體對/5個雙重鹼基經修飾文庫)。(C)關於源於具有單一鹼基經修飾適體之捕捉適體文庫及具有單一鹼基經修飾適體之偵測適體文庫；具有單一鹼基經修飾適體之捕捉適體文庫及具有兩種鹼基經修飾適體之偵測適體文庫；及具有兩種鹼基經修飾適體之捕捉適體文庫及具有兩種鹼基經修飾適體之偵測適體文庫的靶標蛋白PCSK9之夾心對數目的比較。
圖8A-D。在基於珠粒之Luminex®分析中顯示PCSK9濃度依賴性信號之夾心對。(A)用與所選二次或偵測適體配對之表現最好的捕捉或一次適體觀察濃度依賴性信號。(B)用與所選一次或捕捉適體配對之表現最好的二次或偵測適體觀察濃度依賴性信號。(C)主要夾心對dC/PP-dU適體(一次)及Nap-dC/Nap-dU適體(二次)，當該等適體之取向轉換時顯示信號。(D)用重組野生型PCSK9及功能獲得型突變體PCSK9 D374Y獲得之標準曲線。用偵測野生型PCSK9(圓形)及功能獲得型突變體PCSK9 D374Y(三角形)蛋白之夾心對獲得線性濃度依賴性信號。
圖9A-B。夾心分析之敏感性：適體夾心分析(dC/PP-dU適體(一次)及Nap-dC/Nap-dU適體(二次))之效能顯示在緩衝液中PCSK9濃度之偵測極限。(A)用具有約80pg/mL(LLOQ)之定量下限之適體夾心分析觀察線性濃度依賴性信號。(B)用具有約10ng/mL(ULOQ)之定量上限之適體夾心分析觀察線性濃度依賴性信號。
圖10。使用dC/PP-dU適體(一次)及Nap-dC/Nap-dU適體(二次)之夾心分析之稀釋線性。
圖11。該夾心分析包含一次單一鹼基經修飾適體及二次兩種鹼基經修飾適體(dC/PP-dU適體(一次)及Nap-dC/Nap-dU適體(二次))。
圖12。野生型HepG2細胞中PCSK9之過度表現。
圖13。基於板之活體外PCSK9抑制分析：用適體抑制PCSK9之示意圖。
圖14。關於單一鹼基或兩種鹼基經修飾適體之抑制篩選。
圖15A-B。物種交叉反應性潛在治療性之兩種鹼基經修飾適體。(A)30聚體兩種鹼基經修飾(PP-dC/Nap-dU)齧齒動物交叉反應性適體(11733-44，SEQ ID No：44)與人類PCSK9(經填充藍色圓形)、人類功能獲得型突變體PCSK9 D374Y(經填充紅色圓形)、恆河猴PCSK9(經填充綠色正方形)、大鼠PCSK9(經填充粉色六邊形)、小鼠PCSK9(經填充倒三角形)之親和力及混合型對照適體(空心黑色菱形)。(B)物種交叉反應性潛在治療性之兩種鹼基經修飾適體顯示對PCSK9與LDL-R相互作用之抑制。適體潛在地以2.1nM之EC50值(藍色經填充圓形)抑制PCSK9與LDL-R相互作用且以3.6nM之EC50值(紅色經填充三角形)抑制PCSK9 D374Y且混合型對照適體顯示對野生型PCSK9(綠色經填充正方形)及功能獲得型突變體PCSK9 D374Y(空心黑色正方形)無抑制。
圖16。LDL-攝取逆轉分析之示意圖。
圖17。物種交叉反應性PP-dC/Nap-DU適體藉由阻斷PCSK9與LDL-R相互作用而抑制LDL-R降解且增加HepG2細胞表面上之LDL-R水準。藉由活性SOMA聚體(紅色圓形)，關於LDL-攝取逆轉之EC50值為13.5nM，這用具有相同序列之混合型對照物(藍色三角形)未觀察到。
圖18。單一經修飾及雙重經修飾適體在90%人類血清中隨時間之穩定性。單一C-5經修飾或雙重C-5經修飾適體之修飾模式用圖例提供(例如X/Y，其中X表示dC(未修飾核苷酸)、NapdC(Nap)或PPdC(PP)；且Y表示dU或dT(未修飾核苷酸、TyrdU(Tyr)、NapdU(Nap)、PPdU(PP)或MOEdU(MOE))。
圖19A-C。40聚體(30N+5+5)適體與使用多個經修飾文庫產生之ErbB2(A)、ErbB3(B)及PSMA(C)的結合親和力。具有
Figure 106121878-A0202-12-0019-175
1nM之親和力的適體以灰色陰影突出顯示且以320nM親和力顯示之適體表示在結合曲線上在32nM最高濃度下無可偵測結合。各文庫上之黑線指示關於彼文庫中之所有適體的中值。
圖20。可併入適體中之某些例示性5位修飾尿嘧啶核苷及胞嘧啶核苷。
圖21。可存在於尿嘧啶核苷之5位處的某些例示性修飾。該C-5修飾之化學結構包括連接該修飾至尿嘧啶核苷之5位的例示性醯胺鍵。所示之5位部分包括苯甲基部分(例如Bn、PE及PP)、萘基部分(例如Nap、2Nap、NE)、丁基部分(例如iBu)、氟苯甲基部分(例如FBn)、酪胺醯基部分(例如Tyr)、3,4-亞甲基二氧基苯甲基(例如MBn)、N-嗎啉基部分(例如MOE)、苯并呋喃基部分(例如BF)、吲哚部分(例如Trp)及羥基丙基部分(例如Thr)。
圖22。可存在於胞嘧啶核苷之5位處的某些例示性修飾。該C-5修飾之化學結構包括連接該修飾至胞嘧啶核苷之5位的例示性醯胺鍵。所示之5位部分包括苯甲基部分(例如Bn、PE及PP)、萘基部分(例如Nap、2Nap、NE及2NE)及酪胺醯基部分(例如Tyr)。
本申請案主張2016年7月1日申請之美國臨時申請案第62/357,623號及2016年12月21日申請之美國臨時申請案第62/437,592號的優先權權益，該等臨時申請案各自以引用之方式整體併入本文中來達成任何目的。
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以引用之方式整體併入本文。2017年6月15日創建之該ASCII複本名稱為01137-0020-00PCT_SL.txt且大小為21,863位元。
除非另外注明，否則技術術語根據習知用法使用。分子生物學中之常見術語的定義可發現於Benjamin Lewin,Genes V，由Oxford University Press公佈，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.公佈，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(編)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.公佈，1995(ISBN 1-56081-569-8)中。
除非另外解釋，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之相同意義。除非本文另外清楚地指示，否則單數術語「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。「包含A或B」意謂包括A、或B、或A及B。應進一步理解，關於核酸或多肽給出之所有鹼基大小或胺基酸大小、及所有分子量或分子質量值均為近似值，且為了描述而提供。
此外，本文所提供之範圍應理解為關於該範圍內之所有值的速記。例如，1至50之範圍應理解為包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50組成之群的任何數字、數字組合或子範圍(以及其分數，除非本文另外清楚地規定)。除非另外指示，否則任何 濃度範圍、百分率範圍、比率範圍或整數範圍均應理解為包括在所陳述之範圍內的任何整數值且當適當時，包括其分數(諸如整數之十分之一及一百分之一)。又，除非另外指示，否則本文中關於任何物理特徵(諸如聚合物次單元、大小或厚度)所陳述之任何數字均應理解為包括在所陳述之範圍內的任何整數。除非另外指示，否則如本文所用，「約」或「基本上由......組成」意謂所指示之範圍、值或結構之±20%。如本文所用，術語「包括」及「包含」為開放式且同義使用。
儘管與本文所述之彼等類似或相等的方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但下文描述合適方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以引用之方式整體併入。若有衝突，則將以本說明書(包括術語之解釋)為準。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。
如本文所用，術語「核苷酸」係指核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，或其經修飾形式，以及其類似物。核苷酸包括包括嘌呤(例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤及其衍生物及類似物)以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物及類似物)之物質。除非另外特定地指示，否則如本文所用，術語「胞嘧啶核苷」一般地用於指包含胞嘧啶鹼基之核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或經修飾核糖核苷酸。術語「胞嘧啶核苷」包括2’-經修飾胞嘧啶核苷，諸如2’-氟、2’-甲氧基等。同樣，除非另外特定地指示，否則術語「經修飾胞嘧啶核苷」或特定經修飾胞嘧啶核苷亦指包含經修飾胞嘧啶鹼基之核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或經修飾核糖核苷酸(諸如2’-氟、2’-甲氧基等)。除非另外特定地指示，否則術語「尿嘧啶核苷」一般地用於 指包含尿嘧啶鹼基之核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或經修飾核糖核苷酸。術語「尿嘧啶核苷」包括2’-經修飾尿嘧啶核苷，諸如2’-氟、2’-甲氧基等。同樣，除非另外特定地指示，否則術語「經修飾尿嘧啶核苷」或特定經修飾尿嘧啶核苷亦指包含經修飾尿嘧啶鹼基之核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或經修飾核糖核苷酸(諸如2’-氟、2’-甲氧基等)。
如本文所用，術語「5位修飾胞嘧啶核苷」或「C-5修飾胞嘧啶核苷」係指在胞嘧啶核苷之C-5位處具有修飾之胞嘧啶核苷，例如如圖20中所示。非限制性例示性5位修飾胞嘧啶核苷包括圖22中所示之彼等。非限制性例示性5位修飾胞嘧啶核苷包括但不限於5-(N-苯甲基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「BndC」且顯示於圖21中)；5-(N-2-苯基乙基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「PEdC」且顯示於圖21中)；5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「PPdC」且顯示於圖21中)；5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「NapdC」且顯示於圖21中)；5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「2NapdC」且顯示於圖21中)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「NEdC」且顯示於圖21中)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作「2NEdC」且顯示於圖21中)；及5-(N-酪胺醯基甲醯胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(稱作TyrdC且顯示於圖21中)。在一些實施例中，該等C5修飾胞嘧啶核苷(例如，呈其三磷酸酯形式)能夠藉由聚合酶(例如KOD DNA聚合酶)併入寡核苷酸中。
本文所述之C-5修飾胞嘧啶核苷之化學修飾亦可與單獨或呈任何組合的2'位糖修飾(例如2’-O-甲基或2’-氟)、在環外胺處之修飾及4-硫代胞嘧啶核苷之取代及其類似修飾組合。
如本文所用，術語「C-5修飾尿嘧啶核苷」或「5位修飾尿嘧啶核苷」係指在尿嘧啶核苷之C-5位處具有修飾之尿嘧啶核苷(典型地去氧尿嘧啶核苷)，例如如圖20中所示。在一些實施例中，該等C5修飾尿嘧啶核苷(例如，呈其三磷酸酯形式)能夠藉由聚合酶(例如KOD DNA聚合酶)併入寡核苷酸中。非限制性例示性5位修飾尿嘧啶核苷包括圖21中所示之彼等。非限制性例示性5位修飾尿嘧啶核苷包括：5-(N-苯甲基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(BndU)，5-(N-苯乙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(PEdU)，5-(N-硫代苯基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(ThdU)，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(iBudU)，5-(N-酪胺醯基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(TyrdU)，5-(N-3,4-亞甲基二氧基苯甲基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(MBndU)，5-(N-4-氟苯甲基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(FBndU)，5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(PPdU)，5-(N-咪唑基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(ImdU)，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(TrpdU)，5-(N-R-酥胺醯基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(ThrdU)，鹽酸5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(NapdU)，5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷)，5-(N-2-苯基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(2NapdU)，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(NEdU)， 5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(2NEdU)，5-(N-3-苯并呋喃基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(BFdU)，5-(N-3-苯并噻吩基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(BTdU)。
本文所述之C-5修飾尿嘧啶核苷之化學修飾亦可與單獨或呈任何組合的2'位糖修飾(例如2’-O-甲基或2’-氟)、在環外胺處之修飾及4-硫代尿嘧啶核苷之取代及其類似修飾組合。
如本文所用，術語「修飾(modify)」、「經修飾(modified)」、「修飾(modification)」及其任何變化形式當參考寡核苷酸使用時意謂寡核苷酸之四種組成性核苷酸鹼基中之至少一者(亦即，A、G、T/U及C)為天然存在之核苷酸的類似物或酯。在一些實施例中，經修飾核苷酸向寡核苷酸賦予核酸酶抗性。額外修飾可包括骨架修飾、甲基化、不常見鹼基配對組合(諸如異鹼基異胞嘧啶核苷及異胍)及其類似修飾。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如加帽。其他修飾可包括一或多種天然存在之核苷酸用類似物取代、核苷酸間修飾(諸如具有不帶電鍵之彼等(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵之彼等(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、具有嵌入劑之彼等(例如，吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑之彼等(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含有烷基化劑之彼等及具有經修飾鍵之彼等(例如，α異頭核酸等))。此外，通常存在於核苷酸之糖上的任何羥基均可藉由膦酸酯基或磷酸酯基置換；由標準保護基保護；或經活化以製備額外核苷酸或固體支撐物上之額外鍵。5'及3'端OH基團可經磷酸化或經胺、具有約1至約20個碳原子之有機加帽基團部分、在一實施例中介於約10至約80kDa範圍內之聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一實施例中介於約 20至約60kDa範圍內之PEG聚合物或其他親水性或疏水性生物或合成聚合物取代。
如本文所用，「核酸」、「寡核苷酸」及「聚核苷酸」可互換使用以指核苷酸之聚合物且包括DNA、RNA、DNA/RNA雜合物及此等種類之核酸、寡核苷酸及聚核苷酸之修飾，其中包括在任何位置處多種實體或部分與核苷酸單元之連接。術語「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」包括雙鏈或單鏈分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸及聚核苷酸為比術語適體寬泛之術語且因此，術語核酸、寡核苷酸及聚核苷酸包括作為適體之核苷酸聚合物，但術語核酸、寡核苷酸及聚核苷酸不限於適體。
聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖的類似形式，包括2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-O-乙基、2'-O-丙基、2'-O-CH2CH2OCH3、2'-氟、2'-NH2或2'-疊氮基、碳環糖類似物、α-異頭糖、差向異構體糖(諸如***糖、木糖或來蘇糖)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及無鹼基核苷酸類似物(諸如甲基核糖苷)。如本文所注明，一或多種磷酸二酯鍵可由替代連接基團置換。此等替代連接基團包括如下實施例，其中磷酸酯由P(O)S(「硫代酯」)、P(S)S(「二硫代酯」)、(O)NRX 2(「醯胺化物」)、P(O)RX、P(O)ORX'、CO或CH2(「甲縮醛」)置換，其中各RX或RX'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基之經取代或未經取代烷基(C1-C20)。並非聚核苷酸中之所有鍵均需要同一。糖、嘌呤及嘧啶之類似形式之取代可有利於設計最終產物，例如，如聚醯胺骨架之替代骨架結構亦可如此。
聚核苷酸亦可含有碳環糖類似物、α-異頭糖、差向異構體糖(諸如***糖、木糖或來蘇糖)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及無鹼基核苷酸類似物(諸如甲基核糖苷)之類似形式。
若存在核苷酸結構之修飾，則其可在聚合物之組裝之前或之後給予。核苷酸序列可由非核苷酸組分中斷。聚核苷酸可在聚合之後進一步經修飾，諸如藉由與標記組分結合。
如本文所用，術語「至少一種核苷酸」當提及核酸之修飾時係指該核酸中之一種、數種或全部核苷酸，指示核酸中之任何或全部A、C、T、G或U的任何或全部出現可經修飾或未經修飾。
如本文所用，「核酸配位體」、「適體」、「SOMA聚體」及「純系」可互換使用以指對靶標分子具有所需作用之非天然存在核酸。所需作用包括但不限於結合靶標、催化改變靶標、以修飾或改變靶標或靶標的功能活性之方式與靶標反應、共價連接至靶標(如在自殺性抑制劑中)及促進靶標與另一分子之間的反應。在一實施例中，該作用為對靶標分子之特異性結合親和力，該靶標分子為除經由獨立於Watson/Crick鹼基配對或三螺旋形成之機制結合於適體的聚核苷酸外之三維化學結構，其中該適體並非具有由靶標分子結合之已知生理學功能的核酸。既定靶標之適體包括藉由如下方法自核酸之候選混合物鑒別的核酸，其中該適體為靶標之配位體，該方法包含：(a)使候選混合物與靶標接觸，其中相對於候選混合物中之其他核酸對靶標具有增加的親和力之核酸可自候選混合物之剩餘部分分配；(b)自候選混合物之剩餘部分分配增加親和力的核酸；及(c)擴增增加親和力的核酸以生成核酸之配位體富集混合物，由此鑒別靶標分子之適體。應認識 到親和力相互作用為程度問題；然而，在此背景下，適體對其靶標之「特異性結合親和力」意謂該適體一般以比其結合於混合物或樣品中之其他、非靶標組分高得多之親和力程度結合於其靶標。「適體」、「SOMA聚體」或「核酸配位體」為一種類型或種類之具有特定核苷酸序列之核酸分子的複本之集合。適體可包括任何合適數目之核苷酸。「適體」係指分子之超過一種該集合。不同適體可具有相同或不同數目之核苷酸。適體可為DNA或RNA且可為單鏈、雙鏈或含有雙鏈或三鏈區域。在一些實施例中，適體使用如本文所述或此項技術中已知之SELEX方法製備。
如本文所用，「SOMA聚體」或緩慢解離速率經修飾適體係指具有改良之解離速率特徵的適體。SOMA聚體可使用標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國專利第7,947,447號中所述的改良SELEX方法產生。
如本文所用，包含兩種不同類型之5位修飾嘧啶或C-5修飾嘧啶之適體可稱作「雙重修飾適體」、具有「兩種經修飾鹼基」之適體、具有「兩種鹼基修飾」或「兩種經修飾鹼基」之適體、具有「雙重修飾鹼基」之適體，其均可互換使用。適體之文庫或適體文庫亦可使用相同術語。因此，在一些實施例中，適體包含兩種不同5位修飾嘧啶，其中該兩種不同5位修飾嘧啶選自NapdC及NapdU、NapdC及PPdU、NapdC及MOEdU、NapdC及TyrdU、NapdC及ThrdU、PPdC及PPdU、PPdC及NapdU、PPdC及MOEdU、PPdC及TyrdU、PPdC及ThrdU、NapdC及2NapdU、NapdC及TrpdU、2NapdC及NapdU、及2NapdC及2NapdU、2NapdC及PPdU、2NapdC及TrpdU、2NapdC及TyrdU、PPdC及2NapdU、PPdC及TrpdU、 PPdC及TyrdU、TyrdC及TyrdU、TrydC及2NapdU、TyrdC及PPdU、TyrdC及TrpdU、TyrdC及TyrdU、及TyrdC及TyrdU。在一些實施例中，適體包含至少一種經修飾尿嘧啶核苷及/或胸腺嘧啶核苷及至少一種經修飾胞嘧啶核苷，其中該至少一種經修飾尿嘧啶核苷及/或胸腺嘧啶核苷在5位處用選自萘基部分、苯甲基部分、氟苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分、N-嗎啉基部分、異丁基部分、3,4-亞甲基二氧基苯甲基部分、苯并噻吩基部分及苯并呋喃基部分之部分修飾，且其中該至少一種經修飾胞嘧啶核苷在5位處用選自萘基部分、酪胺醯基部分及苯甲基部分之部分修飾。在某些實施例中，該部分經由連接體共價連接至鹼基之5位，該連接體包含選自醯胺連接體、羰基連接體、丙炔基連接體、炔連接體、酯連接體、脲連接體、胺基甲酸酯連接體、胍連接體、脒連接體、亞碸連接體及碸連接體之基團。
如本文所用，包含單一類型之5位修飾嘧啶或C-5修飾嘧啶之適體可稱作「單一經修飾適體」、具有「單一經修飾鹼基」之適體、具有「單一鹼基修飾」或「單一經修飾鹼基」之適體，其均可互換使用。適體之文庫或適體文庫亦可使用相同術語。如本文所用，「蛋白」與「肽」、「多肽」或「肽片段」同義使用。「經純化」多肽、蛋白、肽或肽片段實質上不含細胞材料或來自獲得胺基酸序列之細胞、組織或無細胞來源之其他污染蛋白，或當以化學方式合成時實質上不含化學前驅體或其他化學品。
在某些實施例中，適體包含第一5位修飾嘧啶及第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶在該第一5位修飾嘧啶之5位處包含酪胺醯基部分，且該第二5位修飾嘧啶在該第二5位修飾嘧啶之5位處包含萘基部 分或苯甲基部分。在一相關實施例中，該第一5位修飾嘧啶為尿嘧啶。在一相關實施例中，該第二5位修飾嘧啶為胞嘧啶。在一相關實施例中，該適體之尿嘧啶的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%在5位處經修飾。在一相關實施例中，該適體之胞嘧啶的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%在5位處經修飾。
經修飾核苷酸
在某些實施例中，本發明提供包含兩種不同類型之鹼基經修飾核苷酸的寡核苷酸，諸如適體。在一些實施例中，該等寡核苷酸包含兩種不同類型之5位修飾嘧啶。在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少一種C5修飾胞嘧啶核苷及至少一種C5修飾尿嘧啶核苷。在一些實施例中，該寡核苷酸包含兩種不同之C5修飾胞嘧啶核苷。在一些實施例中，該寡核苷酸包含兩種不同之C5修飾尿嘧啶核苷。非限制性例示性C5修飾尿嘧啶核苷及胞嘧啶核苷顯示於例如下式I中及圖19中。某些非限制性例示性C5修飾尿嘧啶核苷顯示於圖20中，且某些非限制性例示性C5修飾胞嘧啶核苷顯示於圖21中。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含至少一種式I之嘧啶：
Figure 106121878-A0202-12-0030-1
 其中R獨立地為-(CH2)n-，其中n為選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數；RX1獨立地選自由以下組成之群：
Figure 106121878-A0202-12-0030-2
Figure 106121878-A0202-12-0031-3
 其中，*表示RX1基團與-(CH2)n-基團之連接點；且其中，RX4獨立地選自由分支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；酉朋酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX2)；一級醯胺(CONH2)；二級醯胺(CONHRX2)；三級醯胺(CONRX2RX3)；磺醯胺(SO2NH2)；N-烷基磺醯胺(SONHRX2)組成之群；RX2及RX3關於每次出現獨立地選自由分支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C6H5)；RX4取代之苯環(RX4C6H4)，其中RX4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX5)，其中RX5為分支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基組成之群，其中RX2及RX3合起來形成經取代或未經取代之5或6員環； X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2及-疊氮基組成之群；R'獨立地選自由-H、-OAc；-OBz；-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)；及-OSiMe2tBu組成之群；R"獨立地選自由氫、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)及三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其鹽組成之群；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代C(1-4)烷基組成之群；及其鹽。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含圖21中所示之至少一種經修飾嘧啶，其中各X獨立地選自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2及-疊氮基。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含圖20中所示之至少一種經修飾嘧啶，其中各X獨立地選自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2及-疊氮基。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含圖20中所示之至少一種經修飾嘧啶及圖21中所示之至少一種經修飾嘧啶，其中各X獨立地選自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2及-疊氮基。某些非限制性例示性經修飾嘧啶對在本文所述之實例中示出。
在任何本文所述之實施例中，該寡核苷酸可為適體。在一些該等實施例中，該寡核苷酸為特異性結合靶標多肽之適體。
製備寡核苷酸
寡去氧核苷之自動化合成在多個實驗室中為常規實踐(參見例如Matteucci,M.D.及Caruthers,M.H.,(1990)J.Am.Chem.Soc.,103：3185-3191，其內容由此以引用之方式整體併入)。寡核糖核苷之合成亦為熟知的(參見例如Scaringe,S.A.等人，(1990)Nucleic Acids Res.18：5433-5441，其內容由此以引用之方式整體併入)。如本文所注明，亞磷醯胺適用於藉由化學合成將經修飾核苷併入寡核苷酸中，且三磷酸酯適用於藉由酶促合成將經修飾核苷併入寡核苷酸中。(參見例如Vaught,J.D.等人(2004)J.Am.Chem.Soc.,126：11231-11237；Vaught,J.V.等人(2010)J.Am.Chem.Soc. 132,4141-4151；Gait,M.J.「Oligonucleotide Synthesis a practical approach」(1984)IRL Press(Oxford,UK)；Herdewijn,P.「Oligonucleotide Synthesis」(2005)(Humana Press,Totowa,N.J.(各以引用之方式整體併入本文中)。
SELEX方法
術語「SELEX」及「SELEX方法」在本文中可互換使用以一般地指(1)以所需方式(例如以高親和力結合於蛋白)與靶標分子相互作用的核酸之選擇，與(2)彼等所選核酸之擴增的組合。該SELEX方法可用於鑒別對特定靶標分子或生物標記物具有高親和力之適體。
SELEX一般地包括製備核酸之候選混合物、使該候選混合物結合於所需靶標分子以形成親和力複合物、分離該等親和力複合物與未結合候選核酸、分離及離析核酸與該親和力複合物、純化核酸、及鑒別特定適體序列。該方法可包括多輪以進一步細化所選適體之親和力。該方法可在該方法之一或多個點處包括擴增步驟。參見例如標題為「Nucleic Acid Ligands」之美國專利第5,475,096號。該SELEX方法可用於產生共價結合其靶標之適體以及非共價結合其靶標之適體。參見例如標題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX」之美國專利第5,705,337號。
該SELEX方法可用於鑒別含有經修飾核苷酸之高親和力適體，該等核苷酸對適體賦予改良特徵，諸如改良之活體內穩定性或改良之遞送特徵。該等修飾之實例包括在核糖及/或磷酸酯及/或鹼基位置處之化學取代。SELEX方法鑒別之含有經修飾核苷酸之適體描述於標題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」之美國專利第5,660,985號中，該專利描述含有在嘧啶之5'及2'位置處以化學方式修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見上文)描述含有用2'-胺基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)及/或2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之一或多種核苷酸的高度特異性適體。亦參見標題為「SELEX and PHOTOSELEX」之美國專利申請公開案第20090098549號，該公開案描述具有擴展之物理及化學特性的核酸文庫及其在SELEX及光交聯SELEX中之用途。
SELEX亦可用於鑒別具有所需解離速率特徵之適體。參見標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國專利第7,947,447號，該專利以引用之方式整體併入本文中，其描述用於產生可結合於靶標分子之適體的改良SELEX方法。描述了用於產生具有較慢之自其相應靶標分子解離之速率的適體及光適體之方法。該等方法涉及使候選混合物與靶標分子接觸、允許發生核酸-靶標複合物之形成、及執行緩慢解離速率富集方法，其中具有快速解離速率之核酸-靶標複合物解離且不會再形 成，而具有緩慢解離速率之複合物保持完整。另外，該等方法包括在候選核酸混合物之產生中使用經修飾核苷酸以產生具有改良解離速率效能之適體(參見標題為「SELEX and PhotoSELEX」之美國專利第8,409,795號)。(亦參見美國專利第7,855,054號及美國專利公開案第20070166740號)。此等申請案各自以引用之方式整體併入本文中。
「靶標」或「靶標分子」或「靶標」在本文中係指核酸可以所需方式起作用之任何化合物。靶標分子可為而不限於蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質、多醣、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質、受質、代謝物、過渡狀態類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、養分、生長因子、細胞、組織、前述任一者之任何部分或片段等。事實上任何化學或生物效應子均可為合適靶標。具有任何大小之分子均可充當靶標。靶標亦可以某些方式經修飾以增強靶標與核酸之間之相互作用的可能性或強度。靶標亦可包括特定化合物或分子之任何微小變化，諸如在蛋白之情況下，胺基酸序列之微小變化、二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分結合，其不會實質上改變分子身份。「靶標分子」或「靶標」為一種類型或種類之能夠結合於適體之分子或多分子結構的複本之集合。「靶標分子」或「靶標」係指分子之超過一種該集合。其中靶標為肽之SELEX方法的實施例描述於標題為「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」之美國專利第6,376,190號中。在一些實施例中，靶標為蛋白。
如本文所用，「競爭分子」或「競爭劑」可互換使用以指可與非靶標分子形成非特異性複合物之任何分子。在此背景中，非靶標分子包 括游離適體，其中例如競爭劑可用於抑制該適體非特異性結合(再結合)於另一非靶標分子。「競爭分子」或「競爭劑」為一種類型或種類之分子的複本之集合。「競爭分子」或「競爭劑」係指分子之超過一種該集合。競爭分子包括但不限於寡核苷酸、聚陰離子(例如肝素、鯡精DNA、鮭魚精DNA、tRNA、硫酸右旋糖苷、聚右旋糖苷、無鹼基磷酸二酯聚合物、dNTP及焦磷酸鹽)。在多個實施例中，可使用一或多種競爭劑之組合。
如本文所用，「非特異性複合物」係指除適體外之兩種或兩種以上分子與其靶標分子之間的非共價締合。非特異性複合物表示分子類別之間的相互作用。非特異性複合物包括在適體與非靶標分子、競爭劑與非靶標分子、競爭劑與靶標分子、及靶標分子與非靶標分子之間形成之複合物。
如本文所用，術語「緩慢解離速率富集方法」係指一種改變候選混合物之某些組分的相對濃度之方法，以致具有緩慢解離速率之適體親和力複合物的相對濃度相對於具有較快、非所需解離速率之適體親和力複合物的濃度有所增加。在一實施例中，該緩慢解離速率富集方法為基於溶液之緩慢解離速率富集方法。在此實施例中，基於溶液之緩慢解離速率富集方法在溶液中發生，以致混合物中形成適體親和力複合物之靶標及核酸均未在該緩慢解離速率富集方法期間固定於固體支撐物上。在多個實施例中，該緩慢解離速率富集方法可包括一或多個步驟，包括添加競爭分子及用競爭分子培育、稀釋混合物或此等步驟之組合(例如，在競爭分子存在下稀釋混合物)。因為緩慢解離速率富集方法之效應一般地取決於不同適體親和力複合物(亦即，在靶標分子與候選混合物中之不同核酸之間形成的適體 親和力複合物)之不同解離速率，故選擇該緩慢解離速率富集方法之持續時間以便保持高比例的具有緩慢解離速率之適體親和力複合物，同時實質上降低具有快速解離速率之適體親和力複合物的數目。該緩慢解離速率富集方法可在SELEX方法期間以一或多個循環使用。當稀釋及添加競爭劑組合使用時，其可同時或以任何次序依序執行。當混合物中之總靶標(蛋白)濃度低時，可使用該緩慢解離速率富集方法。在一實施例中，當該緩慢解離速率富集方法包括稀釋時，該混合物可儘量可行地加以稀釋，注意適體經保持之核酸回收用於SELEX方法中之後續輪。在一實施例中，該緩慢解離速率富集方法包括使用競爭劑以及稀釋，從而允許該混合物以低於不使用競爭劑時可能所必需之程度加以稀釋。
在一實施例中，該緩慢解離速率富集方法包括添加競爭劑，且該競爭劑為聚陰離子(例如肝素或硫酸右旋糖苷(右旋糖苷))。肝素或右旋糖苷已在先前SELEX選擇中用於鑒別特定適體。然而，在該等方法中，肝素或右旋糖苷在其中靶標及適體結合形成複合物之平衡步驟期間存在。在該等方法中，因為肝素或右旋糖苷之濃度增加，故高親和力靶標/適體複合物與低親和力靶標/適體複合物之比率增加。然而，高濃度之肝素或右旋糖苷可歸因於在核酸與競爭劑之間競爭靶標結合而降低平衡時高親和力靶標/適體複合物之數目。相比之下，目前描述之方法在已允許靶標/適體複合物形成之後添加競爭劑且因此不會影響所形成之複合物的數目。在平衡結合已在靶標與適體之間發生之後添加競爭劑會產生非平衡狀態，其及時發展為具有較少靶標/適體複合物之新平衡。在新平衡已實現之前捕捉靶標/適體複 合物會富集用於緩慢解離速率適體之樣品，因為快速解離速率複合物將首先解離。
在另一實施例中，聚陰離子競爭劑(例如硫酸右旋糖苷或另一聚陰離子材料)用於該緩慢解離速率富集方法以促進鑒別抵抗聚陰離子存在之適體。在此背景中，「聚陰離子抵抗性適體」為能夠形成相比包括非聚陰離子抵抗性適體之適體/靶標複合物不太可能在亦含有該聚陰離子抵抗性材料之溶液中解離之適體/靶標複合物之適體。以此方式，聚陰離子抵抗性適體可用於執行分析方法以偵測樣品中靶標之存在或量或濃度，其中該偵測方法包括使用適體所抵抗之聚陰離子材料(例如硫酸右旋糖苷)。
因此，在一實施例中，提供一種用於產生聚陰離子抵抗性適體之方法。在此實施例中，在核酸之候選混合物與靶標接觸之後。允許靶標與候選混合物中之核酸到達平衡。引入聚陰離子競爭劑且使其在溶液中培育一段時期以確保該候選混合物中之大多數快速解離速率適體自靶標分子解離。又，候選混合物中可在聚陰離子競爭劑存在下解離之適體將自靶標分子釋放。該混合經分配以離析已保持與靶標分子締合之高親和力、緩慢解離速率適體且自溶液中移除任何未複合材料。該適體可接著自靶標分子釋放且經離析。經離析適體亦可經擴增且應用額外數輪選擇以增加所選適體之總體效能。若緩慢解離速率適體之選擇非特定應用所需，則此方法亦可與最少培育時間一起使用。
因此，在一實施例中，提供經修改SELEX方法以鑒別或產生具有緩慢(長)解離速率之適體，其中靶標分子及候選混合物接觸且一起培育一段時期，該時期足以在靶標分子與候選混合物中所含的核酸之間發生平衡 結合。在平衡結合之後，過量競爭分子(例如，聚陰離子競爭劑)添加至混合物中且該混合物與過量競爭分子一起培育一段預定時期。大部分具有低於此預定培育時期之解離速率的適體將在該預定培育時期期間自靶標解離。此等「快速」解離速率適體與靶標之再締合由於過量可非特異性結合於靶標且佔據靶標結合位點之競爭分子而減至最少。大部分具有較長解離速率之適體將在該預定培育時期期間保持複合至靶標。在培育時期結束時，自該混合物之剩餘部分分配核酸-靶標複合物會允許分離緩慢解離速率適體之群體與具有快速解離速率之彼等。解離步驟可用於解離緩慢解離速率適體與其靶標且允許對靶標分子具有高親和力及特異性之緩慢解離速率適體(個別適體或一組緩慢解離速率適體)之離析、鑒別、測序、合成及擴增。如同習知SELEX，自一輪經修改SELEX方法鑒別之適體序列可用於合成新的候選混合物，以致接觸、平衡結合、添加競爭分子、與競爭分子一起培育及分配緩慢解離速率適體之步驟必要時可重複多次。
在競爭劑之添加之前允許候選混合物與靶標平衡結合、隨後添加過量競爭劑及與該競爭劑一起培育一段預定時期之組合允許選擇具有比先前所實現之彼等大得多之解離速率的適體群體。
為了實現平衡結合，該候選混合物可與靶標一起培育至少約5分鐘、或至少約15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時或約6小時。
必要時可選擇競爭分子與候選混合物及靶標分子之混合物的預定培育時期，應考慮諸如靶標性質及已知適體對靶標之已知解離速率(若有的話)之因素。預定培育時期可選自：至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少 約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時。
在其他實施例中，稀釋用作解離速率增強方法且經稀釋候選混合物、靶標分子/適體複合物之培育可進行一段預定時期，該時期可選自：至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時。
本發明之實施例涉及緩慢解離速率適體之鑒別、產生、合成及用途。此等為如下適體，其自非共價適體-靶標複合物解離之速率(t1/2)高於藉由習知SELEX通常獲得之適體的解離速率。關於含有適體及靶標之非共價複合物之混合物，t1/2表示一半適體自適體-靶標複合物解離所用之時間。根據本發明之緩慢解離速率適體之t1/2選自以下一者：大於或等於約30分鐘；在約30分鐘與約240分鐘之間；在約30分鐘至約60分鐘之間；在約60分鐘至約90分鐘之間；在約90分鐘至約120分鐘之間；在約120分鐘至約150分鐘之間；在約150分鐘至約180分鐘之間；在約180分鐘至約210分鐘之間；在約210分鐘至約240分鐘之間。
藉由SELEX程序鑒別之適體的表徵性特徵為其對其靶標之高親和力。適體對其靶標之解離常數(kd)將選自以下一者：小於約1μM、小於約100nM、小於約10nM、小於約1nM、小於約100pM、小於約10pM、小於約1pM。
寡核苷酸文庫
在一些實施例中，提供包含無規序列之寡核苷酸的文庫。該等文庫可在一些實施例中適用於執行SELEX。在一些實施例中，寡核苷酸文庫之各寡核苷酸包含多個隨機化位置，諸如至少20、25、30、35、40、45、或50、或20-100、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40或30-40個隨機化位置。在一些實施例中，寡核苷酸文庫之各寡核苷酸包含側接該等隨機化位置之固定序列。該等固定側接序列可彼此相同或不同(亦即，5’側接序列及3’側接序列可相同或不同)，且在一些實施例中可對於該文庫之所有成員均相同(亦即，該文庫之所有成員可具有相同5’側接序列，及/或該文庫之所有成員可具有相同3’側接序列)。
在一些實施例中，該等隨機化位置可由四種或四種以上不同核苷酸鹼基構成，該等核苷酸鹼基中之一或多者經修飾。在一些實施例中，一種類型之核苷酸鹼基均經修飾或未經修飾(例如，該隨機化區域中之所有胞嘧啶核苷或經修飾，或均未經修飾)。在一些實施例中，該隨機化區域中之一種類型之核苷酸鹼基以經修飾及未經修飾形式存在。在一些該等實施例中，該等隨機化位置由兩種經修飾及兩種未經修飾核苷酸鹼基構成。在一些該等實施例中，該等隨機化位置由腺嘌呤、鳥嘌呤、C5修飾胞嘧啶核苷及C5修飾尿嘧啶核苷構成。非限制性例示性C5修飾胞嘧啶核苷及C5修飾尿嘧啶核苷顯示於圖19或21中。寡核苷酸文庫及其製備方法進一步描述於例如本文實例中。
例示性適體
在一些實施例中，提供結合靶標分子之適體。在一些實施例中，靶標分子為靶標蛋白。在一些實施例中，提供結合PCSK9之適體。在一些 實施例中，結合PCSK9之適體抑制PCSK9結合於LDL-R。在一些該等實施例中，該適體包含序列5’-yGpppG-3’，其中各y為TyrdU且各p為NapdC。在一些實施例中，該適體進一步包含序列5’-yEAyGAnpAp-3’，其中E選自y、A及G；且n為0或1。在一些實施例中，n為0。在一些實施例中，序列5’-yEAyGAnpAp-3’位於序列5’-yGpppG-3’之5’。在一些實施例中，E為y。
在一些實施例中，提供結合PCSK9之適體，其中該適體包含序列5’-FnpppAAGRJrpRppWm-3’(SEQ ID NO：81)，其中F選自r及G；各R獨立地選自G及A；J選自r及A；W選自r、G及A；n為0或1；m為0或1；r為PpdC；且p為NapdU。在一些實施例中，m為1。在一些實施例中，F為r。在一些實施例中，J為r。在一些實施例中，W為G。
在一些實施例中，提供結合PCSK9之適體，其中該適體包含序列5’-TTppGGpp-3’，其中各p為NapdC。
在一些實施例中，結合PCSK9之適體為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
在一些實施例中，該適體抑制PCSK9結合於LDL-R。在一些實施例中，該適體抑制PCSK9結合於LDL-R，其中IC50小於30nM、小於20nM或小於15nM。
在一些實施例中，提供一種降低個體中之膽固醇的方法，該方法包含向有需要之個體投與結合PCSK9之適體。在一些實施例中，結合PCSK9之適體為本文所提供之適體。在一些實施例中，該膽固醇為低密度脂蛋白(LDL)膽固醇(LDL-C)。在一些實施例中，該個體具有雜合家族性高膽固醇血症或臨床動脈粥樣硬化性心血管疾病(CVD)。
鹽
製備、純化及/或處理該化合物之相應鹽(例如，醫藥學上可接受之鹽)可為便利的或需要的。醫藥學上可接受之鹽之實例論述於Berge等人(1977)「Pharmaceutically Acceptable Salts」J.Pharm.Sci.66：1-19中。
例如，若該化合物為陰離子性的，或具有可為陰離子性之官能基(例如，-COOH可為-COO-)，則可與合適陽離子形成鹽。合適無機陽離子之實例包括但不限於鹼金屬離子(諸如Na+及K+)、鹼土金屬陽離子(諸如Ca2+及Mg2+)及其他陽離子(諸如Al+3)。合適有機陽離子之實例包括但不限於銨離子(亦即，NH4 +)及經取代銨離子(例如NH3RX+、NH2RX 2 +、NHRX 3 +、NRX 4 +)。一些合適經取代銨離子之實例為自以下衍生之彼等：乙胺、二乙胺、二環己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲胺、苯基苯甲胺、膽鹼、甲葡胺及緩血酸胺，以及胺基酸(諸如離胺酸及精胺酸)。常見四級銨離子之實例為N(CH3)4 +。
若該化合物為陽離子性的，或具有可為陽離子性之官能基(例如，-NH2可為-NH3 +)，則可與合適陰離子形成鹽。合適無機陰離子之實例包括但不限於自以下無機酸衍生之彼等：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸及亞磷酸。
合適有機陰離子之實例包括但不限於自以下有機酸衍生之彼等：2-乙醯氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡糖庚酸、葡糖酸、麩胺酸、乙醇酸、羥基順丁烯二酸、羥基萘甲酸、羥基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、順丁烯二酸、蘋果酸、甲烷磺酸、黏液酸、油酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、丁二酸、磺胺酸、酒石酸、苯磺酸及戊酸。合適聚合物有機陰離子之實例包括但不限於自以下聚合物酸衍生之彼等：鞣酸、羧基甲基纖維素。
除非另外規定，否則對特定化合物之提及亦包括其鹽形式。
某些非限制性例示性實施例
實施例1. 一種包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶之適體，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
實施例2. 實施例1之適體，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。
實施例3. 實施例1之適體，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
實施例4. 實施例2或實施例3之適體，其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例5. 實施例2至4中任一者之適體，其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例6. 實施例2至5中任一者之適體，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
實施例7. 實施例2至6中任一者之適體，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例8. 實施例1之適體，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU及ThrdU。
實施例9. 實施例1之適體，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU及ThrdU。
實施例10. 實施例8或實施例9之適體，其中該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。
實施例11. 實施例1至10中任一者之適體，其中該適體結合選自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28及PPIB之靶標蛋白。
實施例12. 實施例1至11中任一者之適體，其中該適體在該適體之5’末端處包含至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長、或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長之區域，其中在該適體之5’末端處的該區域缺乏5位修飾嘧啶。
實施例13. 實施例1至12中任一者之適體，其中該適體在該適體之3’末端處包含至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長、或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長之區域，其中在該適體之3’末端處的該區域缺乏5位修飾嘧啶。
實施例14. 實施例1至13中任一者之適體，其中該適體為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
實施例15. 一種包含複數種聚核苷酸之組合物，其中各聚核苷酸包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
實施例16. 實施例15之組合物，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之5’末端處包含固定區域。
實施例17. 實施例16之組合物，其中在各聚核苷酸之5’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
實施例18. 實施例15至17中任一者之組合物，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之3’末端處包含固定區域。
實施例19. 實施例18之組合物，其中在該聚核苷酸之3’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
實施例20. 實施例15至19中任一者之組合物，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。
實施例21. 實施例15至19中任一者之組合物，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
實施例22. 實施例20或實施例21之組合物，其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例23. 實施例20至22中任一者之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例24. 實施例20至23中任一者之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
實施例25. 實施例20至24中任一者之組合物，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例26. 實施例15之組合物，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例27. 實施例15之組合物，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU及ThrdU。
實施例28. 實施例26或實施例27之組合物，其中該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。
實施例29. 實施例15至28中任一者之組合物，其中各聚核苷酸包含無規區域。
實施例30. 實施例29之組合物，其中該無規區域為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或20至40個、或30至100個、或30至90個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或30至40個核苷酸長。
實施例31. 實施例15至29中任一者之組合物，其中各聚核苷酸為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
實施例32. 一種包含第一適體、第二適體及靶標之組合物，其中該第一適體包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶；其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶；其中該第一適體、第二適體及該靶標能夠形成三聚體複合物；及其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
實施例33. 實施例32之組合物，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。
實施例34. 實施例32之組合物，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
實施例35. 實施例33或實施例34之組合物，其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例36. 實施例33至35中任一者之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例37. 實施例33至36中任一者之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
實施例38. 實施例33至37中任一者之組合物，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例39. 實施例32之組合物，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例40. 實施例32之組合物，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例41. 實施例39或實施例40之組合物，其中該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。
實施例42. 實施例32至41中任一者之組合物，其中該第三5位修飾嘧啶選自5位修飾胞嘧啶核苷及5位修飾嘧啶。
實施例43. 實施例42之組合物，其中該第三5位修飾嘧啶選自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC、TyrdC、BndU、NapdU、PEdU、 IbdU、FBndU、2NapdU、NEdU、MBndU、BFdU、BTdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例44. 實施例32至43中任一者之組合物，其中該靶標選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
實施例45. 一種方法，其包含：(a)使能夠結合於靶標分子之適體與樣品接觸；(b)用該樣品培育該適體以允許適體-靶標複合物形成；(c)在該樣品中富集該適體-靶標複合物及(c)偵測該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之存在，其中該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之偵測指示該靶標分子存在於該樣品中，且其中該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之偵測的缺乏指示該靶標分子不存在於該樣品中；其中該適體為實施例1至14中任一者之適體。
實施例46. 實施例45之方法，其中該方法包含至少一個選自以下之額外步驟：添加競爭分子至該樣品中；在固體支撐物上捕捉該適體-靶標複合物；及添加競爭分子且稀釋該樣品；其中該至少一個額外步驟發生於步驟(a)或步驟(b)之後。
實施例47. 實施例46之方法，其中該競爭分子選自聚陰離子競爭劑。
實施例48. 實施例47之方法，其中該聚陰離子競爭劑選自寡核苷酸、聚右旋糖苷、DNA、肝素及dNTP。
實施例49. 實施例48之方法，其中聚右旋糖苷為硫酸右旋糖苷；且DNA為鯡精DNA或鮭魚精DNA。
實施例50. 實施例45至49中任一者之方法，其中該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
實施例51. 實施例45至50中任一者之方法，其中該樣品選自全血、白血球、外周血單核細胞、血漿、血清、唾液、氣息、尿液、***、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽吸液、支氣管抽吸液、滑液、關節抽吸液、細胞、細胞提取物、糞便、組織、組織生檢及腦脊髓液。
實施例52. 一種用於偵測樣品中之靶標的方法，其包含a)使該樣品與第一適體接觸以形成混合物，其中該第一適體能夠結合於該靶標以形成第一複合物；b)在允許該第一複合物形成之條件下培育該混合物；c)使該混合物與第二適體接觸，其中該第二適體能夠結合該第一複合物以形成第二複合物；d)在允許該第二複合物形成之條件下培育該混合物；e)偵測該混合物中該第一適體、該第二適體、該靶標、該第一複合物或該第二複合物之存在或不存在，其中該第一適體、該第二適體、該靶標、該第一複合物或該第二複合物之存在指示該靶標存在於該樣品中；其中該第一適體包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶；其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶；其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
實施例53. 實施例52之方法，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。
實施例54. 實施例53之方法，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
實施例55. 實施例53或實施例54之方法，其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例56. 實施例53至55中任一者之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例57. 實施例53至56中任一者之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
實施例58. 實施例53至57中任一者之方法，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例59. 實施例52之方法，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例60. 實施例52之方法，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例61. 實施例59或實施例60之方法，其中該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。
實施例62. 實施例52至61中任一者之方法，其中該第三5位修飾嘧啶選自5位修飾胞嘧啶核苷及5位修飾嘧啶。
實施例63. 實施例62之方法，其中該第三5位修飾嘧啶選自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC、TyrdC、BNdU、NapdU、PedU、IbdU、FbndU、2NapdU、NedU、MbndU、BfdU、BtdU、PpdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例64. 實施例52至63中任一者之方法，其中該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
實施例65. 實施例52至64中任一者之方法，其中該第一適體、第二適體及該靶標能夠形成三聚體複合物。
實施例66. 一種用於鑒別一或多種能夠結合於靶標分子之適體之方法，該方法包含：(a)使適體之文庫與該靶標分子接觸以形成混合物，且允許形成適體-靶標複合物，其中當適體對該靶標分子具有親和力時，該適體-靶標複合物形成；(b)自該混合物之剩餘部分分配該適體-靶標複合物(或富集該適體-靶標複合物)；(c)解離該適體-靶標複合物；及(d)鑒別一或多種能夠結合於靶標分子之適體；其中該適體之文庫包含複數種聚核苷酸，其中各聚核苷酸包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
實施例67. 實施例66之方法，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之5’末端處包含固定區域。
實施例68. 實施例67之方法，其中在各聚核苷酸之5’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
實施例69.實施例66至68中任一者之方法，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之3’末端處包含固定區域。
實施例70. 實施例69之方法，其中在該聚核苷酸之3’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
實施例71. 實施例66至70中任一者之方法，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷。
實施例72. 實施例66至71中任一者之方法，其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
實施例73. 實施例71或實施例72之方法，其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例74. 實施例71至73中任一者之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
實施例75. 實施例71至74中任一者之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
實施例76. 實施例71至75中任一者之方法，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例77. 實施例66之方法，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為NapdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU及ThrdU。
實施例78. 實施例66之方法，其中該至少一種第一5位修飾嘧啶為PPdC且該至少一種第二5位修飾嘧啶選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
實施例79. 實施例77或實施例78之方法，其中該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。
實施例80. 實施例66至79中任一者之方法，其中各聚核苷酸包含無規區域。
實施例81. 實施例80之方法，其中該無規區域為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或20至40個、或30至100個、或30至90個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或30至40個核苷酸長。
實施例82. 實施例66至81中任一者之方法，其中各聚核苷酸為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
實施例83. 實施例66至82中任一者之方法，其中各聚核苷酸為結合靶標之適體，且其中該文庫包含至少1000種適體，其中各適體包含不同核苷酸序列。
實施例84. 實施例66至83中任一者之方法，其中步驟(a)、(b)及/或(c)重複至少一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
實施例85. 實施例66至84中任一者之方法，其中該一或多種能夠結合於該靶標分子之適體經擴增。
實施例86. 實施例66至85中任一者之方法，其中該混合物包含聚陰離子競爭分子。
實施例87. 實施例86之方法，其中該聚陰離子競爭劑選自寡核苷酸、聚右旋糖苷、DNA、肝素及dNTP。
實施例88. 實施例87之方法，其中聚右旋糖苷為硫酸右旋糖苷；且DNA為鯡精DNA或鮭魚精DNA。
實施例89. 實施例66至88中任一者之方法，其中該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
實施例90. 實施例1至14中任一者之適體，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。
實施例91. 實施例15至44中任一者之組合物，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。
實施例92. 實施例45至89中任一者之方法，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。
實施例93. 實施例1至14及90中任一者之適體，其中與具有相同長度及包含替代該等第一5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶或替代該第二5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶的核鹼基序列之適體相比，該適體具有改良之核酸酶穩定性。
實施例94. 實施例1至14、90及93中任一者之適體，其中與具有相同長度及包含替代該等第一5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶或替代該第二5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶的核鹼基序列之適體相比，該適體在人類血清中具有較長半衰期。
實例
提供以下實例以便更充分地說明本發明之一些實施例。然而，其決不應被視為限制本發明之寬範圍。熟習此項技術者可容易地採用本發明之潛在原理來設計多種化合物，而不偏離本發明之精神。
實例1：包含兩種經修飾鹼基之適體
為了用兩種經修飾鹼基比較SELEX之相對效率，針對總計18種起始文庫分析以未經修飾dT作為對照物在dU上之五種單一修飾(Nap-dU、PP-dU、MOE-dU、Tyr-dU及Thr-dU)、及以未經修飾dC作為對照物在dC上之修飾(Nap-dC及PP-dC)的組合(圖1)。所測試之修飾的類型包括類似於胺基酸上之疏水性側鏈的疏水性芳族側鏈。亦測試dU上之親水性側鏈(MOE-dU及Thr-dU)。該18種文庫各自含有30種隨機化核苷酸，從而允許
Figure 106121878-A0202-12-0057-176
1015種不同序列。該等文庫使用天然及/或經修飾核苷酸三磷酸酯使用外切KOD DNA聚合酶酶促合成(資料未示)。
使用30核苷酸(30N)隨機化文庫來替代具有單一經修飾dU之先前40N隨機化文庫。不意欲受任何特定理論束縛，假設增加經修飾鹼基之密度將允許較短高親和力適體。此外，較短寡核苷酸文庫生成較高產率。各核苷酸之比率針對dA/dC/dG/dT為1：1：1：1(各25%)。在各情形中，該無規區域側接用於雜合PCR擴增引子(表2)之固定序列，在5’末端處及在3’ 末端處具有額外間隔區。主合成模板用於產生所有dU及或dC位置均一地在替換引子延伸反應中經修飾之經修飾文庫。
總計18種酶促合成文庫，其包含單一經修飾dU(Nap-dU、PP-dU、MOE-dU、Tyr-dU及/Thr-dU)，其中未經修飾dT作為對照物；單一經修飾dC(Nap-dC及PP-dC)，其中未經修飾dC作為對照物；及兩種經修飾鹼基之組合：Nap-dC或PP-dC與所有可能的經修飾dU(Nap-dU、PP-dU、MOE-dU、Tyr-dU及Thr-dU)。如下在溶液中使用反義模板、經放射性標記之5’引子與天然或經修飾核苷酸三磷酸酯及KOD聚合酶(外切)進行定性引子延伸反應(一式三份)。在60μL引子延伸反應中，20pmol生物素化反義文庫與40pmol5’冷引子(2X)及痕量32P標記之5’引子、1X SQ20緩衝液(120mM Tris-HCl,pH 7.8；10mM KCl；6mM(NH4)2SO4；7mM MgSO4、0.1% Triton X-100及0.1mg/mL BSA)中之0.5mM天然或經修飾dNTP及0.25U/mL KOD聚合酶(外切)混合。該混合物經熱冷卻，隨後添加DNA聚合酶且該反應在68℃下進行2h，接著在10℃下冷卻。來自各文庫反應之部分連同遊離經標記引子在10% TBU脲凝膠上跑膠。小的等分實驗在變性凝膠上跑膠，該等變性凝膠暴露至磷屏且用Fuji磷相儀成像，使用ImageGauge 4.0軟體對色帶定量且結果以Graph pad Prism軟體6.05繪製曲線。關於製備初始文庫，使用在PierceTM高容量抗生蛋白鏈菌素瓊脂糖珠粒(Life Technologies)上捕捉之主生物素化反義無規文庫進行大規模引子延伸反應。與100%未經修飾文庫DNA(dC/dT)對照物相比，關於某些兩種經修飾核苷之組合獲得較低文庫產率，例如關於Nap-dC/Nap-dU為28±1.3%，關於Nap-dC/MOE-dU為40±5.2%，且關於PP-dC/Nap-dU為43±2.7%。自測序結果計算各核苷酸之頻 率，該等結果獲自初始文庫及用於產生各單一及兩種鹼基經修飾文庫之主反義無規模板。主無規反義模板(30N)在1μM規模下用1：1：1：1比率之dA：dG：dC：dT(TriLink Biotechnologies)以化學方式合成。初始無規單一鹼基及兩種鹼基經修飾文庫在大規模反應中酶促合成且用於選擇實驗中。此等文庫連同富集池一起測序且關於30N無規區域中之所有四種鹼基以總計100%對核苷酸頻率繪製曲線。與起始合成性天然DNA模板文庫及酶促合成之未經修飾DNA對照初始文庫相比，當使用深度測序測定文庫之鹼基組成時在核苷酸頻率方面未觀察到顯著偏差(資料未示)。
使用該等文庫來選擇結合PCSK9之適體。該等選擇實質上如先前使用硫酸右旋糖苷作為聚陰離子競爭劑所報告般進行，持續總計六輪，在各連續輪之選擇期間應用遞增靶標稀釋。參見表1(R1=第1輪，R2=第2輪等)。選擇藉由混合經修飾無規文庫(或對照未經修飾)(
Figure 106121878-A0202-12-0059-178
1000pmol)及人類重組His標記之靶標蛋白PCSK9來開始，該靶標蛋白在100μL體積中以0.5μM濃度存在。所選擇之複合物分配於磁性His標籤捕捉Dynabeads®上，洗滌未結合序列，溶離所選擇之適體且使用所有天然核苷酸及3’生物素-引子進行PCR擴增。在3’末端處生物素化之天然雙鏈DNA經捕捉於Dynabeads® MyOneTM抗生蛋白鏈菌素C1珠粒上，藉由鹼性變性消除有義鏈且在引子延伸反應中用經修飾dC及或dU置換以再生富集池且用經稀釋蛋白重複選擇循環。用於下一輪SELEX之蛋白濃度基於自關於各樣品之臨界循環時間(Ct)值計算的信號：背景比率來測定。
Figure 106121878-A0202-12-0059-4
Figure 106121878-A0202-12-0060-5
用於擴增之5’引子包含(AT4)-尾且3’引子包含(A-生物素)2-T8-尾(SEQ ID NO：82)，其避免了在合成經修飾文庫時添加經修飾dC或dU。
Figure 106121878-A0202-12-0060-6
在六輪選擇之後，使用Ion Torrent PGM儀器對含有天然核苷酸之適體進行深度測序。使用定製軟體使用局部分批比對執行序列分析。來自所有富集池之序列分析之資料證明瞭兩種經修飾文庫組合導致與單一經修飾文庫相比富集序列之較高多樣性(資料未示)。為了測試適體之結合親和力，選擇序列之廣泛集合，其不僅表示高複本獨特序列，而且表示來自不同家族之低複本序列(資料未示)。所有適體均藉由標準固相亞磷醯胺化學使 用經修飾/未經修飾亞磷醯胺試劑以化學方式合成。所有適體最初在溶液中用放射性標記之過濾器結合分析篩選為經截短40聚體，其含有30核苷酸無規區域及來自5’及3’末端的用於其PCSK9結合親和力之固定引子區域之額外5個核苷酸。該等經截短適體(40聚體)包含來自固定區域之10個核苷酸。未經修飾對照DNA文庫(dC/dT)不會產生任何活性序列(K d <32nM)，預期對此文庫之池親和力為單調的(資料未示)且另外深度測序資料不會產生任何經富集多複本序列(資料未示)。在dC或dU上具有Nap(萘基)修飾之單一經修飾文庫產生對靶標具有親和力之適體，然而，對靶標具有最大親和力之適體由具有Tyr(酪胺醯基部分)修飾之dU的Nap(萘基部分)或PP(苯甲基部分)修飾之dC獲得(圖2)。用dT置換Tyr-dU會取消結合於靶標，其指示酪胺醯基部分對與PCSK9之靶標表面之結合相互作用的重要性(資料未示)。親和力資料證明瞭兩種經修飾核苷酸之適體一般具有大於單一經修飾核苷酸之適體的親和力，且亦提供了當與單一經修飾核苷酸之適體相比時比結合於PCSK9多之適體數目(圖3)。此外，高複本單一經修飾核苷酸之適體具有在0.1-100nM之間之平均親和力，而高複本兩種經修飾核苷酸之適體具有
Figure 106121878-A0202-12-0061-179
0.1nM之平均親和力。
包含用於PCSK9之單一經修飾適體(40聚體)及雙重修飾適體(40聚體)之資料概述在下表3中示出。
Figure 106121878-A0202-12-0061-7
Figure 106121878-A0202-12-0062-8
基於表3中之資訊，不顯示結合之所有所分析的單一經修飾適體之百分比為62%。不結合係定義為具有320nM或更大之Kd的適體。具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0062-180
10nM之所有單一經修飾適體之百分比低於21%，且所有單一經修飾適體之平均Kd為5,2nM。相比之下，不顯示結合之所有所分析的兩種經修飾(雙重修飾)之適體的百分比為43%。此外，具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0062-181
10nM之所有兩種經修飾之適體的百分比為47%，且所有兩種經修飾之適體之平均Kd為0.12nM。
實例2：雙重修飾適體之截短
研究進一步截短對高親和力(Kd<1nM)適體結合之影響。適體經截短至30聚體，其為25%長度減少。PP-dC/Tyr-dU組合具有最高數目之可能經截短至30聚體的適體，同時仍保持高親和力(圖4A)。單一鹼基經修飾適體顯示21.5%之可截短性(藍色條，3/14)，具有經修飾dU之兩種鹼基經修飾Nap-dC適體顯示約23%之可截短性(紅色條，11/48)，而具有其他經修飾dU之兩種鹼基經修飾PP-dC顯示60%之增強可截短性(綠色條，27/45)。 關於PP-dC與PP-dU、Nap-dU或Tyr-dU之兩種鹼基經修飾組合，可能經截短至30聚體之40聚體的百分率及數目與其他文庫相比亦較高(圖4B)。測試較少之來自單一鹼基經修飾文庫之適體，因為在該三種文庫中僅有14種適體具有
Figure 106121878-A0202-12-0063-182
1nM之親和力(40聚體，關於單一經修飾在圖4B中之灰色區域中)。相比之下，來自具有高親和力之兩種鹼基經修飾文庫之適體的數目為93(40聚體，關於兩種經修飾在圖4B之灰色區域中)，關於具有經修飾dU之Nap-dC為48且關於具有經修飾dU之PP-dC為45。各文庫上之黑色水平線指示關於彼文庫中之所有適體的中值。不意欲受任何特定理論束縛，有可能的是，PP經修飾鹼基中之延長碳鏈(與其他修飾相比)幫助在靶標表面上到達難以接近之抗原決定基且無需用於結構折疊及有效蛋白結合相互作用之固定引子區域。
亦評估PCSK9適體對多種其他前蛋白轉化酶(PC)之特異性。選擇來自各文庫之三種最高親和力適體(n=33，40聚體；均未來自未經修飾DNA對照文庫，僅兩種適體來自dC/Tyr-dU文庫且一種適體來自PP-dC/MOE-dU文庫)且測試其對其他PC之特異性。結果證明瞭該等適體對PCSK9具特異性且在100nM濃度下用其他PC(圖5)未觀察到可偵測結合。
針對齧齒動物(小鼠及大鼠)及恆河猴PCSK9測試具有
Figure 106121878-A0202-12-0063-183
1nM之Kd值的經截短適體(n=41，30聚體)之交叉物種反應性(參見表4)。來自多種物種之PCSK9之間的百分比一致性在圖6中之圖頂部示出。小鼠/大鼠PCSK9與猴及人類蛋白約76%一致。大多數適體以相似親和力結合於恆河猴PCSK9(一致性96.4%)，然而，較少來自兩種經修飾之文庫(PP-dC/Nap-dU及PP-dC/Tyr-dU)的適體結合於大鼠及小鼠PCSK9(一致性約76%)。此等結 果證明瞭某些兩種鹼基經修飾文庫(例如PP-dC/Nap-dU及PP-dC/Tyr-dU)產生可以相似親和力結合於齧齒動物及人類/猴PCSK9之適體(圖6)。
Figure 106121878-A0202-12-0064-10
Figure 106121878-A0202-12-0065-11
 「-」指示在該分析中未偵測到結合
實例3：夾心分析中之適體結合
SELEX方法有時產生優先結合於靶標表面上之顯性「適應性」抗原決定基之適體。因此，關於適體夾心對之報告限於文獻中。該選擇方法之修改可用於搜索可結合於靶標蛋白上之不同抗原決定基的適體，諸如多價適體離析(MAI-SELEX)、用於多價適體之基於陣列之發現平台(AD-MAP)夾心選擇，其中一級適體過量使用以阻斷第一抗原決定基，從而嘗試發現結合於非競爭性信號傳導抗原決定基之第二適體。為了證明在選擇可結合於靶標表面上之不同抗原決定基的適體時藉由dC及dU合起來之修飾的多重性所產生之化學多樣性是否擴展，開發基於珠粒之夾心對篩選分析，其中使用Luminex® MagPlex®抗生物素蛋白偶合之磁性珠粒來捕捉生物素化一級適體(圖7A)。具有個別適體之捕捉珠粒混合在一起使用以搜索多重成對組合中之第二結合搭配物(圖7A)。關於此實驗，使用來自單一及兩種鹼基經修飾文庫之具有親和力Kd
Figure 106121878-A0202-12-0065-184
1nM之40聚體適體(n=96,9216對)。簡言之，個別適體(每種樣品0.05pmol)經捕捉於單一MagPlex抗生物素蛋白珠粒類型上且混合在一起(在一實驗中為24個珠粒，每種樣品1000個珠粒)且在室溫下在1850rpm下震盪下捕捉持續20min。珠粒用1X SBT洗滌持續2min，隨後在1XSBT中用0.5mM遊離生物素洗滌持續5min，隨後用1X SBT洗滌3次，每次持續2min。珠粒用遊離抗生蛋白鏈菌素阻斷持續5min且再次用1X SBT洗滌持續2min。具有個體適體之24種不同珠粒類型混合在一起用於篩選用於各捕捉適體之夾心搭配物。偵測或二級 適體在1XSBT中稀釋至500nM，熱冷卻且與PCSK9(最終10nM)混合，在25℃下培育1h。添加1000個捕捉珠粒且進一步在震盪下培育1h。珠粒接著經捕捉於磁體上，用1X SBT洗滌三次每次持續2min且再懸浮於具有0.1% BSA及100uM DxSO4之75μL 1X SBT中。向其中添加75μL抗生蛋白鏈菌素藻紅蛋白(最終5μg/mL)且在25℃下在震盪下培育20min。珠粒最終再次用1X SBT洗滌持續2min且在Luminex 3D xMAP機器上讀數。
該等單一鹼基經修飾文庫產生少量夾心對(三個)，而添加與單一鹼基經修飾適體組合之來自兩種鹼基經修飾文庫之適體會產生較多夾心對(22對)。此外，當兩種搭配物(捕捉及偵測)適體來自兩種鹼基經修飾文庫時，每種文庫中夾心對之數目急劇地增加(45對，圖7C，圖7B)。
來自該夾心篩選之多重抗原決定基結合結果表明，初始無規文庫中化學多樣性之增加會產生可結合於靶標表面上之非競爭性位點的經修飾適體。接著，量測產生最高信號之夾心對(10nM PCSK9濃度；所測試之所有對的0.75%，9216對中之70對；圖7C)的PCSK9濃度依賴性反應，其中結果之子集顯示於圖8A(濃度依賴性信號針對單一鹼基經修飾一級適體dC/PP-dU示出且良好起作用之最佳二級為兩種鹼基經修飾適體Nap-dC/Nap-dU[三角形])及8B(濃度依賴性信號針對兩種鹼基經修飾二級適體Nap-dC/Nap-dU示出且良好起作用之最佳一級為單一鹼基經修飾適體dC/PP-dU[閉合正方形])中。有趣的是，構成單一鹼基經修飾一級(PP-dU，親和力Kd 175pM)及兩種鹼基經修飾二級(Nap-dU/Nap-dC，親和力Kd 531pM)之一個特異性對在一種取向中產生比任何其他對高得多之穩固信號(圖8C)。然而，當此單一鹼基經修飾一級適體轉換為二級適體時，信號喪失， 其指示該等適體之取向對此夾心對至關重要。此適體夾心對亦可量測功能獲得型突變蛋白PCSK9 D374Y之活性(圖8D)，該突變蛋白對LDL-R之親和力高於野生型PCSK9且據報告在具有家族性高膽固醇血症(FH)之重度形式之患者中過度表現。關於突變體PCSK9 D374Y之敏感性及MFU值高於野生型蛋白。
適體夾心對之特異性亦藉由當重組人類PCSK9經摻加至新生小牛血清(NBCS)中時，與人類血漿相比缺乏內源信號來量測(資料未示)。
此夾心對進一步經表徵以開發適體夾心分析來偵測人類臨床樣品中血漿PCSK9之循環濃度。該夾心分析之效能藉由進行研究來評估，諸如敏感性(圖9A及9B及表5及6)、精度(表7及8)、準確性(表9)及血漿稀釋線性量測(圖10)，其均證實穩固分析窗。為了分析該分析之樣品稀釋線性，用含有及/或摻加高濃度PCSK9之樣品執行夾心分析。血漿樣品(n=5)連續地用分析緩衝液稀釋以擬合該分析之動態範圍內的值。
偵測極限(LLoD)在表5中示出，其定義為產生高於空白(稀釋緩衝液)之平均RFU加上3個標準偏差之RFU值的PCSK9濃度(40pg/mL)。定量下限(LLoQ)及定量上限(ULoQ)在表6中示出，其定義為可使用應用於標準曲線之4參數邏輯(4PL)擬合定量之最低及最高PCSK9濃度，導致已知靶標濃度之80-120%恢復。為了確定分析內變異性，在單一板中測試已知濃度之五種血漿樣品16次。參見表7。該分析內之變異係數(CV)介於4.3%至6%範圍內。為了確定分析間變異性，在五個獨立分析中量測已知濃度之五種血漿樣品。參見表8。分析之間的CV介於2.3%至9.8%範圍內。最終，為了確定靶標量測之準確性，使五種血漿樣品摻加不同量之PCSK9且進行 量測。評估在該分析之範圍內摻加的PCSK9水準之恢復。參見表9。樣品之百分比恢復平均為摻加之靶標的83.1%至137.5%。
評估自兩組個體(一個對照組(n=42)及其中個體採用Lipitor®司他汀療法之另一研究組(n=42，藉由自主報告))獲得之血漿樣品的集合以便確定該分析是否可在此兩組之間進行統計學區分，因為已知使用司他汀會增加PCSK9之血漿濃度。使用捕捉或一級SOMA聚體(11723-5)作為單一鹼基經修飾適體(PP-dU/dC)且使用二級或偵測適體(11727-20)作為兩種鹼基經修飾適體(Nap-dC/Nap-dU)來開發該夾心分析。
此等結果指示適體夾心分析可藉由Mann-Whitney分析以0.0044之P值(圖11)統計學區分該兩組且此分析可能用於鑒別可能歸因於其高血漿濃度之PCSK9而受益於抗PCSK9療法之人。
亦使用適體夾心分析來量測來自PCSK9過度表現之HepG2細胞的無細胞上清液中之PCSK9濃度以鑒別過度表現純系且證明該分析之研究效用(圖12)。使用SBI System Biosciences LentiViral系統(LV300A-1)使PCSK9在HepG2細胞中過度表現。該HepG2細胞株以獲自Origene(RC220000L1)之用於野生型人類PCSK9之慢病毒表現純系轉導以產生穩定細胞株。總計96種個別純系針對其分泌PCSK9之能力加以篩選。在培養基中分泌之PCSK9的相對量藉由用於各純系之適體夾心分析來量測且與來自野生型HepG2細胞之表現進行比較。用於產生重組蛋白之細胞的數目使用Cell Titer-Glo®發光細胞活力分析來標準化。純係數目45分泌比野生型HepG2細胞多約100倍之PCSK9。
表5：夾心分析之敏感性(偵測下限)
Figure 106121878-A0202-12-0069-12
Figure 106121878-A0202-12-0069-13
Figure 106121878-A0202-12-0069-14
Figure 106121878-A0202-12-0070-16
Figure 106121878-A0202-12-0070-17
Figure 106121878-A0202-12-0070-18
實例4：藉由雙重修飾適體實現之靶標活性抑制
為了發現阻斷PCSK9結合於LDL-R之PCSK9抑制劑，在基於板之分析中篩選具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0070-185
1nM之41種經截短30聚體適體，其中板塗佈有 LDL-R且使用抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物藉由化學發光試劑偵測生物素化PCSK9之結合(圖13)。重組LDL-R(Acro Biosystems)在4℃下塗佈於ELISA板上(2.5μg/mL)隔夜，且接著在室溫下洗滌各孔且用Super Block(Invitrogen)阻斷持續1h。生物素化PCSK9(Acro Biosystems,Avi標記)及適體混合在一起且在室溫下培育1h，接著添加至ELISA板中且進一步在室溫下在震盪下培育2h。最高PCSK9濃度為0.5nM且適體之最高濃度為100nM，且此等濃度接著針對抑制曲線藉由½ log連續地稀釋。抗生蛋白鏈菌素結合之HRP(Invitrogen,1μg/ml)添加至各孔中且在室溫下在震盪下培育30min，添加Pico敏感性化學發光受質(Invitrogen)，在光度計(Hidex Plate Chameleon)中量測發光，且資料在Graph Pad Prism 6.0軟體中繪製曲線以計算EC50值。PCSK9中和抗體(BPS Bioscience)用作對照物。
來自該抑制分析之結果(適體之測試濃度在100nM下且PCSK9在1nM下)顯示出70%之適體為抑制劑(超過90%抑制)且該等兩種經修飾之適體中的一些潛在地抑制PCSK9與LDL-R之相互作用(資料未示)。進一步針對劑量-反應曲線評估適體以測定其用於抑制之EC50值。結果指示多種抑制劑潛在地以0.1-1nM範圍內之EC50抑制PCSK9與LDL-R之相互作用(圖14)。為了證明兩種經修飾之適體的潛在治療價值，選擇一種物種交叉反應性PCSK9適體(30聚體，Seq ID.11733-91_5(11733-198))來量測靶標與來自多種物種之PCSK9的親和力。此適體分別對人類(野生型)、恆河猴、人類(GOF突變體D374Y)、小鼠及大鼠PCSK9具有14.7、11.3、5.2、77及165pM之親和力(圖15A)。此適體亦以2.1nM之EC50阻斷野生型人類PCSK9 LDL-R相互作用且以3.6nM之EC50阻斷GOF突變體PCSK9 D374Y LDL-R 相互作用(圖15B)。評估與其他PC相比此適體對PCSK9之特異性，且結果顯示出此適體僅結合於PCSK9且不結合於其他PC(資料未示)。
為了測試PCSK9適體阻斷LDLR降解之中和效應，在LDL攝取逆轉分析中測試PP-dC/Nap-dU適體，其中野生型HepG2細胞與重組PCSK9一起培育16h，且接著洗滌細胞且添加螢光標記之LDL持續3h。結果顯示出該適體可以159nM之EC50逆轉LDL攝取(圖16及圖17)。此外，適體處理可增加PCSK9過度表現之HepG2細胞中的LDL-R水準，如藉由FACS所量測(圖17。由物種交叉反應性、高親和力、經截短、特異性且高度有效適體獲得之此等結果表明兩種鹼基經修飾適體之潛在治療價值可能藉由SELEX後修飾針對長度及生物穩定性進一步最佳化。
實例5：雙重修飾適體之血清穩定性
為了測定人類血清中該等雙重修飾適體之血清穩定性，1μM凝膠純化之適體在37℃下在PBS緩衝液中之90%彙集人類血清中以200μL之總體積培育。在多個時間點，收集20μL等分試樣且添加相等體積之EDTA/甲醯胺/染料混合物(甲醯胺87.7%、SDS 0.03%、EDTA鈉20mM、二甲苯藍0.05%、溴酚藍0.05%、Orange G 0.1%)。等分試樣混合物接著儲存於-20℃下。在分析之前，40μL等分試樣混合物用100μL H2O稀釋且用150μL 25：24：1苯酚：氯仿：異戊醇萃取。該等樣品在16,100 xg下離心持續15分鐘，且移出含適體之水相且儲存於-20℃下直至凝膠分析。
該等適體樣品裝載於15% TBE PAGE變性凝膠(8M脲)上，且適體用1X(約2μM)SYBR金染色持續10分鐘。使用FluorChemQ分析軟體(AlphaInnotech)定量在各時間點全長適體之量。
彼實驗之結果在圖10及圖18中示出。表10示出在彼實驗中測試之適體的組成、在90%人類血清中96小時之後剩餘之全長適體的百分率及各適體之半衰期，該半衰期藉由線性迴歸擬合使用凝膠定量之資料以GraphPad Prism 7軟體計算。圖18示出隨時間剩餘之全長適體的百分率。一般而言，雙重修飾適體證明瞭人類血清中隨時間之穩定性大於單一經修飾適體。
Figure 106121878-A0202-12-0073-19
實例6：包含兩種經修飾鹼基之適體
使用實例1中描述之文庫來選擇結合於ErbB2、ErbB3及PSMA之適體。實質上如實例1中所述針對各靶標進行選擇。關於ErbB2及ErbB3，使用單一經修飾Nap-dC/dT；PP-dC/dT；及dC/Tyr-dU文庫；及雙重修飾Nap-dC/Tyr-dU及PP-dC/Tyr-dU文庫。關於PSMA，使用未經修飾dC/dT文庫；單一經修飾Nap-dC/dT；PP-dC/dT；dC/Nap-dU、dC-PP-dU、dC-MOE-dU及dC/Tyr-dU文庫；及雙重修飾Nap-dC/Nap-dU、Nap-dC/PP-dU、 Nap-dC/MOE-dU、Nap-dC/Tyr-dU、PP-dC/PP-dU、PP-dC/Nap-dU及PP-dC/Tyr-dU文庫。
如先前，用於PSMA之未經修飾對照DNA文庫(dC/dT)不產生任何結合於PSMA之適體。dC或dU上具有Nap修飾(萘基部分)之單一經修飾文庫產生用於所有三種靶標之結合劑，然而，雙重修飾文庫提供相對於單一經修飾文庫具有較大親和力之適體(圖19A-C)。
比較用於PSMA、ErbB2及ErbB3中每一者之單一經修飾適體(40聚體)及雙重修飾適體(40聚體)的資料概述分別在表11、12及13中示出。
Figure 106121878-A0202-12-0074-20
 N.T.為「未測試」；N/A為不適用或無資料
基於表11中之資訊，不顯示結合之所有所分析的單一經修飾適體之百分率為71%。不結合係定義為具有320nM或更大之Kd的適體。具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0075-186
10nM之所有單一經修飾適體之百分比為12%，且所有單一經修飾適體之平均Kd為12.3nM。相比之下，不顯示結合之所有所分析的兩種經修飾(雙重修飾)之適體的百分比為54%。此外，具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0075-187
10nM之所有兩種經修飾之適體的百分比為20%，且所有兩種經修飾之適體之平均Kd為6.6nM。
Figure 106121878-A0202-12-0075-21
基於表12中之資訊，不顯示結合之所有所分析的單一經修飾適體之百分率為70%。不結合係定義為具有320nM或更大之Kd的適體。具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0075-188
10nM之所有單一經修飾適體之百分比低於2%，且所有單一經修 飾適體之平均Kd為15.1nM。相比之下，不顯示結合之所有所分析的兩種經修飾(雙重修飾)之適體的百分比為44%。此外，具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0076-189
10nM之所有兩種經修飾之適體的百分比為25%，且所有兩種經修飾之適體之平均Kd為0.7nM。
Figure 106121878-A0202-12-0076-22
基於表13中之資訊，不顯示結合之所有所分析的單一經修飾適體之百分率為38%。不結合係定義為具有320nM或更大之Kd的適體。具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0076-190
10nM之所有單一經修飾適體之百分比為40%，且所有單一經修飾適體之平均Kd為6nM。相比之下，不顯示結合之所有所分析的兩種經修飾(雙重修飾)之適體的百分比為24%。此外，具有Kd
Figure 106121878-A0202-12-0076-191
10nM之所有兩種 經修飾之適體的百分比為69%，且所有兩種經修飾之適體之平均Kd為0.02nM。
實例7：包含兩種經修飾鹼基之其他適體
如下製備包含表14中所示之各修飾對之文庫。在一些實施例中，各文庫含有40種或40種以上隨機化核苷酸。在一些實施例中，各文庫含有30種隨機化核苷酸，從而允許
Figure 106121878-A0202-12-0077-192
1015種不同序列。該等文庫可使用天然及/或經修飾核苷酸三磷酸酯使用外切KOD DNA聚合酶酶促合成。在一些實施例中，該無規區域側接用於雜合PCR擴增引子之固定序列，在5’末端處及在3’末端處具有或不具有額外間隔區。在一些情況下，主合成模板用於產生所有dU及或dC位置均一地在替換引子延伸反應中經修飾之經修飾文庫。文庫合成可實質上如實例1中所述執行。
Figure 106121878-A0202-12-0077-23
Figure 106121878-A0202-12-0078-25
表14中之一或多種文庫可用於選擇結合於靶標(諸如蛋白靶標)之適體。包含兩種經修飾鹼基之文庫典型地產生對靶標具有較大特異性及/或親和力之適體。
實例8：例示性雙重修飾適體
來自池11720(Nap-dC/dT)之保守序列家族之PCSK9結合適體在表15中示出。僅示出各序列之無規區域。指示了在11,380種總序列中各序列之複本數(與多達5種錯配一致或相等)。此家族中之所有適體均共享保守序列元件TTppGGpp，其中p=Nap-dC。適體11730-6(SEQ ID No：4,Kd=0.1nM)為針對代謝穩定性分析自此池中選出之代表。
Figure 106121878-A0202-12-0078-26
Figure 106121878-A0202-12-0079-27
來自池11730(Nap-dC/Tyr-dU)之保守序列家族之PCSK9結合適體在表16中示出。僅示出各序列之無規區域。指示了在17,695種總序列中各序列之複本數(與多達5種錯配一致或相等)。此家族中之所有適體均共享保守序列元件yGpppG，其中p=Nap-dC且Y=Tyr-dU。多種序列亦含有保守序列元件yyAyGpAp。適體11730-19(SEQ ID No：27,Kd=0.2nM)為針對代謝穩定性分析自此池中選出之代表。
Figure 106121878-A0202-12-0079-28
來自池11733(Pp-dC/Nap-dU)之保守序列家族之PCSK9結合適體在表17中示出。僅示出各序列之無規區域。指示了在16,118種總序列中各序列之複本數(與多達5種錯配一致或相等)。此家族中之所有適體均共享 保守序列元件rPPPAAGGrrPAPPG(SEQ ID NO：83)，其中r=Pp-dC且P=Nap-dU。適體11733-44(SEQ ID NO：44,SL1063)為野生型人類PCSK9(IC50=2.8nM)之最有效30聚體抑制劑。適體11733-198(SEQ ID No：46,Kd=0.07nM)為針對代謝穩定性分析自此池中選出之代表。
Figure 106121878-A0202-12-0080-29
<110> 美商身體邏輯股份有限公司(SOMALOGIC,INC.)
<120> 包含經修飾核苷之寡核苷酸
<130> 01137-0020-00PCT
<140> TW 106121878
<141> 2017-06-30
<150> 62/437,592
<151> 2016-12-21
<150> 62/357,623
<151> 2016-07-01
<160> 83
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (34)..(63)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<400> 1
Figure 106121878-A0305-02-0082-1
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 2
Figure 106121878-A0305-02-0083-2
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
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<220>
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<400> 4
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<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 5
Figure 106121878-A0305-02-0084-5
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 6
Figure 106121878-A0305-02-0084-6
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 7
Figure 106121878-A0305-02-0084-7
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 8
Figure 106121878-A0305-02-0084-8
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 9
Figure 106121878-A0305-02-0085-9
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 10
Figure 106121878-A0305-02-0085-10
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 11
Figure 106121878-A0305-02-0085-11
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 12
Figure 106121878-A0305-02-0086-12
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 13
Figure 106121878-A0305-02-0086-13
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 14
Figure 106121878-A0305-02-0086-14
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 15
Figure 106121878-A0305-02-0087-15
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 16
Figure 106121878-A0305-02-0087-16
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 17
Figure 106121878-A0305-02-0087-17
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 18
Figure 106121878-A0305-02-0087-18
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 19
Figure 106121878-A0305-02-0088-19
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 20
Figure 106121878-A0305-02-0088-20
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 21
Figure 106121878-A0305-02-0088-21
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 22
Figure 106121878-A0305-02-0089-22
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 23
Figure 106121878-A0305-02-0089-23
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 24
Figure 106121878-A0305-02-0089-24
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 25
Figure 106121878-A0305-02-0089-25
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 26
Figure 106121878-A0305-02-0090-26
<210> 27
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 27
Figure 106121878-A0305-02-0090-27
<210> 28
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 28
Figure 106121878-A0305-02-0090-28
<210> 29
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 29
Figure 106121878-A0305-02-0091-29
<210> 30
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 30
Figure 106121878-A0305-02-0091-30
<210> 31
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 31
Figure 106121878-A0305-02-0091-31
<210> 32
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 32
Figure 106121878-A0305-02-0092-32
<210> 33
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 33
Figure 106121878-A0305-02-0092-33
<210> 34
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 34
Figure 106121878-A0305-02-0092-34
<210> 35
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 35
Figure 106121878-A0305-02-0092-35
<210> 36
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 36
Figure 106121878-A0305-02-0093-36
<210> 37
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 37
Figure 106121878-A0305-02-0093-37
<210> 38
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 38
Figure 106121878-A0305-02-0093-38
<210> 39
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 39
Figure 106121878-A0305-02-0094-39
<210> 40
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 40
Figure 106121878-A0305-02-0094-40
<210> 41
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 41
Figure 106121878-A0305-02-0094-41
<210> 42
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 42
Figure 106121878-A0305-02-0095-42
<210> 43
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 43
Figure 106121878-A0305-02-0095-43
<210> 44
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 44
Figure 106121878-A0305-02-0095-44
<210> 45
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 45
Figure 106121878-A0305-02-0095-45
<210> 46
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 46
Figure 106121878-A0305-02-0096-46
<210> 47
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 47
Figure 106121878-A0305-02-0096-47
<210> 48
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 48
Figure 106121878-A0305-02-0096-48
<210> 49
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 49
Figure 106121878-A0305-02-0097-49
<210> 50
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 50
Figure 106121878-A0305-02-0097-50
<210> 51
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 51
Figure 106121878-A0305-02-0097-51
<210> 52
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 52
Figure 106121878-A0305-02-0097-52
<210> 53
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 53
Figure 106121878-A0305-02-0098-53
<210> 54
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 54
Figure 106121878-A0305-02-0098-54
<210> 55
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 55
Figure 106121878-A0305-02-0098-55
<210> 56
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 56
Figure 106121878-A0305-02-0099-56
<210> 57
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 57
Figure 106121878-A0305-02-0099-57
<210> 58
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 58
Figure 106121878-A0305-02-0099-58
<210> 59
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 59
Figure 106121878-A0305-02-0100-59
<210> 60
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 60
Figure 106121878-A0305-02-0100-60
<210> 61
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 61
Figure 106121878-A0305-02-0100-61
<210> 62
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸"
<400> 62
Figure 106121878-A0305-02-0100-62
<210> 63
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=」「人工序列之描述：合成寡核苷酸"
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Figure 106121878-A0305-02-0101-63
<210> 64
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 64
Figure 106121878-A0305-02-0101-64
<210> 65
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 65
Figure 106121878-A0305-02-0101-65
<210> 66
<400> 66 000
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<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 67
Figure 106121878-A0305-02-0102-66
<210> 68
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 68
Figure 106121878-A0305-02-0102-67
<210> 69
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 69
Figure 106121878-A0305-02-0102-68
<210> 70
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 70
Figure 106121878-A0305-02-0103-69
<210> 71
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 71
Figure 106121878-A0305-02-0103-70
<210> 72
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 72
Figure 106121878-A0305-02-0103-71
<210> 73
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 73
Figure 106121878-A0305-02-0104-72
<210> 74
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 74
Figure 106121878-A0305-02-0104-73
<210> 75
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 75
Figure 106121878-A0305-02-0104-74
<210> 76
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 76
Figure 106121878-A0305-02-0104-75
<210> 77
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 77
Figure 106121878-A0305-02-0105-76
<210> 78
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 78
Figure 106121878-A0305-02-0105-77
<210> 79
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 79
Figure 106121878-A0305-02-0105-78
<210> 80
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 80
Figure 106121878-A0305-02-0106-79
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
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<222> (1)..(1)
<223> /注意=「可或可不存在」
<220>
<221> misc_特徵
<222> (15)..(15)
<223> /注意=「可或可不存在」
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「參見如關於取代及較佳實施例之詳細描述所申請之說明書」
<400> 81
Figure 106121878-A0305-02-0106-80
<210> 82
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
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Figure 106121878-A0305-02-0107-81
<210> 83
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 83
Figure 106121878-A0305-02-0107-82

Claims (72)

  1. 一種包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶之適體(aptamer)，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶；其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷；或其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷；其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分(moiety)、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分；且其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
  2. 如請求項1之適體，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
  3. 如請求項1或2之適體，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
  4. 如請求項1之適體，其中該5位修飾胞嘧啶核苷為NapdC且該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU及ThrdU。
  5. 如請求項1之適體，其中該5位修飾胞嘧啶核苷為PPdC且該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU及ThrdU。
  6. 如請求項4或5之適體，其中該5位修飾尿嘧啶核苷為TyrdU。
  7. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中該適體結合選自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28及PPIB之靶標蛋白。
  8. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中該適體在該適體之5’末端處包含至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長、或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長之區域，其中在該適體之5’末端處的該區域缺乏5位修飾嘧啶。
  9. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中該適體在該適體之3’末端處包含至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長、或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長之區域，其中在該適體之3’末端處的該區域缺乏5位修飾嘧啶。
  10. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中該適體為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
  11. 一種包含複數種聚核苷酸之組合物，其中各聚核苷酸包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶；其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷；或其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷；其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分；且其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
  12. 如請求項11之組合物，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之5’末端處包含固定區域。
  13. 如請求項12之組合物，其中在各聚核苷酸之5’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
  14. 如請求項11至13中任一項之組合物，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之3’末端處包含固定區域。
  15. 如請求項14之組合物，其中在該聚核苷酸之3’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個 核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
  16. 如請求項11之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
  17. 如請求項11或16之組合物，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
  18. 如請求項11之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷為NapdC且該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
  19. 如請求項11之組合物，其中該5位修飾胞嘧啶核苷為PPdC且該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU及ThrdU。
  20. 如請求項18或19之組合物，其中該至少一種第二5位修飾嘧啶為TyrdU。
  21. 如請求項11至13及18至19中任一項之組合物，其中各聚核苷酸包含無規區域。
  22. 如請求項21之組合物，其中該無規區域為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或20至40個、或30至100個、或30至90個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或30至40個核苷酸長。
  23. 如請求項11至13及18至19中任一項之組合物，其中各聚核苷酸為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、 或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
  24. 一種包含適體及靶標之組合物，其中該適體及該靶標能夠形成複合物，且其中該適體為如請求項1至10中任一項之適體。
  25. 如請求項24之組合物，其中該靶標選自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28及PPIB。
  26. 一種包含第一適體、第二適體及靶標之組合物，其中該第一適體包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶；其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶或其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶及至少一種第四5位修飾嘧啶；其中該第一適體、第二適體及該靶標能夠形成三聚體複合物；其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶；且其中該第一適體為如請求項1至10中任一項之適體。
  27. 如請求項26之組合物，其中該第三5位修飾嘧啶及該第四5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
  28. 如請求項26或27之組合物，其中該第三5位修飾嘧啶選自5位修飾胞嘧啶核苷及5位修飾尿嘧啶核苷。
  29. 如請求項26或27之組合物，其中該第三5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且該第四5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
  30. 如請求項29之組合物，其中該第三5位修飾嘧啶為選自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC及TyrdC之5位修飾胞嘧啶核苷，且該第四5位修飾嘧啶為選自BndU、NapdU、PEdU、IbdU、FBndU、2NapdU、NEdU、MBndU、BFdU、BTdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU之5位修飾尿嘧啶核苷。
  31. 如請求項26或27之組合物，其中該靶標選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
  32. 如請求項26或27之組合物，其中該靶標為選自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28及PPIB之靶標蛋白。
  33. 一種用於偵測樣品中之靶標之方法，其包含：(a)使能夠結合於靶標分子之適體與樣品接觸；(b)用該樣品培育該適體以允許適體-靶標複合物形成；(c)在該樣品中富集該適體-靶標複合物及(c)偵測該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之存在，其中該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之偵測指示該靶標分子存在於該樣品中，且其中該適體、適體-靶標複合物或靶標分子之偵測的缺乏指示該靶標分子不存在於該樣品中；其中該適體為如請求項1至10中任一項之適體。
  34. 如請求項33之方法，其中該方法包含至少一個選自以下之額外步驟：添加競爭分子至該樣品中；在固體支撐物上捕捉該適體-靶標複合物；及添加競爭分子且稀釋該樣品；其中該至少一個額外步驟發生於步驟(a)或步驟(b)之後。
  35. 如請求項34之方法，其中該競爭分子選自聚陰離子競爭劑。
  36. 如請求項35之方法，其中該聚陰離子競爭劑選自寡核苷酸、聚右旋糖苷、DNA、肝素及dNTP。
  37. 如請求項36之方法，其中聚右旋糖苷為硫酸右旋糖苷；且DNA為鯡精DNA或鮭魚精DNA。
  38. 如請求項33至37中任一項之方法，其中該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
  39. 如請求項33至37中任一項之方法，其中該樣品選自全血、白血球、外周血單核細胞、血漿、血清、唾液、氣息、尿液、***、唾液、腦膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳頭抽吸液、支氣管抽吸液、滑液、關節抽吸液、細胞、細胞提取物、糞便、組織、組織生檢及腦脊髓液。
  40. 一種用於偵測樣品中之靶標的方法，其包含a)使該樣品與第一適體接觸以形成混合物，其中該第一適體能夠結合於該靶標以形成第一複合物；b)在允許該第一複合物形成之條件下培育該混合物；c)使該混合物與第二適體接觸，其中該第二適體能夠結合該第一複合物以形成第二複合物；d)在允許該第二複合物形成之條件下培育該混合物； e)偵測該混合物中該第一適體、該第二適體、該靶標、該第一複合物或該第二複合物之存在或不存在，其中該第一適體、該第二適體、該靶標、該第一複合物或該第二複合物之存在指示該靶標存在於該樣品中；其中該第一適體為如請求項1至10中任一項之適體；且其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶，或其中該第二適體包含至少一種第三5位修飾嘧啶及至少一種第四5位修飾嘧啶。
  41. 如請求項40之方法，其中該第三5位修飾嘧啶及該第四5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶。
  42. 如請求項40之方法，其中該第三5位修飾嘧啶選自5位修飾胞嘧啶核苷及5位修飾尿嘧啶核苷。
  43. 如請求項40之方法，其中該第三5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且該第四5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷。
  44. 如請求項42或43之方法，其中該第三5位修飾嘧啶為選自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC及TyrdC之5位修飾胞嘧啶核苷，且該第四5位修飾嘧啶為選自BNdU、NapdU、PedU、IbdU、FbndU、2NapdU、NedU、MbndU、BfdU、BtdU、PpdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU之5位修飾尿嘧啶核苷。
  45. 如請求項40至43中任一項之方法，其中該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
  46. 如請求項40至43中任一項之方法，其中該靶標為選自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28及PPIB之靶標蛋白。
  47. 如請求項40至43中任一項之方法，其中該第一適體、第二適體及該靶標能夠形成三聚體複合物。
  48. 一種用於鑑別一或多種能夠結合於靶標分子之適體之方法，該方法包含：(a)使適體之文庫與該靶標分子接觸以形成混合物，且允許形成適體-靶標複合物，其中當適體對該靶標分子具有親和力時，該適體-靶標複合物形成；(b)自該混合物之剩餘部分分配該適體-靶標複合物或富集該適體-靶標複合物；(c)解離該適體-靶標複合物；及(d)鑑別該一或多種能夠結合於該靶標分子之適體；其中該適體之文庫包含複數種聚核苷酸，其中各聚核苷酸包含至少一種第一5位修飾嘧啶及至少一種第二5位修飾嘧啶，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶為不同的5位修飾嘧啶；其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷；或其中該第一5位修飾嘧啶為5位修飾胞嘧啶核苷且其中該第二5位修飾嘧啶為5位修飾尿嘧啶核苷；其中該5位修飾尿嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分、吲哚部分及N-嗎啉基部分之部分；且其中該5位修飾胞嘧啶核苷包含在5位處之選自萘基部分、苯甲基部分、酪胺醯基部分及N-嗎啉基部分之部分。
  49. 如請求項48之方法，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之5’末端處包含固定區域。
  50. 如請求項49之方法，其中在各聚核苷酸之5’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中各聚核苷酸在該聚核苷酸之3’末端處包含固定區域。
  52. 如請求項51之方法，其中在該聚核苷酸之3’末端處的該固定區域為至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或至少30個核苷酸長，或5至30個、10至30個、15至30個、5至20個或10至20個核苷酸長。
  53. 如請求項48之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷選自NapdC、2NapdC、TyrdC及PPdC。
  54. 如請求項48或53之方法，其中該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
  55. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷為NapdC且該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU及ThrdU。
  56. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該5位修飾胞嘧啶核苷為PPdC且該5位修飾尿嘧啶核苷選自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU及ThrdU。
  57. 如請求項48或53之方法，其中該5位修飾尿嘧啶核苷為TyrdU。
  58. 如請求項48或53之方法，其中各聚核苷酸包含無規區域。
  59. 如請求項58之方法，其中該無規區域為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或20至40個、或30至100個、或30至90個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或30至40個核苷酸長。
  60. 如請求項48或53之方法，其中各聚核苷酸為20至100個、或20至90個、或20至80個、或20至70個、或20至60個、或20至50個、或30至100個、或30至90個、或30至80個、或30至70個、或30至60個、或30至50個、或40至100個、或40至90個、或40至80個、或40至70個、或40至60個、或40至50個核苷酸長。
  61. 如請求項48或53之方法，其中各聚核苷酸為結合靶標之適體，且其中該文庫包含至少1000種適體，其中各適體包含不同核苷酸序列。
  62. 如請求項48或53之方法，其中步驟(a)、(b)及/或(c)重複至少一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
  63. 如請求項48或53之方法，其中該一或多種能夠結合於該靶標分子之適體經擴增。
  64. 如請求項48或53之方法，其中該混合物包含聚陰離子競爭分子。
  65. 如請求項64之方法，其中該聚陰離子競爭劑選自寡核苷酸、聚右旋糖苷、DNA、肝素及dNTP。
  66. 如請求項65之方法，其中聚右旋糖苷為硫酸右旋糖苷；且DNA為鯡精DNA或鮭魚精DNA。
  67. 如請求項48或53之方法，其中該靶標分子選自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、細胞及組織。
  68. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。
  69. 如請求項11至13及18至19中任一項之組合物，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。
  70. 如請求項33至37、40至43、48至50及53中任一項之方法，其中該第一5位修飾嘧啶及該第二5位修飾嘧啶能夠藉由聚合酶併入。
  71. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中與具有相同長度及包含替代該等第一5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶或替代該第二5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶的核鹼基序列之適體相比，該適體具有改良之核酸酶穩定性。
  72. 如請求項1、2、4及5中任一項之適體，其中與具有相同長度及包含替代該等第一5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶或替代該第二5位修飾嘧啶中每一者之未經修飾嘧啶的核鹼基序列之適體相比，該適體在人類血清中具有較長半衰期。
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