TWI735410B - 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投予的ｇｐｃ３標的治療劑 - Google Patents

對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投予的ｇｐｃ３標的治療劑 Download PDF

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Abstract

揭示一種決定GPC3標的治療劑療法對接受GPC3標的治療劑療法前之患者或患者中之癌的有效性的方法、或決定繼續對患者之GPC3標的治療劑療法決定的方法，其係包含測定自接受GPC3標的治療劑療法前之患者及/或接受了GPC3標的治療劑療法之患者所單離的生物學試樣中之免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量，當該細胞數或表現量為規定值時，決定該GPC3標的治療劑療法為有效或決定繼續該GPC3標的治療劑療法的方法。又，揭示一種GPC3標的治療劑或製劑，其係用以對決定GPC3標的治療劑療法為有效之患者、或決定繼續GPC3標的治療劑療法之患者投予。

Description

對GPC3標的治療劑療法為有效之患者投予的GPC3標的治療劑
本發明係提供決定GPC3標的治療劑療法對患者中之癌之有效性、或決定繼續對患者之GPC3標的治療劑療法的方法；提供用以對已決定GPC3標的治療劑療法為有效、或已決定繼續GPC3標的治療劑療法之患者進一步投予之GPC3標的治療劑或製劑。
因肝細胞癌所造成的死亡，全年相當於60萬，世界之癌所致之死亡當中為第5高(非專利文獻1)。肝細胞癌之大半，在診斷為該疾病後1年以內會死亡。不幸地，肝細胞癌，診斷為可治癒之療法不太奏效的後期階段的例子係頻繁地發生。對如此患者之包含化學療法、化學塞栓術(chemical embolus)、燒灼或質子束療法之醫療處置的效果依然不充分。多數患者會有疾病復發，此伴隨著血管浸潤及多部位肝內轉移，而急速地往進 行期進行，其5年存活率僅為7%(非專利文獻2)。可進行局部癌切除術之肝細胞癌患者雖預後較佳，但其5年存活率僅止於15%至39%(非專利文獻3)。該技術領域中，係尋求對如此惡性疾病的肝細胞癌的新穎療法。
肝細胞癌被認為佔了日本之原發性肝癌90%以上的原因。作為對如此之肝細胞癌的內科治療方法，例如使用化學療法劑，對於對腫瘤供給營養之路徑之肝動脈注入油性造影劑(碘化油)與抗癌劑、塞栓物質(Gelfoam)之混合物，使營養動脈閉塞，藉以選擇性的導致肝細胞癌壞死的治療法即TAE(肝動脈塞栓療法)，此外有使用經皮乙醇注入法、經皮微波凝固療法、無線電波燒灼療法等伴隨有侵入的手法。又，作為化學療法劑，係進行了作為單獨使用5-FU(氟尿嘧啶)、UFT(尿嘧啶與替加氟)、MMC(絲裂黴素C)、DHAD(mitoxantrone、雙羥蒽醌)、ADR(阿德力黴素)、EPI(泛艾黴素)、CDDP(順鉑)等、或與IFN(干擾素)之併用療法的全身化學療法之臨床試驗(非專利文獻4)。
其中，藉由將Raf/MEK/ERK訊息傳導在Raf激酶的階段予以阻礙，阻斷癌細胞增殖，且藉由以VEGFR-2、VEGFR-3及PDGFR-β酪胺酸激酶為標的，發揮抗血管形成效果，相較於上述化學療法劑，顯示有利效果的經***性型索拉非尼(Sorafenib)(Nexavar、BAY43-9006)已被認可。關於索拉非尼之有效性，係進 行以進行性肝細胞癌為對象之2個第III期多設施共同安慰劑對照比較試驗(SHARP試驗及亞洲‧太平洋地域所實施的試驗)的探討。此等所有試驗中均觀察到存活時間延長，HR均為0.68。SHARP試驗中存活時間由7.9個月延長至10.7個月。另一方面，於亞洲的試驗中，存活時間由4.2個月延長至6.5個月。但是，客觀上的治療反應率低，影像上至腫瘤進行為止的期間雖有延長(歐美之試驗由2.8個月延長至5.5個月、亞洲之試驗由1.4個月延長至2.8個月)，但至症狀惡化為止的期間未觀察到延長。亞洲人群組(cohort)中雖存活延長期間短，但此可認為是因亞洲地域相較於歐美，在疾病過程的稍晚時期開始治療之故(非專利文獻5、6)。
一般而言，伴隨肝癌之進行，會觀察到伴隨有肝功能障礙的食欲不振、體重減少、全身倦怠感、右季肋部腫瘤觸知、右季肋部痛、腹部膨脹感、發熱、黃疸等肝癌特有的症狀。但是索拉非尼等化學療法劑，係有亦併發下痢或便秘、貧血、(致死之嚴重度的)引起感染或敗血症之程度的免疫系統抑制、出血、心毒性、肝毒性、腎毒性、食欲不振、體重減少等化學療法劑固有之副作用之應克服的課題。
一般而言，肝癌在初期雖觀察不到特別的初期症狀，但隨著肝癌進行，會觀察到伴隨著肝功能障害之食欲不振、體重減少、全身倦怠感、右季肋部腫瘤觸知、右季肋部痛、腹部膨脹感、發熱、黃疸等肝癌特有的症 狀。臨床上觀察到如此症狀會因為使用上述化學療法劑而放大。例如，驗出肝癌細胞之患者的食欲不振、及伴隨於此或與其獨立產生之體重減少等症狀，藉由對該患者投予化學療法劑，相較於非投予，有時會有更放大的情況。出現如此症狀時，有時會不得不放棄使用該化學療法劑，上述症狀之放大，係妨礙化學療法劑之治療的要因。因此，就提高治療效果或接受治療的患者之QOL的改善等觀點而言，要求更優良之治療法的確立。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝癌會頻繁地有高表現，因此GPC3可認為在有用於作為GPC3在肝癌中之功能鑑定、肝癌之治療標的或肝癌之診斷標的。
在前述情況下，正進行以GPC3作為肝癌治療標的之治療劑的開發。含有對表現GPC3之細胞發揮抗體依賴性細胞傷害(Antibody-dependent cellular cytotoxicity、以下表述為「ADCC」)活性及/或補體依賴性細胞傷害(Complement-dependent cytotoxicity、以下表述為「CDC」)活性之抗GPC3抗體作為有效成分之肝癌治療劑已被開發(專利文獻1)。又，含有具有ADCC活性及CDC活性之人類化抗GPC3抗體作為有效成分之GPC3標的治療劑已被開發(專利文獻2)。進一步地，除了經增強ADCC活性之人類化抗GPC3抗體(專利文獻3、4)以外，含有具有ADCC活性及CDC活性，且經改善血漿中動態的GPC3抗體(專利文獻5)的GPC3標的治療劑已被開發。又，亦發現藉由合併使用該等抗GPC3 抗體與索拉非尼等化學療法劑的療法，會減弱索拉非尼等化學療法劑之單獨療法所帶來的副作用等，而且兩藥劑會顯示相乘效果(專利文獻6)，由提高治療效果或接受治療之患者之QOL的改善等觀點而言，正在確立以GPC3標的治療劑為核心的更優良之肝癌的治療法。
另一方面，以GPC3為肝癌診斷標的之診斷方法的開發亦正在進行。已知GPC3係對細胞表面之表現途中或表現後，於其特定的部位會藉由轉換酶(convertase)、磷脂酶D、Notum或未鑑定之機制而受到加工(processing)(非專利文獻7、8)。藉由利用如此現象，已開發含有結合於患者血漿中所存在之受到加工而分泌於血漿中之可溶型GPC3的抗原決定位之抗體的肝癌之診斷藥或診斷方法(專利文獻7)。又，含有結合於由患者單離之組織標本等所存在之受到加工後仍存在於細胞表面之停留型GPC3的抗原決定位之抗體的肝癌診斷藥或診斷方法已被開發(專利文獻8)。但是，以上診斷藥或診斷方法，係檢驗被檢驗患者中之肝癌的存在之方法，關於接受過GPC3標的治療劑療法之患者中，決定該療法之有效性的方法、或決定繼續對該患者之GPC3標的治療劑療法的方法，則尚為未知。
本說明書中所引用的參考文獻係如下所示。此等文獻所記載的內容均作為參考而援用於本說明書中。再者，此等文獻之任一者均非相對於本說明書之先前技術。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
[專利文獻1]WO2003/000883
[專利文獻2]WO2006/006693
[專利文獻3]WO2006/046751
[專利文獻4]WO2007/047291
[專利文獻5]WO2009/041062
[專利文獻6]WO2009/122667
[專利文獻7]WO2004/038420
[專利文獻8]WO2009/116659
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[非專利文獻3]Takenaka K, Kawahara N, Yamamoto K, Kajiyama K, Maeda T, Itasaka H, Shirabe K, Nishizaki T, Yanaga K, Sugimachi K; Arch Surg (1996), 131, 71-6
[非專利文獻4]Yeo W, Mok TS, Zee B, Leung TW, Lai PB, Lau WY, Koh J, Mo FK, Yu SC, Chan AT, Hui P, Ma B, Lam KC, Ho WM, Wong HT, Tang A, Johnson PJ; J Natl Cancer Inst (2005), 97, 1532-8
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[非專利文獻7]De Cat B, Muyldermans S-Y, Coomans C, Degeest G, Vanderschueren B, et al. Processing by proprotein convertases is required for glypican-3 modulation of cell survival, Wnt signaling, and gastrulation movements. J. Cell. Biol. (2003) 163, 625-635
[非專利文獻8]Traister A, Shi W and FilmusJ. Mammalian Notum induces the release of glypicans and other GPI-anchored proteins from the cell surface. Biochem. J. (2008) 410,503-511
本發明係鑑於如此情況而為者，其目的為提供於接受過GPC3標的治療劑療法之患者中，決定該療法 之有效性的方法、或決定繼續對該患者之GPC3標的治療劑療法的方法。又，一併提供用以對已決定GPC3標的治療劑療法為有效、或對已決定繼續GPC3標的治療劑療法之患者進一步投予之GPC3標的治療劑或製劑。
本發明者等人在如前述情況下進行深入研究後，創作了測定由接受了GPC3標的治療劑療法之患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量，當該細胞數或表現量為規定值時，或接受GPC3標的治療劑療法後該細胞數或表現量為規定值時，決定該GPC3標的治療劑療法為有效、或決定繼續該GPC3標的治療劑療法的方法。又，創作了用以對已決定GPC3標的治療劑療法為有效、或對已決定繼續GPC3標的治療劑療法之患者投予之GPC3標的治療劑或製劑。
更具體而言係提供以下發明。
〔1〕一種決定GPC3標的治療劑療法對患者中之癌之有效性、或決定繼續對患者之GPC3標的治療劑療法的方法，其係包含測定由接受GPC3標的治療劑療法前之患者及/或接受了GPC3標的治療劑療法之患者所單離的生物學試樣中之免疫細胞數或該細胞上表現之分子的表現量，該免疫細胞數或該細胞上表現之分子的表現量為規定值時決定該GPC3標的治療劑療法為有效、或決定繼續進行該GPC3標的治療劑療法的方法。
〔2〕如〔1〕之方法，其中前述生物學試樣為由患者所單離之末梢血。
〔3〕如〔1〕或〔2〕之方法，其中前述免疫細胞為選自白血球、單核球、嗜中性球及淋巴球中至少1種之細胞。
〔4〕如〔3〕之方法，其中前述淋巴球為選自CD45+淋巴球、CD3+T細胞、CD4+T細胞、及CD8+T細胞中至少1種之淋巴球細胞。
〔5〕如〔3〕之方法，其中前述淋巴球為選自CD16+NK細胞、NKp46+NK細胞、及CD56-CD16+NK細胞中至少1種之淋巴球細胞。
〔6〕如〔1〕或〔2〕之方法，其中前述免疫細胞上表現之分子為CD16或CD107a。
〔7〕如〔1〕~〔7〕中任一項之方法，其中前述患者為具有FcγR Ⅲ A之第158位之至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位之至少1個胺基酸殘基為His之多型的患者。
〔8〕如〔1〕~〔7〕中任一項之方法，其中前述癌為肝癌。
〔9〕如〔1〕~〔8〕中任一項之方法，其中前述GPC3標的治療劑，係以癌患者之血中谷底濃度值成為200μg/ml以上來投予。
〔10〕如〔1〕~〔9〕中任一項之方法，其中前述GPC3標的治療劑為包含抗GPC3抗體作為有效成分之治 療劑。
〔11〕如〔10〕之方法，其中前述抗GPC3抗體為具有抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞傷害(CDC)活性之抗體。
〔12〕如〔10〕或〔11〕之方法，其中前述抗GPC3抗體為包含以下(1)~(5)中任一者之抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體：(1)分別以序列編號：4、序列編號：5、及序列編號：6所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：7、序列編號：8、及序列編號：9所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(2)分別以序列編號：12、序列編號：13、及序列編號：14所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：15、序列編號：16、及序列編號：17所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(3)分別以序列編號：20、序列編號：21、及序列編號：22所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：23、序列編號：24、及序列編號：25所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(4)分別以序列編號：28、序列編號：29、及序列編號：30所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：31、序列編號：32、及序 列編號：33所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；或(5)分別以序列編號：36、序列編號：37、及序列編號：38所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：39、序列編號：40、及序列編號：41所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。
〔13〕如〔10〕~〔12〕中任一項之方法，其中前述抗GPC3抗體為包含以下任一者之抗體：(1)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及以序列編號：51所示之輕鏈可變區；(2)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及由序列編號：52、序列編號：53、序列編號：54、序列編號：55、序列編號：56、序列編號：57、序列編號：58、序列編號：59、序列編號：60、序列編號：61、序列編號：62、序列編號：63、序列編號：64、序列編號：65、及序列編號：66所示之輕鏈可變區之群組中所選的輕鏈可變區；(3)以序列編號：67所示之重鏈可變區、及以序列編號：68所示之輕鏈可變區； (4)以序列編號：69所示之重鏈可變區、及以序列編號：70所示之輕鏈可變區；(5)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：72所示之輕鏈可變區；或(6)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：73所示之輕鏈可變區。
〔14〕如〔10〕之方法，其中前述GPC3標的治療劑為包含於抗GPC3抗體連結有細胞傷害性物質之抗體。
〔15〕一種GPC3標的治療劑，其係用以投予至免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量具有規定值之癌患者。
〔16〕如〔15〕之GPC3標的治療劑，其中免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量為由癌患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量。
〔17〕如〔16〕之治療劑，其中前述生物學試樣為由癌患者所單離之末梢血。
〔18〕如〔15〕~〔17〕中任一項之治療劑，其中前述免疫細胞為選自白血球、單核球、嗜中性球及淋巴球中至少1種之細胞。
〔19〕如〔18〕之治療劑，其中前述淋巴球為選自CD45+淋巴球、CD3+T細胞、CD4+T細胞、及CD8+T細胞中至少1種之淋巴球細胞。
〔20〕如〔18〕之治療劑，其中前述淋巴球為選自 CD16+NK細胞、NKp46+NK細胞、及CD56-CD16+NK細胞中至少1種之淋巴球細胞。
〔21〕如〔15〕~〔17〕中任一項之治療劑，其中前述免疫細胞上表現之分子為CD16或CD107a。
〔22〕如〔15〕~〔21〕中任一項之治療劑，其中前述患者為具有FcγR Ⅲ A之第158位之至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位之至少1個胺基酸殘基為His之多型的患者。
〔23〕如〔15〕~〔22〕中任一項之治療劑，其中前述癌患者為肝癌患者。
〔24〕如〔15〕~〔23〕中任一項之治療劑，其中前述GPC3標的治療劑，係以癌患者之血中谷底濃度值成為200μg/ml以上來投予。
〔25〕如〔15〕~〔24〕中任一項之治療劑，其中前述GPC3標的治療劑為包含抗GPC3抗體作為有效成分之治療劑。
〔26〕如〔25〕之治療劑，其中前述抗GPC3抗體為具有抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞傷害(CDC)活性之抗體。
〔27〕如〔25〕或〔26〕之治療劑，其中前述抗GPC3抗體為包含以下(1)~(5)之任一者的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體：(1)分別以序列編號：4、序列編號：5、及序列編號：6所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及 分別以序列編號：7、序列編號：8、及序列編號：9所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(2)分別以序列編號：12、序列編號：13、及序列編號：14所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：15、序列編號：16、及序列編號：17所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(3)分別以序列編號：20、序列編號：21、及序列編號：22所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：23、序列編號：24、及序列編號：25所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(4)分別以序列編號：28、序列編號：29、及序列編號：30所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：31、序列編號：32、及序列編號：33所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；或(5)分別以序列編號：36、序列編號：37、及序列編號：38所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：39、序列編號：40、及序列編號：41所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。
〔28〕如〔25〕~〔27〕中任一項之治療劑，其中前述抗GPC3抗體為包含以下任一者的抗體：(1)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及以序列編號：51所示之輕鏈可變區； (2)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及由以序列編號：52、序列編號：53、序列編號：54、序列編號：55、序列編號：56、序列編號：57、序列編號：58、序列編號：59、序列編號：60、序列編號：61、序列編號：62、序列編號：63、序列編號：64、序列編號：65、及序列編號：66所示之輕鏈可變區之群組中所選的輕鏈可變區；(3)以序列編號：67所示之重鏈可變區、及以序列編號：68所示之輕鏈可變區；(4)以序列編號：69所示之重鏈可變區、及以序列編號：70所示之輕鏈可變區；(5)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：72所示之輕鏈可變區；或(6)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：73所示之輕鏈可變區。
〔29〕如〔25〕之治療劑，其中前述GPC3標的治療劑為於抗GPC3抗體結合有細胞傷害性物質的抗體。
〔30〕一種用以進行GPC3標的治療之製劑，其係包含指示書，該指示書的主旨為對由接受GPC3標的治療劑療法前之癌患者所單離的生物學試樣中之免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量為規定值的患者投予。
〔31〕一種用以進行GPC3標的治療之製劑，其係包 含指示書，該指示書的主旨為對由接受過GPC3標的治療劑療法之癌患者所單離的生物學試樣中之免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量為規定值的患者進一步投予。
〔32〕如〔30〕或〔31〕之製劑，其中前述生物學試樣為由癌患者所單離之末梢血。
〔33〕如〔30〕~〔32〕中任一項之製劑，其中前述免疫細胞為選自白血球、單核球、嗜中性球及淋巴球中至少1種之細胞。
〔34〕如〔33〕之製劑，其中前述淋巴球為選自CD45+淋巴球、CD3+T細胞、CD4+T細胞、及CD8+T細胞中至少1種之淋巴球細胞。
〔35〕如〔33〕之製劑，其中前述淋巴球為選自CD16+NK細胞、NKp46+NK細胞、及CD56-CD16+NK細胞中至少1種之淋巴球細胞。
〔36〕如〔30〕~〔32〕中任一項之製劑，其中前述免疫細胞上表現之分子為CD16或CD107a。
〔37〕如〔30〕~〔36〕中任一項之製劑，其中前述患者為具有FcγR Ⅲ A之第158位之至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位之至少1個胺基酸殘基為His之多型的患者。
〔38〕如〔30〕~〔37〕中任一項之製劑，其中前述癌患者為肝癌患者。
〔39〕如〔30〕~〔38〕中任一項之製劑，其中前述 GPC3標的治療劑，係以癌患者之血中谷底濃度值成為200μg/ml以上來投予。
〔40〕如〔30〕~〔39〕中任一項之製劑，其中前述GPC3標的治療劑為包含抗GPC3抗體作為有效成分之治療劑。
〔41〕如〔40〕之製劑，其中前述抗GPC3抗體為具有抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞傷害(CDC)活性之抗體。
〔42〕如〔40〕或〔41〕之製劑，其中前述抗GPC3抗體為包含以下(1)~(5)之任一者的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體：(1)分別以序列編號：4、序列編號：5、及序列編號：6所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：7、序列編號：8、及序列編號：9所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(2)分別以序列編號：12、序列編號：13、及序列編號：14所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：15、序列編號：16、及序列編號：17所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(3)分別以序列編號：20、序列編號：21、及序列編號：22所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：23、序列編號：24、及序列編號：25所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(4)分別以序列編號：28、序列編號：29、及序列 編號：30所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：31、序列編號：32、及序列編號：33所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；或(5)分別以序列編號：36、序列編號：37、及序列編號：38所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：39、序列編號：40、及序列編號：41所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。
〔43〕如〔40〕~〔42〕中任一項之製劑，其中前述抗GPC3抗體為包含以下任一者的抗體：(1)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及以序列編號：51所示之輕鏈可變區；(2)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及由以序列編號：52、序列編號：53、序列編號：54、序列編號：55、序列編號：56、序列編號：57、序列編號：58、序列編號：59、序列編號：60、序列編號：61、序列編號：62、序列編號：63、序列編號：64、序列編號：65、及序列編號：66所示之輕鏈可變區之群組中所選的輕鏈可變區；(3)以序列編號：67所示之重鏈可變區、及以序列編號：68所示之輕鏈可變區； (4)以序列編號：69所示之重鏈可變區、及以序列編號：70所示之輕鏈可變區；(5)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：72所示之輕鏈可變區；或(6)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及序列編號：73所示之輕鏈可變區。
〔44〕如〔40〕之製劑，其中前述GPC3標的治療劑為於抗GPC3抗體結合有細胞傷害性物質的抗體。
〔45〕一種癌之治療方法，其係以對藉由如〔1〕至〔14〕之方法所決定之患者投予GPC3標的治療劑而進行。
依照本發明，可簡便且確實地決定GPC3標的治療劑療法有效與否、或應繼續GPC3標的治療劑療法與否。藉此，可提高GPC3標的治療劑療法之效果、改善接受治療之患者的QOL，實現更優越的癌治療。
[圖1]卡本-麥爾曲線(PFS以及OS)：顯示接受GPC3標的治療劑療法或安慰劑之患者的無惡化存活時間或全存活時間之圖。虛線為GC33投予群、實線為安慰劑群，分別表示其無惡化存活時間、或全存活時間。
[圖2]依據GC33暴露分層患者時之卡本-麥爾曲線(PFS以及OS)：顯示接受GPC3標的治療劑療法或安慰劑之患者的無惡化存活時間或全存活時間之圖。實線為安慰劑群、點線為GC33高暴露群、虛線為GC33低暴露群，分別表示其無惡化存活時間、或全存活時間。
[圖3]依據末梢血嗜中性球數之患者分層中的卡本-麥爾曲線(PFS)：顯示由接受GPC3標的治療劑療法前之患者所採取的血液中嗜中性球較中央值(3,607個/μL)少之群或較多之群與該患者之無惡化存活時間的相關關係之圖。虛線為GC33投予群、實線為安慰劑群，分別表示其無惡化存活時間。相對於嗜中性球數較少之群中GC33投予群相對於安慰劑群之風險比為1.229(p=0.369)，嗜中性球較多之群的風險比為0.607(p=0.030)。
[圖4]依據末梢血CD4+T細胞數之患者分層中的卡本-麥爾曲線(PFS)：顯示由接受GPC3標的治療劑療法前之患者所採取的血液中CD4陽性T細胞較中央值(490個/μL)少之群或較多之群與該患者之無惡化存活時間的相關關係之圖。虛線為GC33投予群、實線為安慰劑群，分別表示其無惡化存活時間。相對於CD4陽性T細胞數較少之群中GC33投予群相對於安慰劑群之風險比為1.273(p=0.307)，較多之群的風險比為0.635(p=0.05)。
[圖5]依據末梢血CD56-CD16+NK細胞數之患者分層中的卡本-麥爾曲線(PFS)：顯示由接受GPC3標的治療劑療法前之患者所採取的血液中CD56陰性CD16陽性 NK細胞較中央值(6.3個/μL)少之群或較多之群與該患者之無惡化存活時間的相關關係之圖。虛線為GC33投予群、實線為安慰劑群，分別表示其無惡化存活時間。相對於CD56陰性CD16陽性NK細胞較少群中GC33投予群相對於安慰劑群之風險比為1.259(p=0.344)，較多之群的風險比為0.571(p=0.022)。
[圖6]依據末梢血NK細胞上CD16表現量(MESF)之患者分層中的卡本-麥爾曲線(PFS)：顯示由接受GPC3標的治療劑療法前之患者所採取的血液中NK細胞上之CD16表現量(MESF)較中央值(372,254mesf)少之群或較多之群與該患者之無惡化存活時間的相關關係之圖。虛線為GC33投予群、實線為安慰劑群，分別表示其無惡化存活時間。相對於CD16表現較少群中GC33投予群相對於安慰劑群之風險比為1.130(p=0.612)，較多之群的風險比為0.668(p=0.101)。
[圖7]依據基線in vitro ADCC活性(CD16表現)之患者分層中的卡本-麥爾曲線(PFS)：顯示使用接受GPC3標的治療劑療法前之患者所採取的血液細胞，藉由細胞表面上之CD16表現量變化評估ADCC活性值時，CD16表現變化量較中央值(-64.33%)少之群(ADCC高活性群)或較多之群(ADCC低活性群)與該患者之無惡化存活時間的相關關係之圖。實線為安慰劑群、點線為GC33高暴露群、虛線為GC33低暴露群，分別表示其無惡化存活時間。
[圖8]依據基線in vitro ADCC活性(CD107a表現)之 患者分層中的卡本-麥爾曲線(PFS)：顯示使用接受GPC3標的治療劑療法前之患者所採取的血液細胞，藉由細胞表面上之CD107a表現量變化評估ADCC活性值時，CD107a表現變化量較中央值(34.15%)多之群(ADCC高活性群)或較少之群(ADCC低活性群)與該患者之無惡化存活時間的相關關係之圖。實線為安慰劑群、點線為GC33高暴露群、虛線為GC33低暴露群，分別表示其無惡化存活時間。
定義
本說明書中，若無其他特別之定義，關於本發明所用之化學用語及技術用語，係具有所屬技術領域中具有通常知識者一般所理解之意義。
不定冠詞
「一(a)」及「一(an)」之不定冠詞，在本發明中，係指一個或二個以上(亦即至少一個)在其不定冠詞之文法上的對象。例如「一(a)要素」，意指一個要素或二個以上之要素。
胺基酸
本說明書中，例如如表述為Ala/A、Leu/L、Arg/R、 Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V般，胺基酸係以1字編碼或3字編碼、或以其兩者來表述。
胺基酸之改變
為了改變抗原結合分子之胺基酸序列中之胺基酸，可適當採用定點誘導突變法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等周知的方法。又，作為取代為天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸之改變方法，亦可採用複數個周知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，亦可適合使用包含非天然胺基酸結合於終止密碼子之一的UAG密碼子(琥珀(amber)密碼子)之互補的琥珀抑制型tRNA而得的tRNA之無細胞轉譯系統(Clover Direct(Protein Express))等。
本說明書中，表示胺基酸之改變部位時所用之「及/或」的用語之意義，係包含將「及」與「或」適當組合的任何組合。具體而言，例如「第43位、第52位、及/或第105位之胺基酸被取代」係包含以下之胺基酸改變的變化：(a)第43位、(b)第52位、(c)第105位、 (d)第43位及第52位、(e)第43位及第105位、(f)第52位及第105位、(g)第43位及第52位及第105位。
EU編號及Kabat編號
依照本發明中使用之方法，分配到抗體之CDR與FR之胺基酸位置，係遵照Kabat所規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.，1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段的情況時，可變區之胺基酸係遵照Kabat編號，恆定區之胺基酸係遵照準用Kabat之胺基酸位置的EU編號而表示。
生物學試樣
本發明中，「生物學試樣」之用語，係指由對象單離之組織或流體的試樣。作為如此試樣之非限定的一態樣，係包含例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、氣管、腸管、及尿生殖道之外部切片、眼淚、唾液、痰、乳、全血或任何的血液區分、血液衍生物、血球、腫瘤、神經組織、器官或任何類型的組織、藉由洗淨所得之任何試樣(例如支氣管系者)、以及體外(in vitro)之細胞培養物的構成成分之試樣。
免疫細胞數或免疫細胞上表現之分子的表現量，可在自患者所單離之生物學試樣中測定。例如，使用 血液作為生物學試樣之情形，末梢血較佳，可測定單離之末梢血中免疫細胞數或免疫細胞上表現之分子的表現量。作為非限定之一態樣，自患者所單離之末梢血中的免疫細胞數，例如，可使用吉姆沙染色之白血球區分、或自動血球計數測定機等測定。又，作為非限定之一態樣，自患者所單離之末梢血中的免疫細胞上表現之分子的表現量，例如，可藉由使用特異性抗體之流動式細胞測量術來測定。
「單離」意指由其天然的狀態經「人為的」變化，亦即，為天然產生的情況時，係指由其本來的環境經變化及/或取出者。例如，本發明中，生物中所存在之細胞、多核苷酸或多肽意指未經單離，由天然狀態下一起存在之材料所分離之相同細胞、多核苷酸或多肽意指經單離。進一步地，將藉由轉形、遺傳學操作或任何其他重組方法而導入於生物中之多核苷酸或多肽，即使尚存在於生物(可為存活亦可為非存活)內的情況，亦為經單離。
免疫細胞
本發明中所謂「免疫細胞」，係指白血球等參與生體內免疫反應之細胞的意思，具體而言，例如，可舉例顆粒球(嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球)、單核球(巨噬細胞)、淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)、樹狀細胞等。
免疫細胞數之測定方法
本發明中，測定成為對象之患者的末梢血中的免疫細胞數之方法並無特別限定。例如，可由成為對象之患者採取血液作為生物學試樣，將所採取之血液作為試樣藉由自動血球計數機測定。又，例如使用血球計數器，記算紅血球及白血球之數，且藉由吉姆沙染色將血液細胞染色後，依據染色的樣式或形狀的差異區分嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、單核球、淋巴球，可由其比例算出各別的細胞數。此處所採取之生物學試樣，只要是可測定來自患者的免疫細胞的試樣便無特別限定，例如，可舉例末梢血。具體而言，可依據例如實施例所記載之方法來測定。
免疫細胞上表現之分子的表現量之測定方法
本發明中，測定成為對象之患者的免疫細胞上表現之分子的表現量之方法並無特別限定。例如，可由成為對象之患者採取血液作為生物學試樣，使其與對於細胞表現之分子有特異性的抗體反應，使用流動式細胞測量術等來測定。進而，可藉由使用經螢光標識之校準珠粒設定可溶性螢光色素分子等量(Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome：MESF)，將某細胞集團之流動式細胞測量術的螢光強度測定值變換成MESF值來定量化。具體而言，例如可依循Journal of Research of the National Institute of Standard and Technology,vol.107,No.4(2002)pp339-353所記載之方法來測定。此處所採取之生物學試樣，只要是可測定來自患者之免疫細胞的試樣便 無特別限定，例如，可舉例末梢血。具體而言，可依據例如實施例所記載之方法來測定。
Fcγ受體多型之確認
本發明中，確認成為對象之患者是否具有Fcγ受體之基因多型的方法並無特別限定。例如，可藉由自成為對象之患者採取生物學試樣所採取的試樣單離基因體基因決定Fcγ受體相關基因之鹼基序列來確認。具體而言例如，可依循Journal of Clinical Oncology,vol.21,No.21(2003)pp3940-3947所記載之方法來測定。此處所採取之生物學試樣，只要是可取得來自患者之基因體基因的試樣便無特別限定，例如，可舉例末梢血、皮膚切片等。
本發明中，作為用以檢測組織中GPC3之表現量的生物學試樣，可適合列舉被檢驗體試樣。較佳之被檢驗體試樣，係由被檢驗體所得到之組織，更佳為被檢驗體之肝癌或肝細胞癌組織。作為採取肝癌或肝細胞癌組織之方法，可適合使用周知方法之活體組織切片(biopsy)。肝活體組織切片係指細長的針直接由皮膚表面刺入肝臟，採取肝臟組織的方法。通常，針所穿刺之部位係在右胸下部之肋間。於術前使用超音波檢查裝置確認穿刺部之安全性後，消毒穿刺部。再者由皮膚至肝臟表面係麻醉的對象，穿刺部之皮膚切開小切口後，將穿刺針穿刺。
為了於顯微鏡下藉由穿透光線觀察組織試 樣，組織試樣係以使顯微鏡所使用之光線充分透過的程度而切薄片。作為切薄片之前階段，係固定組織試樣。亦即，藉由使組織‧細胞之蛋白質引起脫水或變性而凝固，使構成組織之細胞迅速死亡，而穩定化及不溶化其構造。首先，作為固定對象之組織試樣，係以手術用刀等刀具切取適於製作石蠟包埋切片之大小及形狀的片段。接著，將該片段浸漬於用以實施固定之試藥即固定液中。作為固定液，適合使用甲醛，更佳為中性緩衝甲醛。中性緩衝甲醛的濃度對應組織試樣特性或物性適宜地選擇。濃度可於1~50%，較佳為5~25%，更佳為10~15%之間適當變更來使用。使用真空泵，對浸漬有組織試樣之固定液適當脫氣。藉由將組織標本於常壓及室溫之條件下，放置於固定液中數小時，而實施固定。固定所需之時間，可於1小時至7日，較佳為2小時至3日，又較佳為3小時至24小時，更佳為4小時至16小時之範圍適當選擇。固定後係於磷酸緩衝液等中進一步適當浸漬數小時(可於2小時至48小時，較佳為3小時至24小時，更佳為4小時至16小時之範圍適當選擇之時間)。
接著，可使用凍結切片法或石蠟切片法，由施以固定之組織試樣中適合地製作切片。凍結切片法之適合的例子，可列舉將組織投入O.C.T.compound(Miles.Inc)中並冷凍後，使用低溫恆溫器(冷凍切片製作裝置)切薄片的方法。石蠟切片法中，藉由將固定所施用之組織試樣浸漬於包埋劑並硬化，而賦予均勻且適切的 硬度。包埋劑可適合使用石蠟。使用乙醇將固定所施用之組織試樣脫水。具體而言，將組織試樣依序浸漬於70%乙醇、80%乙醇、100%乙醇中，藉以將該組織試樣脫水。浸漬所需之時間及次數，可於1小時至數日及1次至3次之範圍中適當選擇。又，亦可於室溫或4℃浸漬，但於4℃浸漬時，浸漬時間係為一整夜等較長時間較佳。接著將其液相取代為二甲苯後，藉由石蠟包埋組織試樣。其液相取代為二甲苯所需之時間，可於1小時至數小時之範圍適當選擇。此時，可於室溫取代，亦可於4℃取代，但於4℃取代時，取代之時間係為一整夜等較長時間較佳。石蠟包埋所需之時間及次數，可於1小時至數小時及1次至4次之範圍適當選擇。此時，可於室溫包埋，亦可於4℃包埋，但於4℃包埋時，包埋之時間係為一整夜等較長時間較佳。又，可藉由使用將石蠟包埋反應自動化處理的石蠟包埋裝置(EG1160、Leica等)，合適地以石蠟包埋組織試樣。
藉由將經如上述方式以石蠟包埋之組織試樣接著於基台，以製作「石蠟塊」，藉由微切片機，將此石蠟塊切薄片為由1至20μm之厚度中選擇之期望厚度。藉由將經切薄片之組織切片靜置於透過性之支持體即載玻片上以固定接著。此情況時，為了防止組織切片之剝離，於載玻片塗佈0.01%聚-L-離胺酸(Sigma)並乾燥之載玻片亦可適合使用。將經固定接著之組織切片，風乾由數分鐘至1小時之間中所選擇的適當時間。
抗原活化
較佳之態樣中，係將因甲醛固定使與抗體之反應性減弱的抗原之反應性予以活化。本發明中，亦可應用蛋白酶抗原活化法(PIER法)，亦可應用熱誘導抗原活化法(HIER法)。又，於非限定的一態樣中，亦可對如下述所示方式配製的「可視為相同之二個組織試樣」當中之一個試樣應用PIER法，對另一試樣應用HIER法，將與抗體反應時兩者間的染色程度之差異予以數值化。
於非限定的一態樣中，係準備一組二個於「生物學試樣」之項目中所示之經配製，且安裝於透過性之支持體上的組織試樣。此該組織試樣，較佳為組織上可視為相同之二個組織試樣。「可視為相同」，意指相比較的二個組織試樣，於該組織試樣所由來的被檢驗體試樣中幾乎由相同之細胞或組織所構成。例如，作為鄰接的切片所調製之二個組織試樣，係可視為相同之二個組織試樣。本發明中若無特別記載，「可視為相同之二個組織試樣」係指作為鄰接的切片所調製之二個組織試樣，但此外，即使未作為鄰接的切片被配製，只要構成二個組織試樣之細胞或組織的構成，在該二個組織試樣間可視為相同者，則為「可視為相同之二個組織試樣」。細胞或組織之構成在該二個組織試樣間可視為相同的情況時，例如適合地舉例：(1)組織切片中之平面座標上於相同位置存在有來自相同細胞之細胞的切片的情況、(2)該細胞之切片在 該平面座標上之相同位置存在的比例為至少50%以上，較佳為60%以上，又較佳為70%以上，更佳為80%以上，又更佳為90%以上，特佳為95%以上的情況等。
熱誘導抗原活化法，可適當使用微波之加熱方法或熱壓釜(autoclave)之加熱方法、或煮沸處理之加熱方法等。以780W之輸出進行煮沸處理，使液溫保持於約98℃的情況時，處理等活化所需要之時間係由5分鐘~60分鐘之間適當選擇，例如為10分鐘。抗原之活化處理，除了10mM檸檬酸鈉緩衝液之外，可於市售之Target Retrieval Solution(DakoCytomation)等中進行。下述實施例中係使用Target Retrieval Solution。只要作為活化處理之結果，抗GPC3抗體所認識之抗原中的抗原決定位係獲得與抗體之結合性，可檢測後述之抗原與抗體的複合體者，任意緩衝液、水溶液均可適合使用。
蛋白酶抗原活化法中所使用之蛋白酶，其種類或由來並無特殊限定，可適當選擇一般可獲得之蛋白酶來使用。所使用之蛋白酶的例子，可適合列舉0.01N鹽酸中0.05%濃度之胃蛋白酶、或進一步含有pH7.6之Tris緩衝液中0.01%濃度之CaCl2的0.1%濃度之胰蛋白酶、含有10mM之EDTA及0.5%之SDS的pH7.8之10mM Tris鹽酸緩衝液中1~50μg/ml濃度之蛋白酶K等。再者使用蛋白酶K時，其反應液之pH係由6.5至9.5之間適當選擇，亦可適當利用SH試藥、胰蛋白酶阻止劑或胰凝乳蛋白酶阻止劑。作為如此之適合的蛋白酶之具體例子，亦可列舉 Histofine HER2套組(MONO)(Nichirei Bioscience)所添附之蛋白酶。蛋白酶抗原活化，通常係在37℃進行，反應溫度可於25℃至50℃之範圍內適當變更。在37℃進行蛋白酶抗原活化時，反應時間係於例如1分鐘至5小時之間適當選擇，例如為15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時等。活化處理結束後，藉由洗淨用緩衝液洗淨施以該處理之組織試樣。洗淨用緩衝液可適合使用PBS(Phosphate buffer saline)以外、亦可適合使用Tris鹽酸緩衝液。通常，作為洗淨條件，係採用於室溫實施3次5分鐘洗淨的方法，但洗淨時間及溫度可適當變更。
組織試樣與抗GPC3抗體之反應
對經施以熱誘導抗原活化法之抗原活化處理的組織試樣及/或經施以蛋白酶抗原活化法之抗原活化處理的組織試樣，使後述抗GPC3抗體作為一次抗體而反應。該反應係在於欲使抗GPC3抗體認識抗原中之抗原決定位而形成抗原抗體複合體所適當之條件下實施。通常，該反應係於4℃實施一整夜、或於37℃實施1小時，但反應條件在於欲使抗體認識抗原中之抗原決定位而形成抗原抗體複合體所適當之範圍可作適當變更。例如，反應溫度可於4℃至50℃的範圍內變更、反應時間可於1分鐘至7日之間變更。於低溫實施反應的情況時，較佳係長時間反應。一次抗體反應結束後，以洗淨用緩衝液洗淨組織試樣。洗淨用 緩衝液可適合使用PBS(Phosphate buffer saline)以外，亦可適合使用Tris鹽酸緩衝液。通常，作為洗淨條件，雖採用實施3次於室溫洗淨5分鐘之方法，但洗淨之時間及溫度可適當變更。
接著，對經施以一次抗體反應之組織試樣，使認識一次抗體之二次抗體反應。通常，係使用經由用以使二次抗體可見化之標識物質預先標識之二次抗體。作為標識物質，可適合列舉FITC(螢光異硫氰酸鹽)或Cy2(Amersham)、Alexa488(Molecular Probe)等之螢光色素；過氧化酶或鹼性磷酸酯酶等之酵素；或金膠體等。
與二次抗體之反應，係在欲使抗GPC3抗體與認識該抗GPC3抗體之二次抗體形成抗原抗體複合體所適當的條件下實施。通常，該反應係於室溫或37℃實施30分鐘至1小時，但可於欲使抗GPC3抗體與二次抗體形成抗原抗體複合體所適切的範圍中作適當變更。例如，反應溫度可於4℃至50℃之範圍內變更、反應時間可於1分鐘至7日之間變更。於低溫實施反應時，較佳為長時間反應。二次抗體反應結束後，以洗淨用緩衝液洗淨組織試樣。洗淨用緩衝液可適合使用PBS(Phosphate buffer saline)以外，亦可適合使用Tris鹽酸緩衝液。通常，作為洗淨條件，係採用實施3次於室溫5分鐘之洗淨的方法，但洗淨時間及溫度可適當變更。
接著，對經施以二次抗體反應之組織試樣，使用以使標識物質可見化的物質反應。使用過氧化酶作為 二次抗體之標識物質時，組織試樣係定溫培置(incubate)於反應液中，該反應液係使0.02%過氧化氫水與經pH 7.2之0.1M TRIS鹽酸緩衝液調整為0.1%濃度的DAB(二胺基聯苯胺)溶液在正欲定溫培置前等量混合而得。於DAB以外，可適當選擇DAB-Ni或AEC+(以上、DAKO)等之顯色基質。定溫培置過程中，不時在顯微鏡下觀察顯色程度，於確認了適切顯色的階段時，將組織試樣浸漬於PBS，藉以停止可見化反應。
使用了鹼性磷酸酯酶作為二次抗體之標識物質時，組織試樣係於BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)/NBT(四唑氮藍、Nitroblue tetrazolium)(Zymed)基質溶液(於含有10mM濃度之MgCl2及28mM濃度之NaCl的pH9.8之50mM碳酸鈉緩衝液中，溶解有0.4mM濃度之NBT及0.38mM濃度之BCIP者)中定溫培置。又，於BCIP及NBT以外，亦可適當使用Permanent Red、Fast Red、或Fuchsin+(以上、DAKO)等。定溫培置之前，亦可與含有1mM濃度之內在性鹼性磷酸酯酶阻止劑即氯化左旋咪唑衍生物(levamisole chloride)(Nacalai Tesque)、0.1M氯化鈉及50mM氯化鎂的0.1M TRIS-鹽酸緩衝液(pH 9.5)，在室溫預定溫培置1分鐘至數小時。定溫培置之過程中，不時在顯微鏡下觀察，在觀察到反應最終產物之紫色的甲
Figure 104114756-A0305-02-0036-140
(formazan)沈積的階段，將組織試樣以水洗或含有2%聚乙烯醇之TBS使反應停止後，以TBST(含有0.1%之Tween20的TBS)洗淨。使用 金膠體作為二次抗體之標識時，係以銀增感，使金屬銀附著於金粒子，藉以使金膠體可見化。銀增感之方法，係所屬技術領域中具有通常知識者所周知。
使用FITC(螢光異硫氰酸鹽)或Cy2(Amersham)、Alexa488(Molecular Probe)等螢光色素作為二次抗體之標識物質時，不需要可見化物質之反應步驟，而係照射該螢光物質之激發波長的光，可藉由使用螢光顯微鏡，適當檢測出所放出的光。
組織免疫染色分數
本發明之非限定的一態樣中，除了游離GPC3濃度以外，亦由以上述方法所檢測出之組織中GPC3表現量，來決定GPC3標的治療劑療法係有效、或亦提供決定繼續進行該GPC3標的治療劑療法之方法。非限定的一態樣中，以上述方法所檢測出之組織中GPC3表現，例如係藉由下述所舉例之非限定的方法而予以數值化。本發明中，如此方式數值化之組織中GPC3之表現量，係稱為「GPC3之組織免疫染色分數」。
將遵照WO2009116659記載之方法，依照表1所示基準所算出之陽性細胞率(Positive cell rate：PR)、細胞質或細胞膜之染色強度(Staining intensity of cytoplasm：SI-cp,Staining intensity of cell membrane：SI-cm)及細胞膜染色模式(Staining pattern of cell membrane：Sp-cm)的各分數，再依式1及式2之計算式 加算而得之分數，乃作為本發明之非限定之GPC3組織免疫染色分數(方便上稱為「複合評估分數1」)的例示。
Figure 104114756-A0305-02-0038-1
 (Sp-Cm評估時，係評估於使用4倍或10倍之物鏡的顯微鏡檢查下，視野中細胞之染色)
式1 IHC total=PR+SI-Cp+SI-Cm+Sp-Cm
式2 IHC cm=PR+SI-Cm+Sp-Cm
Figure 104114756-A0305-02-0039-2
此外，已知有將細胞膜、或細胞質內之染色強度分類為0~3，且以顯示各自染色強度之細胞比例為基準所算出的H分數(文獻：KS.McCarty Jr.et al.,Use of a monoclonal anti-Estrogen receptor antibody in the immunohistochemical evaluation of human tumors.Cancer Res.Suppl.(1986)46,4244s-4248s)。
另一方面，以膜、以及細胞質之染色強度、染色比例為基準，例示了分類為0~3+之下述分數演算法及基於同演算法而得之評估分數(複合評估分數2)。
Figure 104114756-A0305-02-0040-3
本發明中，作為「GPC3之組織免疫染色分數」，例如可單獨使用此等複合評估分數1、H分數、複合評估分數2等之，或組合此等使用。作為非限定的一態樣，「GPC3之組織免疫染色分數」可使用複合評估分數1，作為其他之非限定的一態樣，「GPC3之組織免疫染色分數」可使用複合評估分數2。
GPC3標的治療劑
本發明中，「GPC3標的治療劑」之用語，係指造成包含由GPC3所媒介之訊息路徑的GPC3之生物學活性之 阻斷、抑制、阻止、或減低；或造成對表現GPC3之細胞的細胞傷害之任何分子。「標的治療」之用語，亦非暗示具有生物學作用之特定機制，而是包含GPC3之藥理學、生理學、及生化學相互作用當中具有可能性之全部作用的概念。GPC3標的治療劑之例子，係包含：(1)對結合於GPC3之配位子之GPC3結合的拮抗阻止劑或非拮抗阻止劑，因而干涉GPC3與其配位子之結合的作用物質、(2)雖未干涉GPC3與其配位子之結合，作為取代地，係使GPC3對其配位子之結合所產生的活性阻止或減少之作用物質、(3)使GPC3之表現減少的作用物質、(4)可對表現GPC3之細胞誘發細胞傷害活性的作用物質。作為配位子之非限定的一態樣，可舉例wnt(Cancer Res.(2005)65,6245-6254)、IGF-II(Carcinogenesis(2008)29(7),1319-1326)或Fibroblast Growth Factor 2(Int.J.Cancer(2003)103(4),455-465)等。作為如此作用物質之非限定的一態樣，可包含抗體(包含其抗原結合區域)、核酸分子(反意或RNAi分子等)、胜肽、非胜肽低分子有機物等。
作為本發明之GPC3標的治療劑所使用的非胜肽性之低分子有機物之非限定的一態樣，可舉例作用於甲基化抑制基因之非胜肽性低分子喹啉衍生物(WO2008/046085)等。又，亦可舉例誘發細胞傷害性T細胞之細胞傷害活性的HLA-A2限制性GPC3胜肽144-152(序列編號：2)或HLA-A24限制性GPC3胜肽298- 306(序列編號：3)(Clin.Cancer Res.(2006)12(9),2689-2697)等。
抗GPC3抗體
作為本發明之GPC3標的治療劑使用之抗GPC3抗體之非限定的一態樣，可例示(BioMosaic公司之型錄編號B0134R所販售之)1G12抗體(WO2003/100429)上連結有細胞傷害性物質的抗體藥物複合體(Antibody drug conjugate(ADC))(WO2007/137170)。
又，作為與上述相異之非限定的一態樣，例示有WO2006/006693或WO2009/041062所記載之人類化抗GPC3抗體。即，可使用包含分別以序列編號：4、序列編號：5、及序列編號：6所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：7、序列編號：8、及序列編號：9所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3的人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。該人類化抗GPC3抗體製作時，可適當選擇與序列編號：10所示之重鏈框架(framework)序列或序列編號：11所示之輕鏈框架序列的序列同一性高的人類框架序列，作為人類化時的模板使用。
作為進一步相異之非限定的一態樣，可使用包含分別以序列編號：12、序列編號：13、及序列編號：14所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：15、序列編號：16、及序列編號：17所 示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。該人類化抗GPC3抗體製作時，可適當選擇與序列編號：18所示之重鏈框架序列或序列編號：19所示之輕鏈框架序列的序列同一性高的人類框架序列，作為人類化時的模板使用。
作為另外相異之非限定的一態樣，可使用包含分別以序列編號：20、序列編號：21、及序列編號：22所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：23、序列編號：24、及序列編號：25所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。該人類化抗GPC3抗體製作時，可適當選擇與序列編號：26所示之重鏈框架序列或序列編號：27所示之輕鏈框架序列的序列同一性高的人類框架序列，作為人類化時的模板使用。
作為進而另外相異之非限定的一態樣，可使用包含分別以序列編號：28、序列編號：29、及序列編號：30所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：31、序列編號：32、及序列編號：33所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。該人類化抗GPC3抗體製作時，可適當選擇與序列編號：34所示之重鏈框架序列或序列編號：35所示 之輕鏈框架序列的序列同一性高的人類框架序列，作為人類化時的模板使用。
又，作為另外相異之非限定的一態樣，可使用包含分別以序列編號：36、序列編號：37、及序列編號：38所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：39、序列編號：40、及序列編號：41所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。該人類化抗GPC3抗體時，可適當選擇與序列編號：42所示之重鏈框架序列或序列編號：43所示之輕鏈框架序列的序列同一性高的人類框架序列，作為人類化時的模板使用。
又，作為進而另外相異之非限定的一態樣，可使用包含由序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群中所選擇之重鏈可變區，以及序列編號：51所示之輕鏈可變區的人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。作為其他之非限定的一態樣，可使用包含由序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群所選擇之重鏈可變區，以及由序列編號：52、序列編號：53、序列編號：54、序列編號：55、序列編號：56、序列編號：57、序列編號：58、序列編號：59、序列編號： 60、序列編號：61、序列編號：62、序列編號：63、序列編號：64、序列編號：65、及序列編號：66所示之輕鏈可變區之群所選擇之輕鏈可變區的人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。
又，作為其他相異之非限定的一態樣，亦可使用包含序列編號：67所示之重鏈可變區及序列編號：68所示之輕鏈可變區的人類化抗GPC3抗體、包含序列編號：69所示之重鏈可變區及序列編號：70所示之輕鏈可變區的人類化抗GPC3抗體、包含序列編號：71所示之重鏈可變區及序列編號：72所示之輕鏈可變區的人類化抗GPC3抗體、或包含序列編號：71所示之重鏈可變區及序列編號：73所示之輕鏈可變區的人類化抗GPC3抗體，作為本發明之GPC3標的治療劑。
細胞傷害活性
作為本發明之抗GPC3抗體，可舉例具有細胞傷害活性之抗GPC3抗體。本發明中，作為細胞傷害活性之非限定的例子，可列舉例如抗體依賴性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依賴性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性及T細胞所致之細胞傷害活性等。本發明中，CDC活性意指補體系統所致之細胞傷害活性。另一方面，ADCC活性，意指免疫細胞等透過表現於該免疫細胞之Fcγ受體而結合於包含與表現於標的細胞之 細胞膜的膜型分子結合之抗原結合區域的抗原結合分子Fc區域，該免疫細胞對標的細胞造成傷害之活性。目標之抗原結合分子有無ADCC活性、或有無CDC活性，係可藉由公眾所知方法測定(例如Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans、Coligan等人編(1993)等)。
具體而言，首先配製作用細胞、補體溶液、標的細胞。
(1)作用細胞之配製
於RPMI1640培養基(Invitrogen)中，自由CBA/N小鼠等取出之脾臟中分離脾臟細胞。將以含有10%胎牛血清(FBS、HyClone)之同培養基洗淨的該脾臟細胞之濃度配製為5×106/mL，藉此可配製作用細胞。
(2)補體溶液之配製
藉由以含有10% FBS之培養基(Invitrogen)將Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀釋成10倍，可配製補體溶液。
(3)標的細胞之配製
將表現抗原之細胞，與0.2 mCi之51Cr-鉻酸鈉(GE Healthcare Bioscience)一起在含有10% FBS之DMEM培養基中37℃培養1小時，藉此該標的細胞可被放射性標 識。放射性標識後，藉由將以含有10% FBS之RPMI1640培養基洗淨3次後的細胞濃度配製為2×105/mL，藉此可配製該標的細胞。
可藉由下述方法測定ADCC活性、或CDC活性。ADCC活性測定時，將添加於96孔U形底盤(Becton Dickinson)之各50μl的標的細胞與抗原結合分子在冰上反應15分鐘。之後，添加作用細胞100μl，將該盤靜置於二氧化碳氣體培養箱內4小時。抗體(抗原結合分子)之終濃度例如可設定為0或10μg/ml等濃度。靜置後，使用伽瑪計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定由各孔所回收之100μl上清液的放射活性。可使用測定值，基於(A-C)/(B-C)×100之計算式來計算細胞傷害活性(%)。A表示各試樣之放射活性(cpm)、B表示添加1% NP-40(nacalai tesque)後之試樣的放射活性(cpm)、C表示僅含有標的細胞之試樣的放射活性(cpm)。
另一方面，CDC活性測定時，將添加於96孔平底盤(Becton Dickinson)之各50μl的標的細胞與抗原結合分子在冰上反應15分鐘。之後，添加補體溶液100μl，將該盤靜置於二氧化碳氣體培養箱內4小時。抗體(抗原結合分子)之終濃度例如可設定為0或3μg/mL等濃度。靜置後，使用伽瑪計數器測定由各孔所回收之100μl上清液的放射活性。細胞傷害活性可由與ADCC活 性測定同樣的方式計算。
細胞傷害性物質
又，作為本發明之抗GPC3抗體之非限定的一態樣，亦可舉例連結有細胞傷害性物質之抗GPC3抗體。如此之抗GPC3-抗體藥物複合體(Antibody drug conjugate(ADC))雖具體揭示於WO2007/137170等，但不限定於此。亦即，作為細胞傷害性物質，可為以下所例示之化學療法劑、亦可為Alley等人(Curr.Opin.Chem.Biol.(2010)14,529-537)或WO2009/140242所揭示之化合物，此等化合物可由適切的連接子(linker)等與抗原結合分子結合。
結合於本發明之抗GPC3抗體的化學療法劑可舉例如以下者：阿扎立平(azaribine)、安美達錠(anastrozole)、氮雜胞嘧啶核苷(azacytidine)、博來黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素-1(bryostatin-1)、硫酸布他卡因(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、卡莫司汀(carmustine)、希樂葆(celebrex)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、卡鉑定(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、***糖基胞嘧啶(cytarabine)、達卡巴仁(dacarbazine)、多烯紫杉醇 (docetaxel)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素葡萄糖醛酸苷(daunomycin glucuronide)、道諾黴素(daunorubicin)、地塞松(dexamethasone)、乙烯雌酚(diethylstilbestrol)、阿德力黴素(doxorubicin)、阿德力黴素葡萄糖醛酸苷(doxorubicin glucuronide)、表阿德力黴素(epirubicin)、乙炔***(ethinyl estradiol)、***氮芥(estramustine)、依妥普賽(etoposide)、依妥普賽葡萄糖醛酸苷(etoposide glucuronide)、氟尿苷(floxuridine)、福達樂(fludarabine)、氟塔醯胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟羥甲基睪酮(fluoxymesterone)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基孕酮己酸酯(hydroxyprogesterone caproate)、羥基尿素(hydroxyurea)、艾達魯比辛(idarubicin)、依弗醯胺(ifosfamide)、菊白葉酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、美登醇(maytansinoid)、甲氮芥(mechlorethamine)、乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸美皆斯妥(megestrol acetate)、氮芥***酸(melphalan)、巰嘌呤(mercaptopurine)、胺甲葉酸(methotrexate)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、苯丁酸(phenylbutyrate)、普賴松(prednisone)、甲基苄肼(procarbazine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、噴司他 汀(pentostatin)、司莫司汀(semustine)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、他莫西芬(tamoxifen)、紫杉烷類(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睪固酮(testosterone propionate)、沙利多邁(thalidomide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、沙奧特帕(thiotepa)、坦尼坡賽(teniposide)、癌康定(topotecan)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、長春花鹼(vinblastine)、溫諾平(vinorelbine)、長春新鹼(vincristine)。
本發明中，較佳之化學療法劑，係低分子化學療法劑。低分子化學療法劑，在本發明之抗GPC3-抗體藥物複合體結合後，干涉抗GPC3抗體功能之可能性亦低。本發明中，低分子之化學療法劑，通常具有100~2000、較佳為200~1000之分子量。此處所例示之化學療法劑，均為低分子化學療法劑。此等之本發明中之化學療法劑，包含於生體內會轉換為活性化學療法劑之前驅藥。前驅藥之活性化，可為酵素轉換、亦可為非酵素轉換。
又，連結於本發明之抗GPC3-抗體藥物複合體的細胞傷害性物質，亦可舉例Pseudomonas exotoxin A、Saporin-s6、Diphtheria toxin、Cnidarian toxin等毒性胜肽(毒素)或Radioiodine、Photosensitizer。毒性胜肽之例子，例如可適合列舉以下者。
白喉毒素A鏈(Diphtheria toxin A Chain)(Langone等人(Methods in Enzymology(1983)93, 307-308))；假單胞菌內毒素(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine(1996)2,350-353)；昆麻毒素鏈(Ricin A Chain)(Fulton等人(J.Biol.Chem.(1986)261,5314-5319)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人、(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、及Gheeite等人(J.Immunol.Methods(1991)142,223-230))；無糖鏈昆麻毒素A鏈(Deglycosylated Ricin A Chain)(Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931))；相思子素A鏈(Abrin A Chain)(Wawrzynczak等人(Br.J.Cancer(1992)66,361-366)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、及Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931))；白樹毒素(Gelonin)(Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.,(1990)50,7519-7562)、及Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；商陸抗病毒蛋白(PAP-s；Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol. (1992)89,341-346))；異株瀉根毒蛋白(Bryodin)(Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；皂草素(Saporin)(Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；木鱉子素(Momordin)(Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)；Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、及Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；木鱉根蛋白(Momorcochin)(Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；石竹素32(Dianthin 32)(Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；石竹素30(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；蒴蓮根毒蛋白(Modeccin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；槲寄生素(Viscumin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；蒴蓮素(Volkensin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；商陸毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；麥芽凝集素(Tritin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；絲瓜素(Luffin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；及括樓素(Trichokirin)(Casellas等人(Eur.J.Biochem.(1988)176,581-588)、及Bolognesi等人(Clin.exp.Immunol.,(1992)89,341-346))。
另一方面，測定本發明之抗GPC3-抗體藥物複合體所致細胞傷害活性時，係於96孔平底盤(Becton Dickinson)中添加標的細胞、與該抗GPC3-抗體藥物複合體之每孔50μl，於冰上實施15分鐘反應。該盤係於二氧化碳氣體培養箱內定溫培置1至4小時。抗GPC3-抗體藥物複合體之終濃度，可於0至3μg/ml之範圍內適當使用。培養後，回收100μl上清液，以伽瑪計數器測定該上清液具有之放射活性。細胞傷害活性可與ADCC活性測定同樣方式計算。
Fc區域
本發明之抗GPC3抗體中所含之恆定區域中所含之Fc區域，可由人類IgG取得，但不限定於IgG之特定的次型(subclass)。Fc區域，係指EU編號表示之大約第216位之胺基酸之由木瓜酵素切斷部位的絞鏈(hinge)區域之N末端起，包含該絞鏈、CH2及CH3區域之抗體的重鏈恆定區域。該Fc區域之適合的例子，可列舉如後述之對Fcγ受體具有結合活性的Fc區域。作為如此之Fc區域 的非限定的一態樣，可舉例人類IgG1(序列編號：74)、IgG2(序列編號：75)、IgG3(序列編號：76)、或IgG4(序列編號：77)表示之恆定區域所含之Fc區域。
Fcγ受體(FcγR)
Fcγ受體(亦記載為FcγR)，係指可與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區域結合之受體，實質上亦意指被Fcγ受體基因所編碼之蛋白質家族的任何成員。在人類中，此家族係包含有包含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；包含同型異構物FcγRIIa(包含他型H131及R131。亦即FcγRIIa(H)及FcγRIIa(R))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及包含同型異構物FcγRIIIa(包含他型V158及F158。亦即FcγRIIIa(V)及FcγRIIIa(F))及FcγRIIIb(包含他型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)、以及亦包含任何未發現之人類FcγR類或FcγR同型異構物或他型，但不限定為該等。FcγR，係包含人類、小鼠、大鼠、兔及猴，但不限定為該等，任何生物來源均可。小鼠FcγR類中，包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、以及亦包含任何未發現之小鼠FcγR類或FcγR同型異構物或他型，但不限定為該等。如此之Fcγ受體之適合的例子，可列舉人類FcγRI (CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。人類FcγRI之多肽序列係記載於序列編號：78(NP_000557.1)、人類FcγRIIa(他型H131)之多肽序列係記載於序列編號：79(AAH20823.1)(他型R131係序列編號：79之第166號胺基酸被取代為Arg之序列)、FcγRIIb之多肽序列係記載於序列編號：80(AAI46679.1)、FcγRIIIa之多肽序列係記載於序列編號：81(AAH33678.1)、及FcγRIIIb之多肽序列係記載於序列編號：82(AAI28563.1)(括號內表示RefSeq等之資料庫登錄編號)。Fcγ受體，對IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區域是否具有結合活性，可藉由FACS或ELISA方式，此外可藉由ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用了表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等周知之方法來確認(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010)。
包含FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)以及包含同型異構物FcγRIIIa(包含他型V158及F158)及FcγRIIIb(包含他型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，與IgG之Fc區域結合的α鏈及具有於細胞內傳達活性化訊息之ITAM的共通γ鏈會締合。另一方面，包含同型異構物FcγRIIa(包含他型H131及R131)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)之本身的細胞質區域(cytoplasmic domain)中係包含 ITAM。該等之受體，係表現於巨噬細胞或肥大細胞、抗原呈現細胞等多數的免疫細胞。藉由使該等受體結合於IgG之Fc區域所傳達的活性化訊息，會促進巨噬細胞的吞噬能力或發炎性細胞激素之產生、肥大細胞之去顆粒、抗原呈現細胞之功能亢進。如上述般具有傳達活性化訊息之能力的Fcγ受體，於本說明書中稱為活性型Fcγ受體。
另一方面，FcγRIIb(包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)之本身的細胞質內區域中係包含傳達抑制型訊息的ITIM。於B細胞中，藉由FcγRIIb與B細胞受體(BCR)之交聯，抑制來自BCR之活性化訊息的結果，會抑制BCR之抗體產生。於巨噬細胞中，藉由FcγRIII與FcγRIIb之交聯，會抑制吞噬能力或發炎性細胞激素之產生能力。如上述般具有傳達抑制化訊息之能力的Fcγ受體，於本說明書中稱為抑制型Fcγ受體。
Fc區域對於FcγR之結合活性
如前所述，作為本發明之抗GPC3抗體中所含之Fc區域，可列舉對Fcγ受體具有結合活性之Fc區域。作為如此之Fc區域之非限定的一態樣，可舉例以人類IgG1(序列編號：74)、IgG2(序列編號：75)、IgG3(序列編號：76)、或IgG4(序列編號：77)表示之恆定區域中所含之Fc區域。Fcγ受體對IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區域是否具有結合活性，除了FACS或ELISA方式以外，亦可藉由ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用了表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等公眾所知之方法加以確認(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA篩選，係藉由使用予體(donor)與接受體(acceptor)之2種珠的ALPHA技術，基於下述原理來實施。結合於予體珠之分子，與結合於接受體珠之分子，會進行生物學上的相互作用，僅在2種珠接近的狀態時，會檢測出發光訊息。被雷射所激發之予體珠內的光敏劑，會將周邊的氧轉換為激發狀態之一重態氧。一重態氧會向予體珠周邊擴散，一到達附近之接受體珠，會引起珠內之化學發光反應，最終會放出光。結合於予體珠之分子結合於接受體珠之分子無相互作用時，予體珠所產生之一重態氧不會到達接受體珠，故不引起化學發光反應。
例如，含有經生物素標識之Fc區域的抗GPC3抗體結合於予體珠，經麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化之Fcγ受體結合於接受體珠。在不存在有包含競爭之Fc區域改變體之抗GPC3抗體之下，具有天然型Fc區域之抗GPC3抗體與Fcγ受體會相互作用，產生520-620nm之訊息。包含未經標籤化之Fc區域改變體的抗GPC3抗體，會與具有天然型Fc區域之抗GPC3抗體與Fcγ受體間之相互作用競爭。藉由將競爭結果所顯現之螢光減少予以定量，可決定相對的結合親和性。使用Sulfo-NHS-生物素等將抗體予以生物素化乃是公眾所知事項。作為將 Fcγ受體以GST予以標籤化的方法，可適當採用保有將使編碼Fcγ受體之多核苷酸與編碼GST之多核苷酸予以框內(in-frame)融合而得的融合基因連結為可作動的載體之細胞等中表現，且使用麩胱甘肽管柱純化之方法等。所得訊息係藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等軟體來擬合於利用非線形回歸解析之單位置競爭(one-site competition)模式，以適當地解析。
將觀察相互作用之物質的一方(配位子)固定於感測晶片之金薄膜上，當照光使得由感測晶片之背側起，於金薄膜與玻璃之界面全反射時，於反射光的一部分會形成反射強度降低的部分(SPR訊息)。將觀察相互作用之物質的另一方(分析物、analyte)流過感測晶片之表面，當配位子與分析物結合時，經固定化之配位子分子的質量會增加，感測晶片表面之溶劑折射率會變化。藉由此折射率之變化，SPR訊息之位置會偏移(相反地，該結合解離時訊息的位置會返回)。Biacore系統係以上述偏移量、亦即感測晶片表面之質量變化作為縱軸，以質量之時間變化作為測常數據而予以表示(傳感圖、sensorgram)。由傳感圖之曲線求出動力學表現：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，且由該常數的比求出親和力(KD)。BIACORE法中亦可適合使用阻止測定法。阻止測定法的例子例於Lazor等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010中記載。
Fcγ受體(FcγR)結合改變Fc區域
作為本發明之抗GPC3抗體所含之Fc區域，於以人類IgG1(序列編號：74)、IgG2(序列編號：75)、IgG3(序列編號：76)、或IgG4(序列編號：77)所示之恆定區中所含的Fc區域以外，亦可適合使用相較於天然型人類IgG之Fc區域對Fcγ受體的結合活性而言，對Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合改變Fc區域。本說明書中，所謂「天然型人類IgG之Fc區域」，意指以序列編號：74、75、76或77所例示之人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區所含的Fc區域之EU編號第297位所結合之糖鏈為含有岩藻糖之糖鏈的Fc區域。如此之FcγR結合改變Fc區域，可藉由將天然型人類IgG之Fc區域胺基酸予以改變而製作。FcγR結合改變Fc區域之對FcγR的結合活性，是否高於天然型人類IgG之Fc區域對FcγR之結合活性，除了前述FACS或ELISA方式以外，亦可使用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用了表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等周知方法來適當實施。
本發明中，所謂Fc區域之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，係包含改變為與起始Fc區域之胺基酸序列相異之胺基酸序列。只要起始Fc區域之修飾改變體可於pH中性區域結合於人類Fcγ受體，則任意之Fc區域均可作為起始Fc區域使用。又，以已施加改變之Fc區 域作為起始Fc區域，進一步施加了改變的Fc區域亦可適合作為本發明之Fc區域而使用。起始Fc區域可意指多肽本身、包含起始Fc區域之組成物、或編碼起始Fc區域之胺基酸序列。起始Fc區域中，可包含於抗體之項目所概說過的經重組而產生之周知Fc區域。起始Fc區域之起源，並無限定，可由非人類動物之任意生物或由人類取得。較佳之任意生物，可適合列舉由小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類中選擇之生物。於另外的態樣中，起始Fc區域亦可由食蟹猴、絨猿、恆河猴、黑猩猩、或人類中取得。較佳為，起始Fc區域可由人類IgG1中取得，但不限定為IgG之特定型。此係意指能夠以人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區域作為起始Fc區域而適當使用。同樣地，本說明書中，意指可將來自前述任意生物之IgG的任意型或次型的Fc區域，較佳作為起始Fc區域使用。天然存在之IgG的變異型或經操作之型的例子，係記載於周知文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、國際公開WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)，但不限定於該等。
作為改變的例子，係包含一個以上之變異，例如包含取代為與起始Fc區域之胺基酸不同的胺基酸殘 基之變異、或對於起始Fc區域之胺基酸***一個以上之胺基酸殘基或由起始Fc區域之胺基酸缺失一個以上之胺基酸等。較佳為於改變後之Fc區域的胺基酸序列中，包含含有天然所不產生之Fc區域的至少一部分的胺基酸序列。如此變種必然具有與起始Fc區域未達100%之序列同一性或類似性。較佳之實施形態中，變種係具有與起始Fc區域之胺基酸序列約75%~未達100%之胺基酸序列同一性或類似性、更佳為約80%~未達100%、又更佳為約85%~未達100%、再更佳為約90%~未達100%、最佳為約95%~未達100%之同一性或類似性的胺基酸序列。於本發明之非限定之一態樣中，起始Fc區域及本發明之FcγR結合改變Fc區域之間，係有至少1個胺基酸的差異。起始Fc區域與本發明之FcγR結合改變Fc區域之胺基酸的相異，亦可適合地藉由特別是以前述EU編號所特定之胺基酸殘基的位置之經特定的胺基酸的不同來特定。
為了改變Fc區域之胺基酸，可適當採用定點誘導突變法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等周知之方法。又，作為取代為天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸之改變方法，亦可採用複數個之周知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如亦可適合使用包含有使非天然胺基酸結合於終止密碼子之一即UAG密碼子(琥珀密碼子)的互補琥珀抑制型tRNA 而得的tRNA之無細胞轉譯系統(Clover Direct(Protein Express))等。
本發明之抗原結合分子中所含之對Fcγ受體之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區域對Fcγ受體之結合活性的FcγR結合改變Fc區域，可藉由任何方法取得，但具體而言，可藉由作為起始Fc區域使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變，來取得該FcγR結合改變Fc區域。用以改變之較佳IgG型免疫球蛋白之Fc區域，可列舉例如舉例為序列編號：74、75、76或77之人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及該等之改變體)之恆定區域中所含之Fc區域。
對其他胺基酸之改變，只要對Fcγ受體之結合活性，比天然型人類IgG之Fc區域對Fcγ受體之結合活性更高，則任何位置之胺基酸均可改變。抗原結合分子，含有人類IgG1之Fc區域作為人類Fc區域時，較佳為包含造成：使對Fcγ受體之的結合活性相較於結合於EU編號第297位之糖鏈為含有岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區域對Fcγ受體之結合活性更高的效果之改變。如此之胺基酸的改變，係於例如國際公開WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260及WO2006/023403等中有報告。
作為可進行如此改變之胺基酸，可舉例例如，EU編號所示之第221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位的群組中選擇之至少一個以上之胺基酸。藉由該等胺基酸之改變，可取得對Fcγ受體之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區域對Fcγ受體之結合活性的Fc區域(FcγR結合改變Fc區域)。
為了使用於本發明，特佳之改變，可舉例例如由Fc區域之EU編號所示之： 第221位之胺基酸為Lys或Tyr之任一者、第222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr之任一者、第223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys之任一者、第224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr之任一者、第225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp之任一者、第227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr之任一者、第228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr之任一者、第230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr之任一者、第231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr之任一者、第232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr之任一者、第233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、 第235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr之任一者、第241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr之任一者、第243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr之任一者、第244位之胺基酸為His、第245位之胺基酸為Ala、第246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr之任一 者、第247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr之任一者、第249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr之任一者、第250位之胺基酸為Glu或Gln之任一者、第251位之胺基酸為Phe、第254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr之任一者、第255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr之任一者、第256位之胺基酸為Ala、Met或Pro之任一者、第258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr之任一者、第260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr之任一者、第262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr之任一者、第263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr之任一者、第264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr之任一者、第265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、 第266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr之任一者、第267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp之任一者、第269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr之任一者、第271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第273位之胺基酸為Phe或Ile之任一者、第274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、 第275位之胺基酸為Leu或Trp之任一者、第276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp之任一者、第279位之胺基酸為Ala、第280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr之任一者、第281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr之任一者、第282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr之任一者、第283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr之任一者、第284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr之任一者、第285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr之任一者、第286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr之任一者、第288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr之任一者、 第290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr之任一者、第291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr之任一者、第292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr之任一者、第293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val之任一者、第297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、 第299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr之任一者、第300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp之任一者、第301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr之任一者、第302位之胺基酸為Ile、第303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr之任一者、第304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr之任一者、第305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr之任一者、第311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr之任一者、第313位之胺基酸為Phe、第315位之胺基酸為Leu、第317位之胺基酸為Glu或Gln、第318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr之任一者、第320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、 Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第323位之胺基酸為Ile、第324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、 第332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr之任一者、第333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr之任一者、第334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr之任一者、第335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr之任一者、第336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr之任一者、第337位之胺基酸為Glu、His或Asn之任一者、第339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr之任一者、第376位之胺基酸為Ala或Val之任一者、第377位之胺基酸為Gly或Lys之任一者、第378位之胺基酸為Asp、第379位之胺基酸為Asn、第380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser之任一者、第382位之胺基酸為Ala或Ile之任一者、第385位之胺基酸為Glu、第392位之胺基酸為Thr、第396位之胺基酸為Leu、 第421位之胺基酸為Lys、第427位之胺基酸為Asn、第428位之胺基酸為Phe或Leu之任一者、第429位之胺基酸為Met、第434位之胺基酸為Trp、第436位之胺基酸為Ile、或第440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr之任一者之群組中選擇的至少一個以上之胺基酸的改變。又，改變之胺基酸個數並無特殊限定，可僅改變一處的胺基酸、亦可改變二處以上之胺基酸。作為二處以上之胺基酸改變的組合，可列舉例如表3(表3-1~表3-3)所記載之組合。又，含有對Fcγ受體之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區域對Fcγ受體之結合活性的FcγR結合改變Fc區域(FcγR結合改變Fc區域)之抗GPC3抗體的具體例子，係記載於WO2007/047291。
Figure 104114756-A0305-02-0074-4
Figure 104114756-A0305-02-0075-5
Figure 104114756-A0305-02-0076-6
測定本發明之抗GPC3抗體中所含之Fcγ受體結合區域與Fcγ受體之結合活性之pH條件可適當使用pH酸性區域至pH中性區域之條件。作為測定本發明之抗原結合分子中所含之Fcγ受體結合區域與Fcγ受體之結合活性的條件之pH酸性區域至pH中性區域，通常意指 pH5.8~pH8.0。較佳為以pH6.0~pH7.4之任意pH值所示之範圍，較佳為由pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、及7.4中選擇，特佳為接近癌組織之pH的pH6.15~7.4(Vaupel等人(Cancer Res.(1989)49,6449-6665))。作為測定條件所使用之溫度，Fc區域與人類Fcγ受體之結合親和力，能夠於10℃~50℃之任意溫度評估。較佳為，為了決定Fc區域與人類Fcγ受體之結合親和力，係使用15℃~40℃之溫度。更佳為，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃之任一者的20℃至35℃之任意溫度，亦同樣地為了決定Fc區域與Fcγ受體之結合親和力而被使用。25℃之溫度乃是本發明之態樣的非限定之一例。
本說明書中，FcγR結合改變Fc區域對Fcγ受體之結合活性高於天然型Fc區域對Fcγ受體之結合活性，係指FcγR結合改變Fc區域對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb之任一者的人類Fcγ受體之結合活性，高於天然型Fc區域對該等人類Fcγ受體之結合活性。例如，係指基於上述解析方法，相較於作為對照之含有人類IgG天然型Fc區域之抗GPC3抗體的結合活性，含有FcγR結合改變Fc區域之抗GPC3抗體的結合活性，為105%以上，較佳為顯示110%以上、115%以上、120%以上、125%以上，特佳為130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、 160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上之結合活性。作為天然型Fc區域，可使用起始Fc區域、亦可使用相同次型之抗體的天然型Fc區域。
本發明中，作為對照之人類IgG之天然型Fc區域，可適合使用結合於EU編號表示之第297位胺基酸之糖鏈為含有岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區域。結合於EU編號表示之第297位胺基酸之糖鏈是否為含有岩藻糖之糖鏈，可使用周知手法確認。例如，可藉由如下述之方法，判定結合於天然型人類IgG之Fc區域的糖鏈是否為含有岩藻糖之糖鏈。藉由使N-Glycosidase F(Roche diagnostics)與被檢驗天然型人類IgG反應，糖鏈會從被檢驗天然型人類IgG游離(Weitzhandler等人(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。接著，將使乙醇反應而去除蛋白質之反應液(Schenk等人(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)之濃縮乾固物，藉由2-胺基苄醯胺進行螢光標識(Bigge等人(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。將藉由使用了纖維素匣(cellulose cartridge)的固相萃取而經去試藥之經螢光標識的2-AB化糖鏈，藉由順相層析解析。 藉由觀察檢測出之層析圖之波峰，可判定結合於人類IgG之天然型Fc區域的糖鏈是否為含有岩藻糖之糖鏈。
作為對照之含有相同次型之抗體的天然型Fc區域之抗GPC3抗體，可適當使用具有IgG單株抗體之Fc區域的抗GPC3抗體。作為該Fc區域之構造，可舉例序列編號：74(資料庫登錄編號AAC82527.1之N末端附加A)、75(資料庫登錄編號AAB59393.1之N末端附加A)、76(資料庫登錄編號CAA27268.1)、及77(資料庫登錄編號AAB59394.1之N末端附加A)記載之恆定區域中所含之Fc區域。又，使用某特定同型之抗GPC3抗體作為被檢測物質時，藉由使用該特定同型之抗GPC3抗體作為對照，來驗證含有被檢驗Fc區域之抗GPC3抗體對Fcγ受體之結合活性的效果。如上述方式，適當選擇含有經驗證對Fcγ受體之結合活性高的Fc區域之抗GPC3抗體。
對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性的Fc區域
如前所述，作為活性型Fcγ受體，可適合列舉包含FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；FcγRIIa以及包含同型異構物FcγRIIIa(包含他型V158及F158)及FcγRIIIb(包含他型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)。又，作為抑制型Fcγ受體之適合的例子，可列舉FcγRIIb(包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)。
作為本發明之非限定的一態樣，可舉例含有對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性的Fc區域之抗GPC3抗體。此時，對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性，係指對Fc區域之FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb之任一者的人類Fcγ受體之結合活性，高於對FcγRIIb之結合活性。例如，係指基於上述解析方法，含有Fc區域之抗原結合分子對FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb之任一者的人類Fcγ受體之結合活性，係對FcγRIIb之結合活性的105%以上，較佳為顯示110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，特佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上之結合活性。含有如此之Fc區域的IgG抗體，已知前述ADCC活性係有增強，因此含有該Fc區域之抗GPC3抗體，係有用於作為本發明之GPC3標的治療劑。
本發明之非限定的一態樣中，作為對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性(對活性型Fcγ受體具有選擇性的結合活性)的Fc區域之例子，可合適舉例前述EU編號所示之第221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、 231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群組中選擇的至少一個以上之胺基酸被改變為與天然型Fc區域相異之胺基酸的Fc區域。
本發明之非限定的一態樣中，對活性型Fcγ受體之結合活性高於對抑制型Fcγ受體之結合活性(對活性型Fcγ受體具有選擇性的結合活性)的Fc區域之例子，可適合列舉由表3-1至3-3記載之複數個胺基酸被改變為與天然型Fc區域相異之胺基酸的Fc區域。
糖鏈經修飾之Fc區域
本發明所提供之抗GPC3抗體中所含之Fc區域，亦可含有經修飾之Fc區域，使結合於Fc區域之糖鏈組成係結合岩藻糖缺損糖鏈之Fc區域比例提高、或使附加有平分型(bisecting)N-乙醯葡萄糖胺之Fc區域的比例提高。已知自結合於抗體Fc區域之N-醣苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡萄糖胺去除岩藻糖殘基時，對FcγRIIIa之親和性會增強(Sato等人(Expert Opin.Biol.Ther.(2006)6(11),1161-1173))。已知包含如此Fc區域之IgG1抗體，上述ADCC活性會增強，因此含有該Fc區域之抗原結合分子，亦有用於作為本發明之醫藥組成物中所含之抗原結合分子。作為自結合於抗體Fc區域之N-醣苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡萄糖胺去除岩藻糖殘基的抗體，可列舉例如下述抗體；-經修飾醣化之抗體(國際公開WO1999/054342等)、-附加於糖鏈之岩藻糖缺損的抗體(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。又，含有經修飾之Fc區域，使結合於Fc區域之糖鏈組成係結合岩藻糖缺損糖鏈之Fc區域比例提高、或使附加有平分型N-乙醯葡萄糖胺之Fc區域的比例提高之抗GPC3抗體的具體例子，係記載於WO2006/046751及WO2009/041062。
更具體而言，作為自結合於抗體Fc區域之N -醣苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡萄糖胺去除岩藻糖殘基之抗體的不同之非限定的一態樣，為了製作附加於糖鏈之岩藻糖有缺損的抗體(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)，而改變了形成受糖鏈修飾之多肽的糖鏈構造之活性的結果，會製作於糖鏈附加岩藻糖的能力低之宿主細胞。藉由於該宿主細胞中表現所期望的抗體基因，可由該宿主細胞之培養液中回收該糖鏈中的岩藻糖有缺損的該抗體。作為形成多肽糖鏈構造之活性，可列舉由岩藻糖轉移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖轉運蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-表異構酶，4-還原酶)(EC 1.1.1.271)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)所成群組中選擇之酵素或轉運蛋白之活性作為非限定之適合的例子。該等酵素或轉運蛋白，只要可發揮其活性，則其構造並無特別的特定。本說明書中，將可發揮該等活性之蛋白質稱為功能性蛋白質。改變該等活性之方法的非限定之一態樣，可列舉該等活性之缺失。為了製作該等活性經缺失之宿主細胞，可適當採用將該等功能性蛋白質之基因破壞為無法發揮功能的方法等周知之方法(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。如此之活性經缺失的宿主細胞，可藉由將CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓腫細胞、P3X63小鼠骨髓腫細胞、PER細胞、 PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等之內在性的該等功能性蛋白質之基因破壞為無法發揮功能之方法等而製作。
具有含有平分型GlcNAc之糖鏈的抗體(國際公開WO2002/079255等)乃為周知。於非限定之一態樣中，為了製作具有含有平分型GlcNAc之糖鏈的抗體，係製作表現編碼具有GnTIII(β-1,4-甘露糖-糖蛋白，4-β-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖轉移酶)(EC 2.4.1.38)活性之功能性蛋白質的基因之宿主細胞。其他非限定之適合的一態樣中，於前述功能性蛋白質以外，係製作編碼具有人類ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性之功能性蛋白質的基因、編碼具有GnTI(β-1,2-乙醯葡萄糖胺轉移酶I)(EC 2.4.1.94)活性之功能性蛋白質的基因、編碼具有GnTII(β-1,2-乙醯葡萄糖胺轉移酶II)(EC 2.4.1.143)活性之功能性蛋白質的基因、編碼具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性之功能性蛋白質的基因、及α-1,6-岩藻糖轉移酶(EC 2.4.1.68)共同表現的宿主細胞(國際公開WO2004/065540)。
藉由如前述之於對糖鏈附加岩藻糖之能力低的宿主細胞、及具有形成包含平分型GlcNAc構造之糖鏈的活性之宿主細胞中轉導入包含抗體基因之表現載體，可分別製作自結合於抗體Fc區域之N-醣苷結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯葡萄糖胺經去除岩藻糖殘基之抗體、 及具有含有平分型GlcNAc之糖鏈的抗體。該等抗體之製造方法，亦可應用於本發明之含有經修飾之改變Fc區域，使結合於Fc區域之糖鏈組成係結合岩藻糖缺損糖鏈之Fc區域比例提高、或使附加有平分型N-乙醯葡萄糖胺之Fc區域的比例提高的抗原結合分子之製造方法。結合於藉由如此之製造方法所製作之本發明之抗原結合分子中所含之Fc區域的糖鏈組成，可藉由前述「Fcγ受體(FcγR)結合改變Fc區域」所記載的方法予以確認。
等電點經改變之抗GPC3抗體
作為本發明中使用之抗GPC3抗體之非限定的一態樣，亦可舉例改變抗GPC3抗體之胺基酸殘基，使其等電點(pI)變化的抗GPC3抗體。本發明所提供之抗GPC3抗體之「胺基酸殘基之電荷改變」的適合的例子，可列舉以下者。作為使pI值增加的改變，例如可進行由：序列編號：50表示之抗GPC3抗體之重鏈可變區域中以Kabat編號表示之第43位之Q取代為K、第52位之D取代為N、第105位之Q取代為R中選擇之至少一個取代，例如改變為序列編號：67表示之胺基酸序列。又，例如可進行由：序列編號：51或序列編號：66表示之抗GPC3抗體之輕鏈可變區域中以Kabat編號表示之第17位之E取代為Q、第27位之Q取代為R、第105位之Q取代為R中選擇之至少一個取代，例如改變為序列編號：68表示之胺基酸序列。另一方面，作為使pI值減少的改變，可 進行由：序列編號：50表示之抗GPC3抗體之重鏈可變區域中以Kabat編號表示之第19位之K取代為T、第43位之Q取代為E、第61位之G取代為E、第62位之K取代為S、第64位之K取代為Q、第65位之G取代為D中選擇之至少一個取代，例如改變為序列編號：69、序列編號：71表示之胺基酸序列。又，例如可進行由：序列編號：51或序列編號：66表示之抗GPC3抗體之輕鏈可變區域中以Kabat編號表示之第24位之R取代為Q、第27位之Q取代為E、第74位之K取代為T、第77位之R取代為S、第107位之K取代為E中選擇之至少一個取代，例如改變為序列編號：70、序列編號：72、序列編號：73表示之胺基酸序列。進一步地，作為使pI值減少的改變，可列舉序列編號：74表示之重鏈恆定區域中，由EU編號表示之第268位、274位、355位、356位、358位、419位中選擇之胺基酸的至少一者的取代。該等之取代，可列舉例如序列編號31表示之重鏈恆定區域之以EU編號表示之第268位之H取代為Q、第274位之K取代為Q、第355位之R取代為Q、第356位之D取代為E、第358位之L取代為M、第419位之Q取代為E中選擇之至少一個取代作為適合的例子。該等取代之結果，係構築人類抗體之IgG1之恆定區域與IgG4之恆定區域的嵌合體。亦即，藉由該取代，對所改變之抗體之免疫原性不會產生影響，可製作具有所期望之pI的抗體。
用以減低異質性(heterogeneity)之改變
序列編號：74、75、76或77表示之IgG恆定區中之以EU編號表示之第446位之Gly及第447位之Lys經缺損的IgG恆定區，亦可使用作為本發明之抗GPC3抗體中所含之恆定區。藉由使該等胺基酸兩者缺損，可減低來自抗體之重鏈恆定區之末端的異質性。
抗體之修飾
多肽之轉譯後修飾，係指多肽之生合成中，對經轉譯之多肽的化學修飾。抗體之一次構造係由多肽形成，因此本發明之抗GPC3抗體中，亦含有抗GPC3抗體之一次構造之多肽受過轉譯後修飾的修飾物。多肽之轉譯後修飾，可大略分類為官能基附加、多肽或胜肽之附加(ISG化、SUMO化、泛素化)、胺基酸之化學性質轉換(矽烷化或脫胺、脫醯胺)、及構造轉換(雙硫化、蛋白酶分解)。作為本發明中轉譯後修飾之非限定的一態樣，可列舉對多肽之形成單位即胺基酸殘基的胜肽附加或官能基附加。作為該修飾，具體而言可列舉磷酸化(絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸等)、葡萄糖苷化(絲胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸等)、醯化(昆麻毒素)、乙醯化(昆麻毒素)、羥基化(昆麻毒素、脯胺酸)、異戊二烯化(半胱胺酸)、棕櫚醯化(半胱胺酸)、烷基化(昆麻毒素、精胺酸)、聚麩胺醯化(麩胺酸)、羧基化(麩胺酸)、聚甘胺醯化(麩胺酸)、瓜胺酸化(精胺酸)、琥珀醯亞胺形 成(天冬胺酸)等。例如，受到以N末端之麩醯胺的焦麩胺醯化所進行之對焦麩胺酸的修飾的抗GPC3抗體亦當然包含於本發明之抗GPC3抗體中。又，例如藉由意指二個硫原子之間所形成之共價鍵之「雙硫鍵」，以連結重鏈與輕鏈、或重鏈之間的而得之抗GPC3抗體之轉譯後修飾物，亦包含於本發明之抗GPC3抗體中。胺基酸之半胱胺酸中所含之硫醇基，可與第二硫醇基形成雙硫鍵或交聯。一般而言，IgG分子中，其CH1及CL區域藉由雙硫鍵連結，而形成重鏈之二個多肽，係藉由EU編號表示之第226位及229位之半胱胺酸殘基間之雙硫鍵而連結。藉由如此之雙硫鍵而連結之抗GPC3抗體之轉譯後修飾物，亦包含於本發明之抗GPC3抗體中。
GPC3標的治療劑療法
「GPC3標的治療劑療法」之用語，係指將GPC3標的治療劑投予至患者。
「GPC3標的治療劑療法對於癌的有效性」或「GPC3標的治療劑療法對於癌為有效」之用語，係指被診斷為癌的患者中，GPC3標的治療劑療法會產生所期望或有益的效果。所期望或有益的效果，可包含(1)阻止癌細胞進一步成長或擴散、(2)癌細胞之死亡、(3)阻止癌的復發、(4)與癌關聯的症狀(疼痛等)之緩和、減低、減輕、阻止、或前述症狀頻率的減低、或(5)患者之生存率的改善。癌之復發的阻止，係包含至今為止係 藉由放射線、化學療法、外科手術、或其他技術而治療，而阻礙癌於癌之原發部位及於周邊組織的成長、以及癌不於新的遠端部位成長。所期望或有益的效果，可為被患者所知覺者或客觀者的任一者。例如，患者為人類時，人類對於改善或療法的反應，可認識氣力或活力的改善或疼痛之減少，作為被患者所知覺的徵兆。或者臨床醫師可基於身體檢査、實驗參數、腫瘤標記、或X射線攝影之所見，可發覺腫瘤尺寸或腫瘤組織量之減少。關於對治療之反應，臨床醫師可觀察到的數個實驗徵兆，係包含白血球數、紅血球數、血小板數、紅血球沈降速度、及各種酵素量等之試驗結果的標準化。進一步地，臨床醫師可觀察到可檢測之腫瘤標記的減少。或者，為了評估客觀的改善，可使用超音波診斷、核磁共振試驗、及正子放出試驗等其他之試驗。
本作為本發明之GPC3標的治療劑療法之對象的癌，只要係標的之GPC3有高表現的癌，則任何癌均可。作為如此癌的一例，例示有由乳癌、子宮頸癌、大腸癌、子宮體癌、頭頸部癌、肝臟癌、肺癌、惡性類癌(Malignant carcinoid)、惡性神經膠瘤(Malignant glioma)、惡性淋巴瘤(Malignant lymphoma)、惡性黑色素瘤(Malignant melanoma)、卵巢癌、胰臟癌、攝護腺癌、腎臟癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、尿道上皮癌等中選擇之癌。
決定GPC3標的治療劑療法之有效性的方法、或決定繼續GPC3標的治療劑療法的方法
本發明之非限定的一態樣中，係提供測定由接受GPC3標的治療劑療法之前的患者及/或接受GPC3標的治療劑療法後之患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該免疫細胞上表現之分子的表現量，當該細胞數或表現量為規定值時，則決定該GPC3標的治療劑療法為有效之方法、或決定繼續該療法之方法。「接受GPC3標的治療劑療法之前的患者」，係指被診斷為癌之患者，且係未經歷投予上述GPC標的治療劑的患者，進一步地，該患者，亦可由上述組織中GPC3之表現量，來決定GPC3標的治療法為有效。又，「接受GPC3標的治療劑療法後之患者」，係指具有投予上述GPC3標的治療劑之經歷的患者。GPC3標的治療劑之投予路徑，可依據所投予之GPC3標的治療劑的性狀等，適當選擇適合的投予路徑。例如，作為投予路徑之例子，可舉例非經口投予。作為非經口投予之進一步的例子，例如可舉例注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予。例如作為注射投予之進一步的例子，例示有以靜脈內注射投予、肌肉內注射投予、腹腔內注射投予、皮下注射投予等所進行之全身或局部投予。
本發明之非限定的一態樣中，包含測定由前述患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數，此處，該細胞數為規定值時，預測、預想或決定對於該患者之癌的GPC3標的治療劑療法為有效，或決定該療法的繼續。本 發明所測定之免疫細胞並無特別限定，但可舉例例如，白血球、單核球、嗜中性球、淋巴球。關於淋巴球，可舉例CD19+B細胞、CD45+淋巴球、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、以及CD4+/CD8+T細胞、CD16+NK細胞、NKp46+NK細胞、CD56強陽性NK細胞、CD56-CD16+NK細胞、CD56弱中陽性CD16-NK細胞、CD56弱中陽性CD16強陽性NK細胞。測定此等細胞之任一種類的細胞數，可作為用以預測、預想或決定GPC3標的治療劑療法對於癌為有效的指標，此等細胞之中，亦可組合數種作為指標。
規定值係，例如，對複數癌患者進行GPC3標的治療劑療法，若為較無法確定GPC3標的治療劑療法對於癌的效果之患者群的免疫細胞數平均值高的範圍的值的話，則可作為期待該療法效果之規定值。又，例如，對複數癌患者進行GPC3標的治療劑療法，基於確認到顯著的PFS延長或顯著的OS延長傾向之患者群的免疫細胞數平均值可決定規定值。又，例如，測定複數癌患者之免疫細胞數，以較其中央值高的值作為規定值，或可作為用以以高準確率選擇確認到GPC3標的治療劑療法所致之顯著的PFS延長或顯著的OS延長傾向的患者之規定值。此處所謂複數癌患者，只要是作為用以決定GPC3標的治療劑療法之有效性或繼續的基準，對於免疫細胞數之規定值能作為顯著的值算出的數即可，100人以上較佳，150人以上更佳。作為規定值，具體而言例如，白血球數之情形可 由較2500個/μL、3000個/μL、3500個/μL、4000個/μL、4350個/μL、4500個/μL、4750個/μL、5000個/μL、5250個/μL、5500個/μL、5750個/μL、6000個/μL、6500個/μL、7000個/μL、7500個/μL、8000個/μL、8500個/μL、9000個/μL等特定之值高的值中決定。該規定值，例如，可由2500個/μL至9000個/μL之數值範圍中適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有3000個/μL至8000個/μL。作為更佳數值範圍，例示有3500個/μL至7000個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有4000個/μL至6000個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
單核球數之情形中，可由較50個/μL、100個/μL、200個/μL、300個/μL、350個/μL、400個/μL、450個/μL、500個/μL、550個/μL、600個/μL、650個/μL、700個/μL、800個/μL、900個/μL、1000個/μL、1100個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由50個/μL至1100個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有100個/μL至1000個/μL。作為更佳數值範圍，例示有200個/μL至900個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有400個/μL至800個/μL但不限定於此等可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
嗜中性球之情形中，可由較500個/μL、1000個/μL、1500個/μL、2000個/μL、2500個/μL、3000個/μL、3250個/μL、3500個/μL、3750個/μL、4000個 /μL、4250個/μL、4500個/μL、5000個/μL、5500個/μL、6000個/μL、6500個/μL、7000個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由500個/μL至7000個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有1000個/μL至6000個/μL。作為更佳數值範圍，例示有1500個/μL至5000個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有3000個/μL至4000個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
淋巴球之情形中，可由較400個/μL、500個/μL、600個/μL、700個/μL、800個/μL、900個/μL、1000個/μL、1100個/μL、1200個/μL、1250個/μL、1300個/μL、1400個/μL、1500個/μL、1600個/μL、1700個/μL、1800個/μL、1900個/μL、2000個/μL、2100個/μL、2200個/μL、2300個/μL、2400個/μL、2500個/μL、3000個/μL、3500個/μL、4000個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由400個/μL至4000個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有450個/μL至3000個/μL。作為更佳數值範圍，例示有500個/μL至2500個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有1000個/μL至2000個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
進而淋巴球之中，CD45+淋巴球之情形中，可由較400個/μL、500個/μL、600個/μL、700個/μL、800個/μL、900個/μL、950個/μL、1000個/μL、1050個 /μL、1100個/μL、1200個/μL、1300個/μL、1400個/μL、1500個/μL、1600個/μL、1700個/μL、1800個/μL、1900個/μL、2000個/μL、2100個/μL、2200個/μL、2300個/μL、2400個/μL、2500個/μL、2600個/μL、2700個/μL、2800個/μL、2900個/μL、3000個/μL、3500個/μL、4000個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由400個/μL至4000個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有450個/μL至3500個/μL。作為更佳數值範圍，例示有500個/μL至3000個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有1000個/μL至1500個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
CD3+T細胞之情形中，可由較250個/μL、300個/μL、400個/μL、500個/μL、600個/μL、700個/μL、800個/μL、900個/μL、1000個/μL、1100個/μL、1200個/μL、1250個/μL、1300個/μL、1400個/μL、1500個/μL、1600個/μL、1700個/μL、1800個/μL、1900個/μL、2000個/μL、2100個/μL、2200個/μL、2300個/μL、2400個/μL、2500個/μL、3000個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由250個/μL至3000個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有300個/μL至2500個/μL。作為更佳數值範圍，例示有350個/μL至2000個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有400個/μL至1000個/μL但不限定於此等。可由較該數值 範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
CD4+T細胞之情形中，可由較150個/μL、200個/μL、250個/μL、300個/μL、350個/μL、400個/μL、450個/μL、500個/μL、550個/μL、600個/μL、650個/μL、700個/μL、750個/μL、800個/μL、850個/μL、900個/μL、950個/μL、1000個/μL、1100個/μL、1200個/μL、1300個/μL、1400個/μL、1500個/μL、1600個/μL、1700個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由150個/μL至1700個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有200個/μL至1500個/μL。作為更佳數值範圍，例示有250個/μL至700個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有300個/μL至600個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
CD8+T細胞之情形中，可由較50個/μL、75個/μL、100個/μL、125個/μL、150個/μL、175個/μL、200個/μL、225個/μL、250個/μL、275個/μL、300個/μL、325個/μL、350個/μL、400個/μL、500個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由50個/μL至500個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有50個/μL至300個/μL。作為更佳數值範圍，例示有75個/μL至275個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有100個/μL至250個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
CD16+NK細胞之情形中，可由較25個/μL、50個/μL、150個/μL、175個/μL、200個/μL、225個/μL、250個/μL、300個/μL、350個/μL、400個/μL、450個/μL、500個/μL、550個/μL、600個/μL、700個/μL、800個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由25個/μL至800個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有50個/μL至700個/μL。作為更佳數值範圍，例示有100個/μL至600個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有150個/μL至300個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
NKp46+NK細胞之情形中，可由較20個/μL、30個/μL、40個/μL、50個/μL、60個/μL、70個/μL、80個/μL、90個/μL、100個/μL、110個/μL、120個/μL、130個/μL、140個/μL、150個/μL、200個/μL、250個/μL、300個/μL、350個/μL、400個/μL.等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由20個/μL至400個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有30個/μL至300個/μL。作為更佳數值範圍，例示有50個/μL至250個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有100個/μL至200個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
CD56-CD16+NK細胞之情形中，可由較2個/μL、3個/μL、4個/μL、5個/μL、6個/μL、7個/μL、8個 /μL、9個/μL、10個/μL、11個/μL、12個/μL、13個/μL、14個/μL、15個/μL、20個/μL、25個/μL、30個/μL、40個/μL等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由2個/μL至40個/μL之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有2個/μL至30個/μL。作為更佳數值範圍，例示有2個/μL至20個/μL，作為再更佳數值範圍，例示有3個/μL至10個/μL但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
又，本發明之非限定的一態樣中，包含測定由前述患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞上所表現的分子之表現量，此處，該表現量為規定值時，預測、預想或決定對於該患者之癌之GPC3標的治療劑療法為有效，或決定繼續該療法。本發明所測定之免疫細胞上所表現之分子並無特別限定，但可舉例例如CD16。測定此等分子之表現量，可作為用以預測、預想或決定GPC3標的治療劑療法對於癌為有效的指標，此等表現量之中，亦可組合數種作為指標。規定值係，例如CD16之情形，對複數癌患者進行GPC3標的治療劑療法，若為較無法確認GPC3標的治療劑療法對於癌效果之患者群的免疫細胞上之CD16表現量的平均值高之範圍的值的話，則可作為期待該療法效果的規定值。又，例如，對複數癌患者進行GPC3標的治療劑療法，基於確認到顯著的PFS延長或顯著的OS延長傾向之患者群的CD16表現量的平均值可決定規定值。又，例如，測定複數癌患者之CD16表現量， 以較其中央值高的值作為規定值，或可作為用以以高準確率選擇確認到GPC3標的治療劑療法所致之顯著的PFS延長或顯著的OS延長傾向的患者之規定值。此處所謂複數癌患者，只要是作為用以決定GPC3標的治療劑療法之有效性或繼續的基準，對於CD16表現量之規定值能作為顯著的值算出的數即可，100人以上較佳，150人以上更佳。作為規定值，具體而言例如，NK細胞上之CD16之情形中，以上述流動式細胞測量術之螢光強度測定值，可由較150000mesf、175000 mesf、200000 mesf、225000 mesf、250000 mesf、275000 mesf、300000 mesf、325000 mesf、350000 mesf、375000 mesf、400000 mesf、425000 mesf、450000 mesf、475000 mesf、500000 mesf、525000 mesf、550000 mesf、575000 mesf、600000 mesf、625000 mesf、650000 mesf、675000 mesf、700000 mesf、750000 mesf、800000 mesf等特定之值高的值來決定。該特定之值，例如，可由150000 mesf至800000 mesf之數值範圍適宜地選擇。作為較佳數值範圍，例示有200000 mesf至700000 mesf，作為更佳數值範圍，例示有300000 mesf至650000 mesf，作為再更佳數值範圍，例示有350000 mesf至600000 mesf但不限定於此等。可由較該數值範圍所選擇之特定之值高的值作為規定值。
又，本發明之非限定的一態樣中，包含使用由前述患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞測定對GPC3表現細胞之ADCC活性，此處，該免疫細胞上之 CD16及/或CD107a表現量為規定值時，該患者中之ADCC活性高，預測、預想或決定GPC3標的治療劑療法對於癌為有效，或決定繼續該療法。本發明中測定免疫細胞上之CD16、CD107a之任一種類或兩者的表現量，可作為用以預測、預想或決定GPC3標的治療劑療法對於癌為有效的指標。
規定值係，例如，對複數癌患者進行GPC3標的治療劑療法，將無法確認GPC3標的治療劑療法對於癌效果患者群之生物學試樣中的免疫細胞上之CD16或CD107a表現量在GPC3標的療法劑存在下與非存在下比較，CD16之情形中，若規定值為較與GPC3標的療法劑非存在下之表現量之差的平均值低範圍的值的話，則可作為期待該療法效果之規定值，CD107a之情形中，若規定值為較與GPC3標的療法劑非存在下之表現量之差的平均值高範圍的值的話，則可作為期待該療法效果的規定值。又，例如，對複數癌患者進行GPC3標的治療劑療法，將被確認顯著的PFS延長或顯著的OS延長傾向之患者群的生物學試樣中之免疫細胞上的CD16或CD107a表現量在GPC3標的療法劑存在下與非存在下進行比較，可基於與GPC3標的療法劑非存在下之表現量的差之平均值決定規定值。又，例如，將複數癌患者之生物學試樣中的免疫細胞上之CD16或CD107a表現量在GPC3標的療法劑存在下與非存在下進行比較，CD16之情形中，若規定值為較與GPC3標的療法劑非存在下之表現量的差之中央值低範 圍的值的話，則可作為期待該療法效果之規定值，CD107a之情形中，若規定值為較與GPC3標的療法劑非存在下之表現量的差之中央值高範圍的值的話，則可作為期待該療法效果之規定值。此處所謂複數癌患者，只要是能作為用以GPC3標的治療劑療法之有效性或決定繼續的基準，將對於CD16或CD107a表現量之規定值作為顯著的值算出的數即可，100人以上較佳，150人以上更佳。
規定值係，具體而言例如，CD16之情形中，例示有將GPC3標的療法劑存在下之CD16表現量減去GPC3標的療法劑非存在下之表現量的值為較由-10%至-95%所選擇之特定之值低的值。作為較佳數值範圍，例示有-20%至-90%，作為再更佳數值範圍，例示有-50%至-90%但不限定於此等。
CD107a之情形中，例示有將GCP標的療法劑存在下之CD16表現量減去GPC3標的療法劑非存在下之表現量的值較由5%至70%所選擇之特定之值高的值。作為較佳數值範圍，例示有10%至60%，作為再更佳數值範圍，例示有25%至60%但不限定於此等。
免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量之規定值，係依賴於許多因子，例如，所用之分析方法、測定游離GPC3之試樣的類型、試樣之保存條件(溫度及期間等)、患者之民族的同一性等，可有少許變化。預測、預想或決定上述為有效之方法，或決定繼續該療法的方法中，免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量，係 在自患者所單離之生物學試樣，尤其是末梢血中測定。
前述免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量，可於開始GPC3標的治療劑療法之前及/或開始之後所單離之試樣中測定，但該等以規定時間間隔所採取之複數的試樣亦可測定。以規定時間間隔所採取之複數的試樣當中任一者的免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量為上述規定之細胞數及/或表現量時，則預測、預想或決定該患者之對癌之GPC3標的治療劑療法為有效，或決定該療法的繼續。規定之時間間隔可適當設定，作為該間隔之非限定的一態樣，可於GPC3標的治療劑之初次投予後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日(即1週)、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日(即2週)、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日(即3週)、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日(即4週)、29日、30日、1月、5週、6週、7週、8週、9週、10週、2個月、3個月、4個月、5個月、或6個月、或1次、2次、3次、4次、或其以上之治療循環後等之療法開始與結束之間的任何時間點採取。投予間隔亦即治療循環可適當設定，可舉例例如，1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日(即1週)、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日(即2週)、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日(即3週)、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日(即4週)、29日、30日、1月、5週、6週、7週、8 週、9週、10週、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月等作為非限定的一例。
上述之，該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定該GPC3標的治療劑療法為有效時，可考慮該患者是否具有Fcγ受體的型Ⅱ A及/或型Ⅲ A之基因中，FcγR Ⅲ A之第158位的至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型。即亦包含：對象患者中免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量為規定值，且對象患者具有FcγR Ⅲ A之第158位的胺基酸殘基之至少1個為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型時，則決定該GPC3標的治療劑療法為有效。
又，上述之，該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定繼續該GPC3標的治療劑療法時，可考慮該患者是否具有Fcγ受體之型Ⅱ A及/或型Ⅲ A之基因中，FcγR Ⅲ A之第158位的至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型。即亦包含：對象患者中免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量為規定值，且對象患者具有FcγR Ⅲ A之第158位的胺基酸殘基之至少1個為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型時，則決定繼續該GPC3標的治療劑療法。
此處，所謂具有FcγR Ⅲ A之第158位的至少1個胺基酸殘基為Val之多型，係指依循上述Fcγ受體多型之確認中所記載之方法，FcγR Ⅲ A之情形中確認編碼第158位之胺基酸殘基的鹼基序列，若為Val之同型(V/V)或異型(V/F)的鹼基序列時，則符合此等。又，所謂具有FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型，係指同樣地，確認編碼FcγR Ⅱ A之第131位胺基酸殘基的鹼基序列，若為His之同型(H/H)或異型(H/R)的鹼基序列時，則符合此等。
上述之，該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定該GPC3標的治療劑療法為有效時，可進一步考慮該自患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量。即亦包含：自對象患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量為特定之評估分數以上，且對象患者之免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量為規定值時，決定該GPC3標的治療劑療法為有效。
又，上述之，該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定繼續該GPC3標的治療劑療法時，可一併考慮由該患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3之表現量。即亦包含：自對象患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量為特定之評估分數以上，且對象患者之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規 定值時，決定繼續該GPC3標的治療劑療法。
作為自患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量為特定之價分數以上時之非限定的一態樣，可舉例為規定之組織免疫染色分數以上。作為規定之組織免疫染色分數以上時之非限定的一態樣，可例示有以WO2009116659所記載之染色法(染色法1)之染色結果算出的複合評估分數1為高表現、或低或中表現(各IHC total分數為7以上或未達7)。又，以複合評估分數2所使用之染色法(染色法2)之染色結果算出的GPC3-IHC分數(複合評估分數2)為1+、2+、3+之情形等亦可例示為規定之組織免疫染色分數以上時之非限定的一態樣。
治療劑及製劑
本發明中，治療劑通常係指用以治療或預防、或檢查‧診斷疾病之藥劑。又，本發明中，「用以對自接受GPC3標的治療劑療法之前的癌患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之患者所投予之GPC3標的治療劑」之用語，亦可換稱為「包含對自接受GPC3標的治療劑療法之前的癌患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之患者投予GPC3標的治療劑之癌之治療方法」，亦可換稱為「製造用以治療癌之醫藥時，用以對自接受GPC3標的治療劑療法之前的癌患者所 單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之患者投予之GPC3標的治療劑之使用」。又，本發明中，「用以對自接受過GPC3標的治療劑療法後的癌患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之患者進一步投予之GPC3標的治療劑」之用語，亦可換稱為「包含對自接受過GPC3標的治療劑療法後的癌患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之患者進一步投予GPC3標的治療劑之癌之治療方法」，亦可換稱為「製造用以治療癌之醫藥時，用以對自接受過GPC3標的治療劑療法後的癌患者所單離之生物學試樣中的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之患者進一步投予之GPC3標的治療劑之使用」。
本發明之治療劑，可使用對所屬技術領域中具有通常知識者係周知之方法予以製劑化。例如，能夠以與水或其以外之藥學上可容許的液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑的形式，非經口地使用。例如，能夠與藥理學上容許之載體或媒體，具體而言係滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、香味劑、賦形劑、載具(vehicle)、防腐劑、結合劑等適當地組合，藉由以一般認可之製藥實施所要求的單位用量形態混合而予以製劑化。該等製劑中之有效成分量，係設定為可得到指示範圍之適當容量。
用以注射之無菌組成物，可藉由使用如注射用蒸餾水般之載具，遵照通常之製劑實施予以處方。注射用之水溶液，可列舉例如含有生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。可併用適當之溶解輔助劑、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(Polysorbate 80(TM)、HCO-50等)。
油性液可列舉芝麻油、大豆油，作為溶解輔助劑，亦可併用苯甲酸苄酯及/或苄醇。又，可調配緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、無痛化劑(例如普魯卡因鹽酸鹽)、穩定劑(例如苄醇及酚)、抗氧化劑。所配製之注射液通常係填充於適切的安瓿中。
本發明之治療劑，較佳為藉由非經口投予來投予。例如係投予注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之治療劑。可藉由例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等，對全身或局部投予。
投予方法可由患者年齡、症狀而適當選擇。含有前述治療劑之醫藥用製劑之投予量，例如可於每一次體重每1kg由0.0001mg至1000mg之範圍內設定。或例如可設定每個患者0.001~100000mg之投予量，但本發明並不一定限制於此等數值。投予量及投予方法，係隨患者之體重、年齡、症狀等而變動，所屬技術領域中具有通常知識者，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。例如，作為本發明之較佳投予量與投予方法之一例， 可以使患者之血中谷底濃度值成為一定量以上的方式投予。較佳之血中谷底濃度值，可舉例例如，150μg/mL以上、160μg/mL以上、170μg/mL以上、180μg/mL以上、190μg/mL以上、200μg/mL以上、210μg/mL以上、220μg/mL以上、230μg/mL以上、240μg/mL以上、250μg/mL以上、260μg/mL以上、270μg/mL以上、280μg/mL以上、290μg/mL以上、300μg/mL以上、400μg/mL以上。更佳為可舉例200μg/mL以上。
本發明之製劑中，包含對自接受過GPC3標的治療劑療法之癌患者所單離之生物學試樣中之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值的患者進一步投予主旨之指示書。又，另一非限定的一態樣中，包含對自接受過GPC3標的治療劑療法之癌患者所單離之生物學試樣中之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為，較接受GPC3標的治療劑療法後增大之患者進一步投予主旨的指示書。
本發明之非限定的一態樣中提供一種包含指示書的製劑，該指示書記載了包含測定自接受了GPC3標的治療劑療法之患者所單離之生物學試樣中之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量，該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值時，則決定該GPC3標的治療劑療法為有效，或決定繼續該療法。
本發明之非限定的一態樣中提供一種包含指示書的製劑，該指示書記載了包含測定自前述患者所單離 之生物學試樣中之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量，此處，該細胞數及/或表現量為規定值時，預測、預想或決定該患者之GPC3標的治療劑療法對於癌為有效，或決定繼續該療法。此處該指示書所記載之規定值，例示有決定上述GPC3標的治療劑療法之有效性的方法，或決定繼續GPC3標的治療劑療法的方法所記載之規定值。
免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量之規定值，係依賴於許多因子，例如，所用之分析方法、測定免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量之試樣的類型、試樣之保存條件(溫度及期間等)、患者之民族的同一性等，可有少許變化。預測、預想或決定上述為有效之方法，或決定繼續該療法的方法中，作為免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量之規定值，係在自患者所單離之生物學試樣，尤其是末梢血中測定的值。
前述免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量，可於開始GPC3標的治療劑療法之前及/或開始之後所單離之試樣中測定，但該等以規定時間間隔所採取之複數的試樣亦可測定。以規定時間間隔所採取之複數的試樣當中任一者的免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為上述規定值時，則預測、預想或決定該患者之對癌之GPC3標的治療劑療法為有效，或決定該療法的繼續。開始GPC3標的治療劑療法之後的試樣採取之規定的時間間隔可適當地設定，但作為該間隔之非限定的一態 樣，可於GPC3標的治療劑之初次投予後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日(即1週)、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日(即2週)、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日(即3週)、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日(即4週)、29日、30日、1月、5週、6週、7週、8週、9週、10週、2個月、3個月、4個月、5個月、或6個月、或1次、2次、3次、4次、或其以上之治療循環後等之療法開始與結束之間的任何時間點採取。投予間隔亦即治療循環可適當設定，可舉例例如，1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日(即1週)、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日(即2週)、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日(即3週)、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日(即4週)、29日、30日、1月、5週、6週、7週、8週、9週、10週、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月等作為非限定的一例。
上述之，記載有該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定該GPC3標的治療劑療法為有效之指示書中，可記載：考慮該患者是否具有Fcγ受體的型Ⅱ A及/或型Ⅲ A之基因中，FcγR Ⅲ A之第158位的至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型。即亦可記載：對象患者中免疫細胞數及該細胞上表現 之分子的表現量為規定值，且對象患者具有FcγR Ⅲ A之第158位的胺基酸殘基之至少1個為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型時，則決定該GPC3標的治療劑療法為有效。
又，上述之，記載有該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定繼續該GPC3標的治療劑療法之指示書中，亦可記載：考慮該患者是否具有Fcγ受體之型Ⅱ A及/或型Ⅲ A之基因中，FcγR Ⅲ A之第158位的至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型。即亦記載：對象患者中免疫細胞數及該細胞上表現之分子的表現量為規定值，且對象患者具有FcγR Ⅲ A之第158位的胺基酸殘基之至少1個為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型時，則決定繼續該GPC3標的治療劑療法。
此處，所謂具有FcγR Ⅲ A之第158位的至少1個胺基酸殘基為Val之多型，係指依循上述Fcγ受體多型之確認中所記載之方法，FcγR Ⅲ A之情形中確認編碼第158位之胺基酸殘基的鹼基序列，若為Val之同型(V/V)或異型(V/F)的鹼基序列時，則符合此等。又，所謂具有FcγR Ⅱ A之第131位的至少1個胺基酸殘基為His之多型，係指同樣地，確認編碼FcγR Ⅱ A之第131位胺基酸殘基的鹼基序列，若為His之同型(H/H)或異型(H/R)的鹼基序列時，則符合此等。
上述之，記載有該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定該GPC3標的治療劑療法為有效之指示書中，亦可記載：進一步考慮該自患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量。即亦可記載：自對象患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量為特定之評估分數以上，且對象患者之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值時，決定該GPC3標的治療劑療法為有效。
又，上述之，記載有該免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值之情形中，決定繼續該GPC3標的治療劑療法之指示書中，亦可記載：一併考慮該自患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3之表現量。即亦記載：自對象患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量為特定之評估分數以上，且對象患者之免疫細胞數及/或該細胞上表現之分子的表現量為規定值時，決定繼續該GPC3標的治療劑療法。
作為自患者所單離之組織，尤其是包含肝癌組織之癌組織中GPC3的表現量為特定之評估分數以上時之非限定的一態樣，可舉例為規定之組織免疫染色分數以上。作為規定之組織免疫染色分數以上時之非限定的一態樣，可例示有以WO2009116659所記載之染色法(染色法1)之染色結果算出的複合評估分數1為高表現、或低或 中表現(各IHC total分數為7以上或未達7)。又，以複合評估分數2所使用之染色法(染色法2)之染色結果算出的GPC3-IHC分數(複合評估分數2)為1+、2+、3+之情形等亦可例示為規定之組織免疫染色分數以上時之非限定的一態樣。
以下藉由實施例具體地說明本發明，但本發明不受該等實施例限制。
[實施例1]
本實施例所使用之GC33(一般名：codrituzumab)，係對人類GPC3具備高的親和性而結合之基因重組人類化IgG1單株抗體(WO2006/006693)。對於進行及/或復發性肝細胞癌(HCC)患者中且至少1劑之全身療法之全治療後，因病理進展或不良反應而藥劑投予中止、無法切除的進行性或轉移性肝細胞癌患者中，為了確認GC33的效果，實施了第II期隨機化安慰劑對照雙盲多中心臨床試驗(NP-27884試驗)。以進行性或轉移性HCC患者中無惡化存活時間之有效性評估作為主要目的，以全存活時間、病勢控制率、無惡化期間作為指標之有效性評估、以及安全性及/或忍容性的評估、GC33之藥物動力學曲線、及生物標記探索作為次要目的之本試驗中，對於HCC患者，最初2週為1週1次，之後為2週1次使用點滴静脈注射來投予GC33(1,600mg)
經探討投予之HCC患者，具有於組織學上確 認了不適合治癒的療法(外科切除、肝移植等)及/或局部療法、或治療後惡化之進行性或轉移性的HCC(除了fibrolamellar型)，且具有至少1劑之全身療法的前治療歴。符合條件的患者至少18歳，可提供GPC3測定用之腫瘤樣本，美國東海岸癌臨床試驗群‧表現狀態為0或1、且Child-Pugh指數為A級。又，遵照固體腫瘤之治療效果基準(RECIST)，具有至少1個可評估之病變。作為其他基準，評估了適當的造血機能(絶對嗜中性球數≧1500/μl、血小板≧50000/μl、血紅素≧8.0g/dl)、肝功能(總膽紅素≦2mg/dl、天冬胺酸胺基轉移酶及丙胺酸胺基轉移酶≦正常上限值之5倍)、及腎功能(血清肌酸酐≦正常上限值之2倍)。關於停經前的女性，臨床試驗藥投予開始前10日以內實施之血清懷孕檢查確認為陰性的患者，接受過外科避孕處置，或者停經後經過1年以上之無懷孕可能性的女性，停經後(12個月以上無月經)，或者關於接受過外科避孕處置(卵巢及/或子宮切除)以外之女性，同意臨床試驗治療中及臨床試驗藥投予結束後至少3個月以上使用2種類適當的避孕方法的患者係可登錄。男性的情況時，除了臨床試驗治療中以外，同意於臨床試驗藥投予結束後使用基於至少40日之屏障法的避孕方法的患者係被登錄。另一方面，GPC3標的治療劑投予前2週以內接受過主要外科手術或尚未由嚴重障礙回復之患者、確認有對腦或軟腦膜之轉移的患者、過去5年以內有過惡性腫瘤之患者、具有B型/C型肝炎以外之需要治 療之活動性感染症的患者、臨床試驗藥投予開始前4週以內根據NCI CTCAE v4.0有過Grade 3以上出血之患者、有過包含肝移植之臟器移植的患者、有投予本試驗投予之藥劑以外之抗癌劑的預定或投予中之患者、試驗登錄前2週以內投予過抗癌劑之患者、尚未由對肝細胞癌之前次局部區域療法或全身療法之副作用完全回復的患者、干擾素療法施行中之患者、基線之QTc超過470ms、或基線中安靜時呈現徐脈(未達45次/分鐘)之患者、臨床試驗藥投予開始前2週以內，經投予以治療為目的之抗凝血劑或血栓溶解劑的患者(以去除導管堵塞為目的、或以預防目的之低用量投予除外)、懷孕中或授乳中之患者、HIV陽性患者、或AIDS相關疾病發病之患者、對類似藥劑(單株抗體、含蛋白製劑、來自中國倉鼠卵巢之製劑)有過敏症經歷的患者、有重要之併存疾病，臨床試驗責任/分擔醫師判斷因臨床試驗藥會有惡化可能性患者，係登錄之除外對象。
實驗計劃，係遵照醫藥品臨床試驗之實施基準的規範來實施，並經各自所參加之臨床試驗倫理審査委員會認可。全部的患者係於登錄之前，於書面的告知後同意上簽名。患者只要未表現疾病進行或無法容許之毒性，則繼續投予GC33。腫瘤之評估係以基線來實施，至疾病進行為止。自投予開始起4循環、7循環、10循環之時間點，之後係每4循環反覆來評估。再者，1循環為2週，疾病狀態係經臨床試驗責任醫師評估。
患者以2：1之比率隨機分成GC33群(以1600mg固定用量1週間隔投予2次後，隔週投予，n=121例)或安慰劑群(n=60例)及藉由使用GPC3-IHC套組(Ventana公司製)之IHC染色，基於GPC3表現水平(複合評估分數2)(0,1+,2+/3+)階層化成3群組。主要解析，係於在臨床試驗實施計畫書中計畫之128例的無復發存活(PFS)事件所發生的時間點實施。
HCC腫瘤組織中之GPC3蛋白質表現，係藉由GPC3組織免疫染色(GPC3-IHC)、即複合評估分數2來評估。GPC3-IHC係於美國Ventana Medical Systems實施中央測定。於各醫院以穿刺活體組織切片摘取之後，實施甲醛固定及由石蠟法包埋之腫瘤石蠟塊所配製之HCC腫瘤組織之未染色玻片的免疫組織染色。抗體係使用小鼠GC33抗體(Ventana公司製)。
[實施例2]
如上述般經投予GC33之121個病例以及經投予安慰劑之60個病例當中，於得到128個病例分之PFS事件的時間點，藉由PFS評估GPC3標的治療中GC33投予所致之效果。又，作為二次評估，係藉由全存活(OS)到達92個事件之時間點的OS來評估。其結果，確認到PFS、OS一同有因GC33投予之延長效果(圖1)。又，以各GPC3-IHC分數(複合評估分數2)之評估中，任一分數中皆未見到延長效果。
又，GC33投予群中，藉由使用本第II期臨床試驗中之GC33血清濃度值所得之集團PK模式，推測第3循環‧第1日(自初次投予開始之第4週)之投予前血中GC33谷底濃度值，以谷底濃度值之中央值即230μg/ml作為截止(cut-off)，分為GC33之暴露少之群(GC33低暴露群)、或GC33之暴露多之群(GC33高暴露群)之2群，藉由卡本-麥爾(Kaplan-Meier)法來比較各自之群、或與安慰劑群之間作為臨床效果之指標的無惡化存活時間(PFS)或全存活時間(OS)。其結果，發現PFS、OS一同於GC33高暴露群中相對於安慰劑群或GC33低暴露群分別有延長效果(圖2)。
進而，以探索與GC33效果相關的生物標記為目的，測定末梢血中之免疫細胞的測定、免疫細胞上表現之Fc伽瑪受體之型IIA或IIIA的基因多型、以及使用GC33投予前之末梢血的抗體依賴性細胞傷害活性(ADCC活性)，同樣地藉由卡本-麥爾(Kaplan-Meier)法分別進行PFS、或OS之比較，實施log-rank檢測。
[實施例3]
作為與GC33效果有關之生物標記，於各設施自症例採血後，為了探討以通常之方法(以自動血球計數機的方法)計測之末梢血免疫細胞數與效果之關連性，分成GC33投予前之患者的末梢血中之各種免疫細胞數相較中央值為高值群與低值群，進行GC33投予群與安慰劑群 之間PFS以及OS的比較之結果，如表4所示，白血球數、單核球、嗜中性球數為高之群中，相對於藉由GC33投予較安慰劑群確認到PFS之延長，各個免疫細胞數為低之群(未達中央值)中，未確認到那樣的效果。尤其是，關於嗜中性球，細胞數為高之群中確認到顯著的PFS之延長(圖3)。
進而，若限定探討上述相對於安慰劑群確認到PFS以及OS之延長的GC33高暴露群，白血球數、單核球數、嗜中性球數為高之群(白血球：
Figure 104114756-A0305-02-0117-141
5,680個/μL、單核球：
Figure 104114756-A0305-02-0117-142
503個/μL、嗜中性球數：
Figure 104114756-A0305-02-0117-143
3,607個/μL)中任一者皆確認到顯著的PFS延長以及OS之延長，進而關於淋巴球數，僅淋巴球數為高之群(
Figure 104114756-A0305-02-0117-144
1,246個/μL)中，確認到PFS之延長傾向以及OS顯著的延長(表4)
Figure 104114756-A0305-02-0117-7
[實施例4]
進一步為了詳細地進行各種免疫細胞的鑑 定，使用針對各種免疫細胞表面抗原之抗體使用FACS所採取之末梢血於Covance公司實施中央測定。如表5所示，作為淋巴球之標記，將分別針對CD19、CD45、CD3、CD4、CD8之抗體與所採取之全血混合，淋巴球亞群使用Trucount tubes(Becton Dickinson公司製)來測定，分類成較測定值之中央值低值群及高值群的結果，在GC33投予群與安慰劑群之比較中，CD4陽性T細胞數為高之群(
Figure 104114756-A0305-02-0118-145
490個/μL)中確認到顯著的PFS之延長(圖4)。
進而，分別在CD45陽性細胞數為高之群(
Figure 104114756-A0305-02-0118-146
1,090個/μL)中，確認到OS之延長傾向、CD3陽性T細胞數為高之群(
Figure 104114756-A0305-02-0118-147
752個/μL)中，確認到PFS及OS之延長傾向、進而CD4陽性T細胞數為高之群(
Figure 104114756-A0305-02-0118-148
490個/μL)中，確認到OS之延長傾向(表5)。
若限定探討GC33高暴露群，僅CD3陽性、CD4陽性細胞數為高之群(CD3：
Figure 104114756-A0305-02-0118-149
752個/μL、CD4：
Figure 104114756-A0305-02-0118-150
490個/μL)、或CD8陽性細胞為低之群(<251個/μL)中，皆確認到顯著的PFS、OS之延長(表5)。且，其以外之區分中，雖一部分見到顯著的存活時間之延長、或延長效果，但高值群、低值群中未必得到一定的強烈傾向。
Figure 104114756-A0305-02-0119-8
接著，對於NK細胞實施詳細的解析。與上述相同使用自患者所採取之末梢血，於Convance公司中央測定。使用針對CD3、CD16、CD56之抗體以FACS解析之分類之外，進行了包含對於NKp46、CD8之抗體的反應性之分類。關於對於CD3之反應性為陰性的細胞群，CD16陽性、NKp46陽性之外，基於對於CD56及CD16之抗體的反應性，分類成CD56bright NK細胞區分、CD56-/CD16+ NK細胞區分、CD56dim/CD16- NK細胞區分以及CD56dim/CD16bright NK細胞區分。
各別的NK細胞區分中因GC33投予所致之對PFS、OS的影響如表6所示，各NK細胞區分內，僅CD56-CD16+之NK細胞區分為高之群(
Figure 104114756-A0305-02-0119-151
6.3個/μL)中確認到因GC33投予所致之顯著的PFS延長以及OS之延長傾向(圖5)。進而，比較GC33高暴露群與安慰劑群之 情形中，存活時間之延長效果為顯著。且，其以外的區分中，雖一部分見到顯著的存活時間之延長、或延長效果，但高值群、低值群中未必得到一定的強烈傾向。
以各標記之區分之外，NK細胞上之CD16或NKp46表現量同樣地以FACS(FACSCanto II、Beckton Diskinson公司製)測定，基於測定結果之中央值，分類成高表現群與低表現群，同樣地將GC33投予以及GC33高暴露中之PFS、OS與安慰劑群進行比較。各別的表現量(可溶性螢光色素分子等量：mean equivalent soluble fluorescent level(MESF))，基於校準珠粒(Quantum MESF bead standard、Banglaboratories公司製)之螢光量製作MESF標準曲線，藉由NK細胞區分的螢光量算出表現量(MESF)。其結果如表6所示，CD16表現量(CD16 MESF)中，僅表現為高值之群(
Figure 104114756-A0305-02-0120-152
372,254 mesf)中，藉由GC33投予確認到顯著的PFS延長以及OS之延長傾向(圖6)，GC33高暴露群與安慰劑群之比較中，其存活時間延長效果較顯著。
Figure 104114756-A0305-02-0121-9
[實施例5]
作為GC33之作用機制報告有ADCC之誘導(Ishiguro T.et al.,Cancer Res.2008；68：9832-9838)。因此，測定GC33投予前之患者的ADCC活性，探討其與GC33效果之關係。
使用GC33或安慰劑投予前所採取之患者的末梢血，ADCC活性如以下來探討。採血後以液態氮冷凍，融解於-150度保存之末梢血後，加入包含IL-2(Pepro Tech公司製)之RPMI II培養基(HyClone公司製)，培養一晚之1×105個末梢單核球中加入GC33(0.5μg/mL) 以及目標細胞，於37度培養1小時，進而加入Monensin培養2小時後，回收末梢單核球，加入針對CD45、CD3、CD16、CD56以及CD107之抗體混合液，分別以FACS(FACSCantII、Beckton Dickinson公司製)測定NK細胞之CD16表現量或CD107a表現量。又，僅加入目標細胞培養時的CD107a或CD16表現量作為陰性對象，與陰性對象的差作為ADCC活性的指標。作為目標細胞，於ADCC活性測定用中使用表現GPC3之人類肝癌細胞株HepG2細胞(ATCC)，於抗體非依賴之NK活性測定用中使用人類慢性骨髓性白血病細胞株K562細胞(ATCC)。且，任一樣本調製以及測定係於Covance公司實施中央測定。
關於CD107a，較中央值(34.15%)高值者定為ADCC高活性群，低值者定為ADCC低活性群，又CD16較中央值(-64.33%)低值者定為ADCC高活性群，高值者定為ADCC低活性群。對於各個，同樣地於高暴露群、低暴露群、安慰劑群進行PFS、OS之比較。其結果如表7所示，CD107a、CD16任一指標中，僅ADCC高活性群確認到PFS、OS之顯著的延長(圖7、圖8)。
另一方面，測定對於K562細胞之CD107a或CD16表現的變化(CD107a變化量中央值：9.74%、CD16變化量中央值：-15.76%)作為NK活性，但與ADCC不同，NK活性低值群、高值群間皆未確認到顯著的PFS或OS之延長(表7)。
Figure 104114756-A0305-02-0123-10
[實施例6]
已知與抗體之Fc區域結合之Fc伽瑪受體的基因多型對於與抗體之Fc區域的結合有影響。因此，探討與Fc伽瑪受體型IIA以及IIIA之基因多型的關連性。由自患者所採取之末梢血單離基因體基因，測定對應於Fc伽瑪領域型IIA之第131位的胺基酸殘基之鹼基序列，或對應於型IIIA之第158位的胺基酸殘基之鹼基序列的多型。即，使用利用MagNa Pure LC DNA Isolation kit 1(Roche Applied Science公司製)自患者所採血之全血單離之基因體DNA，藉由對應各自SNPs所設計之TaqMan ® probe及Real-Time PCR進行genotyping。
其結果，僅具有FcγRIIIA之第158位之胺基酸殘基為Val之多型(V/V或V/F)與具有僅Phe之多型(F/F)之間，高暴露群、低暴露群與安慰劑群中分別比 較PFS、OS之結果，如表8所示，GC33高暴露群中，具有V/V或V/F之群中，相對於安慰劑群PFS、OS同時確認到顯著的延長，F/F中並未確認到那樣的效果。
Figure 104114756-A0305-02-0124-11
又，關於FcγRIIA之第131位之基因多型進行同樣地探討。在具有第131位之胺基酸殘基為His的多型(H/H或H/R)與具有僅Arg的多型(R/R)之間，將PFS、OS於高暴露群、低暴露群與安慰劑群分別進行比較的結果，如表8所示，GC33高暴露群中，具有H/H或H/R之群中，確認到PFS、OS一同相對於安慰劑群有顯著的延長，R/R中未確認到那樣的效果。
以上顯示：分別測定患者之免疫狀態、末梢血免疫細胞數、ADCC活性、或Fc伽瑪受體之基因多型，或此等之組合，可提升GPC3標的治療法之有效性。
[實施例7]
關於NK細胞上之CD16表現量(CD16 MESF)，進一步實施使用基於比例風險模型之Cox迴歸的解析。該解析中，基於實施例5之測定結果，依據不同截止值分類成CD16 MESF高值群與CD16 MESF低值群，算出關於各群之風險比、95%信賴區間(95% CI)以及log-rank檢定之p值。且，解析時使用全存活時間作為反應之變數，以對於臨床有意義之背景因子調整。
將CD16 MESF值之33%(33百分位數值)的279,736.9 mesf、50%(50百分位數值)的363,594 mesf、或67%(33百分位數值)的439,468.3定為截止值。然後，依據各截止值分別分類成低值群與高值群，將GC33高暴露群中之風險比、95%信賴區間及p值與安慰劑群進行比較。其結果，如表9所示，CD16 MESF高值群中，隨CD16 MESF值之截止值變高而風險比變低，故暗示GC33之臨床有效性與CD16表現量有相關(表9)。
另一方面，CD16 MESF低值群中，未確認到CD16之MESF值的截止值變化與風險比之間有顯著的關係。
Figure 104114756-A0305-02-0125-12
直接將本說明書中所引用之全部的刊物、專利及專利申請案作為參考，援引至本說明書中。
〔產業上之可利用性〕
本發明係有助於GPC3標的治療劑療法之有效性提升、與接受治療之患者的QOL改善者，且有用於以肝癌為始之癌的治療。
<110> 中外製藥股份有限公司(Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha) 福赫夫曼拉瑞奇股份有限公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)
<120> 對GPC3標的治療劑療法為有效之患者投予的GPC3標的治療劑
<160> 82
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<21> 580
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Figure 104114756-A0305-02-0127-13
Figure 104114756-A0305-02-0128-14
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
<400> 32
Figure 104114756-A0305-02-0132-125
<210> 33
<21> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 33
Figure 104114756-A0305-02-0132-124
<210> 34
<21> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 34
Figure 104114756-A0305-02-0132-126
<210> 35
<21> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 35
Figure 104114756-A0305-02-0132-57
<210> 36
<21> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 36
Figure 104114756-A0305-02-0132-56
<210> 37
<21> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 37
Figure 104114756-A0305-02-0132-55
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 38
Figure 104114756-A0305-02-0133-63
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 39
Figure 104114756-A0305-02-0133-64
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 40
Figure 104114756-A0305-02-0133-65
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 41
Figure 104114756-A0305-02-0133-66
<210> 42
<211> 123
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 42
Figure 104114756-A0305-02-0133-67
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 43
Figure 104114756-A0305-02-0133-68
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<400> 44
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<400> 46
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<212> PRT
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<400> 50
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 53
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<212> PRT
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<400> 54
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 61
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Figure 104114756-A0305-02-0139-94
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 63
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 66
Figure 104114756-A0305-02-0140-128
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Figure 104114756-A0305-02-0140-127
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 68
Figure 104114756-A0305-02-0140-102
Figure 104114756-A0305-02-0141-104
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 69
Figure 104114756-A0305-02-0141-130
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 70
Figure 104114756-A0305-02-0141-132
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Figure 104114756-A0305-02-0141-107
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 72
Figure 104114756-A0305-02-0142-133
<210> 73
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 73
Figure 104114756-A0305-02-0142-109
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 74
Figure 104114756-A0305-02-0142-110
Figure 104114756-A0305-02-0143-111
<210> 75
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 75
Figure 104114756-A0305-02-0143-134
<210> 76
<211> 377
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 76
Figure 104114756-A0305-02-0143-135
Figure 104114756-A0305-02-0144-114
<210> 77
<211> 327
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 77
Figure 104114756-A0305-02-0144-136
Figure 104114756-A0305-02-0145-116
<210> 78
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 78
Figure 104114756-A0305-02-0145-117
<210> 79
<211> 316
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 79
Figure 104114756-A0305-02-0145-118
Figure 104114756-A0305-02-0146-119
<210> 80
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 80
Figure 104114756-A0305-02-0146-137
Figure 104114756-A0305-02-0147-121
<210> 81
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<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 81
Figure 104114756-A0305-02-0147-138
<210> 82
<211> 233
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 82
Figure 104114756-A0305-02-0147-139

Claims (10)

  1. 一種決定抗GPC3抗體療法對患者中之肝細胞癌(HCC)之有效性、或決定繼續對患者之抗GPC3抗體療法的方法，其係包含測定由接受抗GPC3抗體療法前之患者及/或接受了抗GPC3抗體療法之患者所單離的末梢血中之免疫細胞數或該細胞上表現之分子的表現量，當該免疫細胞數或該細胞上表現之分子的表現量為規定值時決定該抗GPC3抗體療法為有效、或決定繼續該抗GPC3抗體療法的方法，其中，(i)當前述免疫細胞為白血球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自3000個/μL~8000個/μL，(ii)當前述免疫細胞為單核球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自100個/μL~1000個/μL，(iii)當前述免疫細胞為嗜中性球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自1000個/μL~6000個/μL，(iv)當前述免疫細胞為淋巴球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自450個/μL~3000個/μL，(v)當前述免疫細胞上表現之分子為CD16時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自200000 mesf~700000 mesf。
  2. 如請求項1之方法，其中前述患者為具有FcγR Ⅲ A之第158位之至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位之至少1個胺基酸殘基為His之多型的患者。
  3. 如請求項1或2之方法，其中前述抗GPC3抗體為具有抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞傷害(CDC)活性之抗體。
  4. 如請求項3之方法，其中前述抗GPC3抗體為包含以下(1)~(5)中任一者之抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體：(1)分別以序列編號：4、序列編號：5、及序列編號：6所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：7、序列編號：8、及序列編號：9所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(2)分別以序列編號：12、序列編號：13、及序列編號：14所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：15、序列編號：16、及序列編號：17所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(3)分別以序列編號：20、序列編號：21、及序列編號：22所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：23、序列編號：24、及序列編號：25所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3； (4)分別以序列編號：28、序列編號：29、及序列編號：30所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：31、序列編號：32、及序列編號：33所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；或(5)分別以序列編號：36、序列編號：37、及序列編號：38所表示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：39、序列編號：40、及序列編號：41所表示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。
  5. 如請求項3之方法，其中前述抗GPC3抗體為包含以下任一者之抗體：(1)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及以序列編號：51所示之輕鏈可變區；(2)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及由序列編號：52、序列編號：53、序列編號：54、序列編號：55、序列編號：56、序列編號：57、序列編號：58、序列編號：59、序列編號：60、序列編號：61、序列編號：62、序列編號：63、序列編號：64、序列編號：65、及序列編號：66所示之輕鏈可變區之群 組中所選的輕鏈可變區；(3)以序列編號：67所示之重鏈可變區、及以序列編號：68所示之輕鏈可變區；(4)以序列編號：69所示之重鏈可變區、及以序列編號：70所示之輕鏈可變區；(5)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：72所示之輕鏈可變區；或(6)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：73所示之輕鏈可變區。
  6. 一種抗GPC3抗體用以製造投予至免疫細胞數或該免疫細胞上表現之分子的表現量具有規定值之肝細胞癌(HCC)患者的治療劑之用途，前述免疫細胞係由患者的末梢血所單離，其中，(i)當前述免疫細胞為白血球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自3000個/μL~8000個/μL，(ii)當前述免疫細胞為單核球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自100個/μL~1000個/μL，(iii)當前述免疫細胞為嗜中性球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自1000個/μL~6000個/μL，(iv)當前述免疫細胞為淋巴球時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自450個/μL~3000 個/μL，(v)當前述免疫細胞上表現之分子為CD16時，前述規定值為較後述特定之值高的值，該特定之值係選自200000 mesf~700000 mesf。
  7. 如請求項6之用途，其中前述患者為具有FcγR Ⅲ A之第158位之至少1個胺基酸殘基為Val之多型及/或FcγR Ⅱ A之第131位之至少1個胺基酸殘基為His之多型的患者。
  8. 如請求項6或7之用途，其中前述抗GPC3抗體為具有抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞傷害(CDC)活性之抗體。
  9. 如請求項8之用途，其中前述抗GPC3抗體為包含以下(1)~(5)之任一者的抗GPC3嵌合抗體或人類化抗GPC3抗體：(1)分別以序列編號：4、序列編號：5、及序列編號：6所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：7、序列編號：8、及序列編號：9所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(2)分別以序列編號：12、序列編號：13、及序列編號：14所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：15、序列編號：16、及序列編號：17所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(3)分別以序列編號：20、序列編號：21、及序列編號：22所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3， 以及分別以序列編號：23、序列編號：24、及序列編號：25所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；(4)分別以序列編號：28、序列編號：29、及序列編號：30所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：31、序列編號：32、及序列編號：33所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3；或(5)分別以序列編號：36、序列編號：37、及序列編號：38所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，以及分別以序列編號：39、序列編號：40、及序列編號：41所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。
  10. 如請求項8之用途，其中前述抗GPC3抗體為包含以下任一者的抗體：(1)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及以序列編號：51所示之輕鏈可變區；(2)由以序列編號：44、序列編號：45、序列編號：46、序列編號：47、序列編號：48、序列編號：49、及序列編號：50所示之重鏈可變區之群組中所選的重鏈可變區，以及由以序列編號：52、序列編號：53、序列編號：54、序列編號：55、序列編號：56、序列編號：57、序列編號：58、序列編號：59、序列編號：60、序列編號：61、序列編號：62、序列編號：63、序列編號：64、序列編號：65、及序列編號：66所示之輕鏈可變區之群 組中所選的輕鏈可變區；(3)以序列編號：67所示之重鏈可變區、及以序列編號：68所示之輕鏈可變區；(4)以序列編號：69所示之重鏈可變區、及以序列編號：70所示之輕鏈可變區；(5)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：72所示之輕鏈可變區；或(6)以序列編號：71所示之重鏈可變區、及以序列編號：73所示之輕鏈可變區。
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