TWI719220B

TWI719220B - 用於血清蛋白的活性保存的新穎方法

Info

Publication number: TWI719220B
Application number: TW106119680A
Authority: TW
Inventors: 崇謹孫; 蘇正堯; 王盛世; 宮川卓也
Original assignee: 英屬維爾京群島商大利緯眾生物科技股份有限公司
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2021-02-21
Also published as: TW201902508A

Abstract

本發明提供一種用於血清蛋白的活性保存的方法。該方法包含步驟：將血清與選自於由白蛋白、三酸甘油酯、甘油、葡聚醣、丙二醇、半乳糖、藻酸鹽及海藻糖所組成之群組中的一或更多種保護劑混合；以及將該混合物凍乾。

Description

用於血清蛋白的活性保存的新穎方法

本發明係關於一種用於血清蛋白的活性保存的方法。

血液通常看起來相對簡單，但其組成若從化學觀點來看，則有些複雜。在大部分的情況下，其有五個主要成分：血清，血漿，凝血因子，脂質和蛋白質以及血球細胞。血清是一種透明，淡黃色的液體，是血液中不含有白血球細胞或紅血球細胞的一部分。在實質上，它是血液中最基本也最中性的部分，不僅作為許多血液最重要的流動背景功能，即從一個地方穿過礦物質，糖和脂肪酸到下一個地方，也提供了理想的一致性及氣候使得血球顆粒可以自由移動。血清包括未用於凝血（血液凝結）和所有電解質、抗體、抗原、激素和任何額外物質如藥物和微生物的所有蛋白質。其中立性使得在許多不同的醫學測試中是有價值的。研究人員有完善分離物質的方法，以用來診斷一系列不同的條件和問題。它有時也被具有淚管問題的人作為淚液，因為它的穩定性通常與天然眼淚相仿。

血清儲存的現有技術是在放血術之後24小時內將血清快速冷凍，並可將其典型地作為新鮮冷凍血清（FFP）儲存達一年。FFP可以在使用前不久解凍。然而，此類儲存方法至少具有以下缺點：（1）除非冷凍為FFP並儲存在超低溫冰箱中，否則血漿可能無法長期儲存；以及（2）解凍後使用時，纖維蛋白原無法保持良好的活性。

本發明提供一種用於血清蛋白的活性保存的方法，包含將血清與選自於由白蛋白、三酸甘油酯、甘油、葡聚醣、丙二醇、半乳糖、藻酸鹽及海藻糖所組成之群組中的一或更多種保護劑混合。

較佳地，該方法包含將血清與選自於由白蛋白、三酸甘油酯、甘油、葡聚醣、丙二醇、半乳糖、藻酸鹽及海藻糖所組成之群組中的二或更多種保護劑混合。根據本發明的部分具體實施例，該二或更多種保護劑係選自於由甘油、藻酸鹽及海藻糖所組成之群組。

在本發明的部分具體實施例中，該二或更多種保護劑包含海藻糖為一第一保護劑，以及甘油或藻酸鹽為一第二保護劑。根據本發明之一具體實施例，該二或更多種保護劑包含海藻糖及甘油。在另一具體實施例中，該二或更多種保護劑包含海藻糖及藻酸鹽。

根據本發明，在混合步驟中，該血清可進一步與選自於由於由葡聚醣、丙二醇、蔗糖、半乳糖、三酸甘油酯及其組合所組成之群組中的一或更多種保護劑混合。

本發明之方法可用來保護血清中的生長因子以免降解，血清中的生長因子包括但不限於PDGF-AB、TGF-β1及VEGF。

應當理解的是，前文的一般性描述和以下的實施方式都只是例示性和說明性的，而不是對本發明的限制。

本發明提供一種用於血清蛋白的活性保存的方法，其包含將血清與選自於由白蛋白、三酸甘油酯、甘油、葡聚醣、丙二醇、半乳糖、藻酸鹽及海藻糖所組成之群組中的一或更多種保護劑混合。

根據本發明，可以下述的量添加保護劑：（1）基於血清的體積為0.01-10％（v/v）、較佳為0.1-5％（v/v）的甘油；（2）基於血清的體積為0.01％-10％（v/v）、較佳為0.1-5％（v/v）的海藻酸；（3）基於血清的體積為0.01％-10％（v/v）、較佳0.1-10％（v/v）為的海藻糖。

在本發明的部分具體實施例中，該二或更多種保護劑包含海藻糖為一第一保護劑，以及甘油或藻酸鹽為一第二保護劑。

根據本發明的一具體實施例，該二或更多種保護劑包含海藻糖及甘油。例如，可以添加以下量的保護劑（基於血漿的體積）：約2％（v/v）的海藻糖及約2％（v/v）的甘油。

在另一具體實施例中，該二或更多種保護劑包含海藻糖及藻酸鹽。例如，可以添加以下量的保護劑（基於血漿的體積）：約2％（v/v）的海藻糖及約2％（v/v）的藻酸鹽。

根據本發明，在混合步驟中，該血清係進一步與選自於由葡聚醣、丙二醇、蔗糖、半乳糖、三酸甘油酯及其組合所組成之群組中的一或更多種保護劑混合。

通過以下實例進一步說明本發明，其係以說明之目的提供，而非限制。

實例 1 ：血清的製備

從志願捐贈者收集全血必須由受過放血術/靜脈穿刺訓練的個人使用具有抗凝血劑（1 ml抗凝血檸檬酸鹽右旋糖（ACD）溶液配方/每10 ml血液）的雙聯血袋系統（約50 ml）（TerumoBCT，日本）進行。收集血液之後，藉由將管反轉數次來和緩地混合血液，以確保與抗凝血劑充分混合。為了將收集的血液充分混合到檸檬酸鹽管中，建議將管反轉3-4次，而ACD管應被反轉8次。抗凝血劑(A)加入1ml 5mM的CaCl₂ 後活化，以產生內源性凝血酶及誘導纖維蛋白聚合還有PLT活化。混合物在輕度旋轉下混合直到凝塊形成，接著離心。離心後，上清液(血清)會呈現在凝固的紅血球層之上，來自不同組別的上清液(血清)分別混合到無菌過濾館中。

實例 2 ：血清凍乾粉末的製備

將適量的保護劑加到新鮮收集的血清中並充分混合以獲得混合物。然後將混合物凍乾成粉末。

表1：使用甘油、藻酸鹽及海藻糖的保護劑量

實例 3 ：生長因子的量的檢測

將凍乾後分別經過1小時、3個月及12個月的20 mg血清粉末溶解在1 mL鹽水中並充分混合。在重組後1小時內藉由市售免疫分析以分析樣品。以一式三份化驗標準品和樣品，並計算平均值。將結果乘以應用於樣品的稀釋因子。

藉由ELISA分析量測PDGF-AB、TGF-β1、及VEGF的量。

1. PDGF-AB：使用DueSet® ELISA套組（#DY222, R&D Systems, Minneapolis, Minn.）測定PDGF-AB的量。將樣品在試劑稀釋劑中稀釋20倍。將盤（微量多孔盤）培養2小時、洗滌、並在室溫下與酶結合的抗PDGF-AB抗體培養另外2小時。使用洗滌緩衝液洗滌孔，然後在室溫下加入基質溶液20分鐘。保護孔免於光線照射。將終止溶液加到每個孔中，並使用微孔盤讀取機（Gen5, Biotek, VT, USA）測定在450 nm處吸收。範圍可檢測劑量是15.6-1000 pg/ml。

2. TGF-β1：藉由DueSet® ELISA套組（#DY240, R&D Systems）測定TGF-β1的量。將樣品在試劑稀釋劑中稀釋20倍。在塗有TGF-β受體II的96孔微量盤中製備一個稀釋系列的、體積100 μl的TGF-β1標準品。在分析TGF-β1之前，進行酸活化和中和以將潛伏的TGF-β1活化成免疫反應的形式。為此目的，將0.5 ml的樣品與0.1 ml的1N HCl混合、在室溫下培養10分鐘、藉由添加0.1 ml來自Sigma（H-7523）的1.2N NaOH/0.5M HEPES（N- [2-羥乙基]哌嗪-N0-[2-乙磺酸]）而中和、並離心。然後測定上清液部分的總TGF-β1含量。將等分試樣（50 μl）一式兩份施加於微量盤，然後將微量盤覆蓋並在室溫下培養2小時。接著將孔進行洗滌、加入針對TGF-b1的酶結合多株抗體、並在室溫下繼續培養2小時。如上所述完成量測。TGF-β1的範圍檢測限值為31.20-2000 pg/ml。

3. VEGF：使用DueSet® ELISA套組（#DY293B, R&D Systems, Minneapolis, Minn.）測定VEGF量。將樣品在試劑稀釋劑中稀釋2倍。範圍可檢測劑量通常小於31.2-2000 pg/ml。將100 μl的試驗試劑稀釋劑加到每個孔中，然後加入100 μl的標準品（VEGF標準品）。將盤用膠條覆蓋並在室溫下培養2小時。將孔洗滌4次，然後在室溫下與酶-共軛的VEGF培養2小時。如上所述完成量測。

將所有測試都重複三次，並藉由SPSS22軟體以單向ANOVA、F檢驗、及Duncan檢定分析結果，而且將結果表示為平均值 ± SD。相同儲存時間條形條紋中具有不同字母的平均值是有顯著差異的（P ＜ 0.05）。結果顯示於圖1A-18C中。

所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，可以在不脫離本發明的廣義概念之下對上述具體實施例進行改變。因此，應當理解的是，本發明並不限於所揭示的特定具體實施例，而是意圖包含所附申請專利範圍所界定之具本發明的精神和範圍內之修改。

無

當結合附圖閱讀時，將可更佳地理解前述發明內容以及如後的本發明的詳細描述。在圖式中：

圖1A-1C顯示自使用白蛋白作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖1A顯示PDGF-AB的量，圖1B顯示TGF-β1的量，圖1C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（w/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖2A-2C顯示自使用明膠作為保護劑的血清粉末還原的血漿中的生長因子的量。圖2A顯示PDGF-AB的量，圖2B顯示TGF-β1的量，圖2C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（w/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖3A-3C顯示自使用甘胺酸 作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖3A顯示PDGF-AB的量，圖3B顯示TGF-β1的量，圖3C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（w/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖4A-4C顯示自使用絲胺酸 作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖4A顯示PDGF-AB的量，圖4B顯示TGF-β1的量，圖4C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（w/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖5A-5C顯示自使用三酸甘油酯作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖5A顯示PDGF-AB的量，圖5B顯示TGF-β1的量，圖5C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（w/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖6A-6C顯示自使用甘油作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖6A顯示PDGF-AB的量，圖6B顯示TGF-β1的量，圖6C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（w/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖7A-7C顯示自使用葡聚醣作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖7A顯示PDGF-AB的量，圖7B顯示TGF-β1的量，圖7C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖8A-8C顯示自使用丙二醇作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖8A顯示PDGF-AB的量，圖8B顯示TGF-β1的量，圖8C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖9A-9C顯示自使用藻酸鹽作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖9A顯示PDGF-AB的量，圖9B顯示TGF-β1的量，圖9C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖10A-10C顯示自使用核糖作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖10A顯示PDGF-AB的量，圖10B顯示TGF-β1的量，圖10C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖11A-11C顯示自使用***糖作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖11A顯示PDGF-AB的量，圖11B顯示TGF-β1的量，圖11C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖12A-12C顯示自使用葡萄糖作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖12A顯示PDGF-AB的量，圖12B顯示TGF-β1的量，圖12C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖13A-13C顯示自使用半乳糖作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖13A顯示PDGF-AB的量，圖13B顯示TGF-β1的量，圖13C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖14A-14C顯示自使用蔗糖作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖14A顯示PDGF-AB的量，圖14B顯示TGF-β1的量，圖14C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血漿）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖15A-15C顯示自使用海藻糖作為保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖15A顯示PDGF-AB的量，圖15B顯示TGF-β1的量，圖15C顯示VEGF的量。使用的保護劑量基於血清的體積：％表示（v/v）％。對照組：僅血清。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血漿）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜0.05）。

圖16A-16C顯示自使用兩種（2）保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖16A顯示PDGF-AB的量，圖16B顯示TGF-β1的量，圖16C顯示VEGF的量。對照組：僅血清。1：2％葡聚醣+ 2％甘油；2：2％甘胺酸 + 2％葡聚醣；3：2％葡聚醣+ 2％絲胺酸 ；4：2％葡聚醣+ 2％蔗糖；5：2％葡聚醣+ 2％葡萄糖；6：2％葡聚醣+ 1.6％***糖；7：2％葡聚醣+ 1.6％核糖。使用的保護劑量基於血清的體積：％用於甘油以（v/v）％表示，用於其他保護劑以（w/v）％表示。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜ 0.05）。

圖17A-17C顯示自使用兩種（2）保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖17A顯示PDGF-AB的量，圖17B顯示TGF-β1的量，圖17C顯示VEGF的量。對照組：僅血清。1：2％藻酸鹽+ 2％甘胺酸 ；2：2％藻酸鹽+ 2％海藻糖；3：2％藻酸鹽+ 2％蔗糖；4：2％藻酸鹽+ 2％葡萄糖；5：2％藻酸鹽+ 2％半乳糖；6：2％藻酸鹽+ 1.6％***糖；7：2％藻酸鹽+ 1.6％核糖。使用的保護劑量基於血清的體積：％用於其他保護劑以（w/v）％表示。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜ 0.05）。

圖18A-18C顯示自使用兩種（2）保護劑的血清粉末還原的血清中的生長因子的量。圖18A顯示PDGF-AB的量，圖18B顯示TGF-β1的量，圖18C顯示VEGF的量。對照組：僅血清。1：2％甘油+ 2％三酸甘油酯；2：2％甘油+ 2％甘胺酸 ；3：2％甘油+ 2％絲胺酸 ；4：2％甘油+ 2％海藻糖；5：2％藻甘油+ 2％蔗糖；6：2％甘油+ 1.6％葡萄糖；7：2％甘油+ 1.6％核糖。使用的保護劑量基於血清的體積：％用於三酸甘油酯和甘油以（v/v）％表示，用於其他保護劑以（w/v）％表示。以相同式樣（在凍乾後相同時間（1小時、3個月或12個月）後還原的血清）但不同字母的條形顯示的數據之間的差異是統計學上顯著的（P ＜ 0.05）。

無

Claims

一種用於血清蛋白的活性保存的方法，其包含將血清與選自於由三酸甘油酯、甘油、及葡聚醣所組成之群組中的二或更多種保護劑混合以獲得一混合物；以及將該混合物凍乾。
如請求項第1項之方法，其中該些保護劑係葡聚醣及甘油。
如請求項第1項之方法，其中該些保護劑係甘油及三酸甘油酯。
一種用於血清蛋白的活性保存的方法，其包含將血清與三酸甘油酯混合以獲得一混合物；以及將該混合物凍乾。