CN105628935A - 一种检测人尿中cd80的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测人尿中CD80的试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗人CD80抗体的固相载体、酶标记的另一抗人CD80抗体、CD80标准品、样品稀释液、洗涤液和发光底物液。本发明的优点在于建立了一种仅适用于尿液中微量CD80的灵敏、特异的定量检测试剂盒，不受尿液中的其他成分干扰。本发明试剂盒基于固相酶促化学发光法，以包被抗人CD80抗体的微孔板为固相载体，用辣根过氧化物酶为催化酶催化发光底物发光，显著提高了试剂的检测灵敏度。本发明为微小病变肾病的鉴别诊断提供了一种无创的检测手段，有助于改善肾活检穿刺依赖的微小病变肾病的诊断现状。

Description

一种检测人尿中CD80的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种检测人尿中CD80的试剂盒。
背景技术
CD80，又称B7-1，是最早发现的共刺激分子，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，以单体的形式表达于B细胞及其他抗原提呈细胞(APC)的表面。T细胞的活化、增殖、分化继而发挥其生物学效应至少需要双重信号的参与。第一信号是人类主要组织相容性复合体(MHC)/抗原肽/T细胞受体(TCR)复合物，第二信号是非抗原依赖的共刺激信号(ImmunolToday,1994,15:321-331)。后者由T细胞膜上表达的配体CD28与APC膜上表达的共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)相结合而完成。CD80(B7-1)和CD86(B7-2)在T细胞活化中的作用有何不同尚无定论，CD86常低水平表达于B细胞、巨噬细胞以及树突状细胞的表面，抗原刺激后表达迅速上调，而CD80则为诱导性表达，生理状态下不表达或低表达，且抗原刺激后表达上调速度慢，3-4天后表达才开始上调，因此CD86可能作用于免疫应答初期，而CD80可能在免疫应答后期起一定的作用(ImmunolToday,1999,20:285-288；CurrOpinCellBiol,1999,11:203-210；国际泌尿***杂志,2013,33:282-285)。
微小病变型肾病(MinimalChangeDisease,MCD)是肾病综合征的常见类型，目前，其诊断依赖于肾脏活检穿刺。MCD患者的尿中CD80的水平较其他肾小球疾病，包括局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、急性肾小球肾炎(AGN)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、IgA肾病、膜性肾病(MN)，以及***性红斑狼疮肾炎和正常对照均显著增高(JAmSocNephrol,2009,20:260-266)。在MCD患者的肾脏活检组织中发现CD80仅表达于足细胞(KidneyInt,2010,78:296-302)。因此，人尿中CD80(B7-1)含量的检测，可为肾脏病MCD的诊断和鉴别诊断提供依据，有望改善肾活检穿刺依赖的微小病变肾病的诊断现状。
通过国内专利检索，人尿中CD80(B7-1)的检测尚无专利授权或申报。与CD80密切相关的专利有：①抗人CD80双价抗体及其应用：所述双价抗体由重链可变区和轻链可变区组成，其特征在于，两者间由连接肽Gly4Ser相连，此发明所述双价抗体与抗原的结合能力强，对Raji细胞具有明显的抑制作用，可以用于肿瘤成像中，也可以应用在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中。(申请号：CN201110056304；未授权；法律状态：发明专利申请公布后的视为撤回)；②免疫性疾病的诊断方法：包括用例如识别CD80抗原的抗人CD80单克隆抗体对分离自人的体液中淋巴细胞和/或淋巴细胞亚群的CD80抗原阳性率进行免疫学测定的步骤。其特征在于:可对各种免疫疾病进行简便且准确的诊断,与以前的诊断方法相比,从患者中可分离的外周血等体液中所含有的淋巴细胞的操作简便,患者的负担小。而且还提供了含有作为能减轻或预防免疫疾病的药物的特异性识别CD80抗原的人抗CD80抗原抗体(申请号：CN201380047212；未授权；法律状态：公开)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种新的灵敏度高、特异性强的检测人尿中CD80的试剂盒。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种检测人尿中CD80的试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗人CD80抗体的固相载体、酶标记的另一抗人CD80抗体、CD80标准品、样品稀释液、洗涤液和发光底物液。
优选地，所述人尿为晨尿。其中24小时尿液或门诊随机尿次之。
优选地，所述固相载体是由聚苯乙烯制成的不透明微孔板。更优选地所述固相载体是黑色或白色微孔板。
优选地，所述包被有抗人CD80抗体的固相载体是由以下方法制备而成的：
将抗人CD80抗体按照比例(抗人CD80抗体：包被液＝2～10μg：1mL)的量加入至包被液中，得到含有抗人CD80抗体的包被液，其中所述包被液为pH＝9.6、0.05M的碳酸盐；再将所述含有抗人CD80抗体的包被液按100μL/孔加入至微孔板中，4℃放置24小时；去除包被液后，按150μL/孔加入封闭液至微孔板中，37℃放置2～3小时，其中所述封闭液包括浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)，1％(w/v)的牛血清白蛋白，0.05％(v/v)的proclin300和5％(w/v)的蔗糖；甩掉封闭液，拍干微孔板，室温除湿干燥24～72小时，锡箔纸封袋，置2～8℃保存。
优选地，所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的二抗。所述二抗是与CD80结合的检测抗体。
优选地，所述酶标二抗是由以下方法制备而成：
用戊二醛偶联法将二抗与辣根过氧化物酶偶联，再用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度，其中酶标抗体稀释液包括浓度为0.01～0.05mol/L、pH为7.2～7.4的PBS，0.5％(w/v)的牛血清白蛋白和0.1％(v/v)的proclin300。
所述抗人CD80抗体和二抗，可以采用重组表达的人CD80免疫BALB/c小鼠，再经单克隆筛选制备获得，或用商品化人CD80抗体。
优选地，所述CD80标准品为CD80重组蛋白。
优选地，所述样品稀释液包括浓度为0.01～0.2mol/L、pH为5.7～7.0的PBS。
优选地，所述洗涤液包括浓度为0.01～0.2mol/L、pH为7.2～7.4的PBS，和体积浓度为0.01％～0.05％(v/v)的TritonX-100。
优选地，所述发光底物液包括发光底物A液和发光底物B液，所述发光底物A液包括鲁米诺和异鲁米诺中的至少一种以及发光增强剂，所述发光底物B液包括过氧化氢和过氧化脲中的至少一种以及稳定剂。优选地，所述发光底物A液和发光底物B液的体积比为1:1。
本发明试剂盒的使用方法如下：
(1)试剂盒保存于2～8℃冰箱，使用前先将试剂盒平衡至室温，平衡时间不少于30分钟；
(2)将100μl待检的尿液标本和CD80系列标准品分别加入微孔板的不同板孔中，于37℃反应30分钟；
(3)用洗涤液洗涤板孔2～3次，每次静置3～5分钟，最后弃去洗涤液；
(4)将100μl辣根过氧化物酶标记的二抗加入步骤(3)洗涤后的板孔中，于37℃反应30分钟；
(5)用洗涤液洗涤板孔2～3次，每次静置3～5分钟，最后弃去洗涤液；
(6)将发光底物A液和B液按1:1的体积混匀后，加入步骤(5)洗涤后的板孔中，再将微孔板放入化学发光检测仪中，检测发光值；
(7)根据发光值与CD80标准品的浓度关系计算待检测的尿液中CD80的含量。
本发明的有益效果在于：本发明的优点在于建立了一种仅适用于尿液中微量CD80的灵敏、特异的定量检测试剂盒，不受尿液中其他成分的干扰。本发明试剂盒基于固相酶促化学发光法，以包被抗人CD80抗体的微孔板为固相载体，用辣根过氧化物酶为催化酶催化发光底物发光，显著提高了试剂的检测灵敏度。本发明为微小病变肾病的鉴别诊断提供了一种检测手段，有助于改善肾活检穿刺依赖的微小病变肾病的诊断现状。
附图说明
图1为采用本发明所述试剂盒检测微小病变肾病(MCD)患者、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者和狼疮肾炎患者尿液标本中CD80的含量结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一、检测人尿中CD80的试剂盒的制备
1、抗人CD80抗体的固相载体的制备：
将抗人CD80抗体按照比例(抗人CD80抗体：包被液＝2μg：1mL)的量加入至包被液中，得到含有抗人CD80抗体的包被液，其中所述包被液为pH＝9.6、0.05M的碳酸盐；再将所述含有抗人CD80抗体的包被液按100μL/孔加入至微孔板中，4℃放置24小时；去除包被液后，按150μL/孔加入封闭液至微孔板中，37℃放置3小时，其中所述封闭液包括浓度为0.01mol/L、pH为7.2的PBS，1％(w/v)的牛血清白蛋白，0.05％(v/v)的proclin300和5％(w/v)的蔗糖；甩掉封闭液，拍干微孔板，室温除湿干燥24小时，锡箔纸封袋，置2～8℃保存。
2、酶标二抗的制备：
用戊二醛偶联法将二抗与辣根过氧化物酶偶联，再用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度，其中酶标抗体稀释液包括浓度为0.01mol/L、pH为7.2的PBS，0.5％(w/v)的牛血清白蛋白和0.1％(v/v)的proclin300。过滤除菌，置2～8℃保存。
3、CD80标准品的制备：
将基因重组的人CD80(即CD80重组蛋白)用标准品稀释液稀释至要求浓度，其中标准品稀释液包括浓度为0.01mol/L、pH为7.2的PBS，0.5％(w/v)的牛血清白蛋白和0.1％(v/v)的proclin300。过滤除菌，置2～8℃保存。
4、样品稀释液的制备：
取Na2HPO4溶液母液和KH2PO4溶液母液按比例混合，配置浓度为0.05mol/L、pH为6.0的PBS。
5、洗涤液的制备：
取Na2HPO4溶液母液和KH2PO4溶液母液按比例混合，配置浓度为0.05mol/L、pH为7.2的PBS。同时，洗涤液含体积浓度为1/10000(v/v)的TritonX-100。
6、发光底物A液和发光底物B液的制备：
其中发光底物A液包括鲁米诺和异鲁米诺中的至少一种以及发光增强剂，发光底物B液包括过氧化氢和过氧化脲中的至少一种以及稳定剂。使用时将发光底物A液和发光底物B液按1:1等体积混合均匀后使用。本实施例所用发光底物为ThermoScientific公司的SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate，也可以用其他商业化的产品。
该实施案例，所用的抗人CD80抗体和二抗，均为本实验室制备，当然也可以采用其它市售的抗体。
二、检测人尿中CD80的试剂盒的使用方法
(1)使用前先将试剂盒平衡30分钟至室温；
(2)将待检的微小病变肾病(MCD)患者、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者、狼疮肾炎患者的尿液标本(各100μl)和CD80系列标准品分别加入到微孔板的不同板孔中，于37℃反应30分钟；
(3)用洗涤液洗涤板孔3次，每次静置3分钟，最后弃去洗涤液；
(4)将100μl辣根过氧化物酶标记的人CD80抗体加入到步骤(3)洗涤后的板孔中，于37℃反应30分钟；
(5)用洗涤液洗涤步骤(4)中反应后的板孔3次，每次静置3分钟，最后弃去洗涤液；
(6)将发光底物A液和B液按1:1的体积混匀后，加入至步骤(5)洗涤后的板孔中，再将微孔板放入化学发光检测仪中，检测发光值；
(7)根据发光值与CD80标准品的浓度关系计算待检测的尿液中CD80的含量；
(8)结果如图1所示，发病期MCD患者尿中可检测到较高水平的CD80(ng/g肌酐)，而正常人、MCD缓解期、FSGS患者发病期和狼疮肾炎患者尿中的CD80水平则极低或无(其中MCD为微小病变肾病的患者、FSGS为局灶节段性肾小球硬化的患者)。
三、本发明试剂盒的方法学评价
(1)准确性
准确性检测指把已标定的不同含量的CD80标准品加入到含CD80的人尿液中，将其检测结果与加入的量，进行对比，计算CD80的回收率。结果如下表1所示。
表1CD80的回收率
编号 加入浓度(pg/ml) 回收浓度(pg/ml) 回收率
1 3200 3173 99.16％
2 1600 1628 101.75％
3 800 784 98％
4 400 413 103.25％
5 200 187 93.5％
6 100 106 106％
表1中可以看出，回收率在95-110％之间，满足准确性的可接受标准。
(2)精密性
选择3份不同浓度的标本，按本发明试剂盒的检测方法，在不同时间，重复检测10次，分析10次的检测结果，计算平均偏差CV(％)值，其结果如表2所示。
表2精密性结果
(3)分析灵敏度
分析灵敏度定义：在统计学上可以与零剂量区别的量。重复10次测量0值标准品，计算其平均值(X)和标准差(SD)，将X+2SD计算的结果就是该试剂盒的分析灵敏度。本发明的试剂盒灵敏度为15pg/ml，满足试剂盒灵敏度的要求。
(4)特异性
用该试剂盒测定含浓度为1000pg/ml的人血清白蛋白(HSA)，转铁蛋白，免疫球蛋白IgG时，不影响检测结果。
(5)相关性
浓缩尿液后跑SDS-PAGE电泳，然后转膜做免疫印迹(Westernblot)，以HRP-抗人CD80为检测抗体，化学发光底物为ThermoScientific公司的SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate。对比该方法和本发明试剂盒的检测结果如表3所示。
表3免疫印迹法与本发明试剂盒的检测结果
两种方法的阳性符合率＝98.1％，阴性符合率＝84.6％，总符合率＝95.5％。
综上，本发明的试剂盒可定量检测尿液中的微量CD80，具有灵敏度高、特异性好的优点。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽可能参照较佳实施例对本发明作了详细说明，可为本领域的普通技术人员所理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被有抗人CD80抗体的固相载体、酶标二抗、CD80标准品、样品稀释液、洗涤液和发光底物液。
2.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述人尿为晨尿。
3.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述固相载体是由聚苯乙烯制成的不透明微孔板。
4.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述包被有抗人CD80抗体的固相载体是由以下方法制备而成的：
将抗人CD80抗体按照比例(抗人CD80抗体：包被液＝2-10μg：1mL)的量加入至包被液中，得到含有抗人CD80抗体的包被液，其中所述包被液为pH＝9.6、0.05M的碳酸盐；再将所述含有抗人CD80抗体的包被液按100μL/孔加入至微孔板中，4℃放置24小时；去除包被液后，按150μL/孔加入封闭液至微孔板中，37℃放置2～3小时，其中所述封闭液包括浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS，1％(w/v)的牛血清白蛋白，0.05％(v/v)的proclin300和5％(w/v)的蔗糖；甩掉封闭液，拍干微孔板，室温除湿干燥24～72小时，锡箔纸封袋，置2～8℃保存。
5.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的二抗。
6.根据权利要求5所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗是由以下方法制备而成：
用戊二醛偶联法将二抗与辣根过氧化物酶偶联，再用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度，其中酶标抗体稀释液包括浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS，0.5％(w/v)的牛血清白蛋白和0.1％(v/v)的proclin300。
7.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述CD80标准品为CD80重组蛋白。
8.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液包括浓度为0.01～0.2mol/L、pH为5.7～7.0的PBS。
9.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括浓度为0.01～0.2mol/L、pH为7.2～7.4的PBS，和体积浓度为0.01％～0.05％(v/v)的TritonX-100。
10.根据权利要求1所述的检测人尿中CD80的试剂盒，其特征在于，所述发光底物液包括发光底物A液和发光底物B液，所述发光底物A液包括鲁米诺和异鲁米诺中的至少一种以及发光增强剂，所述发光底物B液包括过氧化氢和过氧化脲中的至少一种以及稳定剂。
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