CN110036110B

CN110036110B - 针对fzd10的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN110036110B
Application number: CN201780075513.0A
Authority: CN
Inventors: 原田阳介; 横关达己; 中村祐辅
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2037-10-04
Also published as: RU2019112825A; US20200174002A1; EP3524677A4; BR112019006422A2; JPWO2018066585A1; JP2022068145A; RU2765431C2; CN110036110A; JP7039039B2; CA3038789A1; KR102531006B1; KR20190059318A; EP3524677A1; EP3524677B1; TW201827465A; TWI762516B; US11079386B2; WO2018066585A1; RU2019112825A3

Abstract

本发明涉及针对FZD10的单克隆抗体。此外，本发明提供使用该抗体诊断FZD10相关疾病的方法、检测出FZD10蛋白质的方法、判定通过FZD10抑制剂的治疗后的药效的方法、筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象的方法、以及包含该抗体的诊断试剂。

Description

针对FZD10的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及针对FZD10的单克隆抗体、使用该抗体诊断FZD10相关疾病的方法、检测出FZD10蛋白质的方法、判定通过FZD10抑制剂的治疗后的药效的方法、筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象的方法、以及包含该抗体的诊断试剂。

背景技术

Frizzled蛋白是对于Wnt蛋白配体具有结合位点的G蛋白结合受体的家族。根据基因分析，目前已经确定了18种Wnt基因和10种Frizzled基因(FZD1～FZD10)，并且已经发现它们全部在结构上都高度相似。

Frizzled蛋白是七次跨膜蛋白，并且在N末端具有细胞外富含半胱氨酸的结构域。这种富含半胱氨酸的结构域是Wnt配体的结合位点。Wnt配体和Frizzled受体之间的结合不一定是一对一的，并且已经证实一种Wnt配体与多种Frizzled受体结合、一种Frizzled受体与多种Wnt配体结合。

通常认为，通过Wnt配体与Frizzled受体的结合，可以使Wnt信号传导途径活化。能够想到：Wnt信号传导途径中使β-连环蛋白途径活化的物质；存在数种不经由β-连环蛋白的途径，并且通过Wnt配体和Frizzled受体的组合而使不同的途径活化的物质。

通过受体结合而活化的Wnt/β-连环蛋白信号途径，通过与Frizzled受体直接相互作用的细胞质蛋白质即Dishevelled(Dsh)的介导，得到β-连环蛋白在细胞质中的稳定化和蓄积。在不存在Wnt信号传导的情况下，β-连环蛋白局部存在于包含肿瘤抑制蛋白即腺瘤性结肠息肉(APC)和轴蛋白(Axin)的细胞质的分解复合体中。这些蛋白质作为使糖原合成酶激酶(GSK)-3β与β-连环蛋白结合、磷酸化，并且使其指定用于通过泛素/蛋白酶体途径的分解中的重要基础而发挥作用。(专利文献1)已经表面β-连环蛋白非依赖性途径涉及许多的过程，存在涉及细胞骨架***的控制的细胞内平面极性(PCP)、涉及细胞的运动和粘接的Wnt/Ca²⁺途径、涉及经由蛋白激酶A的肌生成的控制的途径等。Frizzled受体可以二聚体化，并且有报告(非专利文献1)表明该二聚体化涉及Wnt信号传导途径的活化。

就FZD10(参考序列:Genbank登录号NM_007197.3(SEQ ID NO:21))mRNA而言，有报告(专利文献1～2，非专利文献2～3)表明其在包括宫颈、消化道和胶质母细胞瘤的细胞株等多种癌细胞株中，并且在约40％的原发性胃癌、原发性结肠癌和大多数的滑膜肉瘤组织中被上调。作为与FZD10蛋白质的过表达相关的疾病，可举出：滑膜肉瘤、结直肠癌(大肠癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)、以及急性骨髓性白血病(AML)等(专利文献3～5)。因此，FZD10被认为是抗癌剂的合适靶标，已表明：通过FZD10特异性的siRNA，可以抑制滑膜肉瘤细胞的增殖，并且针对FZD10的抗体在滑膜肉瘤的小鼠移植模型中具有抗肿瘤活性(专利文献3和4)。此外，可以预期针对FZD10的单克隆抗体可用作治疗中的诊断剂。除了针对乳腺癌、恶性淋巴瘤、以及结肠癌的曲妥珠单抗的诊断剂、利妥昔单抗的诊断剂、以及贝伐单抗的诊断剂等单克隆抗体的临床应用的成功案例以外，针对其他分子靶标的几种单克隆抗体正在研发中，其诊断效果正在评价中。从选择对治疗剂有效果的患者的观点来看，期待这些诊断剂与更有效的治疗方法密切相关。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2007/053577

专利文献2：WO2004/020668

专利文献3：WO2005/004912

专利文献4：WO2006/013733

专利文献5：WO2007/148417

非专利文献

非专利文献1：Charles E Dann et al.,Nature(2001),412:86-90

非专利文献2：H.Terasaki et al.,Int.J.Mol.Med.(2002)9,107-112

非专利文献3：S.Nagayama et al.,Oncogene(2005)24,6201-6212

发明内容

发明所解决的技术问题

就使用了分子靶向治疗剂的肿瘤治疗中的诊断剂而言，重要的是，检测出在靶肿瘤的大部分中过度表达并且在正常组织中不表达或以最低限度表达的细胞蛋白质。然而，难以以高灵敏度检测出在肿瘤中特异性表达的蛋白质，也难以获得针对这种蛋白质的抗体。例如，关于被认为是抗癌剂的靶标的FZD10，市售有数种抗体。然而，当本发明人等使用市售获得的抗体来尝试对FZD10表达细胞进行染色时，即使在FZD10的表达水平低的细胞中也可以产生阳性信号(假阳性)。在这种免疫学特异性不充分的抗体中，可能无法以抗体的反应强度作为指标来明确地检测出FZD10的表达水平的差异。因此，本发明的目的是提供一种以高灵敏度与FZD10特异性结合的抗体。

解决问题的技术手段

因此，在本发明人等用FZD10抗原对小鼠进行免疫并从得到的单克隆抗体中搜索特异性结合FZD10的抗体时，特定的抗体可与重组人FZD10蛋白质特异性结合，并且成功确定了可以特异性检测出在细胞或组织中表达的FZD10蛋白质的克隆。

具体而言，本发明如下所述。

[1]、一种抗体或其抗原结合性片段，其包含重链可变区和轻链可变区中的一者或两者，其中，

所述重链可变区包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；以及

CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，

所述轻链可变区包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；以及

CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，

并且，所述抗体或其抗原结合性片段能够与FZD10蛋白质或其部分肽结合。

[2]、根据[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其包含重链可变区和轻链可变区中的一者或两者，其中，

所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

[3]、根据[1]或[2]所述的抗体或其抗原结合性片段，其特异性识别包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列的多肽。

[4]、一种抗体或其抗原结合性片段，其与[1]～[3]中任一项所述的抗体竞争与FZD10的特异性结合。

[5]、根据[1]～[4]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其与亲和标记、酶标记、放射性同位素标记、或荧光标记结合。

[6]、一种多核苷酸，其编码[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段。

[7]、一种试剂，其用于诊断FZD10相关疾病、判定通过FZD10抑制剂的治疗后的药效、或者筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象，并且，

所述试剂包含[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段。

[8]、一种在对象中诊断FZD10相关疾病或该疾病的发病因素的方法，其包含下述阶段：

(a)使从所述对象中分离得到的样品与[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段接触；

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合性片段与所述样品之间的结合，来检测出所述样品中的FZD10蛋白质；以及

(c)将所述样品中的FZD10蛋白质水平与对照进行比较，当FZD10蛋白质水平高于对照时，表示所述对象患有所述疾病或者具有所述疾病的发病风险。

[9]、根据[7]所述的试剂或[8]所述的方法，其中，

所述FZD10相关疾病是表达FZD10的癌症。

[10]、根据[9]所述的试剂或方法，其中，

所述癌症选自滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、结直肠癌(大肠癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)、以及急性骨髓性白血病(AML)。

[11]、一种检测出样品中的FZD10蛋白质的方法，其包含下述阶段：

(a)使从对象中分离得到的样品与[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段接触；

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合性片段与所述样品之间的结合，来检测出所述样品中的FZD10蛋白质。

[12]、一种在对象中判定通过FZD10抑制剂的治疗后的药效的方法，其包含下述阶段：

(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合性片段与所述样品之间的结合，来检测出所述样品中的FZD10蛋白质；

(c)将所述样品中的FZD10蛋白质水平与给药前的表达水平进行比较，当FZD10蛋白质水平低于给药前的表达水平时，表示在所述对象中具有药效。

[13]、一种筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象的方法，其包含下述阶段：

(c)将所述样品中的FZD10蛋白质水平与对照进行比较，当FZD10蛋白质水平等同或高于对照时，表示在所述对象中通过FZD10抑制剂的治疗效果较高。

[14]、根据[8]～[13]中任一项所述的方法，其中，

所述样品是从所述对象中分离得到的细胞或组织。

[15]、一种制造能够与FZD10蛋白质或其部分肽结合的抗体的方法，其包含下述工序：

(a)培养包含导入有[6]所述的多核苷酸的载体的细胞；以及

(b)从所述细胞的培养物或培养基中回收所述抗体。

本发明还涉及：

[16]一种检测出FZD10相关疾病或该疾病的发病原因的诊断标记物的方法，其包含下述阶段：

(a)使从上述对象分离得到的样品与[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段接触；以及

(b)通过检测出上述抗体或其抗原结合性片段与上述样品的结合，来检测出上述样品中的FZD10蛋白质作为上述标记物。

[17]根据[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其用于FZD10相关疾病或该疾病的发病原因的诊断中。

[18]一种用于诊断FZD10相关疾病或该疾病的发病原因的试剂的制造中的、[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段的使用。

[19]一种检测出FZD10抑制剂的药效标记物的方法，其包含下述阶段：

[20]根据[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其用于通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效的判定。

[21]一种用于判定通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效的试剂的制造中的、[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段的使用。

[22]一种检测出FZD10抑制剂治疗应答性标记物的方法，其包含下述阶段：

[23]根据[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其用于筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象。

[24]一种用于筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象的试剂的制造中的、[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段的使用。

除了上述之外，结合附图和实施例并通过阅读以下详细说明，使得本发明的其他目的和特征变得更明显。然而，上述发明内容或以下详细说明都是示例性的实施方式，不被应理解为限制本发明或本发明的其他替代性实施方式。特别是，尽管本说明书中参考若干具体的实施方式来对本发明进行说明，但上述说明仅为本发明的例证，不对本发明进行限定。在不脱离添附的权利要求所记载的本发明的精神或范围的情况下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样，根据本发明内容或下文中记载的特定的实施方式，本发明的其他目的、特征、利益、优点变得明显，并且对于本领域技术人员而言是容易理解的。上述目的、特征、利益、优点能够与添附的实施例、数据、图表、以及由此引申而得的任何合理推论进行组合，单独或考虑到本发明说明书中引用的参考文献而变得明显。

附图说明

[图1]图1是表示使用各种癌症类型的细胞株而得的mRNA的表达分析数据库即Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)中FZD10mRNA在各种癌症类型细胞株中的表达的图。

[图2]图2是表示使用了FZD10强制表达类细胞株的免疫组织化学染色中抗FZD10抗体(10A8H4G4)的特异性的显微照片。通过抗FZD10抗体(10A8H4G4)进行免疫组织化学染色的结果，在由FZD10强制表达细胞株(FZD10/DLD1)制得的石蜡切片中观察到特异性染色，但在导入有空载体(Empty Vector)作为阴性对照的细胞株(Mock/DLD1)中没有染色。另一方面，用市售抗体(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)进行免疫组织化学染色的结果，在FZD10/DLD1和Mock/DLD1中均观察到染色。表明了，与市售抗体相比，抗FZD10抗体(10A8H4G4)的特异性。此外，照片底部的图表表示了根据免疫组织化学染色的结果计算出的强制表达细胞数中FZD10阳性细胞所占的比例(％)。

[图3]图3表示使用FZD10的表达量不同的各种细胞株而得的流式细胞仪和免疫组织化学染色中的表达的关联。A:表示检测出了各细胞株的细胞膜上的FZD10的表达的、使用了10A8H4G4的流式细胞仪的结果的直方图。SYO-1、T.T、H727是FZD10表达细胞株，LoVo是FZD10非表达细胞株。B:表示使用了从各细胞株制得的石蜡切片的免疫组织化学染色的结果的显微照片。此外，照片底部的图表中，根据免疫组织化学染色的结果计算出各细胞株中FZD10阳性细胞所占的比例(％)并示于图中。在SYO-1、T.T、H727等的FZD10表达细胞株中观察到染色，在LoVo(非表达细胞株)中未观察到染色。通过使用了细胞株的分析，表明了抗FZD10抗体(10A8H4G4)的免疫组织化学染色法中的特异性。

[图4]图4表示使用了由SYO-1、COLO201细胞株的小鼠异种移植肿瘤制得的石蜡切片和肺癌临床样品1～6的免疫组织化学染色和RealTime-PCR中的表达的关联。A:通过使用了本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)的免疫组织化学染色，在SYO-1和样品5中观察到FZD10阳性结果。另一方面，在低表达样品中几乎没有染色。B:根据A的免疫组织化学染色结果，计算出肿瘤细胞中FZD10阳性细胞数所占的比例，并示于图中。C:通过相同病例的RealTime-PCR的表达分析，得到了与免疫组织化学染色相关的结果。通过使用了临床样品的分析，表明了本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)的免疫组织化学染色法中的高特异性。

具体实施方式

详细的说明

当对本发明的实施方式进行实施或试验时，可以使用与本说明书中记载的方法和材料类似或等同的任选的方法和材料，本说明书中记载了优选的方法、装置、材料。然而，在记载本发明的材料与方法之前，应当理解为，可以按照常规的实验方法以及最优化的目的来改变本说明书中记载的特定的大小、形状、尺寸、材料、方法、手段等，因此本发明不限于这些。并且应当理解为，本说明书中使用的专业术语仅用于说明特定的类型或实施方式，并不用于限制本发明的范围，本发明的范围仅受添附的权利要求的范围的限制。

本发明提供了能够与FZD10蛋白质或其部分肽特异性结合的抗FZD10单克隆抗体。本发明提供证据表明，本发明的抗FZD10单克隆抗体在免疫组织化学染色法中对于FZD10蛋白质的检测中具有高特异性。

本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)至少在可变区具有以下氨基酸序列。

10A8H4G4，重链可变区氨基酸序列(信号序列除外)：

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)

10A8H4G4，轻链可变区氨基酸序列(信号序列除外)：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)

本发明的抗体可以通过使用编码上述氨基酸序列的DNA的重组技术来进行制备。

本发明的抗体通过下述方式得到：通过ELISA法，从通过免疫接种小鼠而得到的多个抗体产生杂交瘤中进行筛选并选择出具有与FZD10的结合性的抗体。通过ELISA法选择的抗体中，通过免疫染色法进行进一步的筛选。选择在强制表达细胞(阳性对照细胞)中表现阳性并且在阴性对照细胞中表现阴性的抗体，从所选择的抗体中进一步筛选在内源性FZD10表达细胞(阳性对照细胞)中表现阳性并且在阴性对照细胞中表现阴性的抗体。当与FZD10的相互作用不是很强时，伴随着具有弱结合力的抗体作为背景。因此，通过使用预先测定了内因性FZD10表达量的细胞株来进行免疫染色并筛选，可以选择与目的FZD10具有强结合性的抗体。

本发明的抗体与FZD10特异性结合。因此，本发明的抗体可以用作用于检测出FZD10或者表达了FZD10的细胞或组织的工具。此外，本发明的抗体可以用作与能够检测出该抗体的标记结合的标记体，该标记体更优选能够检测出例如结直肠癌等表达FZD10的癌细胞或癌组织。作为与本发明的抗体结合的标记，可以是能够检测出与FZD10结合的抗体的标记，可举出：亲和标记(例如，生物素、抗生物素蛋白等)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明等)等。

当本发明的抗体用作选择癌症治疗患者的诊断剂时，可以原样使用本发明的抗体，也可以制成适于各种使用方式的组合物。

I、定义

就本说明书中所用的词语“一个(a)”、“一个(an)”、以及“该(the)”而言，除非特别说明，否则意味着“至少一个”。

关于物质(例如，肽、抗体、多核苷酸等)所使用的术语“分离得到的”以及“纯化得到的”表示，该物质实际上不包含可能以其他方式包含于天然来源中的至少一种物质。因此，分离或纯化得到的抗体是指，实际上不包含该抗体来源的细胞或组织中的其他细胞材料的抗体，上述细胞材料包括：糖质、脂质、以及其他的混入蛋白质。在优选的实施方式中，本发明的抗体经过了分离或纯化。

术语“多肽”和“蛋白质”在本说明书中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。除了天然型氨基酸聚合物之外，上述术语也适用于包含一个或多个非天然型氨基酸残基的非天然型氨基酸聚合物。非天然型氨基酸包括氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”，在本说明书中可互换使用，是指核苷酸的聚合物。

除非特别说明，否则术语“FZD10相关疾病”是指表达FZD10的癌症。

除非特别说明，否则术语“癌症”是指表达FZD10的癌症，优选指过度表达FZD10基因的癌症，例如可举出：滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、结直肠癌(大肠癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)等，但不限于此。例如，通过使用了各种癌症类型的细胞株而得的mRNA的表达分析数据库Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)等，可知表达FZD10的癌细胞。同样在本申请中，已经证实在肺癌、食道癌、结直肠癌(大肠癌)中的显着上调(图1)。

本说明书中所用的术语“抗体”旨在包含，对于指定的蛋白质或其肽具有特异反应性的免疫球蛋白或其片段。抗体可包含，与其他的蛋白质或标记融合而得的抗体和抗体片段。此外，在本说明书中，抗体以最广泛的意义进行使用，具体而言，只要其表现出所期望的生物活性，就包括：完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体构成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、或抗体片段。“抗体”是指所有的类别(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。

“抗体片段”是完整的抗体的一部分，通常包含完整的抗体的一个或多个抗原结合区或可变区。因此，在本发明中，抗体片段可包含完整的抗体的一个或多个抗原结合部分。本说明书中所用的术语，即抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合性片段”是指，抗体的一个或多个免疫活性片段，其保持有与抗原(例如FZD10)特异性结合的能力。抗体的抗原结合能力表现为，可以通过全长抗体的片段进行。作为抗体片段的实例，包括：Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv片段、直链状抗体、单链抗体分子。无论结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的抗原相同的抗原结合。术语“抗体片段”包含与特异性抗原结合的合成多肽或基因工程多肽，例如可举出：包含轻链可变区的多肽、包含重链和轻链可变区的“Fv”片段、轻链和重链可变区通过肽接头连接而成的重组单链多肽分子(“scFv蛋白质”)、包含模拟高变区的氨基酸残基的最小识别单元。

除非特别说明，否则本说明书中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属的技术领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

在本发明中，例如可以通过抗体之间的竞争来评价抗体与FZD10蛋白质的特异性结合。具体而言，作为本发明的抗体，例如，可以将包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区的抗体作为参照抗体，来评价候补抗体的特异性。代表性的参照抗体是10A8H4G4。在参照抗体与人FZD10蛋白质之间的抗原抗体反应中，当候补抗体参与竞争时，可以确认候补抗体具有与参照抗体相同的特异性。例如，就候补抗体不存在的情况下与FZD10蛋白质结合的抗体的量而言，当参照抗体在候补抗体的共存下与FZD10蛋白质反应时，在10％、20％、30％、或40％、更优选50％或以上的参照抗体的结合受到抑制的情况下，可以确定抗体之间发生竞争。不仅是FZD10蛋白质，只要与参考抗体结合，就能够使用部分肽来评价抗体之间的竞争。优选的部分肽是FZD10蛋白质的N末端细胞外结构域肽，例如包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的部分肽。

II、抗体的产生

在本发明中，使用抗FZD10单克隆抗体。通过本领域公知的方法提供上述抗体。

下面将记载本发明中使用的示例性抗体产生技术。

(i)单克隆抗体

单克隆抗体实际上从均质的抗体群中得到。即，除了可能少量存在的天然突变外，构成抗体群的各个抗体是相同的。因此，“单克隆”这个修饰语表示，抗体不是不同抗体形成的混合物这样的抗体特征。

例如，单克隆抗体可以使用Kohler et al.,Nature,256:495(1975)中首次记载的杂交瘤法来产生，也可以通过重组DNA法(US4816567号)来产生。

在杂交瘤法中，可以用FZD10多肽(FZD10蛋白质或其部分多肽)对小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠等进行免疫，以产生与FZD10多肽特异性结合的抗体或诱导可以产生该抗体的淋巴细胞。或者，可以通过FZD10多肽对淋巴细胞进行体外免疫。然后，使用聚乙二醇等合适的融合剂，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。

将制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其在培养基中增殖，上述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的增殖或存活的物质。例如，亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)时，在用来培养杂交瘤的培养基中，通常可包含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，通过这些物质阻碍HGPRT缺陷细胞的增殖。

优选的骨髓瘤细胞是下述细胞：有效进行融合，辅助通过所选择的抗体产生细胞的稳定且高水平的抗体产生，并且具有对于HAT培养基等培养基的敏感性的细胞。优选的骨髓瘤细胞株包括：小鼠骨髓瘤细胞株，例如可从Salk Institute Cell DistributionCenter,San Diego,California USA获得的MOPC-21与源自MPC-11小鼠肿瘤的细胞株；以及可从American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA获得的SP-2细胞和X63-Ag8-653细胞。关于人单克隆抗体的产生，记载有人骨髓瘤细胞株和小鼠-人异源骨髓瘤细胞株(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

对于繁殖有杂交瘤细胞的培养基，对针对抗原的单克隆抗体的产生进行分析。优选的是，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性，通过免疫沉淀法，或通过放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)等体外结合测定来确定。

单克隆抗体的结合亲和性，例如可通过Munson et al.,Anal Biochem.107:220(1980)的3D Scatchard分析进行判定。

确定了产生具有所期望的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，然后，可通过有限稀释法来亚克隆上述克隆，并通过标准方法进行增殖(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。适用于上述目的的培养基的实例包括D-MEM培养基或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以通过动物的腹水肿瘤等进行体内增殖。

通过亚克隆分泌的单克隆抗体可以纯化至均质。例如，可以根据用于一般蛋白质的分离法和纯化法，进行抗体的分离和纯化。不限于上述方法，例如可以通过适当选择并组合使用亲和色谱法等柱层析法、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等，从培养基、腹水或血清中适当地分离与离析抗体(Antibodies:A LaboratoryManual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。可以使用蛋白A柱与蛋白G柱作为亲和柱。应该可以使用的示例性蛋白A柱包括，例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F(Pharmacia)等。

在示例性色谱法中，除亲和色谱法之外，还包含例如离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤法、反相色谱法、吸附色谱法等(Strategies for Protein Purification andCharacterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1996))。色谱法的程序可以通过HPLC和FPLC等液相色谱法来进行。

就编码单克隆抗体的DNA而言，使用传统的步骤(例如，使用能够与编码小鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地进行分离并确定序列。杂交瘤细胞可用作这种DNA的优选的供给源。对DNA进行分离后，将其导入表达载体中，然后，将其转染至不通过其他方法产生免疫球蛋白质的大肠杆菌(E.coli)细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞等宿主细胞中，可以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章中，包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)与Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

用于产生对FZD10表现出反应性的特异性抗体或抗体片段的另一种方法是：将编码在细菌中表达的免疫球蛋白基因或其一部分的表达库，使用FZD10蛋白质或其部分肽进行筛选。例如可以使用噬菌体表达库在细菌中表达完整的Fab片段、VH区、Fv区等。例如参照Ward et al.,Nature 341:544-546(1989)；Huse et al.,Science 246:1275-1281(1989)；以及，McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)。例如，使用FZD10肽来筛选上述库，由此可以确定对FZD10具有反应性的免疫球蛋白片段。或者，可以使用SCID-hu小鼠(可从Genpharm获得)以产生抗体或其片段。

在其他的实施方式中，可以使用McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中记载的技术并从制得的抗体噬菌体库中分离抗体或抗体片段。在Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)与Marks et al.,J MoL BioL,222:581-597(1991)中，分别记载有使用了噬菌体库的小鼠抗体和人抗体的分离。随后的出版物中，记载了通过链改组的高亲和性(nM范围)人抗体的产生(Marks et al.,BioTechnology,10:779-783(1992))、以及作为用于构建非常大的噬菌体库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))。这些技术是用于单克隆抗体分离的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代方案。

本发明提供一种抗体，其适用于诊断FZD10相关疾病、判定通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效、筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象。本发明成功地建立了能够在免疫组织化学染色或流式细胞仪中以高特异性检测出FZD10蛋白质的小鼠单克隆抗体克隆(10A8H4G4)。当该抗体克隆用于肺癌临床样品的免疫组织化学染色时，在通过RealTime-PCR证实了FZD10的表达水平高的肺癌样品中，观察到阳性结果，但在证实了FZD10的表达水平低的肺癌样品中，几乎没有染色。此外，当使用市售的抗FZD10抗体时，在由FZD10强制表达细胞株、非表达细胞株中任一种制得的样品中，均观察到染色，对此，当使用本发明的抗FZD10抗体时，在由FZD10强制表达细胞株制得的样品中有明显的特异性染色。这样的具有高抗原特异性的本发明的抗体，有利于选择具有高FZD10表达水平的患者，并且有利于选择通过FZD10抑制剂进行的治疗有效性较高的患者。

本发明的抗FZD10小鼠单克隆抗体克隆(10A8H4G4)的重链可变区(H链V区)与轻链可变区(L链V区)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8中。

重链可变区与轻链可变区中包含的CDR(互补决定区)可以根据本领域的公知方法进行确定。例如，由Kabat等(Kabat E.A.et al.,(1991)Sequence of Proteins ofImmunological Interest.5th Edition)或Chothia等(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)196；901-917)记载的方法一般用于CDR的确定。由Kabat的定义确定的本发明的抗FZD10小鼠单克隆抗体克隆(10A8H4G4)的重链可变区的CDR1、2、3分别示于SEQ ID NO:1、2、3，该克隆的轻链可变区的CDR1、2、3，分别示于SEQ ID NO:4、5、6。

因此，本发明提供一种抗体或其抗原结合性片段，其能够与FZD10蛋白质或其部分肽结合，所述抗体或其抗原结合性片段包含重链可变区与轻链可变区中一者或两者，其中，

所述重链可变区包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；以及

CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

所述轻链可变区包含：

CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；以及

CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在本发明中，本发明的抗体所结合的FZD10蛋白质的部分肽优选为FZD10蛋白质的N末端细胞外结构域肽，例如包含FZD10蛋白质(SEQ ID NO:22)的第21位～161位对应的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)，并且包含选自SEQ ID NO:22中的氨基酸序列。更优选的是，本发明中FZD10蛋白质的部分肽可以包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

上述包含“CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列”的重链可变区的一个实例是，包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的重链可变区。上述包含“CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列”的轻链可变区的一个实例是，包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种抗体或其抗原结合性片段，其包含重链可变区或轻链可变区中的一者或两者，其中，上述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，上述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

本发明的抗体可通过常规方法进行制备。例如，可以根据常规的基因重组技术，将编码抗体多肽的多核苷酸导入合适的载体中，将该载体导入宿主中，并从上述宿主中产生抗体，由此来制备抗体(例如参照Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-75)。

编码本发明的抗体的可变区(V区)的多核苷酸的核酸序列，可以从本发明的抗体的V区的氨基酸序列中推定。作为编码本发明的抗体克隆的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)的核酸序列，例如可以分别使用SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11中所示的核酸序列。编码本发明的抗体的V区的多核苷酸，可以通过固相合成技术(Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron(1992)48,2223-311；Matthes et al.,EMBO J(1984)3,801-5)与寡核苷酸合成技术(Jones et al.,Nature(1986)321,522-5)这样的常规方法并基于序列信息进行合成。

将编码抗体V区的多核苷酸导入含有编码抗体恒定(C)区的多核苷酸的表达载体中。

为了产生本发明中使用的抗体，将编码该抗体(抗体基因)的多核苷酸导入表达载体中，并且使得抗体基因可以在表达控制要素(例如，增强子、启动子)的控制下进行表达。使用表达载体，转化宿主细胞，并表达抗体。

在抗体基因的表达中，可以将编码抗体的H链的多核苷酸与编码L链的多核苷酸导入不同的表达载体中，然后将得到的重组表达载体同时转化到宿主细胞中。或者，可以将编码抗体的H链的多核苷酸与编码L链的多核苷酸两者一起导入同一表达载体中，然后将得到的重组表达载体转化到宿主细胞中(例如，国际公开公报第94/11523号)。

抗体基因可以通过公知的方法进行表达。在哺乳动物细胞中进行表达时，可以将常规的有用的启动子、待表达的抗体基因、poly(A)信号(位于抗体基因的3’末端的下游)进行功能性连接。例如，可以使用人巨细胞病毒早期启动子/增强子***作为有用的启动子/增强子***。

其他启动子/增强子***中，例如源自病毒(例如，逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40))的启动子/增强子***、源自哺乳动物细胞的启动子/增强子***(例如，人延伸因子1α(HEF1α))也可以用于本发明中抗体的表达。

当使用SV40启动子/增强子***时，可以通过Mulligan等(Nature(1979)277,108-14)的方法容易地进行基因表达。当使用HEF1α启动子/增强子***时，可以通过Mizushima等(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)的方法容易地进行基因表达。

在大肠杆菌中进行表达时，可以将常规的有用的启动子、用于分泌关注对象的抗体的信号序列、以及抗体基因进行功能性连接。可以使用lacZ启动子或araB启动子作为启动子。当使用lacZ启动子时，可以通过Ward等(Nature(1989)341,544-6.；FASBE J.(1992)6,2422-7)的方法进行基因表达，另一方面，当使用araB启动子时，可以通过Better等(Science(1988)240,1041-3)的方法进行基因表达。

关于用于抗体分泌的信号序列，当关注对象的抗体分泌到大肠杆菌的细胞间隙中时，可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379-83.)。对分泌到细胞间隙中的抗体进行分离，然后将抗体再次折叠并且使抗体具有适当的立体结构。

可以使用源自病毒(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛***瘤病毒(BPV))等的复制起点。为了提高宿主细胞株中的基因拷贝数，在表达载体中，还可以包含氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等选择标记基因。关于本发明中使用的抗体的产生，可以使用包含真核生物和原核生物的细胞株的任选表达***。真核生物细胞包括动物(例如，哺乳类、昆虫、霉菌与真菌、酵母)的构建细胞株。原核生物细胞包括大肠杆菌细胞等细菌细胞。本发明中使用的抗体优选在CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、Vero细胞、HeLa细胞等哺乳动物细胞中进行表达。

然后，在体外或体内培养转化而得的宿主细胞，产生关注对象的抗体。宿主细胞的培养可以通过任选的公知方法进行。本说明书中使用的培养基可以是DMEM、MEM、RPMI-1640、IMDM培养基。培养基可包含胎牛血清(FCS)等血清补充剂。

在重组抗体的产生中，除了上述宿主细胞外，也可以用转基因动物作为宿主。例如，将抗体基因***编码动物乳汁中原本产生的蛋白质(例如β酪蛋白)的基因的指定位点，来制备融合基因。将含有导入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入非人动物的胚胎中，然后将上述胚胎导入雌性动物体内。体内具有上述胚胎的上述雌性动物生出转基因非人动物。关注对象的抗体由上述转基因非人动物或其后代分泌到母乳中。为了增加含有上述抗体的母乳的量，可以向上述转基因动物给药适当的激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。

可以将以上述方式表达并产生的抗体从细胞或宿主动物的体内分离、纯化。本发明中使用的抗体的分离和纯化可以在亲和柱上进行。也可以使用常规用于抗体的分离和纯化的其他方法，因此，方法没有特别限定。例如，可以单独或组合使用各种色谱、过滤、超滤、盐析、透析等，来分离和纯化关注对象的抗体(Antibodies A LaboratoryManual.Ed.Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。

(ii)抗体片段

已经开发了各种技术用于产生抗体片段。以往，这些片段是通过分解消化完整抗体的蛋白质而获得的(例如参照Morimoto et al.,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)与Brennan et al.,Science,229:81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞来直接产生这些片段。例如，可以从抗体噬菌体库中对抗体片段进行分离。或者，可以直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段，并进行化学偶联，以形成F(ab’)₂片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中对F(ab’)₂片段进行分离。用于产生抗体片段的其他技术对于本领域技术人员而言是显而易见的。在另一实施方式中，最合适的抗体是单链Fv片段(scFv)。参照WO93/16185号；US5571894号；以及US5587458号。此外，抗体片段也可以是，例如US5641870号中记载的“直链状抗体”。此类直链状抗体片段可具有单一特异性或双重特异性。

(iii)标记化抗体

本发明的抗体任选与亲和标记、酶标记、放射性同位素标记、荧光标记、化学发光标记结合。例如，根据存在于表达FZD10的癌组织中并且可被检测出的标记的存在，可以判定待诊断对象中癌症或肿瘤的有无。此外，通过肿瘤组织中的标记的局部存在性，也可以判定疾病的扩大。

适合使用的标记例如包括：荧光素与罗丹明等荧光标记；荧光素酶等酶标记。所使用的可检测的/检测用的标记，根据所使用的成像模式进行选择。可以使用本领域公知的方式和技术来制备这些标记与抗体形成的结合体。在本发明中，本发明的抗体可以在使用前立即与所期望的标记结合，也可以提供与标记结合而成的抗体。

就抗体与标记形成的结合体而言，可以使用：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双官能性衍生物(例如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)、双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)等各种双官能性蛋白质偶联剂来进行制备。或者，可以通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体及标记的融合蛋白质。作为这样的融合蛋白质的优选实例，可举出：ECFP、EYFP、EGFP等标记蛋白质与抗体形成的融合蛋白质。

III.FZD10相关疾病的诊断、通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象的筛选 (治疗前诊断)、或通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效的判定(治疗后诊断)

FZD10可用作FZD10相关疾病的诊断标记物，也可用作在上述疾病的患病对象中对于FZD10抑制剂的响应性和上述抑制剂的药效进行评价的标记物。因此，本发明的抗体可用作下述标记物的检测试剂，该标记物用于：诊断癌症等FZD10相关疾病、筛选通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象、或判定通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效。

更具体而言，通过本发明的抗体检测出从对象分离的样品中的FZD10蛋白质，可以诊断FZD10相关疾病、筛选通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象、或判定通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效。因此，就本发明而言，通过使用本发明的抗体，在从对象分离得到的样品中检测出FZD10蛋白质，从而提供：诊断对象中FZD10相关疾病或上述疾病的发病因素的方法、筛选FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象的方法、以及判定通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效的方法。这些方法包括下述阶段：

(a)使从对象中分离得到的样品与本发明的抗体或其抗原结合性片段接触；

(b)通过检测出上述抗体或其抗原结合性片段与上述样品的结合，来检测出上述样品中的FZD10蛋白质；以及

(c)将上述样品中的FZD10蛋白质水平与对照进行比较。

在经典的实施方式中，上述样品是从上述对象分离的细胞或组织，优选是从上述对象分离的组织。因此，对于从对象分离的样品，通常都在体外(in vitro)实施本发明的各方法。通过活体检查(活检)或采血等技术从对象中分离组织或细胞的手段是公知的。或者，可以利用通过用于治疗的医疗处理(外科手术等)从对象取出的生物样品。在与抗体接触之前，还可以对从对象分离的细胞或组织进行适当处理。例如，通常将从对象获得的组织样品在冷冻后进行切片，并进一步通过酒精、***等进行固定，可以作为用于免疫组织学分析的样品。或者，在用***等对组织样品或培养细胞等进行固定后，可以将其包埋在石蜡中以获得用于免疫组织学分析的切片。

可以通过本领域技术人员公知的方法，检测出本发明的抗体或其抗原结合性片段与样品的结合，即与样品中抗原蛋白质的结合。更具体而言，在使本发明的抗体与上述样品接触后，通过洗净除去样品中未与FZD10结合的物质，随后检测出样品中残留的抗体，由此可以检测出本发明的抗体与样品中的FZD10蛋白质的结合。此时，当抗体被直接标记时，可以通过检测出标记来检测出与FZD10蛋白质结合的本发明的抗体的存在。如果标记是酶、荧光物质、发光物质、粒子等可检测出的标记，则可以立即检测出这些标记。此外，当用生物素等亲和物质(结合性物质)标记本发明的抗体时(亲和标记)，可以通过标记抗生物素蛋白等结合配体来捕捉抗体的存在。或者，当本发明的抗体未被直接标记时，可以通过针对抗体的结合试剂来检测出本发明的抗体。例如，作为抗体结合试剂，可以对于蛋白质A或抗体而标记抗体，用于抗体的检出。

在诊断FZD10相关疾病时，在上述阶段(c)中，当与对照水平(正常对照水平，优选从未患FZD10相关疾病的健康对象中分离的样品中FZD10蛋白质的表达水平)相比FZD10蛋白质水平较高时，表示对象患有FZD10相关疾病或有发生FZD10相关疾病的风险。

此外，当筛选通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象时，在上述阶段(c)中，当与对照水平(优选被诊断患有FZD10相关疾病的对象的组织中的FZD10蛋白质的表达水平)相比FZD10蛋白质水平相同或更高时，表示FZD10抑制剂在对象中具有较高的治疗效果。

另一方面，在判定通过FZD10抑制剂进行治疗后的药效时，在上述阶段(c)中，当与对照水平(优选从给药前的对象中分离得到的样品中FZD10蛋白质的表达水平)相比FZD10蛋白质水平较低时，表示在对象中具有药效。

通过本发明的诊断方法而表示为具有FZD10相关疾病的患者，成为通过FZD10抑制剂的治疗对象的可能性较高。因此，根据本发明的诊断方法，可以将FZD10抑制剂给药到表示具有FZD10相关疾病的患者中。或者，表示为通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的患者，也可以通过筛选并给药FZD10抑制剂。并且，在接受了FZD10抑制剂的给药的患者中，即使已经表示具有上述抑制剂产生的治疗效果，也可以继续对同一患者给药FZD10抑制剂。

即，本发明涉及治疗FZD10相关疾病的方法，其包括下述工序：通过本发明的方法，选定选自下组中的任选患者，并对该患者给药FZD10抑制剂。

上述患者包括：

通过本发明的诊断方法，表示为患有FZD10相关疾病的患者；

表示通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的患者；以及

接受了FZD10抑制剂的给药的患者中，表示已经具有该抑制剂产生的治疗效果的患者。

在本发明中，可以使用公知的化合物作为给药到患者的FZD10抑制剂。在本说明书中，FZD10抑制剂还包含：针对FZD10表达细胞表现出细胞伤害活性的抗体和抑制FZD10的表达的双链RNA分子。作为此类抗体或双链RNA分子，可举出：例如WO2005/004912或WO2007/148417中公开的针对FZD10的抗体、以及WO2006/013733中公开的FZD10特异性的siRNA。

在本发明的相关内容中，从被认为不患有FZD10相关疾病(例如，非癌性)的生物样品中测得的对照水平被称为“正常对照水平”。当从对象中分离的样品中的FZD10蛋白质水平与正常对照水平相比较高时，可以诊断为对象患有应该接受治疗的FZD10相关疾病。

另一方面，从被认为患有FZD10相关疾病(例如，癌性)的生物样品中测得的对照水平被称为“疾病对照水平(例如，癌性对照水平)”。当从FZD10抑制剂治疗前的对象中分离的样品中的FZD10蛋白质水平与疾病对照水平相比相同或较高时，可以诊断为对象通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高。

此外，当从通过FZD10抑制剂治疗后的对象中分离得到的样品中的FZD10蛋白质水平低于给药前的同一对象的疾病对照水平时，可以诊断为具有治疗的药效，即对象通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高。

在特定的实施方式中，也可以将从患有应该治疗的FZD10相关疾病(例如，癌)的器官的非患病区域(例如，非癌性区域)获得的正常细胞(或组织)作为正常对照。在另一实施方式中，可以基于对被认为处于疾病状态(例如，癌性或非癌性)的对象来源的样品中预先测得的FZD10蛋白质水平进行分析而得到的结果，通过统计的方法来确定对照水平。此外，对照水平可以从先前进行了试验的样品(细胞或组织)来源的表达模式的数据库中得到。当作为评价对象的样品是组织样品时，优选使用源自相同组织的样品作为对照样品。

此外，根据本发明的一个实施方式，可以将生物样品中的FZD10蛋白质水平与从多个参照样品中测得的多个对照水平进行比较。优选从与对象来源的生物样品的组织类型相似的组织类型来源的参照样品中测得的对照水平。此外，优选使用在明确了疾病状态的群体中的FZD10蛋白质水平的基准值。可以通过本领域公知的任选方法获得基准值。例如，可以使用平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围作为基准值。

当样品中的FZD10蛋白质水平比对照水平例如高10％、高25％或高50％、或者大于对照水平的1.1倍、大于其1.5倍、大于其2.0倍、大于其5.0倍、大于其10.0倍或以上时，可认为样品中的FZD10蛋白质的水平较高。当样品中的FZD10蛋白质的水平比对照水平例如低10％、低25％或低50％、或者低于对照水平的1/1.1、低于其1/1.5、低于其1/2.0、低于其1/5.0、低于其1/10.0或以下时，可认为样品中的FZD10蛋白质的水平较低。

在经典的实施方式中，FZD10相关疾病是表达FZD10的癌症。表达FZD10的癌症为例如：滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、结直肠癌(大肠癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(AML)等，但并不限定于此。

在其他实施方式中，本发明提供检测出FZD10相关疾病或该疾病的发病因素的诊断标记物的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合性片段来检测出样品中的FZD10蛋白质作为上述诊断标记物。已知：与正常组织相比，FZD10在某些类型的癌细胞中的表达得到增强。因此，如果可以特异性地检测出FZD10的表达水平，则可将其用作相关疾病的诊断标记物。在本发明的相关内容中，FZD10相关疾病或该疾病的发病因素的诊断标记物是从对象中分离得到的样品中的FZD10蛋白质，该FZD10蛋白质通过与本发明的抗体或其抗原结合性片段之间的结合而被检测出来，当该FZD10蛋白质的表达水平与对照水平相比较高时，表示该对象患有上述疾病或具有发病风险。此处，上述对照水平是正常对照水平，优选为从未患有FZD10相关疾病的健康对象中分离得到的样品中的FZD10蛋白质的表达水平。通常，对照水平优选为与下述组织相同的组织中的表达水平，该组织为待检测诊断标记物的癌细胞所来源的组织。

本发明还提供本发明的抗体或其抗原结合性片段，其用于诊断FZD10相关疾病或该疾病的发病因素。或者，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合性片段的用途，其用于制备对FZD10相关疾病或该疾病的发病因素进行诊断的试剂。

此外，本发明提供检测出FZD10抑制剂治疗应答性标记物的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合性片段来检测出样品中的FZD10蛋白质作为上述应答性标记物的阶段。已知：FZD10在某些癌细胞中的表达得到特异性增强，并且这些癌细胞的增殖因FZD10抑制剂而被抑制(WO2005/004912、WO2006/013733、WO2007/148417)。即，可以使用FZD10的表达作为指标来预测对FZD10抑制剂的应答性。如果FZD10以高水平表达，则可以能够期待FZD10抑制剂对细胞增殖的抑制作用。因此，如果可以特异性检测出FZD10的表达水平，则可将其用作FZD10抑制剂治疗应答性标记物。在本发明的相关内容中，FZD10抑制剂治疗应答性标记物是从对象中分离得到的样品中的FZD10蛋白质，其通过与本发明的抗体或其抗原结合性片段之间的结合而被检测出来，当该FZD10蛋白质的表达水平与对照水平相比相同或更高时，表示FZD10抑制剂在上述对象中的治疗效果较高。此处，上述对照水平优选为疾病对照水平，即从被认为患有FZD10相关疾病的对象的疾病部位中分离得到的样品中FZD10蛋白质的表达水平，特别优选为在治疗前从通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象中分离得到的样品中FZD10蛋白质的表达水平。

此外，本发明还提供本发明的抗体或其抗原结合性片段，其用于对通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象进行筛选。或者，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合性片段的用途，其用于制备对通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象进行筛选的试剂。

本发明进一步提供检测出FZD10抑制剂的药效标记物的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合性片段来检测出样品中的FZD10蛋白质作为该药效标记物的阶段。已知：FZD10在某些癌细胞中的表达得到特异性增强，并且这些癌细胞的增殖因FZD10抑制剂而被抑制(WO2005/004912、WO2006/013733、WO2007/148417)。因此，具有这种癌细胞的癌组织会因FZD10抑制剂而减少或死亡。即，使用FZD10的表达水平作为指标，可以对具有这种癌细胞的对象中的FZD10抑制剂的药效进行评价。如果从具有FZD10阳性癌细胞的组织中分离得到的样品中FZD10的表达水平，与通过FZD10抑制剂进行治疗前分离得到的样品相比有所降低，则可认为FZD10阳性癌细胞因FZD10抑制剂而减少。因此，如果可以特异性检测出FZD10的表达水平，则可将其用作FZD10抑制剂的药效标记物。在本发明的相关内容中，FZD10抑制剂的药效标记物是指，通过与本发明的抗体或其抗原结合性片段之间的结合而被检测出来的、从给药了FZD10抑制剂的对象中分离得到的样品中的FZD10蛋白质，当该FZD10蛋白质的表达水平低于对照水平时，表示FZD10抑制剂在上述对象中具有药效。此处，上述对照水平优选为在给药前从上述对象的疾病部位中分离得到的样品中FZD10蛋白质的表达水平。

本发明提供本发明的抗体或其抗原结合性片段，其用于对通过FZD10抑制剂治疗后的药效进行判定。或者，本发明提供本发明的抗体或其抗原结合性片段的用途，其用于制备对通过FZD10抑制剂治疗后的药效进判定的试剂。

IV.用于诊断FZD10相关疾病、筛选通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象、或判定通过FZD10抑制剂治疗后的药效的试剂或试剂盒

本发明提供用于诊断FZD10相关疾病、筛选通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象、或判定通过FZD10抑制剂治疗后的药效的试剂或试剂盒。具体而言，这些试剂盒含有本发明的抗体或其抗原结合性片段作为FZD10蛋白质的检测试剂。在一个实施方式中，用于本发明的诊断试剂或试剂盒的抗体可以用荧光物质、发光物质、放射性同位素等进行标记。用于标记抗体的方法与用于检测出标记抗体的方法是本领域所公知的，并且本发明可以利用任选的标记与方法。

本试剂盒可以包含本发明的抗体或其抗原结合性片段与其他标记物检测试剂的组合。本试剂盒可以进一步包含对于FZD10为阳性和为阴性的对照试剂、以及用于检测出本发明的抗体的二次抗体。例如，被认为高表达FZD10的细胞株的培养切片或组织样品，可用作有用的阳性对照试剂。此外，例如从健康对象或非癌性组织中获得的组织样品可以用作有用的阴性对照试剂。用于检测出本发明的抗体的二次抗体优选用荧光物质、发光物质、放射性同位素、酶进行标记。本发明的试剂盒可以进一步包含缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器、记载使用说明的添附书文(例如，书类、胶带、CD-ROM等)，也可以包含从商业立场或用户的立场来看所期望的其他材料。这些试剂等可以保持在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶子、小瓶、试管等。容器可以由玻璃或塑料等各种材料形成。

在本说明书中已经详细说明了关于本发明的特定实施方式，但应该理解为，上述说明实际上是示例性且说明性的，旨在说明本发明与其优选的实施方式。通过常规的实验，本领域技术人员在不脱离本发明的精神与范围的情况下，可以容易地在其中进行各种变更与修正。因此，本发明不被上述说明所限定，旨在由添附的权利要求的范围及其等价物所限定。

以下，将参考实施例来更详细地说明本发明。然而，尽管以下材料、方法和实施例在本发明的某实施方式的制备与使用中能够帮助本领域技术人员，但它们仅用于说明本发明的实施方式，绝对没有限定本发明的范围的意图。本领域技术人员可以使用与本说明书中记载的那些相类似或等同的方法和材料来在本发明的实施或试验中使用。

需要说明的是，本说明书中引用的所有的现有技术文献均并入本说明书中作为参照。

实施例

下面将举出实施例来详细说明本发明，但这些实施例并不限定本发明。

[材料与方法]

细胞培养

将FZD10表达载体导入购自ATCC的人结肠癌细胞株即DLD1中，制得FZD10强制表达细胞株(FZD10/DLD1)，并且制备导入有空载体的细胞株(Mock/DLD1)作为阴性对照。在37℃、5％CO₂的加湿气氛中，将其维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和0.8mg/mL GENETICIN的RPMI-1640中。将国立癌症研究中心罕见癌症中心(NationalCancer Center Rare Cancer Center)分与的人滑膜肉瘤细胞株即SYO-1，在37℃、5％CO₂的加湿气氛中，维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM中。将购自JCRB的人食管癌细胞株即T.T，在37℃、5％CO₂的加湿气氛中，维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素的DMEM/F12(1:1)中。将购自ATCC的人肺癌细胞株即H727，在37℃、5％CO₂的加湿气氛中，维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640中。将购自ATCC的人结肠癌细胞株即COLO201，在37℃、5％CO₂的加湿气氛中，维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和4.5g/L葡萄糖的RPMI-1640中。将购自ATCC的人结肠癌细胞株即LoVo，在37℃、CO₂的加湿气氛中，维持在补充有20％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的F12中。

临床样本

来自外科手术切除的肺癌中的组织样本(***固定石蜡切片、冷冻组织)及其相应的临床信息，是在取得书面知情同意的前提下，从神奈川癌症中心获得的。

免疫组织化学染色(IHC)

将***固定石蜡切片化而得的FZD10/DLD1、Mock/DLD1、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201和临床样品在二甲苯中每次浸渍3分钟地浸渍3次并且脱蜡后，在100％乙醇中每次浸渍1分钟地浸渍两次，在90％、70％、50％的乙醇中各浸渍1分钟并使其再水合。将为了抗原活化处理而浸渍在抗原活化液pH9(Nichirei Biosciences)中的切片进行培养，将FZD10/DLD1、Mock/DLD1在125℃下培养30秒钟、将SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201和临床样品在95℃下培养40分钟。培养后，将其在室温下放置20分钟并用流水洗涤5分钟。将其浸渍在3.0％过氧化氢水中10分钟以阻断内因性过氧化物酶，通过洗涤缓冲液(Wash Buffer)(TBS-T(Takara Bio))，每次5分钟地洗涤3次。此外，为了阻断非特异性反应，将适量的蛋白质阻断(Protein Block)液(Dako)滴在目的切片上，静置10分钟。通过湿润箱，分别滴加适量的1次抗体(FZD10Ab(10A8H4G4)、FZD10(L164)pAb、FZD10 PolyclonalAb)，静置60分钟后，通过洗涤缓冲液(Wash Buffer)，每次5分钟地洗涤3次。通过湿润箱，滴加适量的Histofine Simple Stain MAX-PO(Nichirei Biosciences)作为2次抗体，静置30分钟。通过洗涤缓冲液(Wash Buffer)每次5分钟地洗涤3次。通过DAB基质溶液(NichireiBiosciences)进行显色反应。将滑动切片浸渍在苏木精(Dako)中20秒钟，用流水洗涤。分别在50％、70％、90％乙醇中浸渍1分钟，在100％乙醇中每次1分钟地浸渍2次，进行脱水。最后，将切片在二甲苯中每次3分钟地浸渍两次，使其透彻，并通过Mount-Quick(DAIDOSANGYO)将其封入。

实时(RT)PCR

使用RNeasy Mini kit(QIAGEN)，从癌细胞株(SYO-1、COLO201)中提取总RNA。就临床冷冻组织(肺鳞状细胞癌)而言，将冷冻组织片浸入TRIzol Reagent(Invitrogen)中、磨碎、并进行氯仿提取。向得到的提取液中添加大致等量的70％乙醇，使用RNeasy Mini kit(QIAGEN)提取总RNA。使用SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)的逆转录酶，由总RNA合成cDNA。使用KAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR kit(KAPA Biosystems)，并且以cDNA为模板进行PCR反应。表达分析目的基因是FZD10，持家基因(housekeepinggene)是GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。就FZD10而言，使用FZD10-11F:5'-GTGTGCAGCCGTAGGTTAAAG-3'(SEQ ID NO:12)、FZD10R5:5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3'(SEQ ID NO:13)的引物组进行扩增，就GAPDH而言，使用GAPDHRT-PCR Fw:5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(SEQ ID NO:14)、GAPDH RT-PCR Re:5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(SEQ ID NO:15)的引物组进行实时(RT)PCR反应。随时间推移地监测PCR扩增产物的量，并在PCR扩增产物的指数扩增的区域中设定阈值来计算出Ct值。将Ct值应用于校准曲线以计算出未知样品的浓度。通过将FZD10基因的定量值除以GAPDH基因的定量值，来将样品之间的模板量进行标准化，比较FZD10基因的表达量。

流式细胞仪(FCM)

将SYO1、T.T、H727和LoVo分别维持在推荐的培养基中，直到早期融合(early-confluent)。接下来，为了避免细胞表面抗原的变性，用细胞解离用溶液(CellDissociation Solution；SIGMA,MO)来分离细胞，并用0.5％BSA/PBS使其悬浮。使悬浮的细胞通过细胞筛，除去团块，并计算细胞数。将细胞等分到96孔测定板(2×10⁵个/50μL)中。添加50μL稀释了的试验抗体或培养上清液，并使其在4℃下静置1小时。将测定板在1500rpm、4℃下离心5分钟，并且在去除上清液后，将测定板用150μL的0.5％BSA/PBS洗涤两次。使其与Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen,CA)20mg/mL混合，并在黑暗中在4℃下静置1小时。将测定板在1500rpm、4℃下离心5分钟，并且在去除上清液后，将测定板用150μL的0.5％BSA/PBS洗涤两次，并用120μL的0.5％BSA/PBS使细胞悬浮。根据制造商的使用说明书，通过FACS Calibur(Becton Dickinson,NJ)来评价试验抗体的结合模式和特异性。

[实施例1]抗FZD10单克隆抗体的制备

(1)使用可溶型FZD10蛋白质作为免疫原，获得产生抗FZD10抗体的杂交瘤

由于FZD10是膜蛋白质，因此细胞外结构域可以是与被固定了的膜蛋白质反应的抗体的制作中的免疫原。由于FZD10的N末端以外的细胞外结构域非常短并且被认为难以成为抗原，因此选择N末端的细胞外结构域(1-161氨基酸)作为免疫原，并且使用除信号肽之外的可溶型FZD10蛋白质(21-161氨基酸区域)(SEQ ID NO:9)作为免疫原来制备单克隆抗体。向弗氏佐剂(Freund adjuvant)中加入50μg抗原肽后，使其乳化，并通过对Balb/c小鼠(日本SLC株式会社)进行皮下注射来进行初次免疫。通过皮下注射以相同方式制得的25μg抗原肽，以实施第二次以后的免疫。从最后一次免疫起3天后，由小鼠无菌制备脾细胞，并按照常规方法，通过聚乙二醇法进行与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的细胞融合。

(2)产生抗FZD10抗体的杂交瘤的选择

就抗FZD10抗体的选择而言，首先，通过使用了可溶性FZD10蛋白质的ELISA法，筛选具有与FZD10的结合性的抗体。对于由ELISA法选择的抗体，通过免疫染色法进行进一步的选择。通过使用了表达全长FZD10蛋白质(SEQ ID NO:22)的FZD10强制表达细胞株FZD10/DLD1的免疫组织化学染色，来进行免疫染色法的选择。即，在将强制表达了全长FZD10蛋白质的FZD10强制表达细胞株FZD10/DLD1进行***固定石蜡切片化后，实施免疫染色，选择观察到强反应的杂交瘤。

在经过试验的杂交瘤中，将已确认了以高水平产生FZD10特异性抗体的杂交瘤克隆10A8H4G4的免疫组织化学染色结果示于图2中。如图2的照片和图表所示，当用10A8H4G4进行染色时，在由FZD10强制表达细胞株FZD10/DLD1制得的石蜡切片中观察到染色，即表示为FZD10阳性细胞的比例较高。另一方面，在作为阴性对照的由导入有空载体的细胞株(Mock/DLD1)制得的石蜡切片中，几乎没有观察到染色，表示为FZD10阳性细胞的比例较低。根据这些结果，表示：杂交瘤克隆10A8H4G4可用作产生在免疫组织化学染色中特异性检测出FZD10的抗体的杂交瘤。

另一方面，当使用市售的抗体(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)进行染色时，在FZD10/DLD1和Mock/DLD1中均观察到染色(在高比例的细胞中检测出信号)。因此，怀疑通过这些市售的抗体所检测出的结果可能含有假阳性信号。

根据上述结果，表面：本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)，在免疫组织化学染色中，显然具有与市售的抗FZD10抗体相比而能够高特异性地检测出FZD10的有利的性质。

选择上述杂交瘤克隆10A8H4G4以产生用于接下来的实验的抗体。大量培养杂交瘤克隆10A8H4G4，2～3周后采集培养液。使用蛋白A柱(GE Healthcare，NJ)从培养液中纯化抗体。在本说明书中，本发明的抗体也称为克隆10A8H4G4。

[实施例2]抗FZD10单克隆抗体的特异性的评价

接下来，使用FZD10表达量不同的各种细胞株来评价10A8H4G4的特异性。即，将使用了10A8H4G4的免疫组织化学染色与流式细胞仪的结果进行比较，并且讨论是否可以观察到与FZD10蛋白质的表达量相对应的染色。在这里，在使用了各种癌症类型的细胞株而得的mRNA的表达分析数据库Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)中，表示了上述表达在肺癌、食道癌和结直肠癌(大肠癌)中得到显着上调(图1)。因此，将源自这些癌症类型的细胞株用于以下的分析。

首先，通过使用了10A8H4G4的流式细胞仪，确认了内因性FZD10蛋白质在源自各种人癌组织的细胞株的细胞膜上的表达。如图3所示，除了已知内因性的FZD10蛋白质的表达的、源自人滑膜肉瘤SYO-1之外，在源自人食道癌的细胞株T.T和源自人肺癌的细胞株H727中，通过使用了10A8H4G4的流式细胞仪，也检测出阳性信号。另一方面，在已知为FZD10非表达细胞株的、源自人结肠癌细胞株LoVo中，通过使用了10A8H4G4的流式细胞仪，未检测出阳性信号。

随后，对于由上述细胞株制得的石蜡切片，使用10A8H4G4进行免疫组织化学染色。如图3B所示，用10A8H4G4染色的结果为，在由确认了表达FZD10的细胞株SYO-1、T.T、H727制得的石蜡切片中观察到染色。在这些石蜡切片中，与流式细胞仪的结果相关，在高比例的细胞中检测到阳性信号。另一方面，在由FVD10非细胞株即LoVo制得的石蜡切片中几乎不染色，并且几乎检测不到阳性信号。

以上结果表示，本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)是能够在流式细胞仪和免疫组织化学染色中高特异性地检测出样品中的FZD10蛋白质的有用工具。

[实施例3]肿瘤移植模型和临床样品中FZD10蛋白质的检出

就本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)在免疫组织化学染色中的特异性而言，使用由癌细胞株的小鼠异种移植肿瘤制得的石蜡切片以及肺癌临床样品进行评价。通过免疫组织化学染色和RealTime-PCR，在由SYO-1、COLO 201细胞株的小鼠异种移植肿瘤制得的石蜡切片以及肺癌临床样品1～6的肿瘤区域和非肿瘤区域中，对FZD10的蛋白质和RNA的表达进行检测，检测结果如图4所示。

如图4所示，在由确认了FZD10的RNA的高表达的细胞株SYO-1的小鼠异种移植瘤制得的石蜡切片中，用10A8H4G4进行了染色的细胞，即FZD10阳性细胞被检测出，但在由FZD10的RNA的表达水平低的细胞株COLO 201的小鼠异种移植肿瘤制得的石蜡切片中，用10A8H4G4进行了染色的细胞，即FZD10阳性细胞较少。该结果表明，本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)是用于获得与免疫组织化学染色法中样品中的FZD10蛋白质的表达水平相关的检测结果的有用工具。

此外，在确认了肿瘤区域特异性的FZD10的RNA的表达的肺癌临床样品5中，用10A8H4G4进行了染色的细胞，即FZD10阳性细胞被检测出，但在未确认肿瘤区域特异性的FZD10的RNA的表达的其他的肺癌临床样品中，几乎不染色，并且几乎检测不到FZD10阳性细胞。该结果表明，10A8H4G4也可以在临床样品中特异性检测出FZD10蛋白质。

[实施例4]抗FZD10单克隆抗体的可变区的氨基酸序列的分析

分析了本发明的抗FZD10抗体(10A8H4G4)的可变区的氨基酸序列。

使用RNeasy mini kit(QIAGEN)，从杂交瘤10A8H4G4中提取了总RNA。使用SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)，由总RNA合成了cDNA。用于cDNA合成的引物如下所述。

重链3’引物的mIGCUniRv：

5’-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3’(SEQ ID NO:16)

轻链3’引物的mIGKRv2：

5’-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3’(SEQ ID NO:17)

使用5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen),将dC的聚合物添加到cDNA末端，并使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)来扩增编码单克隆抗体的可变区的多核苷酸。用于扩增的引物如下所述。引物序列中的碱基“I”表示肌苷。

重链5’与轻链5’引物的5’RACE Abridged Anchor Primer：

5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’(SEQ ID NO:18)、

重链3’引物的mIGCUniRv2：

5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’(SEQ ID NO:19)、以及

轻链3’引物的mIGKNesRv2：

5’-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3’(SEQ ID NO:20)。

将PCR产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega)中。确定***片段区域的序列，并确定10A8H4G4的可变区(除信号序列外)的核酸序列。

小鼠单克隆抗体的重链可变区与轻链可变区的氨基酸与核酸序列确定如下。

10A8H4G4，重链可变区氨基酸序列(除信号序列外)：

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)(由SEQ IDNO:10中所示的核酸序列编码)

10A8H4G4，重链可变区核酸序列：

5’-CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTCTGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGAGCCTACTATGGTAATTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3’(SEQ ID NO:10)

10A8H4G4，轻链可变区氨基酸序列(除信号序列外)：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)(由SEQ ID NO:11中所示的核酸序列编码)

10A8H4G4，轻链可变区核酸序列：

5’-GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3’(SEQ ID NO:11)

由Kabat的定义确定的本发明抗体(10A8H4G4)的CDR序列如下所述。

重链CDR1(CDR-H1)：TSGLGVS(SEQ ID NO:1)；

重链CDR2(CDR-H2)：HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO:2)；

重链CDR3(CDR-H3)：RAYYGNYYALDY(SEQ ID NO:3)；

轻链CDR1(CDR-L1)：KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:4)；

轻链CDR2(CDR-L2)：WASTRKS(SEQ ID NO:5)；以及

轻链CDR3(CDR-L3)：QNDYSYPVT(SEQ ID NO:6)

工业实用性

本发明成功地制备了能够以高特异性对从临床样品等对象中分离得到的样品中的FZD10蛋白质进行检测的抗FZD10抗体。通过使用本发明的抗FZD10抗体，可以以高灵敏度和低背景地检测出样品中的FZD10蛋白质。因此，本发明的抗体可用于对表达FZD10的癌症等FZD10相关疾病进行诊断。此外，由于本发明的抗体可进行与样品中FZD10的表达水平相对应的FZD10检测，因此，其可用于筛选通过FZD10抑制剂产生的治疗效果较高的对象(治疗前诊断)或可用于对象中通过FZD10抑制剂的治疗后的药效判定(治疗后诊断)。

序列表

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.

<120> 针对FZD10的单克隆抗体及其用途

<130> ONC-A1605P

<150> JP 2016-197881

<151> 2016-10-06

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR1

<400> 1

Thr Ser Gly Leu Gly Val Ser

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR2

<400> 2

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR3

<400> 3

Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR2

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR

<400> 6

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Val Thr

1 5

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H链可变区

<400> 7

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Leu Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L链可变区

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Ala Asp

115

<210> 9

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FZD10免疫原片段

<400> 9

Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly Lys Cys Gln Pro

1 5 10 15

Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn Met Thr Arg Met

20 25 30

Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala Ala Ile Gln Leu

35 40 45

His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His Gly His Leu Arg

50 55 60

Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr Glu Gln Val Ser

65 70 75 80

Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln Ala Arg Leu Lys

85 90 95

Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp Pro Asp Ser Leu

100 105 110

Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn Tyr Leu Cys Met

115 120 125

Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg Gly

130 135 140

<210> 10

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H链可变区的核苷酸序列

<400> 10

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggtc tgggtgtgag ctggattcgt 120

cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180

tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag caaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaga 300

gcctactatg gtaattacta tgctttggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 11

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L链可变区的核苷酸序列

<400> 11

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

aaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300

ccggtcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gggctgat 348

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FZD10的人工合成的正向引物序列

<400> 12

gtgtgcagcc gtaggttaaa g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FZD10的人工合成的反向引物序列

<400> 13

gactgggcag ggatctcata 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH的人工合成的正向引物序列

<400> 14

acaacagcct caagatcatc ag 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH的人工合成的反向引物序列

<400> 15

ggtccaccac tgacacgttg 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH的人工合成的3'引物序列

<400> 16

ctgggaaggt gtgcacac 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL的人工合成的3'引物序列

<400> 17

gttgttcaag aagcacacga c 21

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH及VL的人工合成的5'引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n是肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(30)

<223> n是肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(35)

<223> n是肌苷

<400> 18

ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH的人工合成的3'引物序列

<400> 19

tggacaggga tccagagttc c 21

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL的人工合成的3'引物序列

<400> 20

cagatgttaa ctgctcactg gatgg 25

<210> 21

<211> 3288

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> CDS

<222> (485)..(2230)

<300>

<308> Genbank acc no. NM_007197.3

<309> 2015-12-31

<313> (1)..(3288)

<400> 21

cgagtcttct catcccggga cgcaaacctc gaaacagctg ccggctggtc ccggccgagg 60

ccggcgcagg gagggaggag ccgcccgggc tgtgggggcg ccgcgagctg ggccggcctc 120

ggtgtgcccg cgccgccagc ccgctccaga cgcgccacct gggcgctcca agaagaggcc 180

gaagtttgcc gcggccgtga gttggagctc gcgccgggcc gctgcgccgg gagctccggg 240

ggcttccctc gcttcccggt attgtttgca aactttgctg ctctccgccg cggcccccaa 300

ctcggcggac gccgggcgcg gagagccgag ccgggggcgc tgtgcgcagc gctcgggcca 360

ggccgggcgg gcatgggcgg gggcccgagc aggggtggag agccggggcc agcagcagcc 420

cgtgcccggg agcggcggcg ctgaggggcg cggagctccc cgcgaggaca cgtccaacgc 480

cagc atg cag cgc ccg ggc ccc cgc ctg tgg ctg gtc ctg cag gtg atg 529

Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met

1 5 10 15

ggc tcg tgc gcc gcc atc agc tcc atg gac atg gag cgc ccg ggc gac 577

Gly Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp

20 25 30

ggc aaa tgc cag ccc atc gag atc ccg atg tgc aag gac atc ggc tac 625

Gly Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr

35 40 45

aac atg act cgt atg ccc aac ctg atg ggc cac gag aac cag cgc gag 673

Asn Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu

50 55 60

gca gcc atc cag ttg cac gag ttc gcg ccg ctg gtg gag tac ggc tgc 721

Ala Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys

65 70 75

cac ggc cac ctc cgc ttc ttc ctg tgc tcg ctg tac gcg ccg atg tgc 769

His Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys

80 85 90 95

acc gag cag gtc tct acc ccc atc ccc gcc tgc cgg gtc atg tgc gag 817

Thr Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu

100 105 110

cag gcc cgg ctc aag tgc tcc ccg att atg gag cag ttc aac ttc aag 865

Gln Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys

115 120 125

tgg ccc gac tcc ctg gac tgc cgg aaa ctc ccc aac aag aac gac ccc 913

Trp Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro

130 135 140

aac tac ctg tgc atg gag gcg ccc aac aac ggc tcg gac gag ccc acc 961

Asn Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr

145 150 155

cgg ggc tcg ggc ctg ttc ccg ccg ctg ttc cgg ccg cag cgg ccc cac 1009

Arg Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His

160 165 170 175

agc gcg cag gag cac ccg ctg aag gac ggg ggc ccc ggg cgc ggc ggc 1057

Ser Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly

180 185 190

tgc gac aac ccg ggc aag ttc cac cac gtg gag aag agc gcg tcg tgc 1105

Cys Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser Cys

195 200 205

gcg ccg ctc tgc acg ccc ggc gtg gac gtg tac tgg agc cgc gag gac 1153

Ala Pro Leu Cys Thr Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu Asp

210 215 220

aag cgc ttc gca gtg gtc tgg ctg gcc atc tgg gcg gtg ctg tgc ttc 1201

Lys Arg Phe Ala Val Val Trp Leu Ala Ile Trp Ala Val Leu Cys Phe

225 230 235

ttc tcc agc gcc ttc acc gtg ctc acc ttc ctc atc gac ccg gcc cgc 1249

Phe Ser Ser Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Asp Pro Ala Arg

240 245 250 255

ttc cgc tac ccc gag cgc ccc atc atc ttc ctc tcc atg tgc tac tgc 1297

Phe Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Met Cys Tyr Cys

260 265 270

gtc tac tcc gtg ggc tac ctc atc cgc ctc ttc gcc ggc gcc gag agc 1345

Val Tyr Ser Val Gly Tyr Leu Ile Arg Leu Phe Ala Gly Ala Glu Ser

275 280 285

atc gcc tgc gac cgg gac agc ggc cag ctc tat gtc atc cag gag gga 1393

Ile Ala Cys Asp Arg Asp Ser Gly Gln Leu Tyr Val Ile Gln Glu Gly

290 295 300

ctg gag agc acc ggc tgc acg ctg gtc ttc ctg gtc ctc tac tac ttc 1441

Leu Glu Ser Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Tyr Tyr Phe

305 310 315

ggc atg gcc agc tcg ctg tgg tgg gtg gtc ctc acg ctc acc tgg ttc 1489

Gly Met Ala Ser Ser Leu Trp Trp Val Val Leu Thr Leu Thr Trp Phe

320 325 330 335

ctg gcc gcc ggc aag aag tgg ggc cac gag gcc atc gaa gcc aac agc 1537

Leu Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn Ser

340 345 350

agc tac ttc cac ctg gca gcc tgg gcc atc ccg gcg gtg aag acc atc 1585

Ser Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile

355 360 365

ctg atc ctg gtc atg cgc agg gtg gcg ggg gac gag ctc acc ggg gtc 1633

Leu Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly Val

370 375 380

tgc tac gtg ggc agc atg gac gtc aac gcg ctc acc ggc ttc gtg ctc 1681

Cys Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val Leu

385 390 395

att ccc ctg gcc tgc tac ctg gtc atc ggc acg tcc ttc atc ctc tcg 1729

Ile Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu Ser

400 405 410 415

ggc ttc gtg gcc ctg ttc cac atc cgg agg gtg atg aag acg ggc ggc 1777

Gly Phe Val Ala Leu Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly Gly

420 425 430

gag aac acg gac aag ctg gag aag ctc atg gtg cgt atc ggg ctc ttc 1825

Glu Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu Phe

435 440 445

tct gtg ctg tac acc gtg ccg gcc acc tgt gtg atc gcc tgc tac ttt 1873

Ser Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe

450 455 460

tac gaa cgc ctc aac atg gat tac tgg aag atc ctg gcg gcg cag cac 1921

Tyr Glu Arg Leu Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln His

465 470 475

aag tgc aaa atg aac aac cag act aaa acg ctg gac tgc ctg atg gcc 1969

Lys Cys Lys Met Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala

480 485 490 495

gcc tcc atc ccc gcc gtg gag atc ttc atg gtg aag atc ttt atg ctg 2017

Ala Ser Ile Pro Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met Leu

500 505 510

ctg gtg gtg ggg atc acc agc ggg atg tgg att tgg acc tcc aag act 2065

Leu Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys Thr

515 520 525

ctg cag tcc tgg cag cag gtg tgc agc cgt agg tta aag aag aag agc 2113

Leu Gln Ser Trp Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys Ser

530 535 540

cgg aga aaa ccg gcc agc gtg atc acc agc ggt ggg att tac aaa aaa 2161

Arg Arg Lys Pro Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys Lys

545 550 555

gcc cag cat ccc cag aaa act cac cac ggg aaa tat gag atc cct gcc 2209

Ala Gln His Pro Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro Ala

560 565 570 575

cag tcg ccc acc tgc gtg tga acagggctgg agggaagggc acaggggcgc 2260

Gln Ser Pro Thr Cys Val

580

ccggagctaa gatgtggtgc ttttcttggt tgtgtttttc tttcttcttc ttcttttttt 2320

ttttttataa aagcaaaaga gaaatacata aaaaagtgtt taccctgaaa ttcaggatgc 2380

tgtgatacac tgaaaggaaa aatgtactta aagggttttg ttttgttttg gttttccagc 2440

gaagggaagc tcctccagtg aagtagcctc ttgtgtaact aatttgtggt aaagtagttg 2500

attcagccct cagaagaaaa cttttgttta gagccctccc taaatataca tctgtgtatt 2560

tgagttggct ttgctaccca tttacaaata agaggacaga taactgcttt gcaaattcaa 2620

gagcctcccc tgggttaaca aatgagccat ccccagggcc cacccccagg aaggccacag 2680

tgctgggcgg catccctgca gaggaaagac aggacccggg gcccgcctca caccccagtg 2740

gatttggagt tgcttaaaat agactccggc cttcaccaat agtctctctg caagacagaa 2800

acctccatca aacctcacat ttgtgaactc aaacgatgtg caatacattt ttttctcttt 2860

ccttgaaaat aaaaagagaa acaagtattt tgctatatat aaagacaaca aaagaaatct 2920

cctaacaaaa gaactaagag gcccagccct cagaaaccct tcagtgctac attttgtggc 2980

tttttaatgg aaaccaagcc aatgttatag acgtttggac tgatttgtgg aaaggagggg 3040

ggaagaggga gaaggatcat tcaaaagtta cccaaagggc ttattgactc tttctattgt 3100

taaacaaatg atttccacaa acagatcagg aagcactagg ttggcagaga cactttgtct 3160

agtgtattct cttcacagtg ccaggaaaga gtggtttctg cgtgtgtata tttgtaatat 3220

atgatatttt tcatgctcca ctattttatt aaaaataaaa tatgttcttt agtttgctgc 3280

taaaaaaa 3288

<210> 22

<211> 581

<212> PRT

<213> 人类

<400> 22

Met Gln Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gln Val Met Gly

1 5 10 15

Ser Cys Ala Ala Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly

20 25 30

Lys Cys Gln Pro Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn

35 40 45

Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala

50 55 60

Ala Ile Gln Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His

65 70 75 80

Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr

85 90 95

Glu Gln Val Ser Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln

100 105 110

Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp

115 120 125

Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn

130 135 140

Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg

145 150 155 160

Gly Ser Gly Leu Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His Ser

165 170 175

Ala Gln Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Cys

180 185 190

Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser Cys Ala

195 200 205

Pro Leu Cys Thr Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu Asp Lys

210 215 220

Arg Phe Ala Val Val Trp Leu Ala Ile Trp Ala Val Leu Cys Phe Phe

225 230 235 240

Ser Ser Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Asp Pro Ala Arg Phe

245 250 255

Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe Leu Ser Met Cys Tyr Cys Val

260 265 270

Tyr Ser Val Gly Tyr Leu Ile Arg Leu Phe Ala Gly Ala Glu Ser Ile

275 280 285

Ala Cys Asp Arg Asp Ser Gly Gln Leu Tyr Val Ile Gln Glu Gly Leu

290 295 300

Glu Ser Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Tyr Tyr Phe Gly

305 310 315 320

Met Ala Ser Ser Leu Trp Trp Val Val Leu Thr Leu Thr Trp Phe Leu

325 330 335

Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala Ile Glu Ala Asn Ser Ser

340 345 350

Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile Leu

355 360 365

Ile Leu Val Met Arg Arg Val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly Val Cys

370 375 380

Tyr Val Gly Ser Met Asp Val Asn Ala Leu Thr Gly Phe Val Leu Ile

385 390 395 400

Pro Leu Ala Cys Tyr Leu Val Ile Gly Thr Ser Phe Ile Leu Ser Gly

405 410 415

Phe Val Ala Leu Phe His Ile Arg Arg Val Met Lys Thr Gly Gly Glu

420 425 430

Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg Ile Gly Leu Phe Ser

435 440 445

Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr

450 455 460

Glu Arg Leu Asn Met Asp Tyr Trp Lys Ile Leu Ala Ala Gln His Lys

465 470 475 480

Cys Lys Met Asn Asn Gln Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala Ala

485 490 495

Ser Ile Pro Ala Val Glu Ile Phe Met Val Lys Ile Phe Met Leu Leu

500 505 510

Val Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Thr Ser Lys Thr Leu

515 520 525

Gln Ser Trp Gln Gln Val Cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys Ser Arg

530 535 540

Arg Lys Pro Ala Ser Val Ile Thr Ser Gly Gly Ile Tyr Lys Lys Ala

545 550 555 560

Gln His Pro Gln Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu Ile Pro Ala Gln

565 570 575

Ser Pro Thr Cys Val

580

Claims

1.一种抗体或其抗原结合性片段，其包含重链可变区和轻链可变区这两者，其中，

所述重链可变区包含：

CDR1，其如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所示；

CDR2，其如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列所示；以及

CDR3，其如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列所示，

所述轻链可变区包含：

CDR1，其如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所示；

CDR2，其如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列所示；以及

CDR3，其如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列所示，

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其包含重链可变区和轻链可变区这两者，其中，

所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，

所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合性片段，其特异性识别包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽。

4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合性片段，其与亲和标记、酶标记、放射性同位素标记、或荧光标记结合。

5.一种多核苷酸，其编码权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段。

6.一种试剂，其用于诊断FZD10相关疾病、判定通过FZD10抑制剂的治疗后的药效、或者筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象，并且，

所述试剂包含权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段。

7.权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段在制备用于在对象中诊断FZD10相关疾病或该疾病的发病因素的试剂中的用途，其中，所述诊断包含下述阶段：

(a)使从所述对象中分离得到的样品与权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段接触；

8.根据权利要求6所述的试剂或权利要求7所述的用途，其中，

所述FZD10相关疾病是表达FZD10的癌症。

9.根据权利要求8所述的试剂或用途，其中，

10.权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段在制备用于检出样品中FZD10蛋白的试剂中的用途，其包含下述阶段：

(a)使从对象中分离得到的样品与权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段接触；

11.权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段在制备用于在对象中判定通过FZD10抑制剂治疗后的药效的试剂中的用途，其包含下述阶段：

12.权利要求1~3中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段在制备用于筛选通过FZD10抑制剂的治疗效果较高的对象的试剂中的用途，其包含下述阶段：

13.根据权利要求7所述的用途，其中，

所述样品是从所述对象中分离得到的细胞或组织。

14.一种制造能够与FZD10蛋白质或其部分肽结合的抗体或其抗原结合性片段的方法，其包含下述工序：

(a)培养包含导入有权利要求5所述的多核苷酸的载体的细胞；以及

(b)从所述细胞的培养物或培养基中回收所述抗体。