KR20220116475A - 시퀀싱을 위한 핵산을 획득하기 위한 방법 - Google Patents

시퀀싱을 위한 핵산을 획득하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 쉐딩되고/되거나 고형 종양 샘플의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계 및 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법을 제공한다.

Description

시퀀싱을 위한 핵산을 획득하기 위한 방법
본 발명은 특히 핵산을 시퀀싱할 목적으로 환자로부터의 종양으로부터 상기 핵산을 획득하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 쉐딩(shedding)된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계, 및 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다. 상기 방법으로부터 획득된 서열 정보는 종양의 치료에서 표적화될 수 있는 클론 신생항원을 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 환자에서 암을 치료하는데 사용될 수 있는 상기 클론 신생항원에 특이적인 T 세포 집단을 확장시키기 위한 방법에 관한 것이다.
종양 세포의 유전적 불안정성은 종종 다수의 돌연변이의 발생을 초래하고, 비-동의 돌연변이의 발현은 신생항원으로 불리는 종양-특이적 항원을 생산할 수 있다. 신생항원은 종양 세포 유전체에서 비-동의 돌연변이에 의해 생성되는 개별 특이성을 갖는 비-자가 단백질이다. 신생항원은 정상 조직에서 발현되지 않기 때문에 매우 면역원성이다. 이들은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 활성화시켜 면역 반응을 생성할 수 있으므로 종양 면역요법에 이상적인 표적이다. 생물정보학 기술의 발전은 신생항원의 확인을 가속화시켰다. 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 대한 신생항원의 친화성 또는 신생항원의 면역원성을 확인하고 예측하기 위한 상이한 알고리즘의 조합은 주로 전체-엑솜(exome) 시퀀싱 기술에 기반한다.
종양 신생항원을 표적화하기 위해, 신생항원은 먼저 확인되어야 하며, 이는 종양으로부터의 핵산의 시퀀싱을 포함한다. 이는 반드시 관심 종양으로부터 핵산을 획득하는 것을 포함한다.
가능한 한 적은 양의 종양 샘플로부터 시퀀싱을 위한 상기 핵산을 획득하여, 나머지 종양을 추가 병리학적 분석 또는 종양 신생항원을 표적화할 수 있는 치료적 T 세포 집단의 생산에 이용 가능하게 하는 것이 유리하다.
따라서, 종양 샘플로부터 종양 핵산을 효율적으로 획득하는 수단이 당 분야에 필요하다. 시퀀싱 목적을 위해 종양 샘플로부터 충분한 양의 핵산을 획득할 수 있는 것이 유리하며, 여기서 상기 핵산은 신생항원, 특히 클론 신생항원의 확인을 가능하게 하기에 충분한 양 및 품질의 핵산이다.
본 발명자는 놀랍게도, 예를 들어, 종양 절제 후에 고형 종양 샘플로부터 배지로 쉐딩된 세포가, 예를 들어, 암 치료에서 표적화될 수 있는 신생항원을 확인하기 위해 핵산의 시퀀싱을 가능하게 하는 적합한 품질의 충분한 핵산을 제공한다는 것을 발견하였다. 배지 내로 쉐딩되는 종양 세포는 전체로서 종양을 대표할 수 있고, 종양 내의 대부분의 편재성 또는 클론 돌연변이의 검출을 가능하게 하기에 충분한 서열 정보를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 고형 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계, 및 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법을 제공한다.
일 양태에서, 상기 방법은,
(a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 고형 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 배지로부터 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 배지는 생체 외 또는 시험관 내에서 고형 종양 샘플로부터 배지로 직접 쉐딩된 종양 세포를 함유한다.
일 양태에서, 고형 종양은 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 신장암, 방광암, 두경부암 및 유방암으로부터 선택된다.
일 양태에서, 상기 방법은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 생성된 서열 정보는 종양으로부터 클론 신생항원(들)의 확인에 적합하다. 일 양태에서, 상기 방법은 종양으로부터 클론 신생항원(들)을 확인하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 상기 방법은 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. TIL은 클론 신생항원-특이적 T 세포(cNeT)의 집단을 생산하기 위해 선택적으로 확장될 수 있다.
일 양태에서, 상기 방법은 고형 종양 샘플의 적어도 일부를 기계적으로 파괴하는 단계 및 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 방법은 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 고형 종양 샘플을 효소적으로 파괴하는 단계를 포함하지 않는다.
일 양태에서, 상기 방법은 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 음성 선택에 의해, 예를 들어, 면역자기 음성 선택에 의해 비-종양 세포를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 설명된 바와 같은 본 발명은 또한 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 제공하기 위한 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 쉐딩된 종양 세포의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위해 T 세포 집단을 선택적으로 확장시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계;
(c) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 획득된 서열 정보를 사용하여 종양으로부터 클론 신생항원을 확인하는 단계;
(e) 상기 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계; 및
(f) 단계 (d)에서 확인된 클론 신생항원을 포함하는 펩티드 및 항원 제시 세포와 TIL을 공동-배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 쉐딩되거나 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계, 및 바람직하게는 상기 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법을 제공한다.
일 양태에서, 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포로부터 추출된 종양 핵산은 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산과 조합될 수 있다. 일 양태에서, 조합된 추출된 핵산이 시퀀싱될 수 있다.
도 1 - 이종 세포 현탁액 내에서 종양 세포를 확인하기 위한 게이팅 전략. 공지된 오염 세포(백혈구, 내피 세포 및 섬유모세포)의 순차적 배제에 기반함.
도 2 - 효소적으로 해리된 종양 단편은 낮은 종양 세포 수율을 갖는다. A. 효소적 해리에 의해 획득된 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었다. B. 각각의 샘플에 대한 종양 세포의 추정된 수율은 종양 세포 빈도를 세포 현탁액에서 획득된 세포의 총 수로 곱함으로써 계산되었다. 종양 세포 수율은 처리를 위해 수용된 전형적인 종양 단편의 크기(0.1 그램)로 표준화되었다. 점선은 1백만 개의 세포 역치를 강조 표시한다. 혈구계 및 트립판 블루 염색을 사용하여 생존 세포 계수가 수행되었다. 각각의 그룹의 평균은 기하 평균으로 표시된다. N=5-8/그룹.
도 3 - 수송 배지는 많은 수의 종양 세포를 함유한다. A. 수송 배지로부터 획득된 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었다. B. 각각의 샘플에 대한 종양 세포의 추정된 수율은 종양 세포 빈도를 세포 현탁액에서 획득된 세포의 총 수로 곱함으로써 계산되었다. 추정된 종양 세포 수율은 절제되고 배지에 담지된 각각의 총 종양 중량으로 표준화되었다. 점선은 1백만 개의 세포 역치를 강조 표시한다. C. 혈구계 및 트립판 블루 염색을 사용하여 생존 세포 계수가 수행되었다. 데이터는 세포 현탁액에서 생존 세포의 백분율로 제시된다. 각각의 그룹의 평균은 기하 평균으로 표시된다. N=4/그룹.
도 4 - 수송 배지로 쉐딩된 종양 세포 수. A. 각각의 샘플에 대한 종양 세포의 추정된 수율은 종양 세포 빈도를 세포 현탁액에서 획득된 세포의 총 수로 곱함으로써 계산되었다. 추정된 종양 세포 수율은 절제되고 배지에 담지된 각각의 총 종양 중량으로 표준화되었다. 점선은 1백만 개의 세포 역치를 강조 표시한다. B. 혈구계 및 트립판 블루 염색을 사용하여 생존 세포 계수가 수행되었다. 데이터는 세포 현탁액에서 생존 세포의 백분율로 제시된다. N=4/그룹.
도 5 - TM 및 CM 종양 세포 파라미터는 종양 유형과 무관하게 유사하다. A. 수송 배지(TM) 및 절단 배지(CM)로부터 획득된 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었다. B. 각각의 샘플에 대한 종양 세포의 추정된 수율은 종양 세포 빈도를 세포 현탁액에서 획득된 세포의 총 수로 곱함으로써 계산되었다. 추정된 종양 세포 수율은 절제되고 배지에 담지된 각각의 총 종양 중량으로 표준화되었다. 점선은 1백만 개의 세포 역치를 강조 표시한다.
도 6 - TM 및 CM을 푸울링(pooling)시키는 것은 상이한 종양 유형에 걸쳐 보다 일관된 세포 수를 제공한다. A. 수송 배지 및 절단 배지로부터 획득된 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었다. B. 각각의 샘플에 대한 종양 세포의 추정된 수율은 종양 세포 빈도를 세포 현탁액에서 획득된 세포의 총 수로 곱함으로써 계산되었다. 추정된 종양 세포 수율은 절제되고 배지에 담지된 각각의 총 종양 중량으로 표준화되었다. 점선은 1백만 개의 세포 역치를 강조 표시한다.
도 7 - 효소적 또는 기계적 해리로부터 획득된 종양 세포 현탁액은 비종양 기원의 세포에 의해 침윤된다. 가장 흔한 유핵화된 오염 세포(백혈구, 내피 세포 및 섬유모세포)에 대한 세포 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었고, 데이터는 단일한 살아있는 세포에서 오염 세포의 백분율로 제시된다. ED - 효소적 해리; MD - 기계적 해리(TM+CM); N = 5-12/그룹.
도 8 - 저 빈도 종양 세포 현탁액은 면역자기 음성 선택에 의해 성공적으로 농축될 수 있다. A. 비정제 또는 정제된 분획에서 종양 세포 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었고, 데이터는 단일한 살아있는 세포에서 종양 세포의 백분율로 제시된다. 수송 배지로부터 획득된 세포 현탁액에서의 빈도는 흐름세포측정법에 의해 추정되었다. B. 각각의 샘플에 대한 종양 세포의 추정된 수율은 종양 세포 빈도를 세포 현탁액에서 획득된 세포의 총 수로 곱함으로써 계산되었다. 추정된 종양 세포 수율은 절제되고 배지에 담지된 각각의 총 종양 중량으로 표준화되었다. 점선은 1백만 개의 세포 역치를 강조 표시한다. C. 시험된 정제 전략 각각에 대한 회수율은 다음과 같이 계산되었다: 회수 [%] = 100 × ([농축 분획의 세포 수] × [농축 분획의 종양 세포 빈도]) / ([원래 분획의 세포 수] × [원래 분획의 종양 세포 빈도]). D. 혈구계 및 트립판 블루 염색을 사용하여 비정제 또는 정제된 분획에서 생존 세포 수가 획득되었다. 데이터는 샘플에서 생존 세포의 백분율로 제시된다. N = 15-25/그룹.
도 9 - 전체 엑솜 시퀀싱으로부터의 직교 검증은 NSCLC 및 흑색종 샘플에서 종양 세포의 성공적인 농축을 예시한다. 비정제 및 정제된 샘플에서 종양 세포 빈도는 NSCLC 환자 "환자 1"(A) 및 흑색종 환자 "환자 2"(B)에 대해 ASCAT에 의해 계산적으로 추정되었다. 플롯은 정제된 샘플에서 종양 세포 함량의 증가를 제시한다. 환자 "환자 1"(C) 및 "환자 2"(D)로부터의 비정제 및 정제된 샘플에서 확인된 체세포 돌연변이에 대한 변이체 대립유전자 빈도는 매칭된 다중-영역 데이터세트에서 이들의 유병률에 따라 그룹화되었다. 빈도는 비정제된 샘플과 비교하여 정제된 샘플에서 더 높은 것으로 나타났고, 편재성/클론 및 공유 돌연변이의 빈도는 개인 돌연변이의 빈도보다 높으며, 이는 원발성 종양에서 돌연변이를 보유하는 세포의 가능성 있는 풍부함을 반영한다.
도 10 - 일차 다중-영역 데이터세트에서 확인되고 이후에 매칭된 TM 및 CM 샘플에서 검출된 클론 돌연변이의 양성 퍼센트 일치. 신선한 동결된 다중-영역 전체 엑솜 데이터세트에서 편재성 또는 클론으로 분류되고, 환자 (A) + (C) "환자 1"(n = 41) 및 (B) + (D) "환자 2"에 대한 비정제 및 정제된 샘플에서 검출된 돌연변이의 백분율.
도 11 - 일차 다중-영역 데이터세트에서 확인되고 이후에 매칭된 TM 샘플에서 검출된 돌연변이의 양성 퍼센트 일치. 신선한 동결된 다중-영역 전체 엑솜 데이터세트에서 편재성(또는 클론), 공유 및 개인으로 분류되고, 정제된 TM에서 검출된 돌연변이의 백분율.
도 12 - 일차 다중-영역 데이터세트에서 확인되고 이후에 매칭된 CM 샘플에서 검출된 돌연변이의 양성 퍼센트 일치. 신선한 동결된 다중-영역 전체 엑솜 데이터세트에서 편재성(또는 클론), 공유 및 개인으로 분류되고, 정제된 CM에서 검출된 돌연변이의 백분율.
도 13 - 일차 다중-영역 데이터세트에서 확인되고 이후에 두경부 편평 암종으로부터 획득된 매칭된 TM 샘플에서 검출된 돌연변이의 양성 퍼센트 일치. 신선한 동결된 다중-영역 전체 엑솜 데이터세트에서 편재성(또는 클론), 공유 및 개인으로 분류되고, 정제된 TM에서 검출된 돌연변이의 백분율.
도 14 - 일차 다중-영역 데이터세트에서 확인되고 이후에 두경부 편평 암종으로부터 획득된 매칭된 CM 샘플에서 검출된 돌연변이의 양성 퍼센트 일치. 신선한 동결된 다중-영역 전체 엑솜 데이터세트에서 편재성(또는 클론), 공유 및 개인으로 분류되고, 정제된 CM에서 검출된 돌연변이의 백분율.
본원에 설명된 바와 같이, 본 발명은 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계 및 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱에 적합한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 고형 종양으로부터 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은,
(i) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계; 및
(ii) 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
용어 "쉐딩된(shed)"은 종양으로부터 분리된 종양 세포를 설명하기 위한 것이다. 이와 같이, 쉐딩된 종양 세포는 배지에 유리되어 있고 고형 종양 샘플에 물리적으로 직접 연결되어 있지 않다. 용어 "쉐딩된"은 배지 내로 수동적으로 쉐딩되는, 즉, 고형 종양 샘플로부터 능동적으로 해리되지 않은 종양 세포를 설명하기 위한 것이다. 이들 종양 세포는 전형적으로 고형 종양 샘플의 외부 표면으로부터 배지로 쉐딩될 것이다.
쉐딩된 종양 세포는 배지에서 보유 기간 동안 종양 샘플로부터 수동적으로 분리될 수 있다.
일 양태에서, 배지는 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 직접 쉐딩된 종양 세포를 함유한다.
일 양태에서, 종양 샘플은 일정 기간 동안 본원에 설명된 바와 같은 배지에 보유될 수 있고, 쉐딩된 종양 세포는 이 기간 동안 종양 샘플로부터 해리되는 것들이다.
쉐딩된 종양 세포는 원발성 종양으로부터 생체 내 혈액으로 방출되는 순환 종양 세포와 구별된다. 본 발명의 방법에서 이용되는 쉐딩된 종양 세포는 시험관 내 또는 생체 외에서 상기 배지에서 종양 샘플의 보유 동안 종양 샘플로부터 배지로 직접 쉐딩된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외 방법이다.
본 발명의 일 양태에서, 종양 샘플은 핵산의 추출 전에 시험관 내 또는 생체 외에서 배양되지 않는다.
일 양태에서, 종양 샘플은 체외이식편 배양물이 아니다. 일 양태에서, 쉐딩된 세포는 종양 체외이식편의 시험관 내 또는 생체 외 배양 동안 쉐딩되지 않는다. 일 양태에서, 종양 샘플은 시험관 내 또는 생체 외 배양된 종양 세포가 아니다. 일 양태에서, 쉐딩된 세포는 종양 세포의 시험관 내 또는 생체 외 배양 동안 쉐딩되지 않는다.
일 양태에서, 쉐딩된 세포는 배양 배지, 즉, 세포 또는 종양 체외이식편이 배양된 배지(예를 들어, 배양 용기 중의 상층액 배지)로부터 수집되거나 분리되지 않는다. 일 양태에서, 세포는 배양 용기로부터 수집되거나 분리되지 않는다.
일 양태에서, 고형 종양 샘플 자체는 핵산을 추출하는데 사용되지 않는다. 즉, 핵산은 온전한 고형 종양 샘플로부터 추출되지 않는다. 일 양태에서, 고형 종양 샘플은 시퀀싱을 위해 핵산을 추출하는데 사용되지 않는다(이와 같이, 액체 배지 성분만이 핵산 추출을 위해 사용된다).
일 양태에서, 핵산 추출 전에 효소적 또는 다른 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴는 없다.
또 다른 양태에서, 핵산 추출 전에 기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴는 없다. 일 양태에서, 상기 방법은 고형 종양 샘플의 적어도 일부를 기계적으로 파괴하는 단계 및 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하지 않는다. 이와 같이, 핵산은 고형 종양 샘플이 수송 및/또는 보유된 배지로 쉐딩된 종양 세포로부터만 추출된다.
배지
고형 종양 샘플을 수송, 보유 또는 저장하기 위한 임의의 적합한 배지가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 배지는 세포 생존력을 유지하는 임의의 적합한 배지일 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, 배지는 하이포써모솔®(HypoThermosol®) 생물보존 배지(BioLife Solutions)일 수 있다.
다른 적합한 배지는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), 햄(Ham) F10 배지, 햄 F12 배지, 어드밴스드(Advanced) DMEM, 어드밴스드 DMEM/F12, 최소 필수 배지, DMEM/F-12, DMEM/F-15, 리보비츠(Liebovitz) L-15, RPMI 1640, 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지(IMDM), OPTI-MEM SFM(Invitrogen Inc.), N2B27, MEF-CM 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일 양태에서, 배지는 인산염 완충 염수(PBS)일 수 있다.
일 양태에서, 배지는 혈청, 예를 들어, 우태아 혈청을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 배지는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 우태아 혈청을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 배지는 항생제 및/또는 살진균제를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 배지는 글루타민 또는 HEPES와 같은 다른 보충물, 또는 세포 생존력을 유지하는데 도움이 되는 임의의 다른 보충물을 포함할 수 있다. 이러한 보충물은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "배지"는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 일 양태에서, 배지는 대상체로부터의 생물학적 샘플이 아니며, 예를 들어, 배지는 혈액 또는 혈액 분획, 예를 들어, 혈청 또는 혈장 또는 말초 혈액 단핵 세포가 아니다. 일 양태에서, 배지는 타액, 림프, 흉막액, 복수, 또는 뇌척수액이 아니다.
본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 방법에 따르면, 고형 종양 샘플은 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계 전에 적어도 약 5분, 10분, 15분, 30분, 60분/1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 6.5시간, 7시간, 7.5시간, 8시간, 8.5시간, 9시간, 9.5시간, 10시간, 10.5시간, 11시간, 11.5시간 또는 12시간 또는 그 초과의 기간 동안 본원에 설명된 바와 같은 배지에 보유될 수 있거나 보유되었을 수 있다.
일 양태에서, 고형 종양 샘플은 적어도 약 1시간의 기간 동안 본원에 설명된 바와 같은 배지에 보유될 수 있거나 보유되었을 수 있다.
고형 종양 샘플은 적어도 약 3.5시간의 기간 동안 본원에 설명된 바와 같은 배지에 보유될 수 있거나 보유되었을 수 있다.
수송 배지는 종양의 외과적 절제 후에 수술실로부터 종양 샘플을 수송하는데 사용될 수 있다.
샘플
본원에서 언급되는 바와 같이, "종양 샘플"은 종양으로부터 유래되거나 획득된 샘플을 지칭한다. 본 발명에 따른 종양은 고형 종양이다.
종양으로부터 생검 및 샘플의 분리는 당 분야에서 통상적인 관행이며 임의의 적합한 방법에 따라 수행될 수 있고, 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
종양 샘플은 원발성 종양 샘플, 종양-관련 림프절 샘플 또는 대상체로부터의 전이성 부위로부터의 샘플일 수 있다.
종양 샘플 및 비-암성 샘플은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 획득될 수 있다. 예를 들어, 고형 종양 샘플은 절제를 겪은 암 환자로부터 획득될 수 있거나, 이들은 피하 바늘, 펀치 생검, 미세박리, 또는 레이저 포획을 사용한 추출에 의해 획득될 수 있다. 필요한 경우 대조군(비-암성) 샘플은, 예를 들어, 종양에 인접한 혈액 샘플 또는 정상 조직으로부터 획득될 수 있다.
기계적 파괴
본 발명의 일 양태에서, 상기 방법은 고형 종양 샘플의 적어도 일부를 기계적으로 파괴하는 단계 및 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
"방출된"은 기계적 파괴 동안 고형 종양 샘플로부터 해리된 세포, 예를 들어, 고형 종양 샘플 내부의 세포를 지칭하는 것으로 의도된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계 및 상기 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 고형 종양으로부터 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은,
(i) 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계; 및
(ii) 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 상기 종양 샘플 또는 상기 방출된 세포는 상기 핵산의 추출 전에 생체 외에서 배양되지 않는다. 일 양태에서, 핵산 추출 전에 효소적 또는 다른 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴는 없다.
본 발명에 따른 방법은,
(a) 고형 종양 샘플로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 배지로부터 방출된 종양 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 방출된 세포는 배양 배지, 즉, 세포 또는 종양 체외이식편이 배양된 배지(예를 들어, 배양 용기 중의 상층액 배지)로부터 수집되거나 분리되지 않는다. 일 양태에서, 세포는 배양 용기로부터 수집되거나 분리되지 않는다.
상기 기계적 파괴는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 종양 샘플의 민싱(mincing) 또는 절개에 의해 수행될 수 있다.
기계적 파괴 동안 종양 세포가 방출되는 배지는 절단 배지(cutting medium)로 지칭될 수 있다. 절단 배지는 종양 샘플의 적어도 일부가 가공되는 배지(예를 들어, 실시예 2 참조), 또는 종양 샘플을 절단하고/하거나, 민스(mince)하고/하거나, 절개하는 데 사용되는 장비를 세척하고/하거나 헹구거나 플러싱하는 데 사용되는 배지일 수 있다.
본 발명에서 적용되는 기계적 파괴는 종양 샘플의 적어도 일부를 작은 조각, 예를 들어, 약 0.5 내지 10 mm3, 약 1 내지 6 mm3 또는 약 1 내지 3 mm3으로 절단할 수 있다. 바람직하게는, 기계적 파괴는 종양 샘플의 적어도 일부를 약 1 내지 3 mm3의 조각으로 절단할 수 있다.
기계적 파괴는 종양 샘플의 적어도 일부를 적어도 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 5, 7 또는 9 mm3의 조각으로 절단할 수 있다.
기계적 파괴는 종양 샘플의 적어도 일부를 적어도 1, 1.5, 2 또는 2.5 mm3의 조각으로 절단할 수 있다.
본 발명의 기계적 파괴 또는 절단은 균질화 단계와 구별되며, 이는 전형적으로 샘플을 본원에 설명된 것보다 더 작은 조각으로 가공하는 것을 포함한다. 예를 들어, 균질화된 샘플은 개별 세포 또는 세포의 작은 클러스터(예를 들어, 1000개 미만의 세포)로 해리된 조직을 함유할 수 있고, 이의 유동 능력에 기반하여 액체 또는 액화 샘플로 지칭될 수 있다.
일 양태에서, 상기 방법은 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 고형 종양 샘플을 효소적으로 파괴하는 단계를 포함하지 않는다.
일 양태에서, 상기 방법은 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 종양 샘플의 적어도 일부를 균질화하는 단계를 포함하지 않는다. 상기 균질화는 기계적 또는 효소적 파괴 단계일 수 있다.
또 다른 양태에서, 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 직접 쉐딩된 종양 세포로부터 추출된 종양 핵산은 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산과 조합될 수 있다. 일 양태에서, 조합된 추출된 핵산이 시퀀싱될 수 있다.
세포 분리 및 핵산 추출
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 배지로부터 본원에 설명된 바와 같은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 배지로부터 분리될 수 있다. 예로서, 세포는 본 발명의 실시예에 설명된 바와 같은 여과 및/또는 원심분리를 사용하여 분리될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
본원에 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 핵산은 DNA 및/또는 RNA일 수 있다.
다운스트림 시퀀싱에 적합한 DNA 및/또는 RNA와 같은 핵산은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 샘플로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, DNA 및/또는 RNA 분리는 페놀-기반 추출을 사용하여 수행될 수 있다. 페놀-기반 시약은 세포 및 조직 파괴 및 오염물로부터 DNA 또는 RNA의 후속 분리를 위한 변성제 및 RNase 억제제의 조합물을 함유한다. 예를 들어, DNAzol™, TRIZOL™ 또는 TRI REAGENT™를 사용하는 것과 같은 추출 절차가 사용될 수 있다. DNA 및/또는 RNA는 PureLink™ Genomic DNA Mini Kit 또는 QIAGEN RNeasy™ 방법과 같은 고체상 추출 방법(예를 들어, 스핀 컬럼)을 사용하여 추가로 분리될 수 있다. 분리된 RNA는 당 분야에 공지된 방법(RT-PCR)을 사용하여 다운스트림 시퀀싱을 위해 cDNA로 전환될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은,
(a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 배지로부터 쉐딩된 종양 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은,
(a) 본원에 설명된 바와 같은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 배지로부터 종양 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 적어도 약 0.25×105, 0.5×105, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 5×106, 10×106, 15×106, 20×106, 25×106, 30×106, 35×106, 40×106, 45×106 또는 50×106개의 세포이다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 약 0.25×105, 0.5×105, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 5×106, 10×106, 15×106, 20×106, 25×106, 30×106, 35×106, 40×106, 45×106 또는 50×106개 초과의 세포이다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 종양 샘플의 그램 당 약 10×106 내지 140×106개 세포이다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 적어도 약 1×106이다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 약 1×106 초과이다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 적어도 약 1×105이다.
일 양태에서, 배지로부터 분리된 종양 세포의 수는 약 1×105 초과이다.
정제
고형 종양은 이종 림프구 하위집단, 섬유모세포, 및 내피 세포를 포함하는 비-종양 기원의 유핵 세포에 의해 침윤된다. 침윤 세포의 양 및 조성은 매우 가변적이고 환자 의존적이며, 이는 종양 샘플의 분석을 어렵게 만든다. 또한, 오염 세포의 존재는 시퀀싱 동안 관련 없는 신호의 측정에 의해 야기된 민감도의 감소를 초래하며, 일부 경우에 클론 신생항원 확인에 상당한 위험을 초래한다. 본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 이러한 원치 않는 세포의 고갈은 더 높은 종양 세포 빈도로 샘플의 순도를 개선시켜, 뉴클레오티드 시퀀싱 동안 신호-대-잡음 비율을 증가시킨다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 음성 선택에 의해 비-종양 세포를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 음성 선택은 CD45+ 세포, 적혈구, 혈소판, 과립구, 이종 림프구 집단, 섬유모세포, 내피 세포 및/또는 조혈 세포의 고갈을 포함할 수 있다.
상기 음성 선택은 면역자기 음성 선택에 의해 수행될 수 있다.
면역자기 분리는 표적 세포 상의 항원에 특이적인 항체로 코팅된 작은 자화된 입자 또는 비드의 부착을 통해 생체분자의 특이적 포획을 통해 배지로부터 세포를 효율적으로 분리할 수 있는 실험실 도구이다.
면역자기 분리는 전형적으로 생물학적 거대분자, 예를 들어, 특정 항체를 초상자성 산화철(Fe3O4) 입자에 커플링시키는 것을 포함한다.
초상자성 입자는 자기장 내에 배치될 때 자기 특성을 나타내지만 자기장으로부터 제거될 때 잔류 자기를 갖지 않는다. 이 기술은 비드 전체에 걸쳐 자성 Fe3O4의 균일한 분산과 함께 직경이 대략 2-5 μm인 균일한 다공성 폴리스티렌 구체를 만들기 위해 통합되었다. 이러한 자성 비드는 자성 물질을 둘러싸고 항체와 같은 분자의 커플링의 흡착을 위해 정의된 화학적 표면적을 제공하는 얇은 폴리스티렌 쉘로 코팅된다.
자성 입자는 불균일한 현탁액에 첨가되어 원하는 표적(본 발명에 따른 비-종양 세포)에 결합하고 자성 입자 및 표적으로 구성된 복합체를 형성한다. 표적과 복합체화된 자성 입자를 용기 벽에 고정시키기 위해 자석이 사용되고, 나머지 물질이 제거된다. 입자-표적 복합체가 보유되는 동안 세척 단계가 용이하게 수행된다.
일 양태에서, 제조업체의 설명서에 따라 상업적으로 이용 가능한 키트, 예를 들어, EasySep Direct Human CD45 고갈 키트(StemCell #17898), EasySep Direct Human PBMC 분리 키트(StemCell # 19654), Tumour Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec # 130-108-339) 및/또는 EasySep Direct Human Circulating Tumour Cell (CTC) Enrichment Kit(StemCell #19657) 중 하나 이상이 음성 선택에 사용될 수 있다.
일 양태에서, 음성 선택은 단핵 세포 분리의 제1 단계(예를 들어, PBMC 분리 키트 사용), 및 CD45+ 세포 고갈의 제2 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 단계 1에서 적혈구, 과립구 및 혈소판 및 단계 2에서 조혈 세포를 고갈시킬 것이다.
일 양태에서, EasySep Direct Human PBMC 분리 키트(StemCell # 19654)는 적혈구, 혈소판 및 과립구를 고갈시키기 위해 사용될 수 있고, 이어서 EasySep Direct Human CD45 고갈 키트(StemCell #17898)는 조혈 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
추가 양태에서, Tumour Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec # 130-108-339)는 적혈구, 이종 림프구 집단, 섬유모세포 및 내피 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
추가 양태에서, EasySep Direct Human Circulating Tumour Cell (CTC) Enrichment Kit(StemCell #19657)는 적혈구, 혈소판 및 조혈 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
이러한 키트는 세포 분리를 위해 자성 비드를 사용한다. 예를 들어, StemCell 키트는 EasySep Direct RapidSpheres(PBMC Isolation 및 CTC Enrichment 키트) 또는 EasySep Dextran RapidSpheres(CD45 고갈)를 사용할 수 있다. Miltenyi 키트는 MACS MicroBeads를 사용한다.
대안적 양태에서, 상기 음성 선택은 세포 부착-기반 분리, 또는 세포 밀도 또는 크기-기반 분리(예를 들어, 밀도 구배 원심분리 또는 여과에 의함)를 사용하여 수행될 수 있다.
추가 대안에서, 오염 세포는 표지될 수 있고, 형광색소 활성화된 세포 분류는 음성의 표지되지 않은 분획(종양 세포)을 보유하면서 이러한 세포를 제거하는데 사용될 수 있다.
세포는 공지된 오염 세포에 대한 인간 계통 마커, 예를 들어, CD45(클론 HI30, Biolegend #368528), CD31(클론 WM59, Biolegend #303122), CD235a(클론 REA175, Miltenyi Biotec #130-120-474) 및/또는 항-섬유모세포 마커(클론 REA165, Miltenyi Biotec 130-100-136)를 사용하여 흐름세포측정법에 의해 평가될 수 있다. 일 양태에서, 종양 세포 유형에 따라 상이한 종양 세포 유형에 대한 마커, 예를 들어, 비소세포폐암 CD326(클론 9C4, Biolegend #324212) 또는 흑색종 종양 세포 MCSP(클론 9.2.27, BD #562414) + MART-1(클론 EP1422Y, Abcam, #ab51061) + MCAM(클론 EPR3208, Abcam #ab75769)이 또한 평가될 수 있다.
시퀀싱
본원에 설명된 바와 같이, 본 발명은 시퀀싱에 적합한 핵산을 제공한다.
이와 같이, 본 발명의 일 양태에서, 핵산은 시퀀싱될 수 있다.
하기 상세히 논의되는 바와 같이, 종양 서열 정보는, 예를 들어, 신생항원을 확인하는데 사용될 수 있다. 신생항원의 종양 시퀀싱 및 확인은 다양한 이유로 유용하며, 예를 들어, 신생항원 확인은 암 환자에 대한 예후, 진단 및 치료적 가치를 갖는다. 신생항원 확인은 암 환자의 치료 계획을 설계하고 개선하는데 가치가 있을 수 있다.
일 양태에서, 신생항원의 확인은 암 요법의 설계 및 생산을 용이하게 할 수 있다.
예를 들어, 신생항원은 본원에 상세히 설명된 바와 같은 T 세포 요법과 같은 세포 요법을 설계하는데 사용될 수 있다. 또한, 신생항원은 백신화 요법, 예를 들어, 종양 신생항원에 대한 백신접종에 기초한 요법을 위한 펩티드의 생성에 사용될 수 있다.
또한, 신생항원은 T 세포와 같은 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신생항원이 로딩된 MHC 복합체는 T 세포 수용체가 시퀀싱될 수 있는 T 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 따라서, 신생항원 확인은 세포를 확장하거나, 특정 TCR을 분리하거나, 백신을 생성하는데 사용될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같은 시퀀싱은 당 분야에 공지된 임의의 표준 방법, 예를 들어, 차세대 시퀀싱(NGS), 전체 유전체 시퀀싱, RNA 시퀀싱 또는 전체-엑솜 시퀀싱(WES)에 의해 수행될 수 있다.
클론 신생항원 확인
본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 일 양태에서, 핵산의 서열은 종양으로부터 클론 신생항원을 확인하는데 사용된다. 본 발명의 실시예는 본 발명이 클론 신생항원의 확인에 적합한 서열 정보를 제공할 수 있음을 입증한다.
"신생항원"은 암 세포 내의 돌연변이의 결과로서 발생하는 종양-특이적 항원이다. 따라서, 신생항원은 대상체의 건강한 세포에 의해 발현되지 않는다.
신생항원은 야생형의 건강한 세포에 의해 발현되는 돌연변이되지 않은 단백질과 비교하여 암 세포에 의해 발현되는 단백질을 변경하는 임의의 비-침묵 돌연변이에 의해 야기될 수 있다.
"돌연변이"는 동일한 개체로부터의 건강한 세포와 비교하여 종양 세포에서 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 차이를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열의 차이는 동일한 개체로부터의 건강한 세포에 의해 발현되지 않는 단백질의 발현을 초래할 수 있다.
예를 들어, 돌연변이는 아미노산 서열의 변화(코딩 돌연변이)를 야기하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV), 다중 뉴클레오티드 변이체(MNV), 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 삽입결실 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 전위, 미스센스 돌연변이 또는 스플라이스 부위 돌연변이일 수 있다.
돌연변이는 엑솜 시퀀싱, RNA-seq, 전체 유전체 시퀀싱 및/또는 표적화된 유전자 패널 시퀀싱 및/또는 단일 유전자의 일상적인 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다. 적합한 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
엑솜 시퀀싱 및 RNA-seq의 설명은 각각 문헌[Boa et al. (Cancer Informatics. 2014;13(Suppl 2):67-82.) 및 Ares et al. (Cold Spring Harb Protoc. 2014 Nov 3;2014(11):1139-48)]에 의해 제공된다. 표적화된 유전자 패널 시퀀싱의 설명은, 예를 들어, 문헌[Kammermeier et al. (J Med Genet. 2014 Nov; 51(11):748-55) 및 Yap KL et al. (Clin Cancer Res. 2014. 20:6605)]에서 발견될 수 있다. 또한, 문헌[Meyerson et al., Nat. Rev. Genetics, 2010 및 Mardis, Annu Rev Anal Chem, 2013]을 참조한다. 표적화된 유전자 시퀀싱 패널이 또한 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, Biocompare(http://www.biocompare.com/ Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)에 의해 요약된 바와 같음).
비-종양 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA와 비교하여 종양 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA에서 뉴클레오티드 차이(예를 들어, SNV)를 확인하기 위한 서열 정렬은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 참조 샘플과 비교하여 뉴클레오티드 차이는 문헌[Koboldt et al. (Genome Res. 2012; 22: 568-576)]에 의해 설명된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 참조 샘플은 점라인 DNA 및/또는 RNA 서열일 수 있다.
일 양태에서, 신생항원은 클론 신생항원일 수 있다.
"클론" 신생항원은 클론 돌연변이로부터 발생하는 신생항원이다. 클론 돌연변이는 종양형성 초기에 발생하고 본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩되는 돌연변이이다. "서브클로날" 신생항원은 서브클로날 돌연변이, 즉, 종양형성의 후기에 특정 종양 세포에서 발생하고 그 세포의 후손인 세포에서만 발견되는 돌연변이로부터 발생하는 신생항원이다.
이와 같이, 클론 신생항원은 종양 전체에 걸쳐 효과적으로 발현되는 신생항원이다. 서브클로날 신생항원은 종양 내의 세포 또는 영역의 서브셋 또는 비율에서 발현되는 신생항원이다. '종양 전체에 걸쳐 효과적으로 발현됨'은 클론 신생항원이 샘플이 분석되는 종양의 모든 영역에서 발현됨을 의미할 수 있다.
돌연변이가 '본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩된다'는 결정은 통계적 계산을 지칭하며, 따라서 통계적 분석 및 역치의 대상이 된다는 것이 이해될 것이다.
마찬가지로, 클론 신생항원이 '종양 전체에 걸쳐 효과적으로 발현된다'는 결정은 통계적 계산을 지칭하며, 따라서 통계적 분석 및 역치의 대상이 된다.
신생항원이 "클론성"인지 여부를 결정하기 위한 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 클론 신생항원을 확인하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
예로서, 돌연변이를 보유하는 암 세포의 비율을 설명하는 암 세포 분획(CCF)은 돌연변이가 클론성인지 서브클론성인지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 분획은 문헌[Landau et al. (Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26)]에 의해 설명된 바와 같이 변이체 대립유전자 빈도를 카피 수 및 순도 추정치와 통합함으로써 결정될 수 있다.
적합하게는, CCF 값은 분석된 각각의 및 모든 종양 영역 내에서 확인된 모든 돌연변이에 대해 계산될 수 있다. 단지 하나의 영역이 사용되는 경우(즉, 단지 단일 샘플), 단지 하나의 세트의 CCF 값이 획득될 것이다. 이는 어떤 돌연변이가 그 종양 영역 내의 모든 종양 세포에 존재하는지에 대한 정보를 제공할 것이고, 이에 의해 돌연변이가 클론성인지 서브클론성인지에 대한 표시를 제공할 것이다.
클론 돌연변이는 암 세포 분획(CCF) ≥ 0.75, 예를 들어, CCF ≥ 0.80, 0.85, 0.90, 0.95 또는 1.0을 갖는 돌연변이로 정의될 수 있다. 서브클로날 돌연변이는 CCF < 0.95, 0.90, 0.85, 0.80 또는 0.75를 갖는 돌연변이로 정의될 수 있다. 일 양태에서, 클론 돌연변이는 CCF ≥ 0.95를 갖는 돌연변이로 정의되고, 서브클로날 돌연변이는 CCF < 0.95를 갖는 돌연변이로 정의된다. 또 다른 양태에서, 클론 돌연변이는 CCF ≥ 0.75를 갖는 돌연변이로 정의되고, 서브클로날 돌연변이는 CCF < 0.75를 갖는 돌연변이로 정의된다.
언급된 바와 같이, 클론 돌연변이의 결정은 통계적 분석 및 역치의 대상이 된다.
일 양태에서, 돌연변이는 95% CCF 신뢰 구간이 >= 0.75인 경우, 즉, CCF의 95% 신뢰 구간의 상한이 0.75 이상인 경우 클론 돌연변이로 정의될 수 있다.
또 다른 양태에서, 돌연변이는 이의 암 세포 분획(CCF)이 상기 정의된 바와 같은 요구되는 값, 예를 들어, 0.95에 도달하거나 이를 초과하는 50% 초과의 기회 또는 확률, 예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 기회 또는 확률인 경우에 클론성으로 확인될 수 있다.
확률 값은 백분율 또는 분획으로 표현될 수 있다. 확률은 사후 확률로 정의될 수 있다.
일 양태에서, 돌연변이는 이의 암 세포 분획(CCF)이 ≥ 0.95일 기회가 50% 초과인 경우 클론성인 것으로 확인될 수 있다.
추가 양태에서, 돌연변이는 이들의 CCF가 0.95를 초과하는 사후 확률이 각각 0.5보다 크거나 작은지에 기초하여 클론성 또는 서브클론성으로 분류될 수 있다.
또 다른 양태에서, 돌연변이가 0.75 초과의 암 세포 분획을 가질 확률이 ≥ 0.5인 경우 돌연변이는 클론성인 것으로 확인될 수 있다.
일 양태에서, 클론 신생항원은 종양 전체에 편재하는 신생항원이다. 일 양태에서, 클론 신생항원은 종양의 다중 영역, 예를 들어, 종양의 1개 초과의 영역, 예를 들어, 종양의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 영역에 존재할 수 있다. 클론 신생항원은 다중-영역 샘플 세트에 존재할 수 있다. 일 양태에서, 클론 신생항원은 샘플링된 종양의 모든 영역에서 확인될 수 있으며, 즉, 이는 종양에 편재한다.
상기 설명된 바와 같이, 클론 신생항원은 본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩되는 것이고, 즉, 신생항원을 인코딩하는 돌연변이는 본질적으로 모든 종양 세포 내에 존재하고 종양 전체에 걸쳐 효과적으로 발현된다. 그러나, 클론 신생항원은 종양의 적어도 일부에서 손실된 HLA 대립유전자에 의해 인코딩된 HLA 분자에 의해 제시되는 것으로 예측될 수 있다. 이 경우, 클론 신생항원은 실제로 본질적으로 모든 종양 세포에 제시되지 않을 수 있다. 이와 같이, 신생항원의 제시는 클론성이 아닐 수 있으며, 즉, 이는 본질적으로 모든 종양 세포 내에 제시되지 않는다. HLA의 손실을 예측하는 방법은 국제 특허 공개 번호 WO2019/012296호에 설명되어 있다.
본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 일 양태에서, 신생항원은 본질적으로 모든 종양 세포 내에 제시되는 것으로 예측된다(즉, 신생항원의 제시는 클론성이다).
신생항원-특이적 T 세포 요법
본원에서 논의되는 바와 같이, 신생항원은 암 치료에서 T 세포 요법의 표적일 수 있다. 클론 신생항원과 같은 신생항원은 본원에 설명된 방법에 따라 확인될 수 있다.
일 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 T 세포 요법은 복수, 즉, 하나 초과의 클론 신생항원을 표적화하는 T 세포를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 클론 신생항원의 수는 2-1000개이다. 예를 들어, 클론 신생항원의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개일 수 있고, 예를 들어, 클론 신생항원의 수는 2 내지 100개일 수 있다.
일 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 T 세포 요법은 복수 또는 집단, 즉, 하나 초과의 T 세포를 포함할 수 있고, 여기서 복수의 T 세포는 클론 신생항원을 인식하는 T 세포 및 상이한 클론 신생항원을 인식하는 T 세포를 포함한다. 이와 같이, T 세포 요법은 상이한 클론 신생항원을 인식하는 복수의 T 세포를 포함한다.
일 양태에서, 복수의 T 세포에 의해 인식되는 클론 신생항원의 수는 2-1000개이다. 예를 들어, 인식되는 클론 신생항원의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개일 수 있고, 예를 들어, 인식되는 클론 신생항원의 수는 2 내지 100개일 수 있다.
일 양태에서, 복수의 T 세포는 동일한 클론 신생항원을 인식한다.
일 양태에서, 신생항원은 본원에 설명된 바와 같은 서브클로날 신생항원일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 방법은 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. TIL은 신생항원-특이적 T 세포의 집단을 생산하기 위해 선택적으로 확장될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 T 세포 집단을 선택적으로 확장시키기 위한 방법을 제공하며, 여기서 T 세포 집단은 신생항원, 예를 들어, 클론 신생항원에 특이적인 T 세포를 포함한다. 선택적 확장 동안, 하나 이상의 신생항원에 반응하는 T 세포는 신생항원(들)에 반응하지 않는 시작 물질의 다른 T 세포보다 우선적으로 확장된다.
일 양태에서, 상기 방법은,
(a) 본원에 설명된 바와 같은 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 본원에 설명된 바와 같은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계;
(c) 본원에 설명된 바와 같은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 획득된 서열 정보를 사용하여 종양으로부터 신생항원을 확인하는 단계;
(e) 상기 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계; 및
(f) 단계 (d)에서 확인된 신생항원을 제시하는 항원 제시 세포와 TIL을 공동-배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 또한 상기 확장된 T 세포 집단을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은,
(a) 본원에 설명된 바와 같은 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 본원에 설명된 바와 같은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계;
(c) 본원에 설명된 바와 같은 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 획득된 서열 정보를 사용하여 종양으로부터 신생항원을 확인하는 단계;
(e) 상기 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계;
(f) 단계 (d)에서 확인된 신생항원을 제시하는 항원 제시 세포와 TIL을 공동-배양하는 단계; 및
(g) 상기 대상체에게 상기 TIL을 투여하는 단계를 포함한다.
항원-제시 세포(APC)는 인공 또는 조사된 APC일 수 있다. 일 양태에서, APC는 수지상 세포이다. 수지상 세포는 환자의 혈액으로부터 획득된 단핵구로부터 유래될 수 있으며, 이는 본원에서 단핵구-유래 수지상 세포(MoDC)로 지칭된다.
대안적 양태에서, 상기 방법의 단계 (f)는 신생항원 펩티드가 로딩된 인공 MHC 복합체로 수행될 수 있다. 공동-배양 단계는 당 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법, 예를 들어, 항원 제시 세포와 동일한 세포 확장을 초래하는 인공 제시 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 양태에서, APC는 관련 신생항원(들)을 제시하는 펩티드로 펄스화될 수 있다. APC는 단일 자극제로서 또는 자극 신생항원 또는 펩티드의 푸울(pool)로서 확인된 돌연변이를 함유하는 펩티드로 펄스화될 수 있다. 대안적으로, APC는, 예를 들어, APC를 신생항원 서열(들)을 인코딩하는 mRNA로 형질감염시킴으로써 신생항원 서열(들)을 발현하도록 변형될 수 있다.
T 세포는 당 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD3, CD4 또는 CD8의 발현에 기초하여 샘플로부터 생성된 단일 세포 현탁액으로부터 정제될 수 있다. T 세포는 Ficoll-paque 구배를 통해 통과시킴으로써 샘플로부터 농축될 수 있다.
T 세포의 확장은 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 T 세포에 분열촉진 자극을 제공하는 것으로 공지된 조건에서 생체 외 배양에 의해 확장될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 IL-2와 같은 사이토카인 또는 항-CD3 및/또는 CD28과 같은 분열촉진 항체와 함께 배양될 수 있다.
상기 확장을 위한 다른 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO2019/094642호는 신생항원에 반응하여 T 세포의 확장을 위한 다수의 프로토콜을 설명한다.
확장된 T 세포 집단은 하나 이상의 신생항원을 표적화하는 증가된 수의 T 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 T 세포 집단은 대상체로부터 분리된 샘플 내의 T 세포와 비교하여 신생항원을 표적화하는 증가된 수의 T 세포를 가질 것이다. 즉, T 세포 집단은 신생항원을 표적으로 하는 T 세포의 백분율 또는 비율이 증가할 것이라는 점에서 "고유" T 세포 집단(즉, 본원에서 논의된 확인 및 확장 단계를 거치지 않은 집단)과 상이할 것이며, 신생항원을 표적화하지 않는 T 세포에 대한 신생항원을 표적화하는 집단의 T 세포의 비율은 신생항원을 표적으로 하는 T 세포에 유리하게 더 높을 것이다.
본 발명에 따른 T 세포 집단은 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%의 신생항원을 표적으로 하는 T 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, T 세포 집단은 약 0.2%-5%, 5%-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50 %, 50-70% 또는 70-100%의 신생항원을 표적으로 하는 T 세포를 가질 수 있다. 일 양태에서, T 세포 집단은 적어도 약 1, 2, 3, 4 또는 5%의 신생항원을 표적으로 하는 T 세포, 예를 들어, 적어도 약 2% 또는 적어도 2%의 신생항원을 표적으로 하는 T 세포를 갖는다.
대안적으로, T 세포 집단은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8% 이하의 신생항원을 표적으로 하지 않는 T 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, T 세포 집단은 약 95%-99.8%, 90%-95%, 80-90%, 70-80%, 60-70%, 50-60%, 30-50% 또는 0-30% 이하의 신생항원을 표적으로 하지 않는 T 세포를 가질 수 있다. 일 양태에서, T 세포 집단은 약 99, 98, 97, 96 또는 95% 이하의 신생항원을 표적으로 하지 않는 T 세포, 예를 들어, 약 98% 또는 95% 이하의 신생항원을 표적으로 하지 않는 T 세포를 갖는다.
신생항원-반응성 T 세포의 확장된 집단은, 예를 들어, 신생항원 펩티드를 사용하여 확장되지 않은 T 세포의 집단보다 더 높은 활성을 가질 수 있다. "활성"에 대한 언급은 신생항원 펩티드, 예를 들어, 확장에 사용된 펩티드에 상응하는 펩티드, 또는 신생항원 펩티드의 혼합물을 사용한 재자극에 대한 T 세포 집단의 반응을 나타낼 수 있다. 반응을 검정하기 위한 적합한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 사이토카인 생산이 측정될 수 있다(예를 들어, IL2 또는 IFNγ 생산이 측정될 수 있다). "더 높은 활성"에 대한 언급은, 예를 들어, 활성의 1-5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-500, 500-1000배 증가를 포함한다. 일 양태에서, 활성은 1000배 초과로 더 높을 수 있다.
T 세포 집단은 CD8+ T 세포로 모두 또는 주로 구성되거나, CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 혼합물로 모두 또는 주로 구성되거나, CD4+ T 세포로 모두 또는 주로 구성될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 집단은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내, 예를 들어, 동소 치료(in situ treatment) 또는 생체 외 치료 후 치료된 세포를 신체에 투여하기 위해 사용될 수 있다.
확장된 T 세포 집단은 대상체에 재주입될 수 있다. T 세포를 생성, 선택, 확장 및 재주입하기 위한 적합한 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
확장된 T 세포 집단은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 요법은 주치의 및 임상 요인에 의해 결정될 수 있다. 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 요인에 좌우된다는 것이 당 분야에서 인정된다.
확장된 T 세포 집단 용량은 본원에 설명된 바와 같은 제공된 수의 T 세포를 환자에게 전달하는 것을 포함할 수 있다. T 세포의 치료적 유효량은 적어도 약 103개의 세포, 적어도 약 104개의 세포, 적어도 약 105개의 세포, 적어도 약 106개의 세포, 적어도 약 107개의 세포, 적어도 약 108개의 세포, 적어도 약 109개의 세포, 적어도 약 1010개의 세포, 적어도 약 1011개의 세포, 적어도 약 1012개 또는 적어도 약 1013개의 세포일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법에 의해 획득되거나 획득될 수 있는 확장된 T 세포 집단을 제공한다. 일 양태에서, 확장된 T 세포 집단은 요법에 사용될 수 있다. 일 양태에서, 확장된 T 세포 집단은 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
일 양태에서, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 집단이 제공된다.
추가 양태에서, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제의 제조에서 본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 집단이 제공된다.
추가 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 집단을 생산하는 단계, 및 동일한 확장된 T 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
대상체
본 발명의 바람직한 구현예에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그이지만, 가장 바람직하게는 대상체는 인간이다.
본원에 정의된 "치료"는 치료 전 증상에 비해 치료되는 질병의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 제거하는 것을 지칭한다.
"예방"(또는 예방(prophylaxis))은 질병의 증상의 발병을 지연시키거나 예방하는 것을 지칭한다. 예방은 절대적일 수 있거나(질병이 발생하지 않도록), 일부 개인에게 또는 제한된 시간 동안에만 효과적일 수 있다.
적합하게는, 암은 난소암, 유방암, 자궁내막암, 신장암(신장 세포), 폐암(소세포, 비소세포 및 중피종), 뇌암(신경교종, 성상세포종, 교모세포종), 흑색종, 메르켈 세포 암종, 투명 세포 신세포 암종(ccRCC), 림프종, 소장암(십이지장 및 공장), 백혈병, 췌장암, 간담도 종양, 생식 세포 암, 전립선암, 두경부암, 갑상선암 및 육종일 수 있다.
일 양태에서, 암은 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 신장암, 방광암, 두경부암, 및 유방암으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 암은 NSCLC, 흑색종 및 두경부암으로부터 선택된다.
조합 요법
본원에 설명된 바와 같은 T 세포 요법은 또한 다른 적합한 요법, 예를 들어, 추가의 암 요법과 조합될 수 있다. 특히, 본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 조성물 또는 집단은 면역 체크포인트 개입, 공동-자극 항체, 화학요법 및/또는 방사선요법, 표적화된 요법 또는 모노클로날 항체 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
면역 체크포인트 분자는 억제 및 활성화 분자 둘 모두를 포함하고, 개입은 분자의 어느 하나 또는 둘 모두의 유형에 적용될 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는, 예를 들어, PD-1 억제제, PD-L1 억제제, Lag-3 억제제, Tim-3 억제제, TIGIT 억제제, BTLA 억제제 및 CTLA-4 억제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 공동-자극 항체는 ICOS, CD137, CD27 OX-40 및 GITR을 포함하나 이에 제한되지 않는 면역-조절 수용체를 통해 양성 신호를 전달한다.
면역 세포 활성의 억제를 예방, 감소 또는 최소화하는 적합한 면역 체크포인트 개입의 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 트레멜리무맙 및 이필리무맙을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 화학요법 존재물은 세포에 파괴적인 존재물을 지칭하며, 즉 상기 존재물은 세포의 생존력을 감소시킨다. 화학요법 존재물은 세포독성 약물일 수 있다. 고려되는 화학요법제는 알킬화제, 안트라사이클린, 에포틸론, 니트로소우레아, 에틸렌이민/메틸멜라민, 알킬 설포네이트, 알킬화제, 항대사물질, 피리미딘 유사체, 에피포도필로톡신, 효소, 예를 들어, L-아스파라기나제; 생물학적 반응 개질제, 예를 들어, IFNα, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF; 백금 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴, 안트라센디온, 치환된 요소, 예를 들어, 하이드록시우레아, 메틸하이드라진 유도체, 예를 들어, N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카르바진, 부신피질 억제제, 예를 들어, 미토탄(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티미드; 호르몬 및 길항제, 예를 들어, 부신피질스테로이드 길항제, 예를 들어, 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드; 프로게스틴, 예를 들어, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐, 예를 들어, 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물; 항에스트로겐, 예를 들어, 타목시펜; 안드로겐, 예를 들어, 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물; 항안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 성선자극호르몬-방출 호르몬 유사체 및 류프롤리드; 및 비-스테로이드성 항안드로겐, 예를 들어, 플루타미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
'조합하여'는 본 발명에 따른 T 세포 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 추가 요법의 투여를 지칭할 수 있다.
체크포인트 차단과의 조합에 추가로 또는 대안으로서, 본 발명의 T 세포 조성물은 또한 TALEN 및 Crispr/Cas를 포함하나 이에 제한되지 않는 유전자-편집 기술을 사용하여 면역-체크포인트에 내성이 되도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, US20140120622호 참조). 유전자 편집 기술은 PD-1, Lag-3, Tim-3, TIGIT, BTLA CTLA-4 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포에 의해 발현되는 면역 체크포인트의 발현을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같은 T 세포는 이들 방법 중 임의의 것에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 T 세포는 또한 종양으로의 귀소를 증가시키는 분자를 발현하고/하거나 사이토카인, 가용성 면역-조절 수용체 및/또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 매개체를 종양 미세환경으로 전달하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
조성물
본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 집단은 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 약학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어, 정맥 내 주입에 적합한 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 대상체를 예방 또는 치료하는데 효과적인 임의의 양을 사용하고 임의의 투여 경로에 의해 투여된다. 유효량은 질병 또는 질환의 증상을 유리하게 예방하거나 개선하기에 충분한 조성물의 양을 지칭한다.
정확한 투여량은 치료될 환자를 고려하여 개별 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성제(들)를 제공하거나 대상체에서 요망되는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가 요인은 질병 상태의 중증도, 예를 들어, 간 기능, 암 진행, 및/또는 황반 변성의 중간 또는 진행 단계; 연령; 체중; 성별; 식이, 시간; 투여 빈도; 투여 경로; 약물 조합; 반응 민감도; 면역억제 수준; 및 요법에 대한 내성/반응을 포함한다. 장기 작용 약학적 조성물은, 예를 들어, 특정 조성물의 반감기 및 청소율에 따라 매시간, 매시간 2회, 3 내지 4시간마다, 매일, 매일 2회, 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1회 투여된다.
본 발명의 구현예의 약학적 조성물의 활성제는 바람직하게는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화된다. 본원에서 사용되는 표현 "투여 단위 형태"는 치료될 환자에 적절한 활성제의 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 본 발명의 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것이다. 임의의 활성제에 대해, 치료적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 잠재적으로 마우스, 돼지, 염소, 토끼, 양, 영장류, 원숭이, 개, 낙타, 또는 가치가 높은 동물에서 추정된다. 본원에서 제공되는 세포-기반, 동물, 및 생체 내 모델은 또한 바람직한 농도, 총 투여 범위, 및 투여 경로를 달성하는데 사용된다. 이러한 정보는 인간에서 투여하기 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하는데 사용된다.
치료적 유효 용량은 증상 또는 질환을 개선하거나 질병 또는 질환의 진행을 예방하는 활성제의 양을 지칭한다. 활성제의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차, 예를 들어, ED 50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량) 및 LD 50(집단의 50%에 치사적인 용량)에 의해 결정된다. 독성 대 치료 효과의 용량 비율은 LD 50/ED 50 비율로 표현되는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 갖는 약학적 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간 사용을 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용된다.
요망되는 투여량의 적절한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 바와 같이, 본원에 제공된 약학적 조성물 또는 방법은 예방 또는 치료 목적 및 암-관련 장애 또는 질환의 중증도 및 특성에 따라 인간 및 다른 포유동물에게, 예를 들어, 피부 종양에 대해 국소적으로(예를 들어, 분말, 연고, 크림, 또는 점적제에 의해), 경구, 직장, 점막, 설하, 비경구, 수조 내, 질 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 협측, 설하, 안구, 또는 비강 내 투여된다.
약학적 조성물의 주사는, 예를 들어, 식도, 유방, 뇌, 두경부, 및 전립선 염증에 대해 직접 염증 또는 질병 부위로의 정맥 내, 피하, 근육 내, 복강 내, 또는 안구 내 주사를 포함한다.
액체 투여 형태는, 예를 들어, 정맥 내, 안구, 점막, 약학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭시르이지만, 이에 제한되지 않는다. 적어도 하나의 활성제 이외에, 액체 투여 형태는 잠재적으로 당 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 다른 용매; 가용화제 및 유화제, 예를 들어, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유한다. 비활성 희석제 외에, 안구, 경구, 또는 다른 전신-전달 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 및 현탁제와 같은 애쥬번트를 포함한다.
본원의 약학적 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제, 또는 패치를 포함한다. 활성제는 멸균 조건 하에 약학적으로 허용되는 담체와 혼합된다. 보존제 또는 완충제가 필요할 수 있다. 예를 들어, 안구 또는 피부 투여 경로는 수성 점적, 미스트, 에멀젼 또는 크림으로 달성된다. 투여는 치료적 또는 예방적 형태이다. 본원에서 본 발명의 특정 구현예는 이식 장치, 수술 장치, 또는 개시된 조성물을 함유하는 제품(예를 들어, 거즈 붕대 또는 스트립), 및 이러한 장치 또는 제품을 제조하거나 사용하는 방법을 함유한다. 이러한 장치는 본원의 조성물로 코팅, 함침, 결합 또는 달리 처리될 수 있다.
경피 패치는 눈 및 신체에 활성 성분의 제어된 전달을 제공한다는 추가 이점을 갖는다. 이러한 투여 형태는 화합물을 적절한 매질에 용해시키거나 분배함으로써 제조될 수 있다. 흡수 향상제는 피부를 통한 화합물의 플럭스를 증가시키기 위해 사용된다. 속도는 속도 제어 막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시킴으로써 제어된다.
약학적 조성물의 주사 가능한 제조물, 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제, 습윤제, 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화된다. 멸균 주사용 제조물은 또한, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액으로서, 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액, 현탁액, 또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거 용액, U.S.P., 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이를 위해, 합성 모노-글리세라이드 또는 디-글리세라이드를 포함하는 순한 고정 오일이 사용된다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용된다. 주사용 제형은 사용 전에, 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 조사에 의해, 또는 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질에 용해되거나 분산된 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입함으로써 멸균된다. 피하 또는 종양 내 주사로부터 제제의 흡수를 늦추는 것이 활성제의 효과를 연장시키는 것으로 관찰되었다. 비경구 투여된 활성제의 지연된 흡수는 오일 비히클에 제제를 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다. 주사 가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체에서 제제의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 활성제 대 중합체의 비율 및 사용되는 특정 중합체의 특성에 따라, 활성제 방출 속도는 제어된다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사 가능한 제형은 또한 신체 조직과 상용성인 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 제제를 포획함으로써 제조된다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 환약, 분말, 및 과립을 포함한다. 고체 투여 형태에서, 활성제는 적어도 하나의 비활성의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 예를 들어, 소듐 시트레이트, 디칼슘 포스페이트, 충전제, 및/또는 증량제, 예를 들어, 전분, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및 규산; 결합제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스, 및 아카시아; 보습제, 예를 들어, 글리세롤; 붕해제, 예를 들어, 아가-아가, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카보네이트; 용해 지연제, 예를 들어, 파라핀; 흡수 촉진제, 예를 들어, 4차 암모늄 화합물; 습윤제, 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; 흡수제, 예를 들어, 카올린 및 벤토나이트 점토; 및 윤활제, 예를 들어, 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합된다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 유당 뿐만 아니라 고분자량 PEG 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환약, 및 과립의 고체 투여 형태는 코팅 및 쉘, 예를 들어, 장용 코팅, 방출 제어 코팅, 및 약학적 제형화 분야에 공지된 다른 코팅으로 제조된다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성제(들)는 수크로스 또는 전분과 같은 적어도 하나의 비활성 희석제와 혼합된다. 이러한 투여 형태는 또한, 표준 관행과 같이, 비활성 희석제 이외의 추가 물질, 예를 들어, 정제화 윤활제 및 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정질 셀룰로스와 같은 다른 정제화 보조제를 포함한다. 캡슐, 정제 및 환약의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 조성물은 선택적으로, 바람직하게는 장관의 특정 부분에서, 및 선택적으로 지연된 방식으로 활성제(들)만을 방출하는 불투명화제를 함유한다. 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다.
키트
일 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 바와 같은 확장된 T 세포 집단을 포함하는 키트를 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)]은 본 발명의 개시에서 사용되는 다수의 용어의 일반적인 사전을 숙련자에게 제공한다.
본 발명의 개시는 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않으며, 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 개시의 구현예의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 임의의 핵산 서열은 5'에서 3' 배향으로 좌측에서 우측으로 기록되고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 각각 기록된다.
본원에 제공된 표제는 명세서 전체를 참조하여 가질 수 있는 본 발명의 개시의 다양한 양태 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 하기에서 정의되는 용어는 명세서 전체를 참조하여 보다 완전히 정의된다.
아미노산은 아미노산의 명칭, 3-문자 약어 또는 단일 문자 약어를 사용하여 본원에서 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 포함한다.
용어의 다른 정의는 명세서 전체에 걸쳐 나타날 수 있다. 예시적인 구현예를 더 상세히 설명하기 전에, 본 발명의 개시는 설명된 특정 구체예로 제한되지 않으며, 물론, 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 개시의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재 값이 하한 단위의 10분의 1까지 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 임의의 언급된 값 또는 언급된 범위의 개재 값과 해당 언급된 범위의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명의 개시내용 내에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있고, 어느 하나, 둘 모두가 아닌 또는 둘 모두의 한계가 더 작은 범위에 포함되는 각각의 범위가 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 하여 본 발명의 개시 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명의 개시에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하다(comprised of)"는 "포함하는(including)", "포함하다(includes)" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어이며, 포괄적이거나 개방형이며, 추가적인 인용되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하다(comprised of)"는 또한 용어 "~로 구성된"을 포함한다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 그러한 간행물이 본원에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
추가 양태
본 발명은 하기 번호가 매겨진 단락(paras)에 정의된 바와 같은 양태를 추가로 제공한다:
1. 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계 및 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법.
2. 고형 종양으로부터 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법으로서,
(i) 상기 고형 종양의 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계; 및
(ii) 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 방법.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 종양 샘플 또는 상기 쉐딩된 세포가 상기 핵산의 추출 전에 생체 외에서 배양되지 않는 방법.
4. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 추출 전에 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴가 없는 방법.
5. 단락 4에 있어서, 핵산 추출 전에 효소적 또는 다른 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴가 없는 방법.
6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 방법이,
(a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 배지로부터 쉐딩된 종양 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
7. 단락 1 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 배지가 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 직접 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 방법.
8. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 고형 종양 샘플이 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계 전에 적어도 약 5분, 10분, 15분, 30분, 60분/1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 6.5시간, 7시간, 7.5시간, 8시간, 8.5시간, 9시간, 9.5시간, 10시간, 10.5시간, 11시간, 11.5시간 또는 12시간 또는 그 초과의 기간 동안 배지에 보유되는 방법.
9. 단락 1 내지 단락 8 중 어느 한 단락에 있어서, 세포가 고형 종양 샘플의 저장 또는 수송 동안 배지 내로 쉐딩되는 방법.
10. 단락 1 내지 단락 9 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 방법이 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 고형 종양 샘플을 기계적으로 파괴하는 단계를 포함하지 않는 방법.
11. 단락 1 내지 단락 9 중 어느 한 단락에 있어서, 고형 종양 샘플의 적어도 일부를 기계적으로 파괴하는 단계 및 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
12. 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계 및 상기 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법.
13. 고형 종양으로부터 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법으로서, 상기 방법이,
(i) 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계; 및
(ii) 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
14. 단락 12 또는 단락 13에 있어서, 상기 종양 샘플 또는 상기 방출된 세포가 상기 핵산의 추출 전에 생체 외에서 배양되지 않는 방법.
15. 단락 12 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 추출 전에 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴가 없는 방법.
16. 단락 15에 있어서, 핵산 추출 전에 효소적 또는 다른 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴가 없는 방법.
17. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 방법이,
(a) 고형 종양 샘플로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 배지로부터 방출된 종양 세포를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
18. 단락 12 내지 단락 17 중 어느 한 단락에 있어서, 배지가 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 직접 방출된 종양 세포를 함유하는 방법.
19. 단락 12 내지 단락 18 중 어느 한 단락에 있어서, 고형 종양 샘플이 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계 전에 적어도 약 5분, 10분, 15분, 30분, 60분/1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 6.5시간, 7시간, 7.5시간, 8시간, 8.5시간, 9시간, 9.5시간, 10시간, 10.5시간, 11시간, 11.5시간 또는 12시간 또는 그 초과의 기간 동안 배지에 보유되는 방법.
20. (i) 단락 1 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 따른 방법에 의해 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(ii) 단락 12 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 따른 방법에 의해 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계; 및
(iii) (i) 및 (ii)로부터의 상기 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법.
21. 단락 1 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 고형 종양이 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 신장암, 방광암, 두경부암 및 유방암으로부터 선택되는 방법.
22. 단락 1 내지 단락 21 중 어느 한 단락에 있어서, 고형 종양이 NSCLC, 흑색종 및 두경부암으로부터 선택되는 방법.
23. 단락 1 내지 단락 22 중 어느 한 단락에 있어서, 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
24. 단락 23에 있어서, 생성된 서열 정보가 종양으로부터 클론 신생항원(들)의 확인에 적합한 방법.
25. 단락 24에 있어서, 종양으로부터 클론 신생항원(들)을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
26. 단락 1 내지 단락 25 중 어느 한 단락에 있어서, 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
27. 단락 27에 있어서, TIL이 선택적으로 확장되어 클론 신생항원-특이적 T 세포(cNeT)의 집단을 생산하는 방법.
28. 단락 1 내지 단락 27 중 어느 한 단락에 있어서, 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 음성 선택에 의해 비-종양 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
29. 단락 28에 있어서, 음성 선택이 면역자기 음성 선택을 포함하는 방법.
30. 단락 29에 있어서, 면역자기 음성 선택이 CD45+ 세포, 적혈구, 혈소판, 과립구, 이종 림프구 집단, 섬유모세포, 내피 세포 및/또는 조혈 세포의 고갈을 포함하는 방법.
31. 단락 1 내지 단락 30 중 어느 한 단락에 있어서, 배지가 하이포써모솔(HypoThermosol), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 햄 F10 배지, 햄 F12 배지, 어드밴스드 DMEM, 어드밴스드 DMEM/F12, 최소 필수 배지, DMEM/F-12, DMEM/F-15, 리보비츠 L-15, RPMI 1640, 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM), OPTI-MEM SFM, N2B27, MEF-CM, PBS 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 바람직하게는 배지가 하이포써모솔인 방법.
32. 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 제공하기 위한 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 쉐딩된 종양 세포의 용도.
33. 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 제공하기 위한 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포의 용도.
34. 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 T 세포 집단을 선택적으로 확장시키기 위한 방법으로서,
(a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계;
(c) 쉐딩된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 획득된 서열 정보를 사용하여 종양으로부터 신생항원을 확인하는 단계;
(e) 상기 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계; 및
(f) 단계 (d)에서 확인된 신생항원을 제시하는 항원 제시 세포와 TIL을 공동-배양하는 단계를 포함하는 방법.
35. 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 T 세포 집단을 선택적으로 확장시키기 위한 방법으로서,
(a) 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 종양 샘플의 적어도 일부로부터 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계;
(c) 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 획득된 서열 정보를 사용하여 종양으로부터 신생항원을 확인하는 단계;
(e) 상기 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계; 및
(f) 단계 (d)에서 확인된 신생항원을 제시하는 항원 제시 세포와 TIL을 공동-배양하는 단계를 포함하는 방법.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 단지 예로서 설명될 것이다.
실시예
방법
종양 세포 현탁액을 종양 표본의 효소적(ED) 또는 기계적 해리(MD)로부터 획득하였다. 농축 절차 전에 Tumor Dissociation Kit, 인간(Miltenyi Biotec #130-095-929) 성분 및 GentleMACS™ Octo Dissociator with Heaters(Miltenyi Biotec #130-096-427)를 사용하여 효소 분해에 의해 종양 단편을 해리시켰다. 대안적으로, 종양 세포 현탁액을 종양 표본이 수송되고 기계적으로 가공된 배지로부터 획득하였다(Hypothermosol FRS 보존 용액, Sigma #H4416). ED 및 MD 세포 현탁액 둘 모두를 70 μm 스트레이너(Falcon #352350)를 통해 여과하고, 혈구계를 사용하여 세포 수(적혈구 포함)를 획득하였다. 생존 세포 계수는 농축 공정 직전 및 직후에 트립판 블루 염색으로 수행하였다.
이후, 세포를 실온에서 450×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 원하는 농도로 PBS + 2%FCS + 1mM EDTA에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 제조업체의 설명서에 따라 상이한 면역자기 음성 선택 방법에 의해 농축시켰다:
· 적혈구, 혈소판 및 과립구를 고갈시키기 위해 EasySep Direct Human PBMC Isolation 키트(StemCell # 19654), 이어서 조혈 세포를 고갈시키기 위해 EasySep Direct Human CD45 고갈 키트(StemCell #17898).
· 적혈구, 이종 림프구 집단, 섬유모세포 및 내피 세포를 고갈시키기 위해 Tumour Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec # 130-108-339).
· 적혈구, 혈소판 및 조혈 세포를 고갈시키기 위해 EasySep Direct Human Circulating Tumour Cell (CTC) Enrichment Kit(StemCell #19657).
분리 후, 농축된 종양 세포 현탁액의 순도를 종양 세포 유형에 따라 비소세포 폐암[CD326(클론 9C4, Biolegend #324212)] 또는 흑색종 종양 세포[MCSP(클론 9.2.27, BD #562414) + MART-1(클론 EP1422Y, Abcam, #ab51061) + MCAM(클론 EPR3208, Abcam #ab75769)]와 함께 공지된 오염 세포에 대한 인간 계통 마커[CD45(클론 HI30, Biolegend #368528), CD31(클론 WM59, Biolegend #303122), CD235a(클론 REA175, Miltenyi Biotec #130-120-474) 및 항-섬유모세포 마커(클론 REA165, Miltenyi Biotec 130-100-136)]를 사용하여 흐름세포측정법에 의해 평가하였다. 이차 AlexaFluor647-컨쥬게이션된 당나귀 항-토끼 IgG 항체(Biolegend #406414)를 필요할 때 사용하였다. 정제된 종양 세포를 후속 DNA 추출 및 전체 엑솜 시퀀싱을 위해 동결시켰다.
실시예 1 - 수송 배지(TM)
본 발명자는 먼저 흐름세포측정법에 의해 이종 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도를 결정하는 방법을 확립하였다. 종양 세포 마커의 발현의 가변성으로 인해, 게이팅 전략은 공지된 오염 세포의 순차적 배제로 구성되었다(도 1a).
효소적으로 해리된 종양 표본으로부터 생존 가능한 세포 현탁액의 제조가 가능하지만, 이는 이용 가능한 조직의 양에 의해 제한된다. 종양 단편은 종양 침윤 림프구(TIL)의 분리에 필요하기 때문에, 나머지 단편은 전형적으로 약 0.1 g이다. 작은 종양 단편의 효소적 해리에 의해 획득된 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도를 숙고하면(도 2a), 추정된 종양 세포 수율은 평균적으로 1백만 개의 세포의 역치 미만이고(도 2b), 기하 평균 0.565×10e6(NSCLC) 및 0.265×10e6(흑색종)의 종양 세포가 0.1 g의 종양 조직의 단편에 존재함이 명백해진다. 이는 종양 세포의 대안적인 공급원을 사용할 필요성을 강조한다.
종양 표본이 수송되는 배지는 비록 대부분이 외부 표면으로부터이지만, 전체 절제된 종양으로부터 쉐딩된 세포를 운반한다. 본 발명자는 이것을 분석 다운스트림 적용에 사용하기 위한 종양 세포의 대안적인 공급원으로서 탐구하였고, 따라서 이러한 목적을 위한 종양 표본의 사용을 피하였다.
첫 번째 관찰로서, 수송 배지로부터 획득된 세포 현탁액에서 종양 세포 빈도는 효소적으로 해리된 종양 단편으로부터의 세포 현탁액에서보다 낮다(도 2a 및 3a). 그러나, 전체 종양에 의해 쉐딩된 세포의 총 수는 높고, 심지어 더 낮은 종양 세포 빈도를 고려할 때, 수송 배지로부터 추정된 종양 세포 수율은 NSCLC 및 흑색종 샘플 둘 모두에 대한 1백만 개의 세포 역치를 가뿐하게 초과한다(도 3b). 각각의 종양 유형에 대한 기하 평균은 평균적으로 3.834×10e6(NSCLC) 또는 23.9×10e6(흑색종) 종양 세포가 종양 조직의 각 그램으로부터 수송 배지 내로 쉐딩될 것으로 예상할 수 있음을 나타낸다. 중요하게는, 세포 생존율은 대부분의 샘플에 대해 전형적으로 60% 이상의 합리적인 수준으로 유지된다(도 3c).
3.5시간만큼 적은 시간 동안 수송 배지에 유지된 종양은 다운스트림 적용에 사용하기에 충분한 세포를 쉐딩하였다(도 4a). 지금까지, 더 높은 기간은 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 보이지만(도 4b), 수율은 부정적인 영향을 받는 것으로 보인다.
실시예 2 - 수송 배지 및 절단 배지(TM 및 CM)
종양 표본이 처리되는 배지(절단 배지 - CM)는 외부 및 내부 모두에서 절제된 종양의 전체 덩어리로부터 쉐딩된 세포를 운반한다.
비교할 때, TM 또는 CM에서의 종양 세포 빈도뿐만 아니라(도 5a), 예상되는 종양 세포 수율(도 5b)은 유사하다. 본 발명자는 CM에서도 NSCLC와 흑색종 샘플 사이에 추정된 종양 세포 수율에서 상당한 차이를 여전히 볼 수 있다.
TM 및 CM을 함께 푸울링할 때, 본 발명자는 NSCLC 샘플의 종양 세포 빈도의 전반적인 개선을 관찰하였다(도 6). 흥미롭게도, NSCLC 샘플(평균, 그램 당 11.55×10e6개 세포)과 대조적으로, 종양 조직의 각 그램에 의해 획득될 수 있는 흑색종 종양 세포의 수가 감소한다(평균, 그램 당 8.06×10e6 세포). TM, CM 및 TM+CM 사이의 직접적인 비교는 신중하게 수행되어야 하는데, 그 이유는 배지에서의 수송 시간과 같은 다른 변수가 또한 수율에 강한 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문이다.
실시예 3 - TM 및 CM의 정제
도 1에 도시된 게이팅 전략을 사용하여, 본 발명자는 오염 세포의 빈도가 매우 가변적이고 환자 의존적임을 관찰하였다(도 7). 도 1에 도시된 게이팅 전략은 또한 원치 않는 세포의 고갈 후 종양 세포 빈도를 추정하는데 사용하였고, 또한 시험된 키트 각각에 대한 회수율의 계산을 가능하게 하였다.
시험된 둘 모두의 키트는 대부분의 농축된 샘플에서 30% 역치 초과의 최종 종양 세포 빈도로 원래의 세포 현탁액을 효율적으로 농축시켰다(도 8a). 종양 세포 수율은 시험된 2개의 키트에 대해 실망스럽게도 낮으며, 숫자는 1백만 개의 세포 역치 미만이다(도 8b). 이는 매우 낮은 회수율로 설명되며(도 8c), 이 문제를 피하기 위한 최적화가 진행 중이다. 시험된 둘 모두의 키트에 대해 농축 후 세포 생존율이 개선되었다(도 3c).
요약하면, 본 발명자는 종양이 수송되고 처리되는 배지가 종양 세포에 대한 신뢰할 수 있는 공급원임을 입증하였다. 생성된 세포 현탁액은 농축되어, 시퀀싱 및 클론 신생항원 확인에 적절한 순도 수준을 생성할 수 있다.
실시예 4 - NSCLC 및 흑색종 종양으로부터의 TM 및 CM 샘플의 시퀀싱
정제 후, 차세대 시퀀싱을 TM 및 CM 샘플에 적용하였다. 첫째, 서열 데이터는 정제 후 개선된 종양 함량의 직교 검증을 제공할 것이다. 둘째, TM 및 CM 샘플 내에서 체세포 변이를 호출하는 능력을 결정하는 것이 필요하였다.
QIAmp DNA Mini 키트, Cat. 51304를 사용하여 정제된 및 정제되지 않은 TM 및 CM 샘플 둘 모두로부터 획득된 세포 용해질로부터 DNA를 추출하였다. 이러한 샘플은 265×의 평균 깊이(범위 = 224 - 302)까지 전체 엑솜 시퀀싱(WES)을 거쳤다. 체세포 변이체를 확인하고 샘플의 종양 함량을 당사의 독점적인 PELEUS™ 생물정보학 플랫폼을 사용하여 추정하였다. 환자 1의 샘플은 NSCLC 종양에서 유래한 반면, 환자 2의 샘플은 흑색종에서 유래하였다. 매칭된 환자의 원발성 종양으로부터의 신선한 동결된 다중-영역 샘플은 점라인 대조군으로 사용하기 위한 환자의 혈액 샘플(평균 깊이 = 92×)과 함께 220×의 평균 깊이로 이전에 시퀀싱되었다(WES). 이러한 샘플을 또한 PELEUS™ 플랫폼을 사용하여 처리하였고, 클론 돌연변이의 확인을 위해 TM 및 CM 샘플에 대한 '최적 표준' 비교 세트를 제공하였다.
비정제 및 정제된 TM 및 CM 샘플에 대한 종양 함량 추정치는 계산 도구 ASCAT(Van Loo et al. (PNAS, 2010, 107 (39): 16910-16915)를 사용하여 계산하였다. 흐름세포측정법으로부터의 추정치와 일치하게, 두 경우 모두, 정제된 샘플의 종양 함량은 정제되지 않은 샘플의 종양 함량보다 실질적으로 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 9a 및 b). 이러한 발견은 이러한 샘플에서 확인된 체세포 돌연변이의 변이체 대립유전자 빈도(VAF)를 비교할 때 추가로 지지되었다(도 9c 및 d). 변이체는 일차 다중-영역 데이터세트에서 이들의 상태에 따라 분류되었다. 개인 돌연변이는 단일 다중-영역 샘플에서만 확인되었다. 공유 돌연변이는 동일한 환자로부터의 다수의 샘플에서 확인되었지만 모든 샘플에서 확인된 것은 아니다. 최종적으로, 편재성 돌연변이는 동일한 환자로부터 획득된 모든 일차 영역에 위치한 돌연변이를 나타내며, 이 보고서의 목적상, 클론 돌연변이로 지칭될 것이다. 체세포 변이의 정확한 확인을 위한 TM 및 CM 샘플의 유용성을 뒷받침하여, 신선한 동결된 영역으로부터의 돌연변이를 재확인하고 돌연변이의 VAF를 일반적으로 돌연변이 부류로 계산하였으며, 클론 돌연변이는 전형적으로 더 높은 VAF를 갖는다. 또한, 정제된 샘플의 VAF는 정제되지 않은 샘플의 VAF보다 높았으며, 이는 증가된 순도 추정치를 뒷받침한다.
TM 및 CM 샘플에서 클론 돌연변이를 검출하는 능력을 결정하기 위해, 다중-영역 분석으로부터의 돌연변이를 TM 및 CM 샘플에서 확인된 돌연변이와 비교하였다. 정제되지 않은 샘플의 경우, 양성 퍼센트 일치는 두 환자 모두에서 >95%였다(도 10). 정제된 샘플의 경우, 양성 퍼센트 일치는 두 환자 모두에서 >99%였다. 이러한 결과는 클론 돌연변이의 확인을 위한 TM 및 CM 샘플의 적용 가능성을 강력하게 뒷받침한다.
실시예 5 - TM 샘플의 시퀀싱 및 분석
정제 후, 체세포 변이를 호출하고 TM 샘플 내에서 주석이 달린 클론 돌연변이를 재확인하는 능력을 결정하기 위해 차세대 시퀀싱을 TM 샘플에 적용하였다. 이러한 TM 샘플은 NSCLC 종양에서 유래하였다.
정제된 TM 샘플로부터 획득된 세포 용해질로부터 DNA를 추출하였다. 이러한 샘플은 346×의 깊이까지 전체 엑솜 시퀀싱(WES)을 거쳤다. 체세포 단일 뉴클레오티드 변이체는 당사의 독점적인 PELEUS™ 생물정보학 플랫폼을 사용하여 확인되었다. 매칭된 환자의 원발성 종양으로부터의 신선한 동결된 다중-영역 샘플은 점라인 대조군으로 사용하기 위한 환자의 혈액 샘플(깊이 = 275×)과 함께 253×의 평균 깊이로 이전에 시퀀싱되었다(WES). 이러한 샘플을 또한 PELEUS™ 플랫폼을 사용하여 처리하였고, 클론 돌연변이의 확인을 위해 TM 샘플에 대한 '최적 표준' 비교 세트를 제공하였다.
변이체는 일차 다중-영역 데이터세트에서 이들의 상태에 따라 분류되었다. 개인 돌연변이는 단일 다중-영역 샘플에서만 확인되었다. 공유 돌연변이는 동일한 환자로부터의 다수의 샘플에서 확인되었지만 모든 샘플에서 확인된 것은 아니다. 최종적으로, 편재성 돌연변이는 동일한 환자로부터 획득된 모든 일차 영역에 위치한 돌연변이를 나타내며, 이 보고서의 목적상, 클론 돌연변이로 지칭될 것이다. TM 샘플에서 돌연변이를 검출하는 능력을 결정하기 위해, 다중-영역 분석으로부터의 돌연변이를 TM 샘플에서 확인된 돌연변이와 비교하였다(도 11). 클론 돌연변이를 검출하기 위한 양성 퍼센트 일치도(PPA)는 99%(179/180)였다. 공유 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 85%(71/84)였고, 개인 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 22%(87/401)였다. 이러한 결과는 클론 돌연변이의 확인을 위한 TM의 적용 가능성을 강력하게 뒷받침한다.
실시예 6 - CM 샘플의 시퀀싱 및 분석
정제 후, 체세포 변이를 호출하고 CM 샘플 내에서 주석이 달린 클론 돌연변이를 재확인하는 능력을 결정하기 위해 차세대 시퀀싱을 실시예 5에서와 동일한 환자로부터 유래된 CM 샘플에 적용하였다. 이러한 CM 샘플은 NSCLC 종양에서 유래하였다.
정제된 CM 샘플로부터 획득된 세포 용해질로부터 DNA를 추출하였다. 이러한 샘플은 273×의 깊이까지 전체 엑솜 시퀀싱(WES)을 거쳤다. 체세포 단일 뉴클레오티드 변이체는 당사의 독점적인 PELEUS™ 생물정보학 플랫폼을 사용하여 확인되었다. 매칭된 환자의 원발성 종양으로부터의 신선한 동결된 다중-영역 샘플은 점라인 대조군으로 사용하기 위한 환자의 혈액 샘플(깊이 = 275×)과 함께 253×의 평균 깊이로 이전에 시퀀싱되었다(WES). 이러한 샘플을 또한 PELEUS™ 플랫폼을 사용하여 처리하였고, 클론 돌연변이의 확인을 위해 CM 샘플에 대한 '최적 표준' 비교 세트를 제공하였다.
변이체는 일차 다중-영역 데이터세트에서 이들의 상태에 따라 분류되었다. 개인 돌연변이는 단일 다중-영역 샘플에서만 확인되었다. 공유 돌연변이는 동일한 환자로부터의 다수의 샘플에서 확인되었지만 모든 샘플에서 확인된 것은 아니다. 최종적으로, 편재성 돌연변이는 동일한 환자로부터 획득된 모든 일차 영역에 위치한 돌연변이를 나타내며, 이 보고서의 목적상, 클론 돌연변이로 지칭될 것이다. CM 샘플에서 돌연변이를 검출하는 능력을 결정하기 위해, 다중-영역 분석으로부터의 돌연변이를 CM 샘플에서 확인된 돌연변이와 비교하였다(도 12). 클론 돌연변이를 검출하기 위한 양성 퍼센트 일치(PPA)는 100%(180/180)였다. 공유 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 89%(75/84)였고, 개인 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 18%(74/401)였다. 이러한 결과는 클론 돌연변이의 확인을 위한 CM의 적용 가능성을 강력하게 뒷받침한다.
실시예 7 - 두경부 편평 세포 암종으로부터 획득된 TM 샘플의 시퀀싱 및 분석
정제 후, 차세대 시퀀싱을 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 종양으로부터 유래된 TM 샘플에 적용하여 체세포 변이를 호출하고 이 암 적응증으로부터의 TM 샘플 내에서 주석이 달린 클론 돌연변이를 재확인하는 능력을 결정하였다.
실시예 5에 설명된 바와 같이 DNA를 추출하고 시퀀싱하였고(본 샘플은 284×의 깊이까지 WES를 거쳤고, 매칭된 환자의 원발성 종양은 364×의 평균 깊이까지 이전에 시퀀싱(WES)되었음), 환자의 혈액 샘플을 시퀀싱하였다(깊이 141×까지 WES).
변이체를 실시예 5에 설명된 바와 같이 분류하였다. TM 샘플에서 돌연변이를 검출하는 능력을 결정하기 위해, 다중-영역 분석으로부터의 돌연변이를 TM 샘플에서 확인된 돌연변이와 비교하였다(도 13). 클론 돌연변이를 검출하기 위한 양성 퍼센트 일치(PPA)는 100%(147/147)였다. 공유 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 33%(7/21)였고, 개인 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 0%(0/24)였다. 이러한 결과는 클론 돌연변이의 확인을 위한 TM의 적용 가능성을 강력하게 뒷받침한다.
실시예 8 - 두경부 편평 세포 암종으로부터 획득된 CM 샘플의 시퀀싱 및 분석
정제 후, 실시예 7에서 사용된 것과 동일한 HNSCC 종양으로부터 유래된 CM 샘플에 차세대 시퀀싱을 적용하였다. 이는 이러한 암 적응증으로부터의 CM 샘플 내에서 체세포 변이를 호출하고 주석이 달린 클론 돌연변이를 재확인하는 능력을 결정하기 위한 것이었다.
실시예 6에 설명된 바와 같이 DNA를 추출하고 시퀀싱하였고(본 샘플은 305×의 깊이까지 WES를 거쳤고, 매칭된 환자의 원발성 종양은 364×의 평균 깊이까지 이전에 시퀀싱(WES)되었음), 환자의 혈액 샘플을 시퀀싱하였다(깊이 141×까지 WES).
변이체를 실시예 6에 설명된 바와 같이 분류하였다. CM 샘플에서 돌연변이를 검출하는 능력을 결정하기 위해, 다중-영역 분석으로부터의 돌연변이를 CM 샘플에서 확인된 돌연변이와 비교하였다(도 14). 클론 돌연변이를 검출하기 위한 양성 퍼센트 일치(PPA)는 100%(147/147)였다. 공유 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 48%(10/21)였고, 개인 돌연변이를 검출하기 위한 PPA는 0%(0/24)였다. 이러한 결과는 클론 돌연변이의 확인을 위한 CM의 적용 가능성을 강력하게 뒷받침한다.

Claims (22)

  1. 고형 종양 샘플로부터 쉐딩(shedding)되고/되거나 고형 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계, 및 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 획득하기 위한 방법.
  2. 고형 종양 샘플로부터 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법으로서,
    (i) 상기 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 상기 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계; 및
    (ii) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는,
    방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양 샘플 또는 상기 쉐딩되거나 방출된 종양 세포가 상기 핵산의 추출 전에 생체 외에서 배양되지 않는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 추출 전에 효소적 또는 다른 비-기계적 수단에 의한 고형 종양 샘플의 파괴가 없는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이,
    (a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 고형 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
    (b) 배지로부터 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포를 분리하는 단계; 및
    (c) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는,
    방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 직접 쉐딩된 종양 세포를 함유하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양 샘플이 쉐딩된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계 전에 적어도 약 5분, 10분, 15분, 30분, 60분/1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 6.5시간, 7시간, 7.5시간, 8시간, 8.5시간, 9시간, 9.5시간, 10시간, 10.5시간, 11시간, 11.5시간 또는 12시간 또는 그 초과의 기간 동안 배지에 보유되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 고형 종양 샘플의 저장 또는 수송 동안 배지 내로 쉐딩되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 고형 종양 샘플을 기계적으로 파괴하는 단계를 포함하지 않는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양이 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 신장암, 방광암, 두경부암 및 유방암으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양이 NSCLC, 흑색종 및 두경부암으로부터 선택되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 생성된 서열 정보가 종양으로부터 클론 신생항원(들)의 확인에 적합한 방법.
  14. 제13항에 있어서, 종양으로부터 클론 신생항원(들)을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, TIL이 선택적으로 확장되어 클론 신생항원-특이적 T 세포(cNeT)의 집단을 생산하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱을 위한 핵산의 추출 전에 음성 선택에 의해 비-종양 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 음성 선택이 면역자기 음성 선택을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 면역자기 음성 선택이 CD45+ 세포, 적혈구, 혈소판, 과립구, 이종 림프구 집단, 섬유모세포, 내피 세포 및/또는 조혈 세포의 고갈을 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 하이포써모솔(HypoThermosol), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), 햄(Ham) F10 배지, 햄 F12 배지, 어드밴스드(Advanced) DMEM, 어드밴스드 DMEM/F12, 최소 필수 배지, DMEM/F-12, DMEM/F-15, 리보비츠(Liebovitz) L-15, RPMI 1640, 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지(IMDM), OPTI-MEM SFM, N2B27, MEF-CM, PBS 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 바람직하게는 배지가 하이포써모솔인 방법.
  21. 시퀀싱을 위한 종양 핵산을 제공하기 위한 고형 종양 샘플로부터 생체 외 배지로 쉐딩되고/되거나 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포의 용도.
  22. 대상체에서 암의 치료에 사용하기 위한 T 세포 집단을 선택적으로 확장시키기 위한 방법으로서,
    (a) 고형 종양 샘플로부터 쉐딩되고/되거나 종양 샘플의 적어도 일부의 기계적 파괴 동안 방출된 종양 세포를 함유하는 배지를 제공하는 단계;
    (b) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (c) 쉐딩되고/되거나 방출된 종양 세포로부터 추출된 핵산을 시퀀싱하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 획득된 서열 정보를 사용하여 종양으로부터 신생항원을 확인하는 단계;
    (e) 상기 고형 종양 샘플의 적어도 일부로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 단계; 및
    (f) 단계 (d)에서 확인된 신생항원을 제시하는 항원 제시 세포와 TIL을 공동-배양하는 단계를 포함하는,
    방법.
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