TWI727152B

TWI727152B - 炔代雜環化合物、其製備方法及其在醫藥學上的應用

Info

Publication number: TWI727152B
Application number: TW107109132A
Authority: TW
Inventors: 陳向陽; 高英祥; 祥龍孔
Original assignee: 大陸商北京天誠醫藥科技有限公司
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2021-05-11
Also published as: TW201938538A

Abstract

本發明涉及作為FGFR抑制劑的炔代雜環化合物、其製備方法及其在醫藥學上的應用。具體而言，本發明涉及一種通式（I）所示的化合物及其可藥用的鹽、含有所述化合物或其可藥用的鹽的藥物組合物、應用所述化合物或其可藥用的鹽治療和/或預防FGFR相關性病症、特別是腫瘤的方法以及所述化合物或其可藥用的鹽的製備方法。本發明還涉及所述化合物或其可藥用的鹽或含有所述化合物或其可藥用的鹽的藥物組合物在製備用於治療和/或預防FGFR相關性病症、特別是腫瘤的藥物中的用途。其中通式（I）的各取代基與說明書中的定義相同。

Description

炔代雜環化合物、其製備方法及其在醫藥學上的應用

本發明涉及一種作為FGFR抑制劑的新的炔代雜環化合物或其可藥用的鹽；含有所述炔代雜環化合物或其可藥用的鹽的藥物組合物；所述炔代雜環化合物或其可藥用的鹽的製備方法；所述炔代雜環化合物或其可藥用的鹽、或含有所述炔代雜環化合物或其可藥用的鹽的藥物組合物在製備用於治療和/或預防FGFR相關性病症、特別是腫瘤的藥物中的用途；以及應用所述化合物或組合物治療和/或預防FGFR相關性病症、特別是腫瘤的方法。

成纖維細胞生長因數受體（Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFR）是一類受體酪胺酸激酶（RTK），結構上由膜外配體結合域、單一的跨膜域和膜內酪胺酸激酶域所組成，主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4四種亞型。它與其配體，成纖維細胞生長因數（Fibroblast Growth Factor，FGF）在細胞信號傳遞中起重要的調節作用。FGF作為細胞外刺激信號，與FGFR膜外區結合，引起其膜內酪胺酸激酶磷酸化，從而啟動下游的一系列信號通路，對細胞的增殖、分化和轉移等進行調控。　　多種腫瘤與FGF/FGFR表達及啟動密切相關，比如非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宮內膜癌、***癌、宮頸癌、結腸癌、食管癌、骨髓瘤和黑色素瘤等（Clin. Cancer Res. 2012, 18, 1855）。研究顯示，FGFRl擴增占非小細胞肺癌的20%、FGFR2擴增占胃癌的~5%、FGFR3突變占非侵襲性膀胱癌的~70%和FGFR4在肝癌中的擴增等（PloS One 2012, 7, e36713）。因此，靶向FGFR的抑制劑的研發已成為抗腫瘤藥物研究的前沿熱點（Drug Disc. Today 2014, 19, 51）。　　目前市場上已有一些非FGFR特異性藥物，比如Pfizer的sunitinib、Eisai的lenvatini和Boehringer Ingelheim的nintedanib，但還沒有FGFR特異性抑制劑。進入臨床的FGFR特異性抑制劑有HMPL-453、BGJ-398、LY-2874455、AZ-4547、JNJ-42756493、TAS-120、ARQ-087和BLU-554等。　　儘管FGFR抑制劑的開發吸引了眾多生物製藥公司的關注，由於其在治療多種惡性腫瘤所展示的前景，仍需要開發新的化合物。經過不斷努力，本發明設計具有通式（I）所示的結構的化合物，並發現具有此類結構的化合物表現出優異的效果和作用。

本發明提供作為FGFR抑制劑的一種通式（I）所示的化合物、其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式：

（I）　　其中：　　A為N或CR² ；　　環B為苯環或5-6元雜芳環，其中所述苯環和雜芳環任選被一個或多個G¹ 所取代；　　R¹ 獨立地選自H、鹵素、氰基、C_1-6 烷基或-NHR³ ；　　R² 獨立地選自H、鹵素、氰基或C_1-6 烷基，其中所述烷基任選被鹵素、氰基、羥基或-OC_1-6 烷基所取代；　　R³ 獨立地選自H、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被鹵素、氰基、-OR⁴ 、-NR⁵ R⁶ 、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基所取代；　　X不存在或為C_1-6 伸烷基；　　Y不存在或選自C_3-8 伸環烷基、3-8元伸雜環基、伸芳基或伸雜芳基，其中所述伸環烷基、伸雜環基、伸芳基和伸雜芳基任選被一個或多個G² 所取代；　　Z獨立地選自氰基、-NR⁷ CN、

、

、

或

；　　鍵a為雙鍵或三鍵；　　當鍵a為雙鍵時，R^a 、R^b 和R^c 各自獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個G³ 所取代；　　R^a 和R^b 或R^b 和R^c 任選與它們連接的碳原子共同形成一任選含有雜原子的3-6元環；　　當鍵a為三鍵時，R^a 和R^c 不存在，R^b 獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個G⁴ 所取代；　　R⁴ 獨立地選自H、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選可被一個或多個G⁵ 所取代；　　G¹ 、G² 、G³ 、G⁴ 和G⁵ 各自獨立地選自鹵素、氰基、 C₁ _－ ₆ 烷基、C₂ _－ ₆ 烯基、C₂ _－ ₆ 炔基、C_3-8 環烷基、3-8元雜環基、C₆ _－ ₁₀ 芳基、5-10元雜芳基、-OR⁸ 、-OC(O)NR⁸ R⁹ 、 -C(O)OR⁸ 、-C(O)NR⁸ R⁹ 、-C(O)R⁸ 、-NR⁸ R⁹ 、 -NR⁸ C(O)R⁹ 、-NR⁸ C(O)NR⁹ R¹⁰ 、-S(O)_m R⁸ 或 -NR⁸ S(O)_m R⁹ ，其中所述烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基任選被一個或多個選自鹵素、氰基、C_1-6 烷基、C_3-8 環烷基、3-8元雜環基、-OR¹¹ 、 -OC(O)NR¹¹ R¹² 、-C(O)OR¹¹ 、-C(O)NR¹¹ R¹² 、-C(O)R¹¹ 、 -NR¹¹ R¹² 、-NR¹¹ C(O)R¹² 、-NR¹¹ C(O)NR¹² R¹³ 、-S(O)_m R¹¹ 或-NR¹¹ S(O)_m R¹² 的取代基所取代；　　R⁴ 、R⁵ 、R⁶ 、R⁸ 、R⁹ 、R¹⁰ 、R¹¹ 、R¹² 和R¹³ 各自獨立地選自H、C_1-6 烷基、C_3-8 環烷基、3-8元單環雜環基、單環雜芳基或苯基；且　　m為1或2。　　本發明的一個實施方案涉及上述通式（I）所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中A為N或CH，較佳為N。　　本發明的另一個實施方案涉及上述通式（I）所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中環B為苯環。　　在一方面，本發明提供以下通式（II）的化合物、或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式：

（II）　　其中：　　G^a 、G^b 、G^c 和G^d 各自獨立地選自H、鹵素、氰基、 C₁ _－ ₆ 烷基、C_3-8 環烷基、3-8元雜環基、-OR⁸ 、-NR⁸ R⁹ 或 -C(O)NR⁸ R⁹ ，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個選自鹵素、氰基、C_1-6 烷基、C_3-8 環烷基、3-8元雜環基、-OR¹¹ 或-NR¹¹ R¹² 的取代基所取代；其中A、R¹ 、R⁸ 、R⁹ 、R¹¹ 、R¹² 、X、Y、Z的定義如前所述。　　本發明的另一個實施方案涉及上述通式（I）所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其為通式（III）所述的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式：

（III）　　其中：　　G^a 和G^b 各自獨立地選自H、鹵素、氰基、C₁ _－ ₆ 烷基、C_3-8 環烷基、3-8元雜環基、-OR⁸ 、-NR⁸ R⁹ 或-C(O)NR⁸ R⁹ ，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個選自鹵素、氰基、C_1-6 烷基、C_3-8 環烷基、3-8元雜環基、-OR¹¹ 或-NR¹¹ R¹² 的取代基所取代；其中A、R¹ 、R⁸ 、R⁹ 、R¹¹ 、R¹² 、X、Y、Z的定義如前所述。　　本發明的另一個實施方案涉及上述通式（I）所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中R¹ 獨立地選自H、-NH₂ 或-NHC_1-6 烷基。　　在本發明實施方案中，R¹ 可以為H或-NH₂ 。　　在本發明實施方案中，G^a 、G^b 、G^c 和G^d 可以各自獨立地為-OC₁ _－ ₂ 烷基或鹵素。　　在本發明實施方案中，R¹ 獨立地選自H、-NH₂ 或 -NHR₃ ；R³ 獨立地選自C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被鹵素、氰基、-OR⁴ 、-NR⁵ R⁶ 、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基所取代。　　本發明的另一個實施方案涉及上述通式（I）、(II)和(III)所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中: 　　X不存在或為C_1-6 伸烷基；　　Y不存在或選自C_3-8 伸環烷基或3-8元伸雜環基；　　Z獨立地選自氰基、-NR⁷ CN、

或

；　　鍵a為雙鍵或三鍵；　　當鍵a為雙鍵時，R^a 、R^b 和R^c 各自獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個獨立地選自鹵素、氰基、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基、3-6元雜環基、-OR⁸ 或 -NR⁸ R⁹ 的取代基所取代；　　當鍵a為三鍵時，R^a 和R^c 不存在，R^b 獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個獨立地選自鹵素、氰基、C_1-6 烷基、C_3-6 環烷基、3-6元雜環基、-OR⁸ 或 -NR⁸ R⁹ 的取代基所取代；　　R⁴ 、R⁸ 、R⁹ 各自獨立地選自H或C_1-6 烷基。　　本發明的一個實施方案涉及上述通式（I）所示的化合物，其中所述化合物選自：

或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物形式。　　本發明化合物對FGFR的活性具有顯著抑制效應。本發明化合物能夠有效抑制FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4的活性，較佳其抑制FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4的IC₅₀ 為100至1000nM，更佳IC₅₀ 小於100nM，最佳其IC₅₀ 小於10nM。特別的是，本發明化合物對腫瘤細胞（例如Hep3B、RT4和SNU-16腫瘤細胞）的細胞增殖具有顯著抑制效應，較佳其IC₅₀ 為100至1000nM，更佳其IC₅₀ 小於100nM，最佳其IC₅₀ 小於10nM。　　因此本發明化合物可用於治療或者預防FGFR相關性疾病，包括但不限於腫瘤和炎症性疾病，例如骨關節炎。本發明化合物可用於治療或者預防FGFR相關性腫瘤，例如非小細胞肺癌、食管癌、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、***癌和肝癌（例如肝細胞癌），更具體為肝癌、胃癌、非小細胞肺癌和膀胱癌。因此，再一方面，本發明提供一種治療或者預防FGFR介導的疾病（例如所述腫瘤）的方法，其包括給予有需要的患者治療有效量的本發明所述化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物、或包含所述化合物的藥物組合物。　　本發明的另一方面涉及作為藥物或者醫藥用途的通式(I)所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物，其用於治療或者預防FGFR介導的疾病，例如腫瘤或炎症性疾病，包括但不限於非小細胞肺癌、食管癌、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、***癌和肝癌。　　本發明進一步涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明所述化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物及藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑。　　本發明的另一方面涉及通式(I)所示的化合物或其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體及其混合物、或所述藥物組合物在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於治療或者預防FGFR介導的疾病，例如腫瘤和炎症性疾病。　　根據本發明，所述藥物可以是任何藥物劑型，包括但不限於片劑、膠囊劑、溶液劑、凍乾製劑、注射劑。　　本發明的藥物製劑可以以每劑量單位包含預定量的活性成分的劑量單位形式給藥。這種單位可根據治療的病症、給藥方法和患者的年齡、體重和狀況包含例如0.5毫克至1克，較佳1毫克至700毫克，特別佳5毫克至300毫克的本發明的化合物，或藥物製劑可以以每劑量單位包含預定量的活性成分的劑量單位形式給藥。較佳劑量單位制劑是包含如上指示的日劑量或分劑量或其相應分數的活性成分的那些。此外，可以使用製藥領域中公知的方法製備這種類型的藥物製劑。　　本發明藥物製劑可適於通過任何所需的合適方法給藥，例如通過經口（包括口腔或舌下）、直腸、經鼻、局部（包括口腔、舌下或經皮）、***或腸道外（包括皮下、肌內、靜脈內或皮內）方法給藥。可以使用製藥領域中已知的所有方法通過例如將活性成分與一種或多種賦形劑或一種或多種輔助劑合併來製備這樣的製劑。

除非有相反陳述，否則下列用在說明書和權利要求書中的術語具有下述含義。　　在本文中使用的表示方式“C_x-y ”表示碳原子數的範圍，其中x和y均為整數，例如C_3-8 環烷基表示具有3-8個碳原子的環烷基，即具有3、4、5、6、7或8個碳原子的環烷基。還應理解，“C3-8”還包含其中的任意亞範圍，例如C3-7、C3-6、C4-7、C4-6、C5-6等。　　“烷基”指含有1至20個碳原子，例如1至18個碳原子、1至12個碳原子、1至8個碳原子、1至6個碳原子或1至4個碳原子的飽和的直鏈或支鏈的烴基基團。烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基和2-乙基丁基。所述烷基可以是取代的或未取代的。　　“烯基”指含有至少一個碳碳雙鍵和通常2至20個碳原子，例如2至8個碳原子、2至6個碳原子或2至4個碳原子的直鏈或支鏈的烴基基團。烯基的非限制性實例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、1,4-戊二烯基和1,4-丁二烯基。所述烯基可以是取代的或未取代的。　　“炔基”指含有至少一個碳碳三鍵和通常2至20個碳原子，例如2至8個碳原子、2至6個碳原子或2至4個碳原子的直鏈或支鏈的烴基基團。炔基的非限制性實例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基和3-丁炔基。所述炔基可以是取代的或未取代的。　　“環烷基”指含有3至14個碳環原子的飽和環形烴基取代基。環烷基可以是單碳環，通常含有3至7個碳環原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基和環庚基。環烷基可選擇地可以是稠合到一起的雙或三環，如十氫萘基。所述環烷基可以是取代的或未取代的。　　“雜環或雜環基”指飽和或部分不飽和的單環或多環環狀基團，其包括3至20個環原子，例如可以是3至16個、3至14個、3至12個、3至10個、3至8個、3至6個或5至6個環原子，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)_m （其中m是整數0至2），但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包括3至12個環原子，更佳3至10個環原子，最佳5或6個環原子，其中1~4個是雜原子，更佳1~3個是雜原子，最佳1~2個是雜原子。單環雜環基的非限制性實例包含吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高呱嗪基、氧雜環己烷基和氮雜環丁烷基。多環雜環基包括稠合、橋接或螺多環雜環基。所述雜環或雜環基可以是取代的或未取代的。　　“芳基”指含有6至14個碳原子的芳香族單環或稠合多環基團，較佳為6至10元，例如苯基和萘基，最佳苯基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，非限制性實例包括:

和

，　　所述芳基可以是取代的或未取代的。　　“雜芳基或雜芳環”指包含5至14個環原子的雜芳族體系，其中1至4個環原子選自包括氧、硫和氮的雜原子。雜芳基較佳為5至10元。更佳雜芳基是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基等。所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，非限制性實例包括:

和

，　　所述雜芳基可以是取代的或未取代的。　　“鹵素”指氟、氯、溴或碘。　　“氰基”指-CN。　　“任選”或“任選地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。　　“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定（通過實驗或理論）可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和（如烯屬）鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。所述取代基包括但不限於羥基、胺基、鹵素、氰基、C₁ _－ ₆ 烷基、C₁ _－ ₆ 烷氧基、C₂ _－ ₆ 烯基、C₂ _－ ₆ 炔基、C_3-8 環烷基等。　　“藥物組合物”指含有一種或多種本文所述的化合物或其可藥用的鹽或前藥以及其他組分例如可藥用的載體和賦形劑的組合物。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。　　“異構體”指具有相同分子式但其原子結合的性質或順序或其原子的空間排列不同的化合物稱為“異構體”。其原子空間排列不同的異構體稱為“立體異構體”。立體異構體包括光學異構體、幾何異構體和構象異構體。　　本發明的化合物可以以光學異構體形式存在。根據手性碳原子周圍取代基的構型，這些光學異構體是“R”或“S”構型。光學異構體包括對映異構體和非對映異構體。製備和分離光學異構體的方法是本領域中已知的。　　本發明的化合物也可以存在幾何異構體。本發明考慮由碳-碳雙鍵、碳-氮雙鍵、環烷基或雜環基團周圍的取代基的分佈所產生的各種幾何異構體和其混合物。碳-碳雙鍵或碳-氮鍵周圍的取代基指定為Z或E構型，環烷基或雜環周圍的取代基指定為順式或反式構型。　　本發明的化合物還可能顯示互變異構現象，例如酮-烯醇互變異構。　　應該理解，本發明包括任何互變異構或立體異構形式和其混合物，並且不僅僅限於化合物的命名或化學結構式中所使用的任何一個互變異構或立體異構形式。　　“同位素”是在本發明化合物中出現的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序數但不同質量數的那些原子。適合併入本發明化合物中的同位素的實例是氫、碳、氮、氧、磷、氟和氯，分別例如但不限於² H、³ H、¹³ C、¹⁴ C、¹⁵ N、¹⁸ O、¹⁷ O、³¹ P、³² P、³⁵ S、¹⁸ F和³⁶ Cl。本發明的同位素標記化合物通常可通過本領域技術人員已知的傳統技術或通過與所附實施例中描述的那些類似的方法使用適當的同位素標記的試劑代替非同位素標記的試劑來製備。這樣的化合物具有各種潛在用途，例如作為測定生物活性中的標樣和試劑。在穩定同位素的情況下，這樣的化合物具有有利地改變生物、藥理學或藥代動力學性質的潛力。　　“前藥”是指本發明的化合物可以以前藥的形式給予。前藥是指在活體內的生理條件下例如通過氧化、還原、水解等（它們各自利用酶或在沒有酶參與下進行）轉化成本發明的生物活性化合物的衍生物。前藥的實例是下述化合物：其中本發明的化合物中的胺基被醯化、烷基化或磷酸化，例如二十烷醯基胺基、丙胺醯胺基、新戊醯氧基甲基胺基，或其中羥基被醯化、烷基化、磷酸化或轉化成硼酸鹽，例如乙醯氧基、棕櫚醯氧基、新戊醯氧基、琥珀醯氧基、富馬醯氧基、丙胺醯氧基，或其中羧基被酯化或醯胺化，或其中巰基與選擇性地向靶和/或向細胞的胞質溶膠遞送藥物的載體分子，例如肽形成二硫橋鍵。這些化合物可以由本發明的化合物根據公知方法製備。　　“可藥用的鹽”或者“藥學上可接受的鹽”是指由可藥用的鹼或酸，包括無機鹼或酸和有機鹼或酸製成的鹽。在本發明的化合物含有一個或多個酸性或鹼性基團的情況下，本發明還包含它們相應的可藥用鹽。因此，含有酸性基團的本發明的化合物可以以鹽形式存在並可根據本發明使用，例如作為鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或作為銨鹽。這樣的鹽的更確切實例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與胺或有機胺，例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或胺基酸的鹽。含有鹼性基團的本發明的化合物可以以鹽形式存在並可根據本發明以它們與無機或有機酸的加成鹽的形式使用。合適的酸的實例包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、特戊酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、胺基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、異煙酸、檸檬酸、己二酸和本領域技術人員已知的其它酸。如果本發明的化合物在分子中同時含有酸性和鹼性基團，本發明除所提到的鹽形式外還包括內鹽或內銨鹽。各鹽可通過本領域技術人員已知的常規方法獲得，例如通過在溶劑或分散劑中使這些與有機或無機酸或鹼接觸或通過與其它鹽陰離子交換或陽離子交換。　　因此，在本申請中當提及“化合物”、“本發明化合物”或“本發明所述化合物”時，包括所有所述化合物形式，例如其前藥、穩定同位素衍生物、可藥用的鹽、異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體及其混合物。　　在本文中，術語“腫瘤”包括良性腫瘤和惡性腫瘤(例如癌症)。　　在本文中，術語“癌症”包括FGFR參與其發生的各種惡性腫瘤，包括但不限於非小細胞肺癌、食管癌、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、***癌和肝癌（例如肝細胞癌），更具體為肝癌、胃癌、非小細胞肺癌和膀胱癌。　　在本文中，術語“炎症性疾病”是指FGFR參與其炎症發生的任何炎性疾病，例如骨關節炎。　　在本文中，術語“治療有效量”是指包括可有效抑制FGFR的功能和/或治療或防止所述疾病的本發明化合物的量。合成方法　　本發明還提供製備所述化合物的方法。本發明通式（I）所述化合物的製備，可通過以下示例性方法和實施例完成，但這些方法和實施例不應以任何方式被認為是對本發明範圍的限制。也可通過本領域技術人員所知的合成技術合成本發明所述的化合物，或者綜合使用本領域已知方法和本發明所述方法。每步反應所得的產物用本領域已知的分離技術得到，包括但不限於萃取、過濾、蒸餾、結晶、色譜分離等。合成所需的起始原料和化學試劑可以根據文獻（可從SciFinder上查詢）常規合成或購買。　　本發明通式（I）所述吡唑類化合物可按照方法A所述路線合成：1）起始物A1通過桑德邁爾（Sandmeyer）反應得到A2，也可被溴化得到A3，其中的R₁ 可以是-CN或酯（-COOR，其中R為烷基）；2）A2或A3與前體X-L~N-P（其中X為離去基團、L~N-P為含有帶保護胺基的功能團、P為胺基的保護基）在鹼催化下發生取代反應生成A4，也可與一帶有羥基的前體（HO-L~N-P）通過光延反應（Mitsunobu反應）得到A4；3）當A4的R₁ 是-CN，在NaOH/H₂ O₂ 條件下水解成醯胺A5；當A4的R₁ 是酯（-COOR，其中R為烷基），先在鹼性條件（比如LiOH）下水解成羧酸，然後醯胺化得到A5；4）A5與炔通過Sonogashira偶聯得到A6；5）A6中胺基去保護得到A7；6）A7中的胺基被含有和激酶配體結合域內半胱胺酸殘基起反應的功能團的化學試劑（例如BrCN、烯丙醯氯等）衍生化得到目標化合物A8。　　方法A：

另外也可以按照方法B所述路線合成，在第二步引入吡唑NH保護基Q，在第五步脫保護得到共同的中間體B7，B7的吡唑NH再與含有帶保護胺基的不同前體反應取代反應，經過脫保護和衍生化，從而得到目標產物A8。　　方法B：

本發明通式（I）所述吡唑類化合物還可以按照方法C所述路線合成：1）A4先與炔通過Sonogashira偶聯得到C1；2）C1中的-NH² 在鹼催化下發生取代反應或通過還原胺化生成C2；3）C2的CN在NaOH/H₂ O₂ 條件下水解成醯胺C3，在有些情況下需先用Boc保護-NH-，然後再水解；最後經過脫保護和衍生化，從而得到目標產物C5；C5也可通過對A8進行直接取代而得到。　　方法C：

實施例　　化合物的結構是通過核磁共振（NMR）或質譜（MS）來確定的。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400或Varian Oxford-300核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸（DMSO-d₆ ）、氘代氯仿（CDC1₃ ）、氘代甲醇（CD₃ OD），內標為四甲基甲矽烷（TMS），化學位移是以10^-6 （ppm）作為單位給出。　　MS的測定用Agilent SQD（ESI）質譜儀（生產商：Agilent，型號：6120）。　　HPLC的測定使用安捷倫1200 DAD高壓液相色譜儀（Sunfirc C18，150×4.6mm，5μm色譜柱）和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀（Gimini C18 150×4.6mm，5μm色譜柱）。　　薄層層析矽膠板使用青島海洋GF254矽膠板，薄層色譜法（TLC）使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm矽膠板。　　柱層析一般使用青島海洋200~300目矽膠為載體。　　本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH&Co. KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、韶遠化學科技（Accela ChemBio Inc.）、北京耦合化學品等公司。　　實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。　　氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。　　氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。　　加壓氫化反應使用北京佳維科創科技有限公司GCD-500G高純氫氣發生器和BLT-2000中壓氫化儀。　　氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反復操作3次。　　微波反應使用CEM Discover-SP型微波反應器。　　實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫，溫度範圍是20°C - 30°C。　　實施例中的反應進程的監測採用薄層色譜法（TLC），反應所使用的展開劑的體系有A：二氯甲烷和甲醇體系；B：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節。　　純化化合物採用的柱層析的洗脫劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括A：二氯甲烷和甲醇體系；B：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。　　實施例1 (S)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (R)-3-(甲苯磺醯氧代)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯　　將化合物(R)-3-羥基吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯1a（3.5g，18.7mmol）、三乙胺（5.25mL，37.9mmol）、4-二甲胺基吡啶（0.35g，2.87mmol）溶於二氯甲烷（50mL），加入對甲苯磺醯氯（5.4g，28.1mmol），將反應混合物在室溫下攪拌12小時。加水（50mL）稀釋，用乙酸乙酯（100mL×3）萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 2/1），得到目標產物(R)-3-(甲苯磺醯氧代)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯1b（6.0g，黃色油狀物），產率：94%。　　MS m/z (ESI): 364[M+23] 第二步 ((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)三甲基甲矽烷　　將混合物1-溴-3,5-二甲氧基苯1c（6.51g，30mmol）、三甲基甲矽基乙炔（8.8g，90mmol）、二（三苯基膦）氯化鈀（1.05g，1.5mmol）、碘化亞銅（0.56g，3.0mmol）、三乙胺（80mL）和N,N-二甲基甲醯胺（150mL）加熱至80°C，並在氮氣保護下攪拌12小時。將反應混合物冷卻至室溫，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚），得到目標產物((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)三甲基甲矽烷1d（6.2g，棕色固體），產率：88%。　　MS m/z (ESI): 235[M+1] 第三步 1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯　　將((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)三甲基甲矽烷1d（3.0g，12.8mmol）溶於甲醇（100mL），加入碳酸鉀（3.5g，25.6mmol），並在室溫下攪拌2小時。過濾，減壓濃縮濾液，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚），得到目標產物1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯1e（2g，黃色固體），產率：96%。第四步 3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯　　將3-胺基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1f（4.7g，30.3mmol）溶於濃鹽酸（12M，40mL），並冷卻至0°C，加入亞硝酸鈉（4.25g，60mmol）溶液（7.5mL），攪拌5分鐘，然後緩慢加入碘化鉀（12.5g，75mmol）溶液（17.5mL），繼續攪拌30分鐘。將上述反應混合物倒入飽和硫代硫酸鈉溶液（200mL），用乙酸乙酯（400mL×3）萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 2/1），得到目標產物3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1g（6.4g，淺黃色固體），產率：80%。　　MS m/z (ESI): 267[M+1] 第五步 (S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯　　將3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1g（4.5g，17mmol）、(R)-3-(甲苯磺醯氧代)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯1b（6.1g，17.8mmol）、碳酸銫（7.5g，20.4mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（50mL）的混合物加熱到80°C，攪拌3小時。將反應混合物冷卻至室溫，倒入飽和碳酸氫鈉溶液（200mL）中，用乙酸乙酯（300mL×3)萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1到2/1)，得到目標產物(S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1h（3.1g，淡黃色固體），產率：42%。　　MS m/z (ESI): 458[M+23] 第六步 (S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯　　將(S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1h（1g，2.25mmol）、1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯1e（0.75g，4.5mmol）、二(三苯基膦)氯化鈀（175mg，0.25mmol）、碘化亞銅（95mg，0.5mmol）、三乙胺（12.5ml）和N,N-二甲基甲醯胺（12.5mL）的混合物加熱到80°C，攪拌12小時。將反應混合物冷卻至室溫，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯 = 2/1)，得到目標產物(S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1i（0.95g，黃色油狀物），產率：90%。　　MS m/z (ESI): 414[M+1-56] 第七步 (S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲酸　　將(S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1i（0.30g，0.64mmol）溶於四氫呋喃（3mL），加入氫氧化鈉溶液（4M，2mL），室溫攪拌1小時。將反應混合物減壓濃縮，殘餘物用鹽酸（6M，1mL）酸化，用乙酸乙酯（10mL×3)萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，得到目標產物(S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲酸1j（200mg，淡黃色油狀物），產率：71%。　　MS m/z (ESI): 386[M+1-56] 第八步 (S)-3-(4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯　　將(S)-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲酸1j（220mg，0.5mmol）、氯化銨（270mg，5mmol）、O-(7-氮雜苯並***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU）（228mg，0.6mmol）、N,N-二異丙基乙胺（129mg，1mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（5mL）的反應混合物在室溫下攪拌過夜。加水稀釋，用乙酸乙酯萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用薄層矽膠製備色譜純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物(S)-3-(4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯1k（140mg，白色固體)，產率：64%。　　MS m/z (ESI): 385[M+1-56] 第九步 (S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將(S)-3-(4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯1k（50mg，0.11mmol)、鹽酸（6M，5mL）和二氧六環（5mL）的反應混合物在室溫下攪拌1小時。在減壓下除去溶劑，得到目標產物(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺1l（42mg，鹽酸鹽，粗品），產率：100%。　　MS m/z (ESI): 341[M+1] 第十步 (S)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　向(S)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽1l（30mg，0.08mmol）、N,N-二異丙基乙胺（31mg，0.24mmol）和四氫呋喃（15mL）的混合物中滴加丙烯醯氯（11mg，0.12mmol）的四氫呋喃（5mL）溶液，將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。加水（30mL）淬滅，用乙酸乙酯萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用薄層矽膠製備色譜純化(二氯甲烷/甲醇 = 20/1)，得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺1（15mg，白色固體），產率：50%。　　MS m/z (ESI): 395[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.10 (d,J = 9.8 Hz, 1H), 6.96 (brs, 1H), 6.71 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.54 - 6.52 (m, 1H), 6.46 - 6.39 (m, 2H), 5.80 (brs, 1H), 5.76 - 5.72 (m, 1H), 5.01 - 4.92 (m, 1H), 4.13 - 4.00 (m, 2H), 3.90 - 3.75 (m, 8H), 2.62 - 2.44 (m, 2H)。實施例2 1-(1-丙烯醯基呱啶-4-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯　　將化合物3-碘-1H-吡唑-4-甲酸乙酯1g（2.01g，7.5mmol）溶於四氫呋喃（80mL）並冷卻至0°C，加入氫化鈉（60%礦物油分散體，0.42g，10.5mmol），室溫下攪拌1小時。向反應混合物中加入2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基甲基氯（1.76g，10.5mmol），繼續攪拌15小時。向反應混合物中加入飽和食鹽水（100mL），用乙酸乙酯萃取（150mL×2）。有機相合併後用飽和食鹽水洗滌（100mL），在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 5/1到1/2），得到目標產物3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯2a（2.6g，無色油狀物），產率：87%。　　MS m/z (ESI): 397[M+1] 第二步 3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酸　　將化合物3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯2a（2.6g，6.5mmol）溶於四氫呋喃（40mL），加入氫氧化鋰水溶液（1M，13mL）並在室溫下攪拌15小時。加水（20mL）稀釋，用鹽酸（1M）酸化至pH = 4-5，用乙酸乙酯萃取（50mL×3）。有機相合併後用飽和食鹽水（100mL）洗滌，在減壓下除去溶劑，乾燥後得到目標產物3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酸2b（2.03g，白色固體），產率：85%。　　MS m/z (ESI): 391[M+23] 第三步 3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲酸2b（2.03g，5.5mmol）、二異丙基乙基胺（2.13g，16.5mmol）和N，N-二甲基甲醯胺（20mL）混合，依次加入O-(7-氮雜苯並***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU）（2.5g，6.6mmol）和1-羥基苯並***（890mg，6.6mmol），室溫下攪拌1小時後加入固體氯化銨（1.47g，27.5mmol），繼續攪拌15小時。向反應混合物物中加入飽和食鹽水（30mL），用乙酸乙酯萃取（50mL×3）。有機相合併後用飽和食鹽水洗滌（100mL），在減壓下除去溶劑後，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2c（2.3g，黃色油狀物)，產率：100%。　　MS m/z (ESI): 368[M+1] 第四步 3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物3-碘-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2c（2.7g，7.3mmol）、1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯（1.78g，11mmol）、三乙胺（2.2g，21.9mmol）、二（三苯基磷）氯化鈀（512mg，0.73mmol）和無水四氫呋喃（70mL）混合，除氧，在氬氣氣氛下室溫攪拌15小時。在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（乙酸乙酯/石油醚 = 10/1至2/1）得到目標產物3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2d（1.5g，黃色固體），產率：51%。　　MS m/z (ESI): 402[M+1] 第五步 3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-((2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2d（1.4g，3.5mmol）、乙二胺（525mg，8.75mmol）和四氫呋喃（30mL）混合，加入四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液（1M，17.5mL，17.5mmol）。加熱回流15小時後，冷卻至室溫，加入飽和食鹽水（20mL），用乙酸乙酯（100mL×3）萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2e（600mg，白色固體），產率：63%。　　MS m/z (ESI): 272[M+1] 第六步 4-(4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)呱啶-1-甲酸第三丁基酯　　將化合物3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2e（180mg，0.66mmol）、4-溴呱啶-1-甲酸第三丁基酯（264mg，0.99mmol）、碳酸鉀（182mg，1.32mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（10mL）混合後，加熱到75°C，攪拌15小時。加入水（30mL），用乙酸乙酯（50mL×3）萃取。有機相合併後用飽和食鹽水洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物4-(4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)呱啶-1-甲酸第三丁基酯2f（120mg，黃色固體，含區域異構體），產率：40%。　　MS m/z (ESI): 477[M+23] 第七步 3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(呱啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物4-(4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)呱啶-1-甲酸第三丁基酯2f（120mg，0.26mmol，混合物）溶於乙醇（20mL），加入氯化氫的乙醇溶液（4M，1mL，4mmol），室溫下攪拌15小時。在減壓下除去溶劑，殘餘物溶於甲醇（20mL）後，用飽和碳酸氫鈉溶液調節至pH = 8-9。再次在減壓下除去溶劑後，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 10/1），得到目標產物3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(呱啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2g（25mg，白色固體），產率：27%。　　MS m/z (ESI): 355[M+1] 第八步 1-(1-丙烯醯基呱啶-4-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(呱啶-4-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2g（25mg，0.07mmol）、烯丙醯氯（10mg，0.11mmol）、固體碳酸氫鈉（18mg，0.21mmol）、水（2mL）和四氫呋喃（10mL）在0°C混合並在此溫度下攪拌10小時。用乙酸乙酯（20mL×3）萃取，有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 10/1），得到目標產物1-(1-丙烯醯基呱啶-4-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺2（17mg，白色固體），產率：60%。　　MS m/z (ESI): 409[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.10 (s, 1H), 7.01 (brs, 1H), 6.72 (d,J = 2.2 Hz, 2H), 6.62 (dd,J = 16.8, 10.6 Hz, 1H), 6.55 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 6.33 (dd,J = 16.8, 1.5 Hz, 1H), 5.80 (brs, 1H), 5.76 (dd,J = 10.6, 1.6 Hz, 1H), 4.81 (brs, 1H), 4.40 (t,J = 11.4 Hz, 1H), 4.18 (brs, 1H), 3.82 (s, 6H), 3.26 (brs, 1H), 2.89 (brs, 1H), 2.42 - 2.25 (m, 2H), 2.08 - 2.00 (m, 2H)。　　參照實施例2的操作步驟合成實施例3-6：實施例3 1-(1-丙烯醯基氮雜環丁烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 381[M+1]¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 8.43 (s, 1H), 7.30 (s, 2H), 6.73 (d,J = 2.2 Hz, 2H), 6.60 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 6.38 (dd,J = 17.0, 10.3 Hz, 1H), 6.16 (dd,J = 17.0, 2.1 Hz, 1H), 5.73 (dd,J = 10.3, 2.1 Hz, 1H), 5.41 - 5.28 (m, 1H), 4.71 (t,J = 8.6 Hz, 1H), 4.50 (dd,J = 9.2, 4.9 Hz, 1H), 4.46 - 4.36 (m, 1H), 4.20 (dd,J = 10.7, 4.8 Hz, 1H), 3.78 (s, 6H)。　　實施例4 1-((1-丙烯醯基呱啶-4-基)甲基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 423[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.00 (s, 1H), 6.98 (brs, 1H), 6.72 (s, 2H), 6.61 - 6.54 (m, 2H), 6.28 (d,J = 16.8 Hz, 1H), 5.87 (brs, 1H), 5.70 (d,J = 10.5 Hz, 1H), 4.72 (brs, 1H), 4.04 (brs, 3H), 3.82 (s, 6H), 3.05 (brs, 1H), 2.64 (brs, 1H), 2.27 (brs, 1H), 1.69 (brs, 2H), 1.24 (brs, 2H)。　　實施例5 1-(4-丙烯醯基胺基環己基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 423[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 8.25 (s, 1H), 6.77 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.58 (t,J = 2.3 Hz, 1H), 6.38 (dd,J = 17.1, 10.0 Hz, 1H), 6.26 (dd,J = 17.1, 2.0 Hz, 1H), 5.68 (dd,J = 10.1, 2.0 Hz, 1H), 4.38 - 4.33 (m, 1H), 4.13 - 4.11 (m, 1H), 3.82 (s, 6H), 2.28 - 2.18 (m, 2H), 2.07 - 2.02 (m, 2H), 1.96 - 1.80 (m, 4H)。　　實施例6 3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(2-(N-甲基丙烯醯基胺基)乙基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 383[M+1]¹ H NMR (300 MHz, DMSO-d₆ ) δ 8.24 (s, 1H), 7.10 - 6.90 (m, 2H), 6.76 (s, 2H), 6.69 - 6.54 (m, 2H), 6.07 (d,J = 16.5 Hz, 1H), 5.64 (d,J = 9.8 Hz, 1H), 4.37 (t,J = 5.7 Hz, 2H), 3.89 - 3.80 (m, 8H), 2.94 (s, 3H)。　　實施例7 (S)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 5-胺基-3-溴-1H-吡唑-4-甲腈　　將化合物5-胺基-1H-吡唑-4-甲腈7a（20g，185mmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（200mL），冷卻至0°C，分批加入N-溴代丁二醯亞胺（34g，190mmol），升至室溫攪拌2小時。將反應液倒入亞硫酸鈉溶液中，用乙酸乙酯（200mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物5-胺基-3-溴-1H-吡唑-4-甲腈7b（32g，黃色固體），產率：93%。　　MS m/z (ESI): 187/189[M+1] 第二步 (S)-3-(5-胺基-3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯　　將5-胺基-3-溴-1H-吡唑-4-甲腈7b（10g，53.8mmol）、3-(甲苯磺醯氧代)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯（22g，64.5mmol）、碳酸銫（58g，107.6mmol）和乙腈（250mL）的混合物加熱到90°C反應4小時。冷卻至室溫，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，濾液合併後減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 5/1），得到目標產物(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7c（5g，黃色油狀物），產率：26%。　　MS m/z (ESI): 300/302[M+1-56] 第三步 (S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯　　將(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7c（5g，14.1mmol）、碘化亞銅（0.6g，2.8mmol）、三乙胺（9mL）、[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀（2g，2.8mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（150mL）的混合物在氬氣保護下加熱至80°C，分批加入1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯（14g，84.5mmol），攪拌2小時。冷卻至室溫，將反應液倒入水中，用乙酸乙酯（200mL×3）萃取。有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 5/1），得到目標產物(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（5g，棕色油狀物），產率：81%。　　MS m/z (ESI): 382[M+1-56] 第四步 (S)-3-(5-胺基-4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯　　將(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（5g，11.4mmol）、氫氧化鈉（1.5g，37.5mmol，溶於2mL水）、乙醇（50mL）和二甲基亞碸（10mL）的混合物冷卻至0°C，加入雙氧水（20mL），室溫攪拌2小時。將反應液倒入亞硫酸鈉溶液中，用乙酸乙酯（100mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 1/1），得到目標產物(S)-3-(5-胺基-4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7e（5g，棕色油狀物），產率：96%。　　MS m/z (ESI): 400[M+1-56] 第五步 (S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-3-(5-胺基-4-胺甲醯基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7e（5g，11mmol）溶於二氯甲烷（100mL）中，加入三氟乙酸（15mL），室溫攪拌2小時。減壓濃縮，得到目標產物(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（7.1g，棕色油狀物，三氟乙酸鹽，粗品），產率：＞100%，產物不經純化直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 356[M+1] 第六步 (S)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（7.1g，11mmol，三氟乙酸鹽，粗品）溶於四氫呋喃（50mL）中，冷卻至0°C，先後加入碳酸氫鈉飽和溶液（20mL）和丙烯醯氯（900mg，10mmol），攪拌30分鐘。將反應液倒入水（100mL）中，並用二氯甲烷（100mL×3）萃取。有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 1/2），得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7（1.9g，白色固體），產率：42%。　　MS m/z (ESI): 410[M+1]¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 7.18 (brs, 1H), 6.75 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.69 - 6.55 (m, 3H), 6.20 - 6.14 (m, 1H), 5.72 - 5.67 (m, 1H), 5.03 - 4.91 (m, 1H), 4.01 - 3.96 (m, 1H), 3.84 - 3.70 (m, 7H), 3.66 - 3.60 (m, 1H), 3.55 - 3.48 (m, 1H), 2.36 - 2.21 (m, 2H)。　　實施例8 (S,E)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S,E)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯酸（23mg，0.14mmol）、O-(7-氮雜苯並***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU）（64mg，0.17mmol）、(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（50mg，0.14mmol）、N,N-二異丙基乙胺（2mL）和二氯甲烷（3mL）的反應混合物在室溫下攪拌1小時。將反應液倒入水中，用二氯甲烷（20mL×3）萃取。有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用高效液相製備色譜純化，得到目標產物(S,E)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺8（2.4mg，白色固體，甲酸鹽），產率：4%。　　MS m/z (ESI): 467[M+1]¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 8.27 (brs, 1H), 7.20 (brs, 1H), 6.75 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.70 - 6.61 (m, 3H), 6.44 - 6.35 (m, 1H), 5.01 - 4.93 (m, 1H), 4.01 - 3.93 (m,1H), 3.77 (s, 6H), 3.74 - 3.64 (m, 3H), 3.06 - 3.03 (m, 2H), 2.38 - 2.24 (m, 2H), 2.17 - 2.15 (m, 6H)。實施例9 (S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(2-氟丙烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(2-氟丙烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（50mg，0.14mmol）和2-氟丙烯酸（15mg，0.17mmol）溶於二氯甲烷，加入N,N-二異丙基乙胺（54mg，0.42mmol）和O-(7-氮雜苯並***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU）（69mg，0.18mmol），室溫攪拌2小時。加水（10mL）稀釋反應混合物，用二氯甲烷（10mL×3）萃取，有機相合併後減壓濃縮。殘餘物用薄層矽膠製備色譜純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(2-氟丙烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺9（3.6mg，白色固體），產率：6%。　　MS m/z (ESI): 428 [M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.62 (t,J = 2.5 Hz, 2H), 6.47 (t,J = 2.3 Hz, 1H), 5.39 (dd,J = 47.2, 3.5 Hz, 1H), 5.16 (ddd,J = 16.6, 5.7, 3.5 Hz, 1H), 4.86 - 4.81 (m, 1H), 4.02 - 3.91 (m, 2H), 3.87 - 3.72 (m, 2H), 3.71 (s, 6H), 2.34 - 2.23 (m, 2H)。　　實施例10 (S)-5-胺基-1-(1-(丁-2-炔醯基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-5-胺基-1-(1-(丁-2-炔醯基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（50mg，0.14mmol）和2-丁炔酸（14mg，0.17mmol）溶於二氯甲烷中，加入N,N-二異丙基乙胺（54mg，0.42mmol）和O-(7-氮雜苯並***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽（HATU）（69mg，0.18mmol），室溫攪拌2小時。反應混合物用水（10mL）稀釋，用二氯甲烷（10mL×3）萃取，有機相合併後減壓濃縮。殘餘物用薄層矽膠製備色譜純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1），得到目標產物(S)-5-胺基-1-(1-(丁-2-炔醯基)吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺10（5.1mg，淡黃色固體），產率：9%。　　MS m/z (ESI): 422 [M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.62 (t,J = 2.1 Hz, 2H), 6.47 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 4.85 - 4.81 (m, 1H), 4.01 - 3.86 (m, 2H), 3.77 - 3.62 (m, 7.5H), 3.54 - 3.46 (m, 0.5H), 2.32 - 2.27 (m, 2H), 1.95 - 1.93 (m, 3H)。　　實施例11 (S,E)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(4-甲氧基丁-2-烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (E)-4-溴丁-2-烯酸　　將(E)-4-溴丁-2-烯酸甲酯11a（3g，16.8mmol）、氫氧化鋰一水合物（1.1g，25.3mmol）、四氫呋喃（50mL）和水（50mL）在0°C混合並繼續攪拌2小時。反應結束後，用石油醚洗去四氫呋喃，水相用2M鹽酸調節至pH = 1，然後用乙酸乙酯（100mL×2）萃取。有機相合併後在減壓下除去溶劑，得到目標產物(E)-4-溴丁-2-烯酸11b（2.3g，黃色油狀物），產率：83%。　　MS m/z (ESI): 163[M-1] 第二步 (E)-4-甲氧基丁-2-烯酸　　將化合物(E)-4-溴丁-2-烯酸11b（100mg，0.61mmmol ）溶於甲醇（5mL）後，加入甲醇鈉的甲醇溶液（30%，0.55mL，3.05mmol）並攪拌15小時。反應混合物在減壓下除去溶劑後溶於水，並用稀鹽酸調節至pH=1，然後用二氯甲烷萃取（10mL×3）。有機相合併後在減壓下除去溶劑，得到目標產物(E)-4-甲氧基丁-2-烯酸11c（50mg，黃色油狀物），產率：71%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 7.13 - 7.03 (m, 1H), 6.15 - 6.07 (m, 1H), 4.18 - 4.11 (m, 2H), 3.48 - 3.38 (s, 3H)。第三步 (S,E)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(4-甲氧基丁-2-烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(E)-4-甲氧基丁-2-烯酸11c（22mg，0.19mmol）、二異丙基乙基胺（67mg，0.52mmol）、(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（50mg，0.13mmol）、2-(7-氧化苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（72mg，0.19mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（10mL）混合並攪拌2小時。在減壓下除去溶劑，殘餘物溶於乙酸乙酯（30mL）後依次用水和飽和食鹽水洗滌。在減壓下除去溶劑，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1）得到目標產物(S,E)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(1-(4-甲氧基丁-2-烯醯基)吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺11（30mg，白色固體），產率：51%。　　MS m/z (ESI): 454[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.98 (d,J = 15.3 Hz, 1H), 6.86 (brs, 1H), 6.72 (d,J = 2.1 Hz, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.39 (dd,J = 27.7, 16.0 Hz, 1H), 5.54 (brs, 1H), 4.73 - 4.70 (m, 1H), 4.14 - 4.12 (m, 2H), 4.05 - 4.00 (m, 2H), 3.95 - 3.93 (m, 1H), 3.82 (s, 6H), 3.77 - 3.68 (m, 1H), 3.43 (d,J = 10.1 Hz, 3H), 2.72 (brs, 0.5H), 2.54 (brs, 0.5H), 2.43 - 2.35 (m, 1H)。　　實施例12 (S)-5-胺基-1-(1-氰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-5-胺基-1-(1-氰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7f（50mg，0.14mmol）溶於四氫呋喃（2mL），加入三乙胺（1mL），冷卻至0°C，加入溴化氰（17mg，0.15mmol），0°C攪拌2小時，升至室溫，繼續攪拌2小時。反應混合物減壓濃縮，殘餘物用薄層矽膠製備色譜純化（二氯甲烷/甲醇 = 15/1），得到目標產物(S)-5-胺基-1-(1-氰基吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺12（18mg，白色固體），產率：34%。　　MS m/z (ESI): 381[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.77 (brs, 1H), 6.68 (d,J = 1.9 Hz, 2H), 6.50 (s, 1H), 5.75 (s, 2H), 5.67 (brs, 1H), 4.79 - 4.73 (m, 1H), 3.84 - 3.73 (m, 9H), 3.61 - 3.53 (m, 1H), 2.53 - 2.43 (m, 1H), 2.37 - 2.26 (m, 1H)。　　參照實施例7的操作步驟合成了實施例13-16：實施例13 (R)-1-(1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 410[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.73 (d,J = 1.9 Hz, 2H), 6.71 - 6.60 (m, 1H), 6.58 (brs, 1H), 6.32 (dd,J = 16.8, 1.7 Hz, 1H), 5.84 - 5.74 (m, 1H), 5.04 - 4.91 (m, 1H), 4.09 (m, 0.5H), 3.98 (td,J = 11.1, 4.0 Hz, 1H), 3.91 (dd,J = 7.8, 5.6 Hz, 1H), 3.86 (dd,J = 9.9, 4.4 Hz, 1H), 3.81 (s, 6H), 3.73 - 3.63 (m, 0.5H), 2.47 (dd,J = 13.2, 6.7 Hz, 1H), 2.38 (dd,J = 13.6, 7.0 Hz, 1H)。　　實施例14 1-(1-丙烯醯基氮雜環丁烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 396[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.75 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.60 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 6.45 - 6.28 (m, 2H), 5.80 (dd,J = 10.1, 2.1 Hz, 1H), 5.29 - 5.21 (m, 1H), 4.79 - 4.64 (m, 2H), 4.54 - 4.47 (m, 1H), 4.46 - 4.39 (m, 1H), 3.82 (s, 6H)。　　實施例15 1-(1-丙烯醯基呱啶-4-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 424[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.88 - 6.78 (m, 1H), 6.73 (d,J = 2.2 Hz, 2H), 6.58 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 6.24 (dd,J = 16.8, 1.7 Hz, 1H), 5.78 (dd,J = 10.7, 1.7 Hz, 1H), 4.73 (d,J = 13.2 Hz, 1H), 4.47 - 4.36 (m, 1H), 4.30 (d,J = 13.3 Hz, 1H), 3.81 (s, 6H), 3.32 - 3.24 (m, 1H), 2.91 (t,J = 9.9 Hz, 1H), 2.02 (d, J = 4.5 Hz, 4H)。　　實施例16 1-((1-丙烯醯基吡咯烷-3-基)甲基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

MS m/z (ESI): 424[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.73 (s, 2H), 6.66 - 6.55 (m, 2H), 6.28 (d,J = 16.7 Hz, 1H), 5.75 (d,J = 10.4 Hz, 1H), 4.13 - 3.99 (m, 2H), 3.82 (s, 6H), 3.78 - 3.61 (m, 2H), 3.48 (dd,J = 14.8, 7.4 Hz, 1H), 3.39 - 3.34 (m, 1H), 2.94 - 2.75 (m, 1H), 2.20 - 2.02 (m, 1H), 1.94 - 1.71 (m, 1H)。　　實施例17 　　(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((2-氟-3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 1-乙炔基-2-氟-3,5-二甲氧基苯　　將混合物1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯1e（2g，12.3mmol ）溶於乙腈（15mL）中，降溫至0°C，並分批加入1-氯甲基-4-氟-1,4-重氮化二環2.2.2辛烷雙(四氟硼酸)鹽（6.6g，18.5mmol），然後室溫攪拌過夜。將反應液倒入水（50mL）中，並用二氯甲烷（30mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 30/1），得到目標產物1-乙炔基-2-氟-3,5-二甲氧基苯17a（800mg，黃色固體），產率：36%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.46 (dd,J = 6.9, 2.9 Hz, 1H), 6.41 (dd,J = 4.5, 3.0 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.22 (s, 1H)。　　參照實施例7第一至第六步的操作步驟合成實施例17，但在第三步中用1-乙炔基-2-氟-3,5-二甲氧基苯取代1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯。　　MS m/z (ESI): 428[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 7.00 (brs, 1H), 6.59 - 6.57 (m, 2H), 6.49 - 6.39 (m, 2H), 5.74 - 5.70 (m, 1H), 5.52 (d,J = 8.5 Hz, 2H), 5.35 (brs, 1H), 4.73 - 4.64 (m, 1H), 4.07 - 3.90 (m, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.78 (d,J = 5.3 Hz, 3H), 3.75 - 3.67 (m, 1H), 2.72 - 2.67 (m, 0.5H), 2.54 - 2.31 (m, 1.5H)。　　實施例18 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((5-氯-2-氟苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 ((2-氟-5-氯苯基)乙炔基)三甲基矽烷　　將2-氟-5-氯溴苯18a（11.0g，52.8mmol）、乙炔基三甲基矽烷（7.7g，79mmol）和三乙胺（60mL）混合，然後加入碘化亞銅（100mg，0.53mmol）和二三苯基膦氯化鈀（1.86g，2.65mmol）。反應混合物在氮氣保護氣氛下加熱到80°C並繼續攪拌4小時。反應結束後，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1）得到目標產物((2-氟-5-氯苯基)乙炔基)三甲基矽烷18b（11.0g，黃色油狀物），產率：90%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 7.45 (dd,J = 6.0, 2.7 Hz, 1H), 7.28 - 7.22 (m, 1H), 7.02 (t,J = 8.8 Hz, 1H), 0.29 (s, 9H)。第二步 4-氯-2-乙炔基-1-氟苯　　將((2-氟-5-氯苯基)乙炔基)三甲基矽烷18b（11.0g，48mmol）、碳酸鉀（8.1g，58mmol）、二氯甲烷（80mL）和甲醇（40mL）混合後，室溫下攪拌18小時。反應結束後，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1）純化得到目標產物4-氯-2-乙炔基-1-氟苯18c（5.5g，黃色固體），產率：74%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 7.45 (dd,J = 6.0, 2.7 Hz, 1H), 7.31 - 7.27 (m, 1H), 7.04 (t,J = 8.0, 1H), 3.35 (s, 1H)。　　參照實施例7第一至第六步的操作步驟合成實施例18，但在第三步中用4-氯-2-乙炔基-1-氟苯取代1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯。　　MS m/z (ESI): 402[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 7.62 - 7.61 (m, 1H), 7.47 - 7.45 (m, 1H), 7.24 (t,J = 9.0 Hz, 1H), 6.69 - 6.56 (m, 1H), 6.30 (d,J = 16.8 Hz, 1H), 5.77 (t,J = 9.2 Hz, 1H), 5.02 - 1.91 (m, 1H), 4.09 - 3.95 (m, 2H), 3.84 - 3.78 (m, 2H), 2.46 (dd,J = 13.1, 6.6 Hz, 1H), 2.37 (dd,J = 13.6, 6.9 Hz, 1H)。　　實施例19 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 4-氯-3-溴苯甲酸甲酯　　將4-氯-3-溴苯甲酸19a（2g，8.5mmol）溶於甲醇（400mL）並冷卻至0°C，然後逐滴加入乙醯氯（2.3g，30mmol）並繼續攪拌18小時。反應結束後減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 10/1）純化得到目標產物4-氯-3-溴苯甲酸甲酯19b（1.2g，黃色固體)，產率：57%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.31 (d,J = 1.9 Hz, 1H), 7.93 (dd,J = 8.3, 1.9 Hz, 1H), 7.55 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H)。第二步 4-氯-3-((三甲基甲矽烷基)乙炔基)苯甲酸甲酯　　將化合物4-氯-3-溴苯甲酸甲酯19b（1.2g，4.8mmol）、三甲基矽基乙炔（0.95g，9.7mmol）、醋酸鈀（108mg，0.48mmol）、三苯基膦（254mg，0.97mmol）、碘化亞銅（185mg，0.97mmol）和三乙胺（25mL）在封管中混合並在100°C下加熱並攪拌15小時。反應完成後減壓脫溶，殘餘物用柱層析矽膠色譜（石油醚/乙酸乙酯 = 10/1）純化得到目標產物4-氯-3-((三甲基甲矽烷基)乙炔基)苯甲酸甲酯19c（1g，黃色固體），產率：78%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.19 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.91 (dd,J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 7.48 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 0.30 (s, 9H)。第三步 4-氯-3-乙炔基苯甲酸甲酯　　將4-氯-3-((三甲基甲矽烷基)乙炔基)苯甲酸甲酯19c（1g，3.76mmol）溶於甲醇（20mL），然後加入碳酸鉀（1.04g，7.52mmol）。室溫攪拌1小時後，減壓脫溶。殘餘物用水洗滌並過濾得到目標產品4-氯-3-乙炔基苯甲酸甲酯19d（380mg，黃色固體），產率：52%。¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.23 (d,J = 2.1 Hz, 1H), 7.96 (dd,J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.51 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.44 (s, 1H)。第四步 (S)-3-(5-胺基-3-溴-4-胺基甲醯-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將化合物(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯7c（2.20g，6.2mmol）、氫氧化鈉水溶液（0.5M，12.4mL，6.2mmol）、過氧化氫水溶液（30%，15mL）和二甲基亞碸（30mL）混合。室溫攪拌2小時後，反應物用飽和食鹽水（50mL）稀釋，並用乙酸乙酯（50mL×3）萃取。有機相合併後減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 100/1至20/1）得到目標產物(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-胺基甲醯-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19e（1.92g，淡黃色固體），產率：83%。　　MS m/z (ESI): 374[M+1] 第五步 (S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((2-氯-5-(甲酯基＜甲氧羰基＞)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-胺基甲醯-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19e（770mg，2.1mmol）、三乙胺（6mL）、1,1'-雙二苯基膦二茂鐵二氯化鈀（307mg，0.42mmol）、碘化亞銅（80mg，0.42mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（20mL）混合，除氧，在氬氣氣氛下加熱至90°C，然後逐滴加入4-氯-3-乙炔基苯甲酸甲酯19d（3.20g，16.5mmol）的N,N-二甲基甲醯胺（2mL）溶液，並繼續攪拌12小時。減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 20/1）得到目標產物(S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((2-氯-5-(甲酯基＜甲氧羰基＞)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19f（420mg，黃色固體），產率：41%。　　MS m/z (ESI): 488[M+1] 第六步 (S)-3-((5-胺基-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-4-胺基甲醯-1H-吡唑-3-基)乙炔基)-4-氯苯甲酸　　將(S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((2-氯-5-(甲酯基＜甲氧羰基＞)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19f（100mg，0.2mmol）溶於甲醇（4mL）和水（4mL）的混合溶劑中，然後加入氫氧化鈉（25mg，0.61mmol）並繼續攪拌2小時。反應完成後，在減壓條件下除去有機溶劑。殘餘物用鹽酸（1M）調節至pH = 4至5，然後用乙酸乙酯萃取（30mL×2）。有機相合併後用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後過濾。濾液減壓脫溶得到目標產物(S)-3-((5-胺基-1-(1-(第三丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-4-胺基甲醯-1H-吡唑-3-基)乙炔基)-4-氯苯甲酸19g（80mg，棕色固體），產率：84%。　　MS m/z (ESI): 418[M+H-56] 第七步 (S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-((5-胺基-1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-4-胺基甲醯-1H-吡唑-3-基)乙炔基)-4-氯苯甲酸19g（80mg，0.17mmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（2.5mL）中，然後依次加入甲胺鹽酸鹽（34mg，0.50mmol）、二異丙基乙基胺（129mg，1mmol）和2-(7-氧化苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（64mg，0.17mmol）。反應物室溫攪拌2小時後用水淬滅，然後用乙酸乙酯（20mL×3）萃取。有機相合併後減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1至0/1）得到目標產物(S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19h（41mg，棕色固體），產率：50%。　　MS m/z (ESI): 387[M+H-Boc] 第八步 (S)-5-胺基-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽　　將(S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19h（40mg，0.08mmol）溶於乙酸乙酯（5mL）中，然後加入氯化氫的乙醇溶液（33%，3mL）並在室溫下攪拌1小時。反應完成後，減壓脫溶，得到目標產物(S)-5-胺基-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽19i（40mg，粗品，棕色固體），該產品未經進一步純化，直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 387[M+H] 第九步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-5-胺基-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽19i（40mg，0.08mmol，粗品）、烯丙醯氯（7.5mg，0.08mmol）、碳酸鉀水溶液（0.4M，1.0mL，0.4mmol）和四氫呋喃（5mL）在0°C混合並在此溫度下攪拌0.5小時。用乙酸乙酯（20mL×2）萃取，有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 100/1至10/1），得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((2-氯-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺19（18mg，白色固體），產率：兩步51%。　　MS m/z (ESI): 441[M+H]¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 8.65 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.90 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d,J = 8.3 Hz, 1H),7.43 (s, 1H), 6.70 - 6.62 (m, 4H), 6.19 - 6.15 (m, 1H), 5.70 (t,J = 10.2 Hz, 1H), 5.03 - 4.94 (m, 1H), 3.80 - 3.54 (m, 4H), 2.78 (d,J = 3.8 Hz, 3H), 2.36 - 2.25 (m, 2H)。　　實施例20 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 3-溴-5-甲氧基-N-甲基苯醯胺　　將3-溴-5-甲氧基苯甲酸20a（500mg，2.17mmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（15mL）中，然後依次加入甲胺鹽酸鹽（291mg，4.35mmol）、二異丙基乙基胺（1.12g，8.68mmol）和2-(7-氧化苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（1.24g，3.26mmol）。反應物室溫攪拌2小時後用水淬滅，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 1/1）得到目標產物3-溴-5-甲氧基-N-甲基苯醯胺20b（500mg，白色固體），產率：95%。　　MS m/z (ESI): 244[M+H] 第二步 3-甲氧基-N-甲基-5-((三甲基甲矽烷基)乙炔基)苯醯胺　　將化合物3-溴-5-甲氧基-N-甲基苯醯胺20b（500mg，2.1mmol）、三甲基矽基乙炔（302mg，3.1mmol）、醋酸鈀（47mg，0.21mmol）、三苯基膦（110mg，0.42mmol）、碘化亞銅（80mg，0.42mmol）和三乙胺（20mL）在封管中混合，加熱至100°C，攪拌15小時。反應完成後，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 1/1）純化，得到目標產物3-甲氧基-N-甲基-5-((三甲基甲矽烷基)乙炔基)苯醯胺20c（220mg，黃色固體），產率：41%。　　MS m/z (ESI): 262[M+H] 第三步 3-乙炔基-5-甲氧基-N-甲基苯醯胺　　將3-甲氧基-N-甲基-5-((三甲基甲矽烷基)乙炔基)苯醯胺20c（220mg，0.84mmol）溶於甲醇（8mL），然後加入碳酸鉀（233mg，1.68mmol）。室溫攪拌1小時後，減壓脫溶。殘餘物用矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 1/1）純化，得到目標產物3-乙炔基-5-甲氧基-N-甲基苯醯胺20d（140mg，淡黃色固體），產率：88%。　　MS m/z (ESI): 190[M+H] 第四步 (S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-胺基甲醯-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯19e（329mg，0.88mmol）、三乙胺（2mL）、1,1'-雙二苯基膦二茂鐵二氯化鈀（129mg，0.2mmol）、碘化亞銅（34mg，0.18mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（8mL）混合，除氧，在氬氣氣氛下加熱至90°C。然後逐滴加入3-乙炔基-5-甲氧基-N-甲基苯醯胺20d（1.00g，5.3mmol）的N,N-二甲基甲醯胺（2mL）溶液並繼續攪拌12小時。減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析（二氯甲烷/甲醇 = 20/1）純化，得到目標產物(S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯20e（400mg，粗品，棕色固體）。　　MS m/z (ESI): 383[M+H-100] 第五步 (S)-5-胺基-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽　　將(S)-3-(5-胺基-4-胺基甲醯-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯20e（400mg，粗品）溶於二氯甲烷（5mL）中，然後加入氯化氫的乙醇溶液（30%，3mL），並在室溫下攪拌1小時。反應完成後，減壓脫溶，得到目標產物(S)-5-胺基-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽20f（300mg，粗品，棕色固體）。產品不經純化，直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 383[M+H] 第六步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-5-胺基-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽20f（150mg，0.39mmol，粗品）、烯丙醯氯（42mg，0.47mmol）、碳酸氫鈉（131mg，1.56mmol）、水（4mL）和四氫呋喃（8mL）在0°C混合並在此溫度下攪拌0.5小時。用乙酸乙酯（20mL×2）萃取，有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析（二氯甲烷/甲醇 = 20/1）純化，得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3-甲氧基-5-(甲基胺基甲醯)苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺20（60mg，白色固體），產率：兩步35%。　　MS m/z (ESI): 437[M+H]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 7.59 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.73 - 6.58 (m, 1H), 6.36 - 6.28 (m, 1H), 5.83 - 5.75 (m, 1H), 5.04 - 4.93 (m, 1H), 4.12 - 3.91 (m, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.86 - 3.66 (m, 2H), 2.93 (s, 3H), 2.51 - 2.44 (m, 1H), 2.42 - 2.34 (m, 1H)。　　實施例21 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-3-(3-溴-4-氰基-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將化合物(S)-3-(5-胺基-3-溴-4-氰基-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯7c（178mg，0.5mmol）和對甲基苯磺酸一水和物（12mg，0.07mmol）溶於原甲酸三乙酯（4mL）中，加熱回流2小時。反應結束後減壓脫溶，殘餘物分散在水中，然後用乙酸乙酯（30mL×2）萃取。有機相合併後，用無水硫酸鈉乾燥。過濾後濾液減壓脫溶，殘餘物溶於乙醇（10mL）。冷卻至0°C後，加入硼氫化鈉（89mg，2.35mmol）並在室溫下攪拌2小時。反應完成後，用飽和食鹽水淬滅，然後用乙酸乙酯（30mL×2）萃取。有機相合併後，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1至1/1）純化得到目標產物(S)-3-(3-溴-4-氰基-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21a（178mg，白色固體），產率：100%。　　MS m/z (ESI): 314[M+H-56] 第二步 (S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(3-溴-4-氰基-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21a（1.85g，5.0mmol）、三乙胺（20mL）、1,1'-雙二苯基膦二茂鐵二氯化鈀（816mg，1mmol）、碘化亞銅（190mg，1mmol）和N,N-二甲基甲醯胺（20mL）混合，除氧，在氬氣氣氛下加熱至90°C，然後逐滴加入1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯（4.86g，30mmol）的N,N-二甲基甲醯胺（10mL）溶液並繼續攪拌12小時。減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 50/1至0/1）得到目標產物(S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21b（2.1g，棕色固體），產率：80%。　　MS m/z (ESI): 496[M+H-56] 第三步 (S)-3-(5-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21b（225mg，0.5mmol）溶於二氯甲烷（10mL），然後依次加入三乙胺（150mg，1.5mmol）、Boc酸酐（218mg，1mmol）和4-二甲胺基吡啶（6mg，0.05mmol）。室溫下攪拌2小時後，加入飽和食鹽水（10mL）並用乙酸乙酯（20mL×2）萃取。有機相合併後，減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 50/1至1/1）得到目標產物(S)-3-(5-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21c（200mg，淡黃色固體），產率：72%。　　MS m/z (ESI): 440[M+H-112] 第四步 (S)-3-(5-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)-4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(5-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21c（55mg，0.1mmol）、氫氧化鈉水溶液（0.5M，0.1mL，0.05mmol）、過氧化氫水溶液（30%，0.5mL）和二甲基亞碸（1mL）混合，室溫攪拌2小時。反應物用飽和食鹽水（10mL）稀釋並用乙酸乙酯（20mL×2）萃取。有機相合併後減壓脫溶，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 100/1至1/100）得到(S)-3-(5-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)-4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21d（30mg，棕色固體），產率：50%。　　MS m/z (ESI): 414[M+H-156] 第五步 (S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽　　將(S)-3-(5-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)-4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯21d（570mg，1mmol）溶於乙酸乙酯（10mL）中，然後加入氯化氫的乙醇溶液（33%，5mL），並在室溫下攪拌1小時。反應完成後，減壓脫溶，得到目標產物(S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽21e（400mg，粗品，棕色固體），該產品未經進一步純化，直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 370[M+H] 第六步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺鹽酸鹽21e（870mg，2.35mmol，粗品）、烯丙醯氯（254mg，2.82mmol）、碳酸鉀水溶液（2.5M，4.7mL，11.78mmol）和四氫呋喃（10mL）在0°C混合並在此溫度下攪拌0.5小時。用乙酸乙酯（50mL×2）萃取，有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓脫溶。殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 100/1至10/1）得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺21（720mg，白色固體），產率：76%。　　MS m/z (ESI): 424[M+H]¹ HNMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.88 (s, 1H), 6.69 (d,J = 2.3 Hz, 2H), 6.51 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 6.46 - 6.40 (m, 2H), 5.74 - 5.72 (m, 1H), 5.52 - 5.48 (m, 1H), 5.06 - 5.01 (m, 1H), 4.09 - 3.94 (m, 3H), 3.80 (s, 6H), 3.72 - 3.70 (m, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.71 - 2.56 (m, 1H), 2.45 - 2.35 (m, 1H)。　　實施例22 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((2-氟-3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

參照實施例21的操作步驟合成實施例22，但在第二步中用1-乙炔基-2-氟-3,5-二甲氧基苯取代1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯。　　MS m/z (ESI): 442[M+H]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 7.08 (s, 1H), 6.68 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 6.60 - 6.57 (m, 2H), 6.51 - 6.40 (m, 2H), 5.74 - 5.69 (m, 1H), 5.35 (s, 1H), 5.08 - 4.99 (m, 1H), 4.11 - 4.08 (m, 1H),4.05 - 3.94 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.75 - 3.65 (m, 1H), 3.00 (t,J = 5.2 Hz, 3H), 2.72 - 2.58 (m, 1H), 2.44 - 2.33 (m, 1H)。　　實施例23 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((5-氯-2-氟苯基)乙炔基)-5-(甲基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

參照實施例21的操作步驟合成實施例23，但在第二步中用4-氯-2-乙炔基-1-氟苯取代1-乙炔基-3,5-二甲氧基苯。　　MS m/z (ESI): 416[M+H]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 7.56 - 7.52 (m, 1H), 7.35 - 7.33 (m, 1H), 7.08 (t,J = 8.8 Hz, 1H), 7.02 - 6.92 (m, 1H), 6.51 - 6.39 (m, 2H), 5.74 (d,J = 9.3 Hz, 1H), 5.55 - 5.44 (m, 1H), 5.09 - 4.98 (m, 1H), 4.14 - 3.90 (m, 3H), 3.80 - 3.65 (m, 1H), 3.01 (s, 3H), 2.74 - 2.55 (m, 1H), 2.49 - 2.34 (m, 1H)。　　實施例24 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(乙基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-3-(5-乙基胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將混合物(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（500mg，1.14mmol）和氫化鈉（91mg，2.28mmol，60%）加入到N,N-二乙基乙醯胺（5mL）中，攪拌10分鐘，加入碘乙烷（106mg，0.68mmol），攪拌0.5小時。將反應液倒入水中，減壓濃縮，殘餘物用反相高效液相製備色譜純化[乙腈/水（含0.1%甲酸）：50%-90%]，得到目標產物(S)-3-(5-乙基胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯24a（70mg，白色固體），產率：22%。　　MS m/z (ESI): 410[M+1-56] 第二步 (S)-3-(5-乙基胺基-4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(5-乙基胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯24a（55mg，0.12mmol）溶於二甲基亞碸（3mL），加入雙氧水（2mL）和氫氧化鈉（300mg，7.5mmol），常溫攪拌10分鐘後，升溫至40^o C。待反應完成，冷卻後用水（20mL）稀釋，乙酸乙酯（30mL）萃取，並用水（20mL×3）洗滌，有機相減壓濃縮，殘餘物用反相高效液相製備色譜純化[乙腈/水（含0.1%甲酸）：50%-90%]，得到目標產物(S)-3-(5-乙基胺基-4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯24b（15mg），產率：26%。　　MS m/z (ESI): 484 [M+1] 第三步 (S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(乙基胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將(S)-3-(5-乙基胺基-4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯24b（15mg，0.031mmol）溶於二氯甲烷（2mL），加入三氟乙酸（0.5mL），攪拌半小時。待反應完成，減壓濃縮，得到目標產物(S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(乙基胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺24c（20mg，粗品，棕色油狀物），產率：＞100%。產物不經純化直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 384[M+1] 第四步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(乙基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(乙基胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺24c（20mg，0.031mmol，粗品）溶於四氫呋喃（5mL），加入飽和碳酸氫鈉溶液（2mL），再加入丙烯醯氯（2.7mg，0.03mmol）的四氫呋喃溶液，攪拌0.5小時。反應液減壓濃縮，殘餘物溶於乙酸乙酯（30mL），並用水（20mL×3）洗滌。有機相減壓濃縮，殘餘物用反相高效液相製備色譜純化[乙腈/水（含0.1%甲酸）：20%-70%]，得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(乙基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺24（4.7mg，白色固體），產率：24%。　　MS m/z (ESI): 438[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.87 (brs, 1H), 6.74 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.48 - 6.40 (m, 2H), 5.74 - 5.69 (m, 1H), 5.06 - 4.97 (m, 2H), 4.13 - 3.93 (m, 3H), 3.84 (s, 6H), 3.80 - 3.67 (m, 1H), 3.42 (brs, 2H), 2.75 - 2.35 (m, 2H), 1.31 - 1.25 (m, 3H)。　　實施例25 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(異丙基胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(異丙基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將混合物(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（600mg，1.37mmol）、碳酸銫（893mg，2.74mmol）和乙腈（25mL）攪拌10分鐘，迅速加入2-溴丙烷（186mg，1.51mmol），加熱至72^o C，攪拌6小時。冷卻至室溫，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 2/1），得到目標產物(S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-(異丙基胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯25a（600mg，淺黃色固體），產率：91%。　　MS m/z (ESI): 424[M+1-56] 　　參照實施例24中第二步至第四步的操作步驟合成實施例25。　　MS m/z (ESI): 452[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.88 (brs, 1H), 6.70 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.51 - 6.39 (m, 2H), 6.03 (t,J = 10.3 Hz, 1H), 5.74 - 5.69 (m, 1H), 5.49 (brs, 1H), 4.96 - 4.87 (m, 1H), 4.09 - 3.86 (m, 3H), 3.80 - 3.66 (m, 7H), 3.45 - 3.43 (m, 1H), 2.69 - 2.32 (m, 2H), 1.27 - 1.15 (m, 6H)。　　實施例26 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-((環丙基甲基)胺基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-((環丙基甲基)胺基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7（50mg，0.12mmol）溶於乙腈（2mL）中，加入碳酸銫（80mg，0.24mmol）和(溴甲基)環丙烷（19mg，0.13mmol），加熱至70^o C，攪拌4小時。將反應液倒入水（30mL）中，並用乙酸乙酯（30mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用薄層矽膠製備色譜（二氯甲烷/甲醇 = 12/1）純化，得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-((環丙基甲基)胺基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺26（14mg，白色固體），產率：28%。　　MS m/z (ESI): 464[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.89 (brs, 1H), 6.71 (s, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.51 - 6.37 (m, 2H), 5.76 - 5.71 (m, 1H), 5.40 (brs, 1H), 5.03 - 4.95 (m, 1H), 4.06 - 3.89 (m, 3H), 3.82 (s, 6H), 3.78 - 3.67 (m, 1H), 3.06 - 3.02 (m, 2H), 2.69 - 2.52 (m, 1H), 2.46 - 2.35 (m, 1H), 1.15 - 0.98 (m, 1H), 0.63 - 0.60 (m, 2H), 0.29 - 0.27 (m, 2H)。　　實施例27 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2,2,2-三氟乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2,2,2-三氟乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（430mg，0.98mmol）、三氟乙醛水溶液（75%）（304mg，1.96mmol）和鈦酸四乙酯（448mg，1.96mmol）加入到二氯甲烷（15mL）中，並攪拌2小時。待反應完全，向反應液中加入硼氫化鈉（75mg，1.96mmol），常溫下繼續攪拌1小時。將反應液倒入水中並用乙酸乙酯（20mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物經快速柱純化，得到目標產物(S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2,2,2-三氟乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯27a（120mg，黃色油狀物），產率：26%。　　MS m/z (ESI): 464[M+1-56] 　　參照實施例24中第二步至第四步的操作步驟合成實施例27。　　MS m/z (ESI): 492[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 6.92 (brs, 1H), 6.70 (s, 2H), 6.52 (s, 1H), 6.47 - 6.39 (m, 2H), 6.31 - 6.25 (m, 1H), 5.75 - 5.65 (m, 1H), 5.65 (brs, 1H), 5.05 - 4.98 (m, 1H), 4.10 - 3.88 (m, 3H), 3.80 (s, 6H), 3.75 - 3.61 (m, 3H), 2.63 - 2.34 (m, 2H)。　　實施例28 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-甲氧基乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

參照實施例25的操作步驟合成實施例28，但在第一步中用1-溴-2-甲氧基乙烷取代2-溴丙烷。　　MS m/z (ESI): 468[M+1]¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 7.32 (brs, 1H), 6.74 (d,J = 2.2 Hz, 2H), 6.64 (dd,J = 16.8, 10.4 Hz, 1H), 6.60 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 6.50 (t,J = 6.0 Hz, 1H), 6.16 (dd,J = 16.8, 5.0 Hz, 1H), 5.68 (t,J = 10.8 Hz, 1H), 5.15 - 5.05 (m, 1H), 4.05 - 4.01 (m, 0.5H), 3.86 - 3.81 (m, 1.5H), 3.77 (s, 6H), 3.70 - 3.61 (m, 1H), 3.59 - 3.50 (m, 1H), 3.46 (t,J = 5.1 Hz, 2H), 3.39 - 3.34 (m, 2H), 3.26 (s, 3H), 2.42 - 2.23 (m, 2H)。　　實施例29 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 (S)-3-(5-((2-乙醯氧基乙基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將混合物(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（300mg，0.685mmol）、2-溴乙基乙酸酯（126mg，0.753mmol）、碳酸銫（447mg，1.37mmol）和乙腈（4mL）加熱至90^o C，並攪拌2小時。將反應液冷卻至室溫，倒入水（50mL）中，並用乙酸乙酯（30mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇 = 15/1），得到目標產物(S)-3-(5-((2-乙醯氧基乙基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯29a（148mg，黃色固體），產率：41%。　　MS m/z (ESI): 468[M+1-56] 第二步 (S)-3-(4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將混合物(S)-3-(5-((2-乙醯氧基乙基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯29a（68mg，0.146mmol）、乙醇（5mL）和二甲基亞碸（1mL），加入飽和氫氧化鈉溶液（3mL）和雙氧水（4mL），30^o C下攪拌1小時。待反應完成，將反應液倒入飽和亞硫酸鈉溶液（30mL）中，並用乙酸乙酯（30mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，得到目標產物(S)-3-(4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯29b（110mg，粗品，黃色油狀物），產率：＞100%，產物不經純化直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 444[M+1-56] 第三步 (S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-3-(4-胺基甲醯-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯29b（110mg，0.146mmol，粗品）溶於鹽酸的甲醇溶液（5mL），加熱至40^o C攪拌1小時。待反應完成後，減壓濃縮，得到目標產物(S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺29c（160mg，粗品，白色固體），產率：＞100%，產物不經純化直接用於下一步反應。　　MS m/z (ESI): 400[M+1] 第四步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1-(吡咯烷-3-基)-1H-吡唑-4-甲醯胺29c（160mg，0.146mmol，粗品）溶於四氫呋喃（5mL）中，加入飽和碳酸氫鈉溶液（10mL），再加入丙烯醯氯（12mg，0.13mmol），室溫攪拌10分鐘。待反應完成後，將反應液倒入水（50mL）中，並用乙酸乙酯（30mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物通過反相高效液相製備色譜[乙腈/水（含0.2%甲酸）：20%-60%]純化，得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-羥基乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺29（6mg，白色固體），產率：9%。　　MS m/z (ESI): 454[M+1]¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 7.36 (brs, 1H), 6.76 (brs, 1H), 6.74 (s, 2H), 6.70 - 6.60 (m, 2H), 6.55 - 6.52 (m, 1H), 6.17 (d,J = 16.9 Hz, 1H), 5.69 (t,J = 10.9 Hz, 1H), 5.16 - 5.10 (m, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.06 - 4.0 (m, 0.5H), 3.83 - 3.81 (m, 1.5H), 3.77 (s, 6H), 3.68 - 3.63 (m, 2H), 3.55 - 3.53 (m, 2H), 3.28 - 3.26 (m, 2H), 2.38 - 2.27 (m, 2H)。　　實施例30 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((3-嗎啉代丙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 3-嗎啉代丙基4-甲基苯磺酸酯　　將化合物3-嗎啉代丙烷-1-醇30a（500mg，3.45mmol）溶於二氯甲烷（100ml），加入4-二甲胺基吡啶（42mg，0.34mmol）、三乙胺（1.04g，10.3mmol）和對甲苯磺醯氯（988mg，5.17mmol），室溫攪拌過夜。待反應完成，將反應液倒入水（50mL）中，並用二氯甲烷（50mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 2/1，得到目標產物3-嗎啉代丙基4-甲基苯磺酸酯30b（660mg，黃色油狀物），產率：64%。　　MS m/z (ESI): 300[M+1] 　　參照實施例25的操作步驟合成實施例30，但在第一步中用3-嗎啉代丙基4-甲基苯磺酸酯取代2-溴丙烷。　　MS m/z (ESI): 537[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.23 (brs, 1H), 7.12 (brs, 1H), 6.94 (brs, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.52 (s, 1H), 6.49 - 6.40 (m, 2H), 5.92 (brs, 1H), 5.74 - 5.70 (m, 1H), 5.03 - 4.96 (m, 1H), 4.09 - 3.90 (m, 3H), 3.80 - 3.68 (m, 11H), 3.28 (brs, 2H), 2.89 (brs, 6H), 2.69 - 2.33 (m, 2H), 1.93 (brs, 2H)。　　實施例31 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-嗎啉代乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

參照實施例25的操作步驟合成實施例31，但在第一步中用4-(2-氯乙基)嗎啉取代2-溴丙烷。　　MS m/z (ESI): 523[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.14 (s, 1H), 6.95 (brs, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.63 (brs, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.49 - 6.39 (m, 2H), 6.14 (brs, 1H), 5.75 - 5.70 (m, 1H), 5.06 - 4.98 (m, 1H), 4.11 - 3.85 (m, 3H), 3.80 - 3.72 (m, 11H), 3.37 - 3.33 (m, 2H), 2.80 - 2.73 (m, 2H), 2.65 (brs, 4H), 2.45 - 2.32 (m, 2H)。　　實施例32 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 2-溴乙基4-甲基苯磺酸酯　　將化合物2-溴乙醇32a（500mg，4.0mmol）、4-二甲胺基吡啶（246mg，2.02mmol）和三乙胺（1.22g，12.1mmol）溶於二氯甲烷（50mL），降溫至0^o C，再分批加對甲苯磺醯氯（1.15g，6.05mmol），加入完成後，升至室溫攪拌過夜。待反應完成，將反應液倒入水（50mL）中並用二氯甲烷（50mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（石油醚/乙酸乙酯 = 10/1），得到目標產物2-溴乙基4-甲基苯磺酸酯32b（600mg，黃色油狀物），產率：53%。　　MS m/z (ESI): 277[M+1] 第二步 (S)-3-(5-((2-溴乙基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將混合物(S)-3-(5-胺基-4-氰基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁基酯7d（400mg，0.92mmol）、2-溴乙基4-甲基苯磺酸酯（380mg，1.37mmol）、碳酸銫（600mg，1.84mmol）和乙腈（10mL）加熱至70^o C，並攪拌2小時。將反應液倒入水（50mL）中，並用乙酸乙酯（50mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物通過快速柱分離，得到目標產物(S)-3-(5-((2-溴乙基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯32c（240mg，棕色油狀物），產率：48%。　　MS m/z (ESI): 408[M+1-56-80] 第三步 (S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯　　將混合(S)-3-(5-((2-溴乙基)胺基)-4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯32c（240mg，0.44mmol）、吡咯烷（47mg，0.66mmol）、碳酸銫（288mg，0.88mmol）和乙腈（5mL）加熱至70^o C，並攪拌1.5小時。將反應液倒入水（30mL）中，並用乙酸乙酯（30mL×3）萃取，有機相合併後經無水硫酸鈉乾燥，過濾除去乾燥劑，減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇= 10/1），得到目標產物(S)-3-(4-氰基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((2-(吡咯烷-1-基)乙基)胺基)-1H-吡唑-1-基)吡咯烷-1-甲酸第三丁酯32d（200mg，黃色油狀物），產率：85%。　　MS m/z (ESI): 479[M+1-56] 　　參照實施例24中第二步至第四步的操作步驟合成實施例32。　　MS m/z (ESI): 507[M+1]¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) δ 8.38 (s, 1H), 6.99 (brs, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.51 (s, 1H), 6.47 - 6.36 (m, 2H), 5.72 - 5.67 m, 2H), 5.16 - 5.08 (m, 1H), 4.12 - 3.86 (m, 3H), 3.80 - 3.62 (m, 9H), 3.33 - 3.29 (m, 6H), 2.62 - 2.34 (m, 2H), 2.07 (brs, 4H)。　　實施例33 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((四氫-2H-吡喃-4-基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 4-碘四氫-2H-吡喃　　將4-羥基四氫-2H-吡喃33a（2.04g，20mmol）、三苯基膦（6.81g，26）和咪唑（2.04g，30mmol）溶於二氯甲烷（100mL）中，冷卻至0^o C，然後加入碘（6.09g，24mmol），並在45^o C下攪拌14小時。反應用水淬滅並用乙酸乙酯（50mL×2）萃取，有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾後濾液減壓脫溶。殘餘物用矽膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 1/1）純化得到目標產物4-碘四氫-2H-吡喃33b（2.12g，白色固體），產率：50%。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 4.62 (dt,J = 13.9, 4.5 Hz, 1H), 3.68 - 3.64 (m, 2H), 3.47 - 3.42 (m, 2H), 2.13 - 1.97 (m, 4H)。　　參照實施例24的操作步驟合成實施例33，但在第一步中用4-碘四氫-2H-吡喃取代碘乙烷。　　MS m/z (ESI): 494[M+H]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.74 (t,J = 2.2 Hz, 2H), 6.71 - 6.62 (m, 1H), 6.60 - 6.58(m, 1H), 6.36 - 6.30 (m, 1H), 5.82 - 5.77 (m, 1H), 5.18 - 5.12 (m, 1H), 4.04 - 3.94 (m, 6H), 3.81 (s, 6H), 3.52 - 3.46 (m, 3H), 2.55 - 2.39 (m, 2H), 1.94 - 1.92 (m, 2H), 1.60 - 1.55 (m, 2H)。　　實施例34 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((1-甲基呱啶-4-基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺

第一步 4-碘-1-甲基呱啶　　將4-羥基-1-甲基呱啶34a（2.3g，20mmol）、三苯基膦（6.81g，26mmol）、咪唑（2.04g，30mmol）和二氯甲烷（100mL）混合並冷卻至0^o C，然後加入碘（6.09g，24mmol）並繼續攪拌18小時。反應結束後用水淬滅，然後用二氯甲烷（50mL×2）萃取。有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥並過濾，然後將濾液減壓脫溶。殘餘物用矽膠柱層析（二氯甲烷/甲醇 = 10/1）純化得到目標產物4-碘-1-甲基呱啶34b（2.25g，白色固體)，產率：50%。　　MS m/z (ESI): 226[M+H] 第二步 (S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((1-甲基呱啶-4-基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺　　將化合物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-5-胺基-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-1H-吡唑-4-甲醯胺7（210mg，0.5mmmol）、4-碘-1-甲基呱啶34b（450mg，2mmol）、碳酸鉀（207mg，1.5mmol）和乙腈（10mL）混合並在90^o C下加熱並攪拌13小時。反應混合物減壓脫溶後溶於水，然後用乙酸乙酯萃取（50mL×2）。有機相合併後減壓脫溶，殘餘物用反向製備液相色譜純化得到目標產物(S)-1-(1-丙烯醯吡咯烷-3-基)-3-((3,5-二甲氧苯基)乙炔基)-5-((1-甲基呱啶-4-基)胺基)-1H-吡唑-4-甲醯胺34（8.1mg，白色固體），產率：3.2%。　　MS m/z (ESI): 507[M+H]¹ H NMR (400 MHz, CD₃ OD) δ 6.77 (s, 2H), 6.68-6.65 (m, 1H), 6.59 (s, 1H), 6.34 - 6.30 (m, 1H), 5.81 - 5.78 (m, 1H), 5.69 - 5.67 (m, 1H), 5.03 - 5.00 (m, 1H), 4.98 - 5.95(m, 1H), 4.92 - 4.90 (m, 1H), 4.36 (s, 2H), 4.12 - 4.07 (m, 1H), 4.00 - 3.98 (m, 1H), 3.93 - 3.90 (m, 1H), 3.86 - 3.84 (m, 1H), 3.81 (s, 6H), 3.72 - 3.68 (m, 1H), 2.53 - 2.47 (m, 3H), 2.40 - 2.38 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.27 - 2.21 (m, 1H)。　　生物學實驗 FGFR的活性抑制測試　　使用HTRF激酶檢測試劑盒，通過檢測激酶反應中底物的磷酸化水準來評估本發明的化合物對FGFR體外活性的影響（表1）。 FGFR1的活性抑制測試　　實驗方法概述如下：　　反應緩衝液包含以下組分：5倍稀釋的enzymatic buffer/kinase 5X（Cisbio，貨號為62EZBFDD）（主要成分為50mM HEPES，pH7.0）、5mM MgCl₂ 和1mM DTT；人重組FGFR1催化結構域蛋白（胺基酸308-731）由公司自己純化，用反應緩衝液稀釋成0.6ng/uL的激酶溶液；底物反應溶液包括用反應緩衝液稀釋成400nM的生物素標記的酪胺酸激酶底物（Cisbio，貨號為62TK0PEC）和40uM ATP；檢測液包括用檢測緩衝液（Cisbio，貨號為62SDBRDF）稀釋成0.125ng/uL Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（Cisbio，貨號為61T66KLB）、25nM鏈黴親和素標記的XL665（Cisbio，貨號為610SAXLB）。　　將化合物用DMSO溶解稀釋至1mM，然後用DMSO進行4倍的系列稀釋至最低濃度為0.061uM，每個濃度點再使用反應緩衝液稀釋40倍。如果化合物IC₅₀ 值非常低，可以降低化合物的起始濃度。　　向384孔檢測板（Thermo，貨號為264706）中添加4uL化合物溶液和2uL的FGFR1激酶溶液，混合均勻後室溫孵育15分鐘；隨後加入4uL底物反應溶液，將反應混合物在室溫孵育60分鐘；隨後加入與反應等體積的10uL檢測液終止反應，混合均勻後室溫放置。60分鐘後，磷酸化的產物同時被Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（供體）和鏈黴親和素標記的XL665抗體（受體）識別，在鐳射激發後，靠近的供體和受體發生能量共振轉移，其從供體（620nm）轉移至受體（665nm）的能量用酶標儀EnVision（Perkin Elmer）檢測。665/620的比值與底物的磷酸化程度呈正相關，因此從而檢測FGFR1激酶的活性。　　該實驗中未加酶組作為100%抑制組，加酶但是未加化合物組作為0%抑制組。化合物對FGFR1活性的抑制百分比用以下公式計算：抑制百分比=100-100*(比值_化合物 -比值_100% _抑制 )/(比值_0% _抑制 -比值_100% _抑制 ) 　　化合物的IC₅₀ 值由10個濃度點用Excel中XLfit軟體通過以下公式來計算： Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC₅₀ -X)*slope factor)) 　　其中Y為抑制百分比，Bottom為S型曲線的底部平臺值，Top為S型曲線的頂部平臺值，X為待測化合物濃度的對數值，slope factor為曲線斜率係數。 FGFR2的活性抑制測試　　實驗方法概述如下：　　反應緩衝液包含以下組分：5倍稀釋的enzymatic buffer/kinase 5X（Cisbio，貨號為62EZBFDD）（主要成分為50mM HEPES，pH7.0）、5mM MgCl₂ 和1mM DTT；人重組FGFR2催化結構域蛋白（胺基酸400-821）購自義翹神州生物技術有限公司，用反應緩衝液稀釋成0.45ng/uL的激酶溶液；底物反應溶液包括用反應緩衝液稀釋成800nM的生物素標記的酪胺酸激酶底物（Cisbio，貨號為62TK0PEC）和50uM ATP；檢測液包括用檢測緩衝液（Cisbio，貨號為62SDBRDF）稀釋成0.125ng/uL Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（Cisbio，貨號為61T66KLB）、50nM鏈黴親和素標記的XL665（Cisbio，貨號為610SAXLB）。　　將化合物用DMSO溶解稀釋至1mM，然後用DMSO進行4倍的系列稀釋至最低濃度為0.061uM，每個濃度點再使用反應緩衝液稀釋40倍。如果化合物IC₅₀ 值非常低，可以降低化合物的起始濃度。　　向384孔檢測板（Thermo，貨號為264706）中添加4uL化合物溶液和2uL的FGFR2激酶溶液，混合均勻後室溫孵育15分鐘；隨後加入4uL底物反應溶液，將反應混合物在室溫孵育60分鐘；隨後加入與反應等體積的10uL檢測液終止反應，混合均勻後室溫放置。60分鐘後，磷酸化的產物同時被Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（供體）和鏈黴親和素標記的XL665抗體（受體）識別。在鐳射激發後，靠近的供體和受體發生能量共振轉移，其從供體（620nm）轉移至受體（665nm）的能量用酶標儀EnVision（Perkin Elmer）檢測。665/620的比值與底物的磷酸化程度呈正相關，因此從而檢測FGFR2激酶的活性。　　該實驗中未加酶組作為100%抑制組，加酶但是未加化合物組作為0%抑制組。化合物對FGFR2活性抑制百分比用以下公式計算：抑制百分比=100-100*(比值_化合物 -比值_100% _抑制 )/(比值_0% _抑制 - 比值_100% _抑制 ) 　　化合物的IC₅₀ 值由10個濃度點用Excel中XLfit軟體通過以下公式來計算： Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC₅₀ -X)*slope factor)) 　　其中Y為抑制百分比，Bottom為S型曲線的底部平臺值，Top為S型曲線的頂部平臺值，X為待測化合物濃度的對數值，slope factor為曲線斜率係數。　　 FGFR3的活性抑制測試　　實驗方法概述如下：　　反應緩衝液包含以下組分：5倍稀釋的enzymatic buffer/kinase 5X（Cisbio，貨號為62EZBFDD）（主要成分為50mM HEPES，pH7.0）、5mM MgCl₂ 和1mM DTT；人重組FGFR3催化結構域蛋白（胺基酸399-806）購自義翹神州生物技術有限公司，用反應緩衝液稀釋成0.3ng/uL的激酶溶液；底物反應溶液包括用反應緩衝液稀釋成1000nM的生物素標記的酪胺酸激酶底物（Cisbio，貨號為62TK0PEC）和90uM ATP；檢測液包括用檢測緩衝液（Cisbio，貨號為62SDBRDF）稀釋成0.125ng/uL Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（Cisbio，貨號為61T66KLB）、62.5nM鏈黴親和素標記的XL665（Cisbio，貨號為610SAXLB）。　　將化合物用DMSO溶解稀釋至1mM，然後用DMSO進行4倍的系列稀釋至最低濃度為0.061uM，每個濃度點再使用反應緩衝液稀釋40倍。如果化合物IC₅₀ 值非常低，可以降低化合物的起始濃度。　　向384孔檢測板（Thermo，貨號為264706）中添加4uL化合物溶液和2uL的FGFR3激酶溶液，混合均勻後室溫孵育15分鐘；隨後加入4uL底物反應溶液，將反應混合物在室溫孵育60分鐘；隨後加入與反應等體積的10uL檢測液終止反應，混合均勻後室溫放置。60分鐘後，磷酸化的產物同時被Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（供體）和鏈黴親和素標記的XL665抗體（受體）識別。在鐳射激發後，靠近的供體和受體發生能量共振轉移，其從供體（620nm）轉移至受體（665nm）的能量用酶標儀EnVision（Perkin Elmer）檢測。665/620的比值與底物的磷酸化程度呈正相關，因此從而檢測FGFR3激酶的活性。　　該實驗中未加酶組作為100%抑制組，加酶但是未加化合物組作為0%抑制組。化合物對FGFR3活性抑制百分比用以下公式計算：抑制百分比=100-100*(比值_化合物 -比值_100% _抑制 )/(比值_0% _抑制 - 比值_100% _抑制 ) 　　化合物的IC₅₀ 值由10個濃度點用Excel中XLfit軟體通過以下公式來計算： Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC₅₀ -X)*slope factor)) 　　其中Y為抑制百分比，Bottom為S型曲線的底部平臺值，Top為S型曲線的頂部平臺值，X為待測化合物濃度的對數值，slope factor為曲線斜率係數。 FGFR4的活性抑制測試　　實驗方法概述如下：　　反應緩衝液包含以下組分：5倍稀釋的enzymatic buffer/kinase 5X（Cisbio，貨號為62EZBFDD）（主要成分為50mM HEPES，pH7.0）、5mM MgCl₂ 和1mM DTT；人重組FGFR4催化結構域蛋白（胺基酸460-802）購自清華大學蛋白質研究技術中心，用反應緩衝液稀釋成0.5ng/uL的激酶溶液；底物反應溶液包括用反應緩衝液稀釋成500nM的生物素標記的酪胺酸激酶底物（Cisbio，貨號為62TK0PEC）和90uM ATP；檢測液包括用檢測緩衝液（Cisbio，貨號為62SDBRDF）稀釋成0.125ng/uL Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（Cisbio，貨號為61T66KLB）、31.25nM鏈黴親和素標記的XL665（Cisbio，貨號為610SAXLB）。　　將化合物用DMSO溶解稀釋至1mM，然後用DMSO進行4倍的系列稀釋至最低濃度為0.061uM，每個濃度點再使用反應緩衝液稀釋40倍。如果化合物IC₅₀ 值非常低，可以降低化合物的起始濃度。　　向384孔檢測板（Thermo，貨號為264706）中添加4uL化合物溶液和2uL的FGFR4激酶溶液，混合均勻後室溫孵育15分鐘；隨後加入4uL底物反應溶液，將反應混合物在室溫孵育60分鐘；隨後加入與反應等體積的10uL檢測液終止反應，混合均勻後室溫放置。60分鐘後，磷酸化的產物同時被Eu³⁺ 標記的籠狀抗體（供體）和鏈黴親和素標記的XL665抗體（受體）識別。在鐳射激發後，靠近的供體和受體發生能量共振轉移，其從供體（620nm）轉移至受體（665nm）的能量用酶標儀EnVision（Perkin Elmer）檢測。665/620的比值與底物的磷酸化程度呈正相關，因此從而檢測FGFR4激酶的活性。　　該實驗中未加酶組作為100%抑制組，加酶但是未加化合物組作為0%抑制組。化合物對FGFR4活性抑制百分比用以下公式計算：抑制百分比=100-100*(比值_化合物 -比值_100% _抑制 )/(比值_0% _抑制 - 比值_100% _抑制 ) 　　化合物的IC₅₀ 值由10個濃度點用Excel中XLfit軟體通過以下公式來計算： Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC₅₀ -X)*slope factor)) 　　其中Y為抑制百分比，Bottom為S型曲線的底部平臺值，Top為S型曲線的頂部平臺值，X為待測化合物濃度的對數值，slope factor為曲線斜率係數。　　　　表1

A﹤10nM；10 nM ≤ B ＜ 100nM；100 nM ≤ C ＜1000nM 　　本發明的實施例化合物對FGFR的活性具有顯著抑制效應，較佳IC₅₀ 為100至1000nM，更佳IC₅₀ 小於100nM，最佳IC₅₀ 小於10nM。 Hep3B細胞增殖抑制的測定　　使用發光細胞活力測試實驗評估本發明的化合物對Hep3B肝癌細胞系細胞增殖的影響（表2）。　　實驗方法概述如下：　　CellTilter-Glo試劑（Promega，貨號為G7572）由CTG凍乾粉和CTG緩衝液組成，使用時將凍乾粉溶解到緩衝液中即可。　　將化合物用DMSO（Sigma，貨號為D5879）溶解稀釋至5mM，然後用DMSO進行4倍的系列稀釋至最低濃度為0.31uM，每個濃度點再用不含FBS的DMEM培養基（ThermoFisher，貨號為11995073）稀釋50倍。如果化合物IC50值非常低，可以降低化合物的起始濃度。　　Hep3B細胞（來自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）在含有10%FBS（GBICO，貨號為10099-141）和100U/mL青鏈黴素混合液（ThermoFisher，貨號為15140122）的DMEM完全培養基中培養，當細胞在培養容器中覆蓋率達80-90%時，用0.25%胰酶（含EDTA）（ThermoFisher，貨號為25200056）消化吹散後種植於白色384孔板（ThermoFisher，貨號為164610），每孔1000細胞（27uL DMEM完全培養基），然後把384孔板置於37ºC、5%CO₂ 的培養箱中培養過夜（18-20小時）。　　過夜後每孔加入3uL DMEM稀釋後的化合物，輕輕離心混勻，然後把384孔板置於37ºC、5%CO₂ 的培養箱中繼續培養，72小時後取出於室溫放置。30分鐘，每孔加15uL平衡至室溫的CTG試劑，置於振盪器上輕輕震盪3分鐘以確保細胞裂解充分，放置10分鐘使冷光信號穩定，然後用EnVision（Perkin Elmer）讀取冷光信號。　　其中，加10uM Blueprint的BLU9931（Cancer Discovery 2015, 5, 424）組的冷光信號作為signal_100% _抑制，加0.2%DMSO組的冷光信號作為signal_0% _抑制。　　化合物對Hep3B細胞增殖抑制的百分比可以用以下公式計算：抑制百分比=100-100*(signal_化合物 -signal_100% _抑制 )/ (signal_0% _抑制 -signal_100% _抑制 ) 　　化合物IC50值由8個濃度點用XLfit（ID Business Solutions Ltd., UK）軟體通過以下公式計算： Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC₅₀ -X)*slope factor)) 　　其中Y為抑制百分比，Bottom為S型曲線的底部平臺值，Top為S型曲線的頂部平臺值，X為待測化合物濃度的對數值，slope factor為曲線斜率係數。　　 RT4細胞增殖抑制的測定　　使用發光細胞活力測試實驗評估本發明的化合物對RT4膀胱癌細胞系細胞增殖的影響（表2）。　　實驗方法概述參照Hep3B細胞增殖抑制的測定方法，其中RT4細胞（來自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）、陽性對照物為Taiho專利申請WO2015008844A1中的實施例1（(S)-1-(3-(4-胺基-3-((3,5-二甲氧基苯基)乙炔基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮）。 SNU-16細胞增殖抑制的測定　　使用發光細胞活力測試實驗評估本發明的化合物對SNU-16胃癌細胞系細胞增殖的影響（表2）。　　實驗方法概述參照Hep3B細胞增殖抑制的測定方法，其中SNU-16細胞（ATCC，HB-8064）、陽性對照物為Novartis的BJG398。　　　　表2

說明：A﹤10nM；10nM≤B＜100nM；100nM≤C＜1000Nm N.D.: 未進行檢測　　本發明的實施例化合物分別對Hep3B、RT4和SNU-16的細胞增殖具有顯著抑制效應，較佳IC₅₀ 為100至1000nM，更佳IC₅₀ 小於100nM。

Claims

一種通式(I)所示的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式：
其中：A為N或CR²；環B為苯環，其中所述苯環任選被一個或多個G¹所取代；R¹獨立地選自H、鹵素、氰基、C_1-6烷基或-NHR³；R²獨立地選自H、鹵素、氰基或C_1-6烷基，其中所述烷基任選被鹵素、氰基、羥基或-OC_1-6烷基所取代；R³獨立地選自H、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被鹵素、氰基、-OR⁴、-NR⁵R⁶、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基所取代；X不存在或為C_1-6伸烷基；Y不存在或選自C_3-8伸環烷基、3-8元伸雜環基、伸芳基或伸雜芳基，其中所述伸環烷基、伸雜環基、伸芳基和伸雜芳基任選被一個或多個G²所取代；Z獨立地選自氰基、-NR⁷CN、

鍵a為雙鍵或三鍵；當鍵a為雙鍵時，R^a、R^b和R^c各自獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個G³所取代；R^a和R^b或R^b和R^c任選與它們連接的碳原子共同形成一任選含有雜原子的3-6元環；當鍵a為三鍵時，R^a和R^c不存在，R^b獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個G⁴所取代；R⁷獨立地選自H、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選可被一個或多個G⁵所取代；G¹、G²、G³、G⁴和G⁵各自獨立地選自鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-8環烷基、3-8元雜環基、C_6-10芳基、5-10元雜芳基、-OR⁸、-OC(O)NR⁸R⁹、-C(O)OR⁸、-C(O)NR⁸R⁹、-C(O)R⁸、-NR⁸R⁹、-NR⁸C(O)R⁹、-NR⁸C(O)NR⁹R¹⁰、-S(O)_mR⁸或-NR⁸S(O)_mR⁹，其中所述烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基任選被一個或多個選自鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-8環烷基、3-8元雜環基、-OR¹¹、-OC(O)NR¹¹R¹²、-C(O)OR¹¹、-C(O)NR¹¹R¹²、-C(O)R¹¹、-NR¹¹R¹²、-NR¹¹C(O)R¹²、-NR¹¹C(O)NR¹²R¹³、-S(O)_mR¹¹或-NR¹¹S(O)_mR¹²的取代基所取代；R⁴、R⁵、R⁶、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²和R¹³各自獨立地選自H、C_1-6烷基、C_3-8環烷基、3-8元單環雜環基、單環雜芳基或苯基；且m為1或2。
根據請求項1所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中A為N或CH，較佳為N。
根據請求項1所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其為以下通式(II)的化合物：
其中：G^a、G^b、G^c和G^d各自獨立地選自H、鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-8環烷基、3-8元雜環基、-OR⁸、-NR⁸R⁹或-C(O)NR⁸R⁹，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個選自鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-8環烷基、3-8元雜環基、-OR¹¹或-NR¹¹R¹²的取代基所取代，並且G^a、G^b、G^c和G^d各自獨立地較佳為-OC_1-2烷基或鹵素；A、R¹、R⁸、R⁹、R¹¹、R¹²、X、Y、Z的定義如權利要求1中所述。
根據請求項1所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其為以下通式(III)的化合物：
其中：G^a和G^b各自獨立地選自H、鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-8環烷基、3-8元雜環基、-OR⁸、-NR⁸R⁹或-C(O)NR⁸R⁹，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個選自鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-8環烷基、3-8元雜環基、-OR¹¹或-NR¹¹R¹²的取代基所取代，並且G^a和G^b各自獨立地較佳為-OC_1-2烷基；A、R¹、R⁸、R⁹、R¹¹、R¹²、X、Y、Z的定義如權利要求1中所述。
根據前述請求項1-4中任一項所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中R¹獨立地選自H、-NH₂或-NHR³；R³獨立地選自C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被鹵素、氰基、-OR⁴、-NR⁵R⁶、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基所取代。
根據前述請求項1-4中任一項所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中R¹獨立地選自H、-NH₂或-NHC_1-6烷基。
根據前述請求項1-4中任一項所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其中：X不存在或為C_1-6伸烷基；Y不存在或選自C_3-8伸環烷基或3-8元伸雜環基；Z獨立地選自氰基、-NR⁷CN、
或
鍵a為雙鍵或三鍵；當鍵a為雙鍵時，R^a、R^b和R^c各自獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個獨立地選自鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-6環烷基、3-6元雜環基、-OR⁸或-NR⁸R⁹的取代基所取代；當鍵a為三鍵時，R^a和R^c不存在，R^b獨立地選自H、氰基、鹵素、C_1-6烷基、C_3-6環烷基或3-6元雜環基，其中所述烷基、環烷基和雜環基任選被一個或多個獨立地選自鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_3-6環烷基、3-6元雜環基、-OR⁸或-NR⁸R⁹的取代基所取代；R⁴、R⁸、R⁹各自獨立地選自H或C_1-6烷基。
根據請求項1所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式，其選自：

或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式。
一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據請求項1-8中任一項所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式和藥學上可接受的載體和賦形劑。
一種根據請求項1-8中任一項所述的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式或根據請求項9所述的藥物組合物在製備用於治療和/或預防FGFR相關性疾病、較佳為腫瘤(例如非小細胞肺癌、食管癌、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、***癌和肝癌，更佳為肝癌、胃癌、非小細胞肺癌和膀胱癌)的藥物中的用途。
一種請求項1-8中任一項的化合物或其可藥用的鹽、異構體及其混合物形式或者請求項9所述的藥物組合物，其用作藥物。