TWI727232B - 個人化癌症疫苗的製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種個人化癌症疫苗的製備方法。具體地，本發明首次採用樣本中分離富集CTC及其DNA和RNA或ctDNA和ctRNA至一定比例，利用背景細胞作為對照，分離和證實13-20種能引起蛋白序列變化並能與人體HLA類型I或II受體及TCR緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈，即腫瘤新生抗原(neoantigen)，有助於癌症的早期診斷；並且，在4-6週內，製成個人化癌症疫苗，及時用於激發患癌對象的免疫反應。本發明能在幾乎非侵入性的情況下，準確、快速、高效地捕獲能夠激發抗癌免疫的抗原，減少了定序時間以及***的誤差，在腫瘤治療領域具有廣泛的應用前景。
Description
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體地，涉及個人化癌症疫苗的製備方法，具體地，涉及從患癌對象的體液中收集篩選含腫瘤特異性體細胞突變的抗原片段，從而製備個人化癌症疫苗的方法。
癌症的發生，是因為病人體內的某些細胞產生了基因突變，出現不受控制地增殖分化，最終發展成為惡性腫瘤。癌細胞表面存在許多由突變基因編碼的新生抗原蛋白，正常情況下應能被人體免疫系統及時辨識，並引發免疫反應將這些癌細胞清除。然而在病理情況下，腫瘤細胞發展分化迅速，且不斷發生新的突變，使得身體免疫系統不能及時辨識。再加上腫瘤微環境中形成的免疫抑制，可能使免疫系統完全喪失反應能力。雖然目前比較先進的免疫治療療法，如CAR-T技術等，能夠在體外改造T細胞，增強其腫瘤細胞免疫辨識和反應能力，並在體外放大後再重新注入到病人身上，但是注射後病人自身還是不能複製這些細胞。當然，輸入體內的免疫細胞中一部分可能會長期潛伏下來，成為“記憶細胞”，這樣
將來可能“復甦”。但這些細胞經過了基因改造，長期潛伏在人體內會造成什麼問題？短期內沒有答案。同時，過度降低免疫反應門檻，可能會導致過度的免疫反應及各種炎症。而最先進的個人化CAR-T技術目前也只對個別癌症的部分病人有效，並且最近也有異體CAR-T藥物造成患者死亡的事件發生。
癌症的免疫治療，需另闢蹊徑。癌細胞表面存在的由突變基因編碼的新生抗原蛋白，之所以無法引起免疫反應，可能是這些異常蛋白表現量不高，不足以引發身體免疫辨識和免疫反應。
而腫瘤基因組定序的實現，及癌症免疫治療的進展，使得應用這些異常的腫瘤新生抗原蛋白來製作癌症疫苗成為可能(Ott PA Nat 2017；547：217-221,Epub 2017 Jul 5；Sahin U et al.Nat 2017；547：222-226,Epub 2017 Jul 5)。所謂個人化癌症疫苗，即根據患癌對象各自腫瘤細胞有關的突變情況定制設計的抗癌疫苗，是個人化醫療(精準醫療)發展的高級階段。然而，如何高效地從組織中獲取關鍵抗原，並安全地施用於所需要的對象從而有效地抑制腫瘤，至今仍面對著不少癌症疫苗挑戰。例如疫苗製備時間較長，需6-8週；樣本的獲得必須進行手術切除晚期病人癌變組織，才能發現和證實腫瘤體細胞突變。癌症疫苗長週期和侵入性的獲得途徑都難以滿足患癌對象巨大的臨床治療需求。
本發明的第一方面，提供了一種製備個人化癌症疫苗的方法，包括以下步驟：
(a)提供對應於所述對象的第一樣本定序數據集A1和第一對照定序數據集R1；和/或提供對應於所述對象的第二樣本定序數據集A2和第二對照定序數據集R2，
其中，所述的第一樣本定序數據集A1和第一對照定序數據集R1透過包括以下步驟的方法獲得：
t1)提供第一樣本，所述第一樣本為含CTC細胞和正常體液細胞的樣本；
t2)對所述第一樣本進行CTC細胞富集處理，從而獲得經富集的第一樣本，其中在所述的經富集的第一樣本中，CTC細胞豐度C1
5%並且正常體液細胞豐度C2
95%，按所述經富集的樣本中所有細胞的總數量計，並且CTC細胞豐度C1與正常體液細胞豐度C2之比記為B1(即B1=C1/C2)；
t3)從所述經富集的第一樣本中萃取DNA和/或RNA，從而獲得第一核酸樣本，其中所述第一核酸樣本包括來自CTC細胞的核酸樣本以及來自正常體液細胞的核酸樣本；和
t4)對所述第一核酸樣本進行定序，其中，將所述第一核酸樣本中來自正常體液細胞的核酸樣本作為來自CTC細胞的核酸樣本的對照，從而獲得第一樣本定序數據集A1和第一對照定序數據集R1，其
中第一樣本定序數據集A1對應於CTC細胞的定序數據集，而第一對照定序數據集R1對應於正常體液細胞的定序數據集；
其中，所述的第二樣本定序數據集A2和第二對照定序數據集R2透過包括以下步驟的方法獲得：
w1)提供第二樣本，所述第二樣本為含循環腫瘤DNA(ctDNA)和循環腫瘤RNA(ctRNA)及其他游離DNA(cfDNA)和游離RNA(cfRNA)的樣本；
w2)對所述第二樣本進行富集處理，從而獲得經富集的第二核酸樣本；其中，所述的經富集的第二核酸樣本包括來自CTC細胞的ctDNA和ctRNA以及來自正常體液細胞的cfDNA和cfRNA，其中按所有核酸的總重量計算，ctDNA和ctRNA含量L1
5%，而來自正常細胞cfDNA和cfRNA的含量L2
95%，並且所述含量L1與L2之比記為B2(即B2=L1/L2)；
w3)對所述第二核酸樣本進行定序，其中，將所述第二核酸樣本中的樣本中來自正常細胞的cfDNA和cfRNA作為來自CTC細胞的ctDNA和ctRNA的對照，從而獲得第二樣本定序數據集A2和第二對照定序數據集R2，其中第二樣本定序數據集A2對應於CTC細胞的定序數據集，而第二對照定序數據集R2對應於正常體液細胞的定序數據集；
(b)將所述第一樣本定序數據集A1與第一對照定序數據集R1，或第二樣本定序數據集A2與第二對照定序數據集R2，分別進行序列比對處理，從而獲得第一候選數據集S1或第二候選數據集S2；其中，所述第一候選數據集S1中的任一序列元素是存在於所述A1但不存在於所述R1的元素；而所述第二候選數據集S2中的任一序列元素是存在於所述A2但不存在於所述R2的元素；
(c)對於所述第一候選數據集S1和/或第二候選數據集S2中的任一序列元素，進行HLA類型I或II受體親和力預測分析，從而獲得一級選定的序列元素，所述一級選定的序列元素為與HLA類型I或II受體結合緊密(IC50 
500nm，較佳地，100nm)的序列元素；
(d)基於所述一級選定的序列元素，合成對應於所述一級選定的(primarily selected)序列元素的DNA、RNA、短肽鏈；
(e)用所述合成的DNA、RNA、短肽鏈，進行離體T-細胞受體(TCR)結合試驗和CD8+T細胞和/或CD4+T輔助細胞活化試驗，從而獲得10-30種二級選定的(secondarily selected)序列元素，其中所述的二級選定的序列元素能夠與TCR結合且使CD8+T細胞和/或CD4+T輔助細胞活化；
(f)基於所述二級選定的序列元素，合成對應於所述二級選定的序列元素的DNA、RNA、肽鏈；
(g)將上一步驟中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈與藥學上可接受的載體混合，從而製得藥物組成物，即為個人化癌症疫苗。
在另一優選例中，在經富集的第一樣本中，CTC細胞豐度為5%至95%(較佳地10-90%)而正常體液細胞豐度為95%至5%(較佳地90-10%)，且CTC細胞豐度和正常體液細胞豐度相加之後為100%。
在另一優選例中，在經富集的第二樣本中，來自於CTC細胞的ctDNA和ctRNA含量為5%至95%(較佳地10-90%)而來自於正常細胞cfDNA和cfRNA的含量為95%至5%(較佳地90-10%)，且CTC細胞的ctDNA和ctRNA含量和正常細胞cfDNA和cfRNA含量相加之後為100%。
在另一優選例中，所述第一核酸樣本中，來自CTC細胞的核酸樣本與來自正常體液細胞的核酸樣本的重量比B2等於或基本上等於B1。
在另一優選例中，第一對照定序數據集R1對應於正常的PBMC細胞的定序數據集。
在另一優選例中，第二對照定序數據集R2對應於正常的PBMC細胞的定序數據集。
在另一優選例中，在步驟(t4)，“將來自正常體液細胞的核酸樣本作為來自CTC細胞的核酸樣本的對照”指在對定序數
據，參考CTC細胞豐度C1與正常體液細胞豐度C2之比B1進行分類和/或分析。
在另一優選例中，在步驟(w3)，“將來自正常細胞的cfDNA和cfRNA作為來自CTC細胞的ctDNA和ctRNA的對照”指在對定序數據，參考CTC細胞的ctDNA和ctRNA含量L1與來自正常細胞cfDNA和cfRNA含量L2之比B2進行分類和/或分析。
在另一優選例中，在所述分類和/或分析中，對於同一位址或位置的兩類定序數據D1和D2，如果符合下式Q1，則將定序數據D1歸類為CTC定序數據，並將定序數據D2歸類為正常體液細胞的定序數據
RD1/(RD1+RD2)
C1/(C1+C2) (Q1)
式中，
RD1為定序數據D1(如閱讀序列或其相關序列)的出現頻率(或豐度，如定序深度)
RD2為定序數據D2(如閱讀序列或其相關序列)的出現頻率(或豐度，如定序深度)
C1為經富集的第一樣本中的CTC細胞豐度；
C2為經富集的第一樣本中的正常體液細胞豐度。
在另一優選例中，在所述分類和/或分析中，對於同一位址或位置的兩類定序數據E1和E2，如果符合下式Q2，則將定序
數據E1歸類為CTC細胞的ctDNA和ctRNA定序數據，並將定序數據E2歸類為正常細胞ctDNA和ctRNA的定序數據
RE1/(RE1+RE2)
L1/(L1+L2) (Q2)
式中，
RE1為定序數據E1(如閱讀序列或其相關序列)的出現頻率(或豐度，如定序深度)
RE2為定序數據E2(如閱讀序列或其相關序列)的出現頻率(或豐度，如定序深度)
L1為經富集的第二樣本中的CTC細胞ctDNA和ctRNA含量；
L2為經富集的第二樣本中的正常細胞ctDNA和ctRNA含量。
在另一優選例中，在步驟(w2)中，所述富集包括用選自下組的一種或多種方法進行：透過基於細胞尺寸的捕獲(過濾方法)或基於腫瘤表面生物標記的陽性捕獲(免疫學方法)。
在另一優選例中，在步驟(t2)中，所述富集包括用選自下組的一種或多種方法進行：分子篩、甲基化分離、過濾離心或其組合。
在另一優選例中，所述的定序包括用選自下組的一種或多種方法進行：初篩Ultra low pass-WGS、WES或RNA-seq。
在另一優選例中，所述的序列元素為下組：DNA序列元素、RNA序列元素、和/或肽鏈序列元素。
在另一優選例中，所述的DNA序列元素包含2-5個DNA變異體，每個DNA變異體包含至少5個短肽鏈編碼序列；和/或
所述的RNA序列元素包含2-5個RNA變異體，每個RNA變異體包含至少5個短肽鏈編碼序列；和/或
所述肽鏈序列元素含有5-100個胺基酸。
在另一優選例中，所述肽鏈序列元素優選為10-80個胺基酸，更優選為15-50個，如20、30、40個胺基酸。
在另一優選例中，所述的“與HLA類型I或II受體結合的序列元素”指所述序列元素所對應的肽序列(即肽鏈序列元素本身，或RNA序列元素/DNA序列元素所編碼的肽序列)能夠與HLA類型I或II受體結合。
在另一優選例中，所述的正常體液細胞包括白血球、單核細胞、淋巴細胞等。
在另一優選例中，所述方法還用於癌症的早期診斷。
在另一優選例中，所述方法在4-6週內完成，以利於個人化癌症疫苗及時應用於激發患癌對象的免疫反應。
在另一優選例中，所述體液包括血液、尿液、唾液、淋巴液或***。
在另一優選例中，所述體液包括胸水、腹水、腦脊液。
在另一優選例中，所述方法還包括步驟(h1)：基於步驟(f)中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈，篩選出與所述二級選定的序列元素特異性結合的單鏈抗體(scFV)，並構建和/或擴增表現嵌合抗原受體(CAR)的T細胞(CAR-T)，其中，所述CAR含有所述scFV作為胞外抗原結合域。
在另一優選例中，所述的單鏈抗體是透過單鏈抗體噬菌體展示技術獲得。
在另一優選例中，在步驟(h1)中，針對一種或多種(如2-5種)所述二級選定的序列元素，分別篩選出具有特異性的單鏈抗體(scFV)，並構建相應的所述表現嵌合抗原受體(CAR)的T細胞(CAR-T)。
在另一優選例中，所述的表現嵌合抗原受體(CAR)的T細胞用於重新輸入給所述對象。
在另一優選例中，所述的重新輸入還包括額外地施用針對通用腫瘤抗原的CAR-T細胞、TCR-T細胞和/或共刺激因子。
在另一優選例中，所述方法還包括步驟(h2)：基於步驟(f)中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈，篩選出與所述二級選定的序列元素特異性結合的T細胞受體(TCR)，並構建和/或擴增表現所述TCR的T細胞(TCR-T)。
在另一優選例中，在步驟(h2)中，針對一種或多種(如2-5種)所述二級選定的序列元素，分別篩選出特異性的TCR，並構建和/或擴增相應的表現所述TCR的T細胞。
在另一優選例中，所述的表現所述TCR-的T細胞用於重新輸入給所述對象。
在另一優選例中，所述的重新輸入還包括額外地施用針對通用腫瘤抗原的CAR-T細胞、TCR-T細胞和/或共刺激因子。
在另一優選例中，所述方法還包括步驟(h3)：基於步驟(f)中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈，在體外對所述對象的樹突狀細胞(DC)進行致敏(priming)處理，從而獲得經致敏的(primed)樹突狀細胞。
在另一優選例中，在步驟(h3)中，用多種(如2-5或5-10或10-20種)所述二級選定的序列元素，進行致敏處理。
在另一優選例中，在步驟(h3)中，還包括：在體外，將所述經致敏的樹突狀細胞與所述對象的T細胞進行共培養，從而製得DC-CTL細胞。
在另一優選例中，所述的經致敏的(primed)樹突狀細胞和/或DC-CTL細胞用於重新輸入給所述對象。
在另一優選例中，步驟(h1)、(h2)和(h3)是各自獨立的，並可任意互相組合。
在另一優選例中，在所述方法中，用步驟(h1)、(h2)和/或(h3)替換步驟(g)。
在另一優選例中，步驟(g)、(h1)、(h2)和(h3)是各自獨立的，並可任意互相組合。
在另一優選例中，所述的正常體液細胞選自下組：外周血單個核細胞(PBMC)。
本發明第二方面，提供了一種個人化癌症疫苗，所述的疫苗是由本發明第一方面中任一所述方法製成的。
在另一優選例中，所述的疫苗還任選地含有佐劑。
在另一優選例中，所述佐劑包括：poly-ICLC，TLR，1018ISS，鋁鹽，Amplivax，AS15，BCG，CP-870、893，CpG7909，CyaA，dSLIM，GM-CSF，IC30，IC31，咪喹莫特，ImuFact IMP321，IS Patch，ISS，ISCOMATRIX，Juvlmmune，LipoVac，MF59，單磷醯脂質A，蒙塔尼德IMS 1312，蒙塔尼德ISA 206，蒙塔尼德ISA 50V，蒙塔尼德ISA-51，OK-432，OM-174，OM-197-MP-EC，ONTAK，PLGA微顆粒，瑞喹莫德，SRL172，病毒微體和其他病毒樣顆粒，YF-17D，VEGF陷阱，R848，β-葡聚糖，Pam3Cys，阿奎拉QS21刺激子，vadimezan或AsA404(DMXAA)。
本發明第三方面，提供了一種用於免疫治療的細胞產品，所述的細胞產品是用本發明第一方面中所述的方法製備的，所述細胞產品包括：個人化CAR-T細胞、個人化TCR-T細胞、個人化經致敏的DC細胞和個人化DC-CTL細胞。
本發明第四方面，提供了一種在患癌對象誘導腫瘤特異免疫反應的方法，包括向需要的對象施用如本發明第二方面所述的個人化癌症疫苗。
在另一優選例中，所述個人化癌症疫苗還可用於製備一種聯合施用治療癌症的藥物組成物。
在另一優選例中，所述個人化癌症疫苗和佐劑還可與其他藥物和/或療法聯合用藥。
在另一優選例中，所述的其它藥物或療法包括抗免疫抑制藥物、化療、放療、或其他標靶藥物。
在另一優選例中，所述抗免疫抑制藥物包括抗CTLA-4抗體，抗PD1抗體，抗PD-L1抗體，抗CD25抗體，抗CD47抗體或IDO抑制劑。
在另一優選例中，所述的治療癌症的藥物組成物包括抗體藥物、細胞免疫治療藥物(如CAR-T細胞、TCR-T細胞、DC-CTL細胞等)、或其組合。
本發明第五方面，提供了一種對患癌對象進行個人化治療的方法，包括向需要的對象施用如本發明第三方面所述的免疫治療的細胞產品。
圖1顯示了小鼠肺癌動物模型身體狀態觀察圖。部份實驗組小鼠(A,B,C)4週注射完成後出現腹部皮毛脫落現象，而對照組小鼠(D)表現正常。
圖2顯示了單個CTC示意圖。從結腸癌病人(A)和患癌小鼠(B)血漿中分離的CTC(如箭頭所指)。利用Celsee系統富集的CTC經染色顯示DAPI陽性(藍色)，panCK陽性(綠色)及CD45陰性。並進行CTC細胞回收及富集，從該結腸癌病人分選的最終CTC細胞數經過次世代定序(NGS)驗證和Sequenza軟體分析，細胞總數為10，其中CTC細胞豐度(cellularity)占比30-40%，染色體倍數(ploidy)為混合多倍體；背景顏色表示分析對數後驗機率(log posterior probability,LPP)的可能性(藍色=最有可能，白色=最不可能)(C)。
圖3顯示了CTC單細胞基因組定序和轉錄組定序(G&T-seq)核酸擴增示意圖。從患癌小鼠血漿CTC富集樣本先分離mRNA，經反轉錄成cDNA(A，B)，同時萃取剩餘的基因組DNA並擴增(C)，以供基因組定序和轉錄組定序使用。
圖4顯示了對應於圖3A與圖3B的cDNA基因庫的一個CTC突變的定序結果。
圖5顯示了小鼠個人化癌症疫苗製備示意圖。已篩選並製作8-12種多肽疫苗，與佐劑混合，注射至患癌小鼠皮下，觀察療效。注射了個人化癌症疫苗的患癌小鼠，仍然存活，而沒有注射疫苗的患癌小鼠，則陸續死亡。
圖6顯示了病人ctDNA片段大小示意圖。利用安捷倫2100分析儀，上圖(Rubicon提供)箭頭顯示有兩個片段，左邊為主要的170bp片段，右邊為一些大分子片段；下圖為一病人ctDNA樣本，除主要170bp片段外，大分子片段已被專有的富集手段清除。
圖7顯示了癌症病人腫瘤新生抗原預測結果。應用HLAHD軟體對病人HLA分子分型，應用Sentieon TNscope等軟體，以病人外周血單個核細胞DNA外顯子組定序序列作為對照，從病人CTC DNA外顯子組定序序列中分離腫瘤新生抗原，並應用相關分析軟體預測短肽鏈腫瘤新生抗原及其相對應的野生型短肽鏈與病人MHC分子的親和力。紅框顯示病人個人化癌症疫苗篩出的最佳候選成份，該短肽鏈腫瘤新生抗原與MHC I類分子的親和力(7.16nM)比其相對應的野生型短肽鏈(25394.2nM)要高出約3550倍。
圖8顯示了癌症病人癌症驅動基因突變示意圖。兩個癌症病人(結腸癌和皮膚癌)外顯子組定序結果顯示Muc16基因突變有5個相同的位址(箭頭所指)。
圖9顯示了腫瘤新生抗原篩檢流程。利用專有的篩檢方法，從癌症病人血漿CTC篩選80-100種腫瘤新生抗原候選成份，組成串聯短基因(TMG)庫，進行體外轉錄(IVT)，RNA分子轉染至從病人血漿分離分化的DC細胞；然後抽取病人外周血，分離CD8+T細胞、CD4+T輔助細胞，分別進行ex vivo ELISPOT實驗，篩選出能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的腫瘤新生抗原，製備個人化癌症疫苗。
圖10顯示了卵巢癌病人非侵入性血漿和侵入性胸腹水分離製備CTC腫瘤新生抗原疫苗實驗流程。
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次在患癌對象體液中透過收集體液並分離富集一定比例的循環腫瘤細胞(CTC)及其DNA和RNA或循環腫瘤DNA(ctDNA)和循環腫瘤RNA(ctRNA)混合物，利用新一代定序技術(包括ULP-WGS、WES及RNA-seq等定序方法)，分別以患癌對象其他正常體液細胞DNA和RNA樣本作為CTC及其DNA和RNA的對照樣本，或患癌對象體液內來自於其他正常細胞的游離DNA(cfDNA)和游離RNA(cfRNA)樣本作為
ctDNA和ctRNA的對照樣本，在萃取和富集的CTC DNA及RNA和/或ctDNA及ctRNA片段中，分離和證實10-30種能引起蛋白序列變化並能與人體HLA類型I或II受體及T-細胞受體(TCR)緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈，即腫瘤新生抗原，有助於癌症的早期診斷；並且，在4-6週內，製成個人化癌症疫苗，從而開發快速、高效個人化實體腫瘤免疫治療方案。在此基礎上，完成了本發明。
具體地，本發明人採用富集(1)循環腫瘤細胞(CTC)及其DNA和RNA或(2)循環腫瘤DNA(ctDNA)和循環腫瘤RNA(ctRNA)，按照特定比例，利用定序技術(NGS)包括Ultra low pass全基因組定序(ULP-WGS)、全外顯子組定序(WES)及RNA-seq，分別以從患癌對象CTC和其他正常體液細胞DNA和RNA混合萃取液中占比
95%的其他正常體液細胞DNA和RNA樣本作為占比
5%的CTC及其DNA和RNA樣本的對照樣本，或患癌對象體液內占比
95%的來自於其他正常細胞的游離DNA(cfDNA)和游離RNA(cfRNA)樣本作為占比
5%的ctDNA和ctRNA樣本的對照樣本，在萃取和富集的CTC DNA及RNA和/或ctDNA及ctRNA片段中，分離和證實10-30種能引起蛋白序列變化並能與人體HLA類型I或II受體及T-細胞受體(TCR)緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈，即腫瘤
新生抗原，有助於癌症的早期診斷；並且，在4-6週內，製成個人化癌症疫苗，及時用於激發患癌對象的免疫反應。
定義
“體液(bodily fluid)”是指人體自然存在或分泌的液體，包括並不限於血液、尿液、唾液、淋巴液、***、胸水、腹水、腦脊液等。
循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是存在於血液循環系統中的各類腫瘤細胞的統稱，因自發或診療操作從實體腫瘤病灶包括原發灶和轉移灶等脫落，大部分CTC在進入外周血後發生凋亡或被吞噬，少數能夠逃逸並發展成為轉移灶，增加癌症患者死亡風險。
“cfDNA和cfRNA”是指人體體液系統，尤其是血液循環系統中，含有不斷流動的來自病人腫瘤基因組的DNA和細胞RNA片段。正常細胞和腫瘤細胞都會破裂，細胞破裂之後，細胞中的DNA就會被釋放到體液當中，其中進入血液的這部分DNA和RNA，就被稱為血漿游離DNA(cfDNA)或cfRNA。
“ctDNA和ctRNA”是指人體體液系統，尤其是血液循環系統中，含有不斷流動的來自病人腫瘤基因組的DNA和細胞RNA片段。以上cfDNA和cfRNA裡源自於腫瘤細胞的那部分DNA和RNA，攜帶腫瘤特異突變，叫ctDNA或ctRNA。
“腫瘤新生抗原(neoantigen)”是指僅表現於某種腫瘤細胞表面而不存在於正常細胞上的新抗原，故又稱獨特腫瘤抗原。
此類抗原可存在於不同個體同一組織類型的腫瘤中，如人惡性黑色素瘤基因編碼的黑色素瘤特異性抗原可存在於不同個體的黑色素瘤細胞，但正常黑色素細胞不表現。這類抗原也可為不同組織學類型的腫瘤所共有，如突變的ras癌基因產物可見於消化道、肺癌等，但由於其胺基酸順序與正常原癌基因ras表現產物存在差異，可被身體的免疫系統所辨識，激發身體的免疫系統攻擊並消除腫瘤細胞。腫瘤新生抗原主要誘導T細胞免疫反應。
“WGS”是在獲得一定的遺傳及物理圖譜資訊的基礎上，將基因組DNA分解成2kb左右的小片段進行隨機定序，輔以一定數量的10kb的轉殖株和BAC轉殖株的末端定序，利用超級電腦進行整合進行序列組裝。
“ULP-WGS”則是一種超低通量的快速、相對廉價的全基因組定序方法，定序深度僅為0.01-0.1x，已應用於非侵入性產前篩檢以檢測大規模染色體異常。可用於癌症病人早期CTC和ctDNA的篩檢，篩檢陽性的CTC和ctDNA樣本可進一步執行WES和RNA-seq分析。
“WES”：外顯子組(Exome)是指真核生物基因組中全部外顯子區域的總和，包含了蛋白質合成最直接的資訊。WES是利
用設計好的探針試劑盒將座標已知的全基因組外顯子區域的DNA捕捉並富集後，進行高通量定序的基因組分析方法。對於人類基因組來說，外顯子區域大概占到基因組的1%，大約30Mbp。
“RNA-seq”：轉錄組是指在相同生理條件下的在一個細胞、或一群細胞中所能轉錄出的所有RNA的總和，包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA。RNA-seq是將萃取所要研究的特定類型的RNA，將其反轉錄成cDNA，利用高通量定序技術獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列資訊。
“MHC”是所有生物相容複合體抗原的一種統稱，表示由MHC基因家族(MHC class I,class II,class III)編碼而成的分子，位於細胞表面，主要功能是綁定由病原體衍生的肽鏈，在細胞表面顯示出病原體，以便於T-細胞的辨識並執行一系列免疫功能。MHC class I位於一般細胞表面上，可提供一般細胞內的一些狀況，比如該細胞遭受病毒感染，則相關病毒外膜碎片的短肽鏈透過MHC提示在細胞外側，可以供CD8+T細胞等辨識，以進行撲殺。
MHC class II只位於抗原呈現細胞(APC)上，如巨噬細胞、CD4+T輔助細胞等。這類提供則是細胞外部的情況，像是組織中有細菌侵入，則巨噬細胞進行吞食後，把細菌碎片利用MHC提示給輔助T細胞，啟動免疫反應。MHC class III主要編碼補體成分，腫瘤壞死因子(TNF)等。人類的MHC通常被稱為HLA(human leucocyte
antigen)，即人類體液細胞抗原。MHC基因，定位於人類第六號染色體短臂，呈高度多型性。
“CD8+T細胞”通常指在細胞表面表現CD8的T細胞。
而CD8(cluster of differentiation 8)是一種跨膜糖蛋白，用作TCR的co-receptor。類似於TCR，CD8與MHC class I分子結合，以供CD8+T細胞等辨識撲殺。
“CD4+T輔助細胞”通常指在細胞表面表現CD4的T輔助細胞，屬於一種體液細胞。而CD4(cluster of differentiation 4)是一種糖蛋白，用作TCR的co-receptor並輔助TCR辨識APC。CD4與MHC class II分子結合，以供CD8+T細胞等辨識撲殺。
“IC50”是指被測量的拮抗劑或抑制劑的最大半抑制濃度。它能指示某一藥物或者物質(抑制劑)在抑制某些生物程序(或包含在此程序中的某些物質，比如酶，細胞受體或是微生物)的半量。
“免疫佐劑”，又稱非特異性免疫增生劑。本身不具抗原性，但同抗原一起或預先注射到身體內能增強免疫原性或改變免疫反應類型。
術語“DNA、RNA、肽鏈”指DNA、RNA、和/或肽鏈。
“CAR-T”，全稱是嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是目前較為有效的惡性腫瘤免疫治療方法之一。嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，賦予T細胞HLA非依賴的方式辨識腫瘤抗原
的能力，這使得經過CAR改造的T細胞相較於天然T細胞表面受體TCR能夠辨識更廣泛的目標。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有較好的療效。
“TCR-T”，全稱是T細胞受體(TCR)嵌合型T細胞(TCR-T)，是透過部分基因改造的方法來提高這些TCR對相應的腫瘤新生抗原的“親和力”來消滅腫瘤細胞。基因改造的TCR技術也被稱為親和力增強的TCR技術。與上述CAR-T作為當前過繼性細胞重新輸入治療ACT技術兩大最新的免疫細胞技術，因其能夠表現特異性受體標靶辨識特異性的細胞如腫瘤細胞，受到廣泛的關注和研究。
“DC-CTL”，DC細胞受自體或同一種類腫瘤細胞裂解物的衝擊，能特異呈現某一類腫瘤抗原，從而誘導具有針對某一特定腫瘤細胞的細胞毒性淋巴細胞(CTL)，提高了抗腫瘤效應。國內外大量的臨床資料顯示DC-CTL免疫治療綜合了DC和CTL的所有優點，對眾多的腫瘤均有明顯療效，且對控制腫瘤的復發與轉移，提高患者身體的免疫力，提高生存品質均有積極作用。DC-CTL已成為當前生物治療的主要治療方法之一，也是未來根治腫瘤中最具發展前景的腫瘤治療手段之一。
CTC富集及CTC DNA和RNA的萃取
CTC的類型、數量及變化在腫瘤早期篩檢、腫瘤用藥、療效評估和復發監測等方面有著重要的臨床指導意義。但在早期腫
瘤病人10mL血液裡面大概僅含1-10個左右的CTC，所以在血液樣本中收集罕見的CTC比較困難。目前CTC富集原理主要包括基於細胞尺寸的捕獲(過濾)和基於腫瘤表面生物標記的陽性捕獲(免疫學)兩種方法。過濾方法由於不依賴於特定的生物標記而且能高效富集或分離所有類型的CTC，應用更廣泛。在現有使用過濾方法富集CTC的產品中，Celsee PREP100和PREP400系統是無需預先去除紅血球、高度自動化、高效率富集，並將細胞富集系統與細胞鑑定和分析系統整合到一起的CTC產品(www.celsee.com)。細胞無需離心、細胞裂解、不添加任何標籤；樣本需求量少；分選速度快；使用微流控晶片分選技術，分選效率高達80%以上；自動化多通道設置，一次可同時處理4個樣本。可對CTC進行原位免疫組織化學染色，DNA-FISH，RNA-FISH，細胞培養，PCR和NGS分析等。另外，CTC富集過程中，其細胞懸浮液不可避免地含有其他背景體液細胞如白血球和淋巴細胞等(Gogoi P et al.Methods Mol Biol 2017；1634：55-64)，我們在此首次巧妙地提出以該細胞懸浮液中其他背景體液細胞如白血球和淋巴細胞DNA和RNA樣本作為對照，對CTC的DNA和RNA進行NGS包括ULP-WGS，WES及RNA-seq等分析，從而發現腫瘤特異體細胞突變。
在一優選例中，對於總數僅10個細胞的細胞樣本(其中，CTC為1-4個，即CTC占比10-40%)，本發明方法仍可高靈敏地檢測出腫瘤特異體細胞突變。
ctDNA和ctRNA的萃取及富集
ctDNA大小約166bp，相當於圍繞核糖體及其連接體的長度。這些DNA片段源自於四個部分：1、壞死的腫瘤細胞；2、凋亡的腫瘤細胞；3、循環腫瘤細胞；4、腫瘤細胞分泌的胞外體。
自1977年人類發現ctDNA以來，一直對其研究。1994年，研究人員首次鑑定了源自於腫瘤的含有癌症生物標記突變的DNA。加上ctDNA的非侵入性和易獲得性，在其中發現的腫瘤生物標記，被認為可以用於檢測腫瘤早期診斷、進展過程、預後判斷及個人化用藥指導。雖說早在1987年Wieczorek等發現患癌對象血漿中存在ctRNA，直到1999年，特異基因mRNA才不斷在不同患癌對象血漿中得到證實(González-Masiá JA et al.OncoTargets & Therapy 2013；6：819-832)。但由於ctDNA和ctRNA在人體血液內含量極低，只有循環DNA的1%，甚至萬分之一，其檢測存在較大的挑戰。
本發明人從患癌對象體液樣本分離去除細胞，並從去除細胞的樣本中透過分子篩、甲基化分離、過濾離心等方法萃取cfDNA和cfRNA，從中富集ctDNA和ctRNA片段達10-100%，有利於下游的WGS，WES和RNA-seq。另外，ctDNA和ctRNA富集過程中，
其核酸懸浮液不可避免地含有來自於體液內其他正常細胞的cfDNA和cfRNA，本發明在此首次巧妙地提出以該核酸懸浮液中來自於體液內其他正常細胞的cfDNA和cfRNA樣本作為對照，對ctDNA和ctRNA進行NGS包括ULP-WGS，WES及RNA-seq等分析，從而發現腫瘤特異體細胞突變。
腫瘤新生抗原分離和證實
本發明的主要目的是在患癌對象體液中分離富集CTC及其DNA和RNA或ctDNA和ctRNA，利用NGS包括ULP-WGS、WES及RNA-seq，分離和證實能引起蛋白序列變化並能與人體HLA類型I或II受體及TCR緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈，即腫瘤新生抗原。尤其重要的是，這些變異的新生抗原只存在於病人的腫瘤細胞，而不存在於病人的正常組織和細胞，有助於癌症的早期診斷。有意義的突變包括：(1)非同義突變導致胺基酸序列變化；(2)通讀突變導致終止密碼子發生變化或消失，而在蛋白序列C端形成較長的腫瘤特異蛋白序列；(3)剪切位址突變導致在mRNA序列內出現包含內顯子的腫瘤特異蛋白序列；(4)染色體重組導致形成一個嵌合蛋白，結合位址含腫瘤特異蛋白序列(基因融合)；(5)mRNA移碼突變或缺失，產生一個含腫瘤特異蛋白序列的新的蛋白開放閱讀框(ORF)。
WES是對定向富集的基因組DNA進行高通量定序，它能夠以相對低廉的成本對人類外顯子組進行定序。2009年，外顯子組捕獲工具的出現，讓WES技術迅速火熱，目前市場上的技術平台相對成熟。經過WES分離出能引起蛋白序列變化的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈後，這些突變還得需要RNA-seq來證實這些突變蛋白或變異體編碼DNA、RNA的表現。前述體液樣品萃取ctRNA後，去除rRNA，保留帶PolyA和不帶PolyA的轉錄本，用六鹼基隨機引物(random hexamers)合成cDNA第一鏈，並加入緩衝液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經過PCR試劑盒純化並加EB緩衝液洗脫經末端修復，加定序接頭，並進行PCR擴增，從而完成整個基因庫製備工作，構建好的基因庫進行NGS。
除了採用傳統的WES和RNA-seq技術來篩檢腫瘤新抗原，還可利用現代的新型生物資訊學建立MHC(HLA類型I或II受體)結合基因庫，從中篩檢能與MHC結合的多肽鏈或RNA變異體，縮小WES尤其是RNA-seq範圍，加快NGS實驗進程。
腫瘤新生抗原與HLA類型I或II受體及TCR結合
領域裡已有各種離體預測HLA結合實驗方法，如IEDB綜合性預測方法，可用來預測分離和證實的潛在腫瘤新生抗原與HLA親和力，即IC50 
100nm或至少
150nm。基於正常人體對前
述完全新穎的蛋白序列不存在耐受性及其腫瘤特異性，只要它們與HLA類型I或II受體預測親和力
500nM，可被作為最優先考慮的短肽鏈以製作個人化疫苗。如果非同義突變短肽鏈與HLA類型I或II受體預測親和力
150nM，同時與之相對應的天然肽鏈與HLA類型I或II受體預測親和力
1000nM，該短肽鏈可被作為次優先考慮來製作個人化疫苗。如果非同義突變短肽鏈和與之相對應的天然肽鏈與HLA類型I或II受體預測親和力分別
150nM，該短肽鏈可被作為第三優先考慮來製作個人化疫苗。
但僅與HLA結合不是一個優化的免疫原性預測，而增加TCR結合度可以提高預測精度。而本發明提出從患癌對象體液中萃取T-細胞，將篩選出的短肽鏈或變異體編碼RNA進行離體TCR結合試驗和CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞活化試驗，這樣能將TCR連結到傳統的工作流程中，以便更好地預測連結到TCR的新表位的準確性。
與HLA類型I或II受體及TCR結合的腫瘤新生抗原CD8
+
T細胞或CD4
+
T輔助細胞活化試驗
從患癌對象分離的CD8+T細胞和CD4+T輔助細胞能透過與HLA類型I或II受體及TCR結合的病人腫瘤新生抗原多肽鏈共同離體培養被活化，從而分泌針對這些腫瘤新生抗原多肽鏈的IFN-γ(IFN-γ ELISPOT assay)。
製作患癌對象個人化癌症疫苗
採用標準固相法合成化學結合逆相高效液相層析法(RP-HPLC)，透過GMP製作能引起蛋白序列變化，並能與人體HLA類型I或II受體及TCR緊密結合，還能活化抗腫瘤CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈個人化癌症疫苗。
加快個人化癌症疫苗治療進程
目前，個人化癌症疫苗研發及製作得從病人癌變組織切除開始，耗時約需6-8週，且費用昂貴，這尤其對於轉移性癌症患者而言，過程漫長。本發明人國際上首次透過收集體液分離富集CTC及其DNA和RNA或循環腫瘤DNA(ctDNA)和循環腫瘤RNA(ctRNA)，利用NGS包括ULP-WGS、WES及RNA-seq，分別以患癌對象其他正常體液細胞DNA和RNA樣本作為CTC及其DNA和RNA的對照樣本，或患癌對象體液內來自於其他正常細胞的游離DNA(cfDNA)和游離RNA(cfRNA)樣本作為ctDNA和ctRNA的對照樣本，在萃取和富集的CTC DNA及RNA和/或ctDNA及ctRNA片段中，分離和證實10-30種能引起蛋白序列變化並能與人體HLA類型I或II受體及T-細胞受體(TCR)緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的DNA，RNA或短肽鏈，即腫瘤新生抗原；在4-6週內，製成個人化癌症疫苗，為開發快
速、高效個人化實體腫瘤，尤其是轉移性癌症免疫治療方案提供可行性參考，以部分滿足患癌對象巨大的臨床治療需求。
佐劑的使用
免疫佐劑本身不具抗原性，但同抗原一起或預先注射到身體內能增強免疫原性或改變免疫反應類型。例如，在以往的研究中，Poly-ICLC顯示出了與黃熱病疫苗相似的佐劑功能，因此，其也是目前認為最好的類鐸受體3激動劑。
用於免疫治療的細胞產品
本發明還提供了用於個人化免疫治療的細胞產品，代表性的所述細胞產品包括(但並不限於)：CAR-T細胞、TCR-T細胞、經致敏的DC細胞和DC-CTL細胞。
在一實例中，本發明方法包括：快速篩選2-5種與所述的二級選定的序列元素(即腫瘤新生抗原)具特異性和高親和力的單鏈抗體(SCFV)；然後收集所述對象(即患癌對象)外周血中的T細胞，透過體外重組DNA技術，使其表現含有所述scFV作為胞外抗原結合域的CAR，從而製得針對所述腫瘤新生抗原的個人化的CAR-T細胞。
本發明的一種或多種(如2-5種)個人化的CAR-T細胞可以重新輸入給所述對象，從而激發患癌對象產生針對實體癌症和/或血液癌症的免疫反應。
在一實例中，本發明方法包括：快速篩選2-5種與所述的二級選定的序列元素(即腫瘤新生抗原)具特異性和高親和力的TCR；然後製備含相應TCR的T細胞，針對所述腫瘤新生抗原的個人化的TCR-T細胞。
本發明的一種或多種(如2-5種)個人化的TCR-T細胞可以重新輸入給所述對象，從而激發患癌對象產生針對實體癌症和/或血液癌症的免疫反應。
在一實例中，本發明方法包括：用多種(如2-5或5-10或10-20種)所述二級選定的序列元素，對DC細胞進行致敏處理，從而獲得經致敏的DC細胞。進一步地製備相應的DC-CTL細胞。
本發明的經致敏的(primed)樹突狀細胞和/或DC-CTL細胞可以重新輸入給所述對象，從而激發患癌對象產生針對實體癌症和/或血液癌症的免疫反應。
個人化癌症疫苗與其他藥物和療法的聯合用藥
《自然》線上發表的兩組黑色素瘤病人中都有在個人化癌症疫苗免疫治療後復發的情況，比如C Wu團隊中有兩名四期患者(肺部轉移)在接受免疫治療後仍舊產生癌症復發。但是這些病人在接受了PD-1抗體聯合治療後，病情得到控制。這在很大程度上應該與個人化癌症疫苗治療後患者免疫庫的變化有關。美德兩隊的研究人員都發現，在經過特異性疫苗治療後，病人大多都產生了對腫
瘤新生抗原具有特異結合能力的T細胞，而這些T細胞在沒有免疫之前在血液中檢測不到，即個人化癌症疫苗從病人免疫庫中找到了那些沉眠中的T細胞，或經過特異性抗原誘導產生原來不存在的T細胞，並把它們招募加入免疫系統，從而產生了抗癌效果(Ott PA Nat 2017；547：217-221,Epub 2017 Jul 5；Sabin U et al.Nat 2017；547：222-226,Epub 2017 Jul 5)。更重要的是，這些新加入的T細胞大多為PD-1陽性，可用PD-1抗體和其他抗免疫抑制藥物包括抗CTLA-4抗體，抗PD-L1抗體，抗CD25抗體，抗CD47抗體或IDO抑制劑等聯合治療。因此，針對腫瘤新生抗原的個人化癌症疫苗可以透過“免疫招募”，“免疫誘導”等手段擴增病人已有的免疫庫，給癌症免疫治療帶來了新的希望。同時，個人化癌症疫苗還可與其他藥物和療法聯合用藥，包括疫苗+化療、疫苗+放療、疫苗+其他標靶藥物等。
本發明所有部分引用了各種參考文獻。這些參考文獻及其引用的參考文獻透過引用納入本發明，予以披露，以便更全面地描述涉及本發明領域內的工作現狀。
應理解的是，上述涉及本發明的優選實施例和許多變動的披露，不脫離本發明適用範圍。本發明進一步用下面的實施例說明，不能以任何方式解釋為限制本發明適用範圍。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
如無特別說明，實施例中所用的材料或試劑均為市售產品。
已有報導，應用甲基硝基亞硝基胍(1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine，MNNG，一種強誘癌試劑)皮下注射小鼠可誘導肺癌的發生，以建立早期肺癌動物模型(Xiao SM et al.2015；Acta Lab Anim Sci Sin 23：227-32)。
我們根據此方法建立小鼠早期肺腺癌模型，並用個人化癌症疫苗治療。
採用濃度為2.0mg/mL的亞硝基胍溶液0.2mL每週皮下注射至20隻KM母鼠(25-30g)，連續注射四週(圖1)。注射後4週左右，從鼠尾取全血200μL，分離富集CTC(圖2A)及其DNA和RNA或ctDNA和ctRNA。圖3顯示了CTC單細胞基因組定序和轉錄
組定序(G&T-seq)核酸擴增示意圖。從患癌小鼠血漿CTC富集樣本先分離mRNA，經反轉錄成cDNA(圖3，A，B)，同時萃取剩餘的基因組DNA並擴增(圖3，C)，以供基因組定序和轉錄組定序使用。
圖4顯示了對應於圖3A與圖3B的cDNA基因庫的一個CTC突變的定序結果。
以病鼠外周血單個核細胞DNA樣本作為對照，在萃取和富集的CTC DNA和RNA片段中，進行WES和RNA-seq，分離和證實能引起蛋白序列變化並含腫瘤特異體細胞突變的短肽鏈。由於小鼠MHC分子編碼基因與人類相似，利用生物資訊學軟體，篩選出8-12種能引起蛋白序列變化並能與MHC I或II類分子及鼠TCR緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的短肽鏈，即腫瘤新生抗原。
對於小鼠腫瘤新生抗原進行了分析，方法如下：應用小鼠H-2分型軟體對小鼠H-2分子分型，應用Sentieon TNscope等軟體，以患癌小鼠外周血單個核細胞DNA外顯子組定序序列作為對照，從患癌小鼠CTC DNA外顯子組定序序列中分離腫瘤新生抗原，並應用相關分析軟體預測短肽鏈腫瘤新生抗原及其相對應的野生型短肽鏈與該小鼠MHC分子的親和力。病鼠個人化癌症疫苗篩出的一個優選的腫瘤新生抗原肽(KAIRNVLII)(序列辨識編號：1)，該短肽鏈腫瘤新生抗原與MHC I類分子的親和力(9.19nM)比其相對應
的野生型短肽鏈(5105.43nM)要高出約556倍；同時，IEDB預測與小鼠TCR親和力(MHC I免疫原性)得分較高(0.20254)。
將該上述優選的腫瘤新生抗原肽製成個人化癌症疫苗，與佐劑混合，注射至患癌小鼠皮下，觀察療效(圖5)。注射了個人化癌症疫苗的患癌小鼠，仍然存活，而沒有注射疫苗的患癌小鼠，則陸續死亡。
在3個患癌對象(肺癌、結直腸癌和膀胱癌)外周血中分別採集兩管，一管10mL，另一管5mL全血，置於EDTA採血管中，上下混勻數次。10mL管利用Celsee系統進行CTC富集和計數(圖2B)。
CTC富集過程中，其細胞懸浮液不可避免地含有其他血液細胞如白血球和淋巴細胞等。我們在此首次利用該細胞懸浮液中其他血液細胞如白血球和淋巴細胞DNA和RNA樣本作為對照，對CTC的DNA和RNA進行NGS包括ULP-WGS，WES及RNA-seq等分析，從而發現腫瘤特異體細胞突變。分選的最終細胞數經過NGS驗證，對於總數僅10個細胞的細胞樣本，CTC細胞豐度(cellularity)占比30-40%，染色體倍數(ploidy)為混合多倍體；背
景顏色表示分析對數後驗機率(log posterior probability,LPP)的可能性(藍色=最有可能，白色=最不可能)(圖2C)。
而另一管5mL全血，在1900 xg(3000rpm)和4℃條件下，離心血液樣本10分鐘。仔細吸取上清液，不干擾下層吸漿。
從5mL全血樣品，可獲取約3mL血漿。上清液分別轉移至2個1.5mL EP管中，在16000 xg和4℃條件下，離心10分鐘。小心吸取上清液，不干擾高速離心形成的少量沉澱物，存放於-80℃冰箱。第2天後，取3mL血漿樣品用QIAamp游離核酸萃取試劑盒(Qiagen 55114)萃取cfDNA，加入離心、過濾步驟，富集ctDNA。同時，利用Rubicon的ThruPLEX Plasma-seq試劑盒，在NGS分析之前擴增含量較少的ctDNA(圖6)。
另外，ctDNA富集過程中，其核酸懸浮液不可避免地含有來自於體液內其他正常細胞的cfDNA，我們在此首次利用該核酸懸浮液中來自於體液內其他正常細胞的cfDNA樣本作為對照，對ctDNA進行NGS包括ULP-WGS，WES及RNA-seq等分析，從而發現腫瘤特異體細胞突變。
上述樣本直接進行核酸萃取、擴增，然後進行次世代定序包括外顯子組定序，利用Sentieon的相關軟體流程包括TNscope等進行分析，基於比較腫瘤外顯子組和轉錄組數據與正常細胞對照數據，同時檢測多種突變產生的變異多肽，結合先進的新
生抗原預測算法和軟體，快速高效篩選出高質量的腫瘤新生抗原短肽序列(圖7)。
兩個癌症病人(結腸癌和皮膚癌)外顯子組定序結果顯示癌症驅動基因Muc16基因突變有5個相同的位址(圖8)。
從癌症病人血漿CTC篩選80-100種腫瘤新生抗原候選成份，組成串聯短基因(TMG)庫，進行體外轉錄(IVT)，RNA分子轉染至從病人血漿分離分化的DC細胞；然後抽取病人外周血，分離CD8+T細胞、CD4+T輔助細胞，分別進行ex vivo ELISPOT實驗，篩選出能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的腫瘤新生抗原，製作個人化癌症疫苗(圖9)。
利用常規基於親和力的方法篩選腫瘤新生抗原，其命中率(hit rate)只有3%，而採用本發明的基於HLA全方位(HLA-agnostic)方法篩選腫瘤新生抗原，其命中率(hit rate)可提高到35%。
本實施例的主要內容是執行以下臨床前動物實驗(實驗流程見圖10)：
1.分離富集CTC。從晚期伴腹水卵巢癌病人非侵入性血漿(10mL)和侵入性腹水進行CTC分離和富集。
2.腹水CTC體外培養，建立卵巢癌病人腹水CTC裸鼠PDX模型。
3.血漿和腹水CTC RNA和DNA萃取和次世代定序。利用次世代定序技術(NGS)包括全外顯子定序(WES)和RNAseq，從血漿和腹水CTC中分離和證實10-30種能引起蛋白序列變化並能與病人MHC分子及TCR緊密結合，還能活化CD8+T細胞或CD4+T輔助細胞的含腫瘤特異體細胞突變的短肽鏈，即腫瘤新生抗原。
4. In vivo證實腫瘤新生抗原疫苗的有效性。腹水和血漿CTC經過次世代定序和後續的生物資訊學分析而篩選出的腫瘤新生抗原多肽或mRNA疫苗，與從該病人血漿中分離的DC離體結合(priming)，並經ex vivo Elispot驗證實驗，篩選合適數量腫瘤新生抗原疫苗成分，與從該病人血漿中分離的PBMC結合，一起注射至PDX裸鼠的尾部靜脈。
5.每日觀察部份人源化PDX小鼠狀況，每兩天測量PDX小鼠皮下腫瘤的大小。以此評估個人化癌症疫苗的安全性和有效性及進一步探索藥效學特徵。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明
作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
<110> 大陸商上海桀蒙生物技術有限公司(Shanghai Jenomed Biotech Co.Ltd.)
<120> 個人化癌症疫苗的製備方法
<150> CN 201711252479.8
<151> 2017-12-01
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 腫瘤新生抗原肽
<400> 1
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 腫瘤新生抗原
<400> 2
Claims (11)
- 一種製備個人化癌症疫苗的方法，其特徵在於，包括以下步驟：(a)提供對應於所述對象的第一樣本定序數據集A1和第一對照定序數據集R1；和提供對應於所述對象的第二樣本定序數據集A2和第二對照定序數據集R2，其中，所述的第一樣本定序數據集A1和第一對照定序數據集R1透過包括以下步驟的方法獲得：t1)提供第一樣本，所述第一樣本為含CTC細胞和正常體液細胞的樣本；t2)對所述第一樣本進行CTC細胞富集處理，從而獲得經富集的第一樣本，其中在所述的經富集的第一樣本中，CTC細胞豐度C15%並且正常體液細胞豐度C2
95%，按所述經富集的樣本中所有細胞的總數量計，並且CTC細胞豐度C1與正常體液細胞豐度C2之比記為B1(即B1=C1/C2)；並且，在所述經富集的第一樣本中，CTC細胞豐度為10-90%；t3)從所述經富集的第一樣本中萃取DNA和/或RNA，從而獲得第一核酸樣本，其中所述第一核酸樣本包括來自CTC細胞的核酸樣本以及來自正常體液細胞的核酸樣本；和t4)對所述第一核酸樣本進行定序，其中，將所述第一核酸樣本中來自正常體液細胞的核酸樣本作為來自CTC細胞的核酸樣本的對照來進行分類和/或分 析，從而獲得第一樣本定序數據集A1和第一對照定序數據集R1，其中第一樣本定序數據集A1對應於CTC細胞的定序數據集，而第一對照定序數據集R1對應於正常體液細胞的定序數據集；其中，所述的第二樣本定序數據集A2和第二對照定序數據集R2透過包括以下步驟的方法獲得：w1)提供第二樣本，所述第二樣本為含循環腫瘤DNA(ctDNA)和循環腫瘤RNA(ctRNA)及其他游離DNA(cfDNA)和游離RNA(cfRNA)的樣本；w2)對所述第二樣本進行富集處理，從而獲得經富集的第二核酸樣本；其中，所述的經富集的第二核酸樣本包括來自CTC細胞的ctDNA和ctRNA以及來自正常體液細胞的cfDNA和cfRNA，其中按所有核酸的總重量計算，ctDNA和ctRNA含量L1
5%，而來自正常細胞cfDNA和cfRNA的含量L2
95%，並且所述含量L1與L2之比記為B2(即B2=L1/L2)；w3)對所述第二核酸樣本進行定序，其中，將所述第二核酸樣本中的樣本中來自正常細胞的cfDNA和cfRNA作為來自CTC細胞的ctDNA和ctRNA的對照來進行分類和/或分析，從而獲得第二樣本定序數據集A2和第二對照定序數據集R2，其中第二樣本定序數據集A2對應於 CTC細胞的定序數據集，而第二對照定序數據集R2對應於正常體液細胞的定序數據集；(b)將所述第一樣本定序數據集A1與第一對照定序數據集R1，或第二樣本定序數據集A2與第二對照定序數據集R2，分別進行序列比對處理，從而獲得第一候選數據集S1或第二候選數據集S2；其中，所述第一候選數據集S1中的任一序列元素是存在於所述A1但不存在於所述R1的元素；而所述第二候選數據集S2中的任一序列元素是存在於所述A2但不存在於所述R2的元素；(c)對於所述第一候選數據集S1和第二候選數據集S2中的任一序列元素，進行HLA類型I或II受體親和力預測分析，從而獲得一級選定的序列元素，所述一級選定的序列元素為與HLA類型I或II受體結合緊密的序列元素；(d)基於所述一級選定的序列元素，合成對應於所述一級選定的(primarily selected)序列元素的DNA、RNA、短肽鏈；(e)用所述合成的DNA、RNA、短肽鏈，進行離體T-細胞受體(TCR)結合試驗和CD8+T細胞和/或CD4+T輔助細胞活化試驗，從而獲得10-30種二級選定的(secondarily selected)序列元素，其中所述的二級選定的序列元素能夠與TCR結合且使CD8+T細胞和/或CD4+T輔助細胞活化； (f)基於所述二級選定的序列元素，合成對應於所述二級選定的序列元素的DNA、RNA、肽鏈；(g)將上一步驟中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈與藥學上可接受的載體混合，從而製得藥物組成物，即為個人化癌症疫苗。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，在針對所述第一核酸樣本定序的分類和/或分析中，對於同一位址或位置的兩類定序數據D1和D2，如果符合下式Q1，則將定序數據D1歸類為CTC定序數據，並將定序數據D2歸類為正常體液細胞的定序數據RD1/(RD1+RD2)C1/(C1+C2) (Q1)式中，RD1為定序數據D1的出現頻率；RD2為定序數據D2的出現頻率；C1為經富集的第一樣本中的CTC細胞豐度；C2為經富集的第一樣本中的正常體液細胞豐度。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，在針對所述第二核酸樣本定序的分類和/或分析中，對於同一位址或位置的兩類定序數據E1和E2，如果符合下式Q2，則將定序數據E1歸類為CTC細胞的ctDNA和ctRNA定序數據，並將定序數據E2歸類為正常細胞ctDNA和ctRNA的定序數據RE1/(RE1+RE2)L1/(L1+L2) (Q2)式中，RE1為定序數據E1的出現頻率； RE2為定序數據E2的出現頻率；L1為經富集的第二樣本中的CTC細胞ctDNA和ctRNA含量；L2為經富集的第二樣本中的正常細胞ctDNA和ctRNA含量。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述的序列元素為下組：DNA序列元素、RNA序列元素、和/或肽鏈序列元素。
- 如請求項4所述的方法，其特徵在於，所述的DNA序列元素包含2-5個DNA變異體，每個DNA變異體包含至少5個短肽鏈編碼序列；和/或所述的RNA序列元素包含2-5個RNA變異體，每個RNA變異體包含至少5個短肽鏈編碼序列；和所述肽鏈序列元素含有5-100個胺基酸。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述的正常體液細胞包括白血球、單核細胞、淋巴細胞等。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述體液包括血液、尿液、唾液、淋巴液或***。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟(h1)：基於步驟(f)中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈，篩選出與所述二級選定的序列元素特異性結合的單鏈抗體(scFV)，並構建和/或擴增表現嵌合抗原受體(CAR)的T細胞(CAR-T)，其中，所述CAR含有所述scFV作為胞外抗原結合域。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟(h2)：基於步驟(f)中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈，篩選出與所述二級選定的序列元素特異性結合的T細胞受體(TCR)，並構建和/或擴增表現所述TCR的T細胞(TCR-T)。
- 如請求項1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟(h3)：基於步驟(f)中合成的所述的DNA、RNA、肽鏈，在體外對所述對象的樹突狀細胞(DC)進行致敏(priming)處理，從而獲得經致敏的(primed)樹突狀細胞。
- 如請求項10所述的方法，其特徵在於，在步驟(h3)中，還包括：在體外，將所述經致敏的樹突狀細胞與所述對象的T細胞進行共培養，從而製得DC-CTL細胞。
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