TWI718528B

TWI718528B - 免疫阻斷粒子的製備方法及該免疫阻斷粒子的用途

Info

Publication number: TWI718528B
Application number: TW108115431A
Authority: TW
Inventors: 林宏殷; 李玫樺; 陳軍任; 李謹安
Original assignee: 國立高雄大學
Priority date: 2019-05-03
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2021-02-11
Also published as: TW202041526A

Abstract

一種免疫阻斷粒子的製備方法，包含：混合數個功能性單體、一模版胜肽及一溶劑，使該該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽；該模版胜肽包含如SEQ ID NO：1、2、3、5、6或7所示之胺基酸序列。藉此，該免疫阻斷粒子能夠阻斷細胞程序性死亡受體1(PD-1)與細胞程序性死亡配體1(PD-L1)的專一性結合，進而應用於癌症免疫療法。

Description

免疫阻斷粒子的製備方法及該免疫阻斷粒子的用途

本發明係關於一種粒子的製備方法，尤其是一種免疫阻斷粒子的製備方法。本發明另關於該免疫阻斷粒子的用途。

癌症免疫療法(cancer immunotherapy)係指藉由人為刺激免疫系統，提高免疫系統對抗癌症的能力，以治療癌症的方法。舉例而言，細胞程序性死亡受體1(programmed cell-death protein 1，簡稱PD-1)及細胞程序性死亡配體1(programmed cell-death ligand 1，簡稱PD-L1)的專一性結合可以抑制與T細胞的活化有關的免疫檢查點途徑(immune checkpoint pathway)。

因此，若是能夠開發出對PD-1具有專一性的藥物，即能夠作為免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，簡稱ICI)，可以阻斷癌細胞的自我保護機制，使自然殺手細胞(natural killer cell，簡稱NK細胞)不再受到免疫檢查點的調控，能夠恢復對抗癌細胞的能力。

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種免疫阻斷粒子的製備方法，係用以製備獲得可以應用於癌症免疫療法的免疫阻斷粒子者。

本發明的次一目的是提供一種免疫阻斷粒子的製備方法，係用以製備獲得可以應用於光動力療法的免疫阻斷粒子者。

本發明的再一目的是提供一種免疫阻斷粒子的製備方法，係能夠製備獲得容易分離純化的免疫阻斷粒子者。

本發明的再一目的是提供一種免疫阻斷粒子的用途，係用以製備治療肝癌的藥物者。

本發明的免疫阻斷粒子的製備方法，包含：混合數個功能性單體、一模版胜肽、一光敏劑、一磁性顆粒及一溶劑，使該該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽、該光敏劑及該磁性顆粒包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物，其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，該光敏劑可以為部花青素，該磁性顆粒的磁化率大於±0.1emu/g，且該磁性顆粒的表面經(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷進行修飾；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽，以獲得該免疫阻斷粒子，該免疫阻斷粒子的表面具有對應該模版胜肽的數個辨識孔位；其中，該模版胜肽包含如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列。

據此，本發明的免疫阻斷粒子的製備方法，可以獲得表面具有能夠辨識PD-1蛋白質的辨識孔位之免疫阻斷粒子，因此當該免疫阻斷粒子投予一所需個體時，即能夠在該所需個體的體內阻斷癌細胞的自我保護機制(即，細胞程序性死亡受體1及細胞程序性死亡配體1的專一性結合)，促進自然殺手細胞的活性，該免疫阻斷粒子能夠應用於癌症免疫療法，為本發明之功效。又，該數個功能性單體能夠聚合形成穩定的結構，並使該免疫阻斷粒子具有良好的生物相容性，進而避免在將該免疫阻斷粒子投予該生物體時，使該生物體發生不良的反應。再且，當該免疫阻斷粒子投予該所需個體後，更可以對該所需個體施予一光能，使該光敏劑受到波長為540nm光照而激活，以有效產生能夠誘發光毒性的自由基，促進癌細胞的死亡。此外，工者能夠藉由施以外界磁場分離純化該免疫阻斷粒子(例如，利用磁石進行吸附)，達成提升該免疫阻斷粒子在進行分離純化時的便利性之功效。

本發明的免疫阻斷粒子的製備方法，其中，各該功能性單體為乙烯莫耳百分比為5~50mol%的聚乙烯乙烯醇。如此，該免疫阻斷粒子具有較佳的拓印效果。

本發明的免疫阻斷粒子的製備方法，其中，該溶劑為水。如此，可以降低該免疫阻斷粒子的製備成本。

本發明的免疫阻斷粒子的用途，係應用於製備治療肝癌的藥物，其中，該免疫阻斷粒子係以如上述的免疫阻斷粒子的製備方法所製備獲得。

據此，本發明的免疫阻斷粒子能夠阻斷PD-1與PD-L1的專一性結合，因而可以作為一種癌症免疫療法的活性成分，為本發明之功效。

本發明的免疫阻斷粒子的用途，其中，該免疫阻斷粒子係以口服投予、靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射的方式投予一所需個體。如此，藉由投予途徑的調整，使該免疫阻斷粒子能夠有效地進入該所需個體的體內。

本發明的免疫阻斷粒子的用途，其中，該免疫阻斷粒子係以每週每公斤之所需個體投予0.001~1000毫克的劑量投予該所需個體。如此，藉由投予劑量的調整，使該免疫阻斷粒子能夠有效地發揮其生物活性，促進癌細胞的死亡。

本發明的免疫阻斷粒子的用途，其中，該免疫阻斷粒子係與自然殺手細胞混合後，共同投予該所需個體。如此，可以在混合該免疫阻斷粒子與自然殺手細胞時，即先行活化自然殺手細胞，使得投予該所需個體的經活化之自然殺手細胞可以快速地發揮其生物活性，促進癌細胞的死亡。

本發明的免疫阻斷粒子的用途，其中，將該免疫阻斷粒子投予該所需個體後，以波長為460~580nm的光照射該所需個體的患部0.01~30分鐘。如此，可以使該光敏劑受到光照而激活，以產生能夠誘發光毒性的自由基，而促進癌細胞的死亡。

〔第1a圖〕試驗(A)中，第A1~A3組奈米粒子的平均粒徑的柱狀圖。

〔第1b圖〕試驗(A)中，第A0~A3組奈米粒子的粒徑分布圖。

〔第2圖〕試驗(B)中，第B0~B1組奈米粒子的模版胜肽吸附量的柱狀圖。

〔第3圖〕試驗(C)中，免疫阻斷粒子mAIP的模版胜肽吸附量變化曲線圖。

〔第4圖〕試驗(D)中，免疫阻斷粒子mAIP的模版胜肽吸附量變化曲線圖。

〔第5圖〕試驗(E)中，第E0~E1組奈米粒子的模版胜肽吸附量變化曲線圖。

〔第6圖〕試驗(F)中，第F0~F1組奈米粒子的磁通量變化曲線圖。

〔第7圖〕試驗(G)中，第G1~G2組奈米粒子的比表面積柱狀圖。

〔第8圖〕試驗(H)中，第H1~H4組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第9a圖〕試驗(I)中，第I1-0~I1-2組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第9b圖〕試驗(I)中，第I2-0~I2-2組肝癌細胞的細胞存活率。

〔第10圖〕試驗(J)中，第J0~J2組肝癌細胞中，細胞凋亡途徑中的主要蛋白質之半胱天冬酶-8(caspase-8，簡稱CASP8)、半胱天冬酶-3(caspase- 3，簡稱CASP3)及核因子活化B細胞κ輕鏈增強子p105次單元(nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit，簡稱NFKB1)的相對基因表現量。

〔第11圖〕試驗(K)中，第K1、K2組肝癌細胞的細胞存活率。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之一實施例的免疫阻斷粒子的製備方法，係藉由使數個功能性單體(functional monomer)及一模版胜肽共同形成一分子拓印聚合物，續移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽所獲得。

詳而言之，該數個功能性單體可以進行聚合，並且於進行聚合的同時包覆該模版胜，以形成該分子拓印聚合物，該分子拓印聚合物的表面會形成數個辨識孔位(recognition site)，各該辨識孔位係對應該模版胜肽的立體結構，因而在移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽之後所獲得的免疫阻斷粒子的表面即會具有該辨識孔位。舉例而言，該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇(poly(ethylene-co-vinyl alcohol)，簡稱EVAL)、甲殼素、聚(羥甲基3,4-伸乙基二氧噻吩)(poly(hydroxymethyl 3,4-ethylene dioxythiophene、聚(苯胺-共-甲酸(poly(aniline-co-metanilic acid))、聚苯硫醚(poly(p-phenylene sulfide))、聚噻吩(poly(thiophene))。於本實施例中，該功能性單體為聚乙烯乙基乙烯醇，其乙烯莫耳百分比介於5~50mol%之間，其能夠形成穩定的結構，且具有良好的生物相容性。

為了使該免疫阻斷粒子能夠作為免疫檢查點抑制劑，本實施例中，該模版胜肽可以為PD-1蛋白質的部分片段，使該免疫阻斷粒子的表面具有可以辨識PD-1蛋白質的辨識孔位，進而將該免疫阻斷粒子投予一所需個體時，可以阻斷癌細胞的自我保護機制(即，PD-1及PD-L1的專一性結合)，使自然殺手細胞不再受到免疫檢查點的調控。於本發明之第一實施例中，該模版胜肽為人類PD-1蛋白質的部分片段，其包含如SEQ ID NO：1、2或3所示之胺基酸序列，較佳地，該模版胜肽為由如SEQ ID NO：1、2、3或4所示之胺基酸序列所組成；於本發明之第二實施例中，該模版胜肽為小鼠PD-1蛋白質的部分片段，其包含如SEQ ID NO：5、6或7所示之胺基酸序列，較佳地，該模版胜肽為由如SEQ ID NO：5、6、7或8所示之胺基酸序列所組成。

較佳地，可以將該數個功能性單體及該模版胜肽加入一溶劑中，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合的同時，包覆該模版胜肽，例如可以於0~25℃之溫度下，將包含該數個功能性單體及該模版胜肽的混合物加入該溶劑中，並以磁石攪拌1~30分鐘，以利形成該分子拓印聚合物。該溶劑係可以提供一良好的聚合環境，舉例而言，該溶劑可以為水、異丙酮(isopropanol)，或者為包含水及異丙酮的混合溶劑。

又，在形成該分子拓印聚合物後，能夠以一清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以露出位於該分子拓印聚合物表面的辨識孔位，即可以獲得該免疫阻斷粒子。舉例而言，該清洗溶液可以為丙酮、乙醇、甲醇、水或包含前述溶劑之混合液體。

值得注意的是，該數個功能性單體在聚合的同時也可以包覆一光敏劑，使所製備獲得的免疫阻斷粒子包含該光敏劑，該光敏劑係可以受到光照而激活，產生能夠誘發光毒性的自由基(free radical)，促進癌細胞的死亡。

詳而言之，工者係可以混合該數個功能性單體、該模版胜肽、該光敏劑及該溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽及該光敏劑包覆其中，以共同形成該分子拓印聚合物。舉例而言，該光敏劑可以為血紫質(hematoporphyrin)、金屬紫質(metalloporphyrin)、卟啉烯(porphycene)、去鎂葉綠素酸(pheophorbide)、尿紅質(purpurin)、二氫卟酚(chlorin)、原紫質(protoporphrin)、酞青素(phthalocyanine)等卟啉類光敏劑(porphyrin photosensitizer)或補骨脂素(psoralean)、蒽環(anthracene)、硫屬吡喃染劑(chalacogenopyrylium dye)、氮-二-甲烷重排(ADPM)、花青素(cyanine)、吩噻嗪染劑(phenothiazinium dye)等非卟啉類光敏劑(non-porphyrin photosensitizer)，於本實施例中，該光敏劑為部花青素(merocyanine 540)，使該免疫阻斷粒子在受到波長為540nm之光照時，可以有效地產生能夠誘發光毒性的自由基。

此外，為了有助於該免疫阻斷粒子的分離純化，較佳可以於使該數個功能性單體在進行聚合的同時也包覆該磁性顆粒，使所製備獲得的免疫阻斷粒子包含該磁性顆粒(即，混合該數個功能性單體、該模版胜肽、該磁性顆粒及該溶劑，即可以使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，同時包覆該磁性顆粒)。該磁性顆粒的飽和磁化率可以大於±0.1emu/g，例如可以為具有超順磁性(superparamagnetism)的四氧化三鐵(Fe₃O₄)、氧化鐵(FeO)或三氧化二鐵(Fe₂O₃)。舉例而言，係提供一含鐵離子水溶液，該含鐵離子水溶液包含莫耳數比為2：1的三價鐵離子(Fe³⁺)及二價鐵離子(Fe²⁺)，於該含鐵離子水溶液中加入一沉澱劑後，於60~95℃之溫度下，使該三價鐵離子及該二價鐵離子共同沉澱而形成四氧化三鐵；於本實施例中，係以氯化鐵(FeCl₃)及氯化亞鐵(FeCl₂)共同配製形成該含鐵離子水溶液，該沉澱劑為一氫氧化鈉水溶液(NaOH_(aq))或一氫氧化銨水溶液(NH₄OH_(aq))，且該沉澱劑所含的氫氧基(OH^-)與該含鐵離子水溶液的三價鐵離子(Fe³⁺)的莫耳數比為4：1。

在該分子拓印聚合物同時包含該磁性顆粒及該光敏劑的狀況下，該磁性顆粒的表面較佳能夠經修飾，例如能夠以(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane，簡稱APTES)進行修飾，此時，使該光敏劑(例如，部花青素)得以經由(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷的矽烷基，接載在該磁性顆粒上。詳而言之，於本實施例中，係將四氧化三鐵(0.2~5g)混合乙醇(10~250mL，乙醇濃度為99.5%)，於其中添加(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷(10~1000μL)混合10~90分鐘，再加熱至100~300℃進行熱處理20~120小時，得一經修飾的磁性顆粒。

將該經修飾的磁性顆粒(5~1000mg)混合部花青素(10~1000μg/mL)1~30分鐘，移除上層溶液，再進行清洗，以得一複合磁性奈米粒子。

將該複合磁性奈米粒子(2~100mg)混合聚乙烯乙基乙烯醇溶液(10~2000μL，溶於二甲基亞碸中，濃度為0.001~2wt%)及該模版胜肽(2~500μL)，得一混合溶液，將該混合溶液滴入0~25℃之去離子水中，以磁石攪拌1~30分鐘即可以形成該分子拓印聚合物。

經由上述方法所製備獲得的免疫阻斷粒子的表面具有能夠辨識PD-1蛋白質的辨識孔位，因此當該免疫阻斷粒子投予該所需個體時，能夠在該所需個體的體內阻斷癌細胞的自我保護機制(即，PD-1及PD-L1的專一性結合)，促進自然殺手細胞的活性。

該免疫阻斷粒子能夠誘發免疫系統，因而可以作為一種癌症免疫療法的活性成分，較佳係可以將該免疫阻斷粒子用於製備治療或輔助性治療肝癌的藥物。該免疫阻斷粒子可以與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑共同形成一醫藥組合物，或是於該醫藥組合物中額外添加他種有助於促進癌細胞的死亡的活性成分(例如，自然殺手細胞或T細胞)，其中，該免疫阻斷粒子係可以製備成任何便於投予一所需個體的型式，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑等。

又，該免疫阻斷粒子係能夠以各種合適之投予途徑投予該所需個體，舉例而言，該免疫阻斷粒子能夠以非經腸道(parenterally)或口服(orally)的方式投予該所需個體，例如該免疫阻斷粒子則可以利用靜脈注射(intravenous injection，簡稱IV injection)、肌肉注射(intramuscular injection，簡稱IM injection)、腹膜內注射(intraperitoneal injection，簡稱IP injection)等方式投予該所需個體。

再者，該免疫阻斷粒子能夠以0.001~1000毫克/公斤/週之投予劑量投予該所需個體；惟前述之投予劑量應對應該所需個體及途徑的不同而有所差異，於此不加以限制。

又，當該免疫阻斷粒子包含該光敏劑時，當該免疫阻斷粒子投予該所需個體後，更可以對該所需個體施予一光能(例如，以波長為460~580nm的光照射該所需個體的患部0.01~30分鐘)，使該光敏劑受到光照而激活，以產生能夠誘發光毒性的自由基，而促進癌細胞的死亡。

此外，由於該免疫阻斷粒子更包含該磁性顆粒，在製備獲得該免疫阻斷粒子後，可以利用藉由施以外界磁場進行分離純化(例如，可以利用磁石進行吸附，此為本領域具有通常知識者可以理解，恕不贅述)，因此可以容易地分離純化該免疫阻斷粒子。

為優化本發明之免疫阻斷粒子的製備方法，遂進行以下試驗：

(A)免疫阻斷粒子的粒徑變化

本試驗係如第1表所示，以由如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽(濃度為100μg/mL)，混合包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙基乙烯醇及該複合磁性奈米粒子，以共同形成第A1組的分子拓印聚合物之後，以水作為該清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以移除該模版胜肽而獲得第A2組的免疫阻斷粒子(簡稱mAIP)；接著再混合該免疫阻斷粒子mAIP與一再吸附溶液(其中含濃度為100μg/mL的模版胜肽)，使該模版胜肽可以再次吸附於該免疫阻斷粒子mAIP的表面上的辨識孔位，為便於後續說明，該辨識孔位結合有該模版胜肽的免疫阻斷粒子mAIP稱為再吸附粒子(第A3組)。

請參照第1a圖所示，在移除該模版胜肽之前，第A1組的分子拓印聚合物之粒徑(直徑)係隨聚乙烯乙基乙烯醇的乙烯莫耳百分比而有所提升，分別為196.9±6.9nm(27mol%)、241.5±42.5nm(32mol%)、253.9±56.9nm(38mol%)及501.4±57.5nm(44mol%)。在移除該模版胜肽之後，第A2組的免疫阻斷粒子mAIP的粒徑比移除前為大，分別為207.1±13.8nm(27mol%)、196.6±12.1nm(32mol%)、302.8±15nm(38mol%)及312.4±28.9nm(44mol%)，其理由可能為親水的模版胜肽被移除後，使該免疫阻斷粒子mAIP較為疏水，而產生團聚的現象。又，在再次吸附之後的第A3組的再吸附粒子的粒徑分別為188±40.9nm(27mol%)、189.4±26.5 nm(32mol%)、200±32.5nm(38mol%)及146.5±22.3nm(44mol%)，顯示親水的模版胜肽可以再次被吸附於該免疫阻斷粒子mAIP的表面上的辨識孔位，使其親水性得以提升。

另，觀察使用乙烯莫耳百分比為32mol%的聚乙烯乙基乙烯醇所得的第A1組的分子拓印聚合物、第A2組的免疫阻斷粒子mAIP及第A3組的再吸附粒子的粒徑分布變化，以及第A0組的該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)的粒徑分布變化，其結果如第1b圖所示，在移除該模版胜肽後的第A2組的免疫阻斷粒子mAIP的粒徑分布較廣，而在再次吸附之後的第A3組的再吸附粒子的粒徑則可以變得較為均一。

(B)乙烯莫耳百分比的影響

請參照第2表所示，本試驗係將包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙基乙烯醇所製備獲得的免疫阻斷粒子mAIP作為第B1組，以及同樣包含前述不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙基乙烯醇，惟未加入該模版胜肽所製備獲得的非免疫阻斷粒子(non-imprinted polymer nanoparticles，簡稱NIPs)作為第B0組。

量測第B0組的非免疫阻斷粒子NIP所能夠吸附的模版胜肽的量，以及第B1組的免疫阻斷粒子mAIP所能夠吸附的模版胜肽的量，其結果如第2圖所示，並依(式一)計算包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙基乙烯醇所製備獲得的免疫阻斷粒子mAIP的拓印效率α。

其結果顯示，乙烯莫耳百分比為27mol%、32mol%、38mol%及44mol%的聚乙烯乙基乙烯醇所製備獲得的免疫阻斷粒子mAIP的拓印效率分別為0.74、1.76、1.13及1.33，可以得知以乙烯莫耳百分比為32mol%的聚乙烯乙基乙烯醇所製備獲得的免疫阻斷粒子mAIP的拓印效率最佳，因此後續所有試驗均以乙烯莫耳百分比為32mol%的聚乙烯乙基乙烯醇進行。

(C)模版胜肽的濃度的影響

接著測試使用不同濃度的模版胜肽，在製備獲得該免疫阻斷粒子mAIP時，對所獲得的免疫阻斷粒子mAIP的吸附量的影響，此時，固定該聚乙烯乙烯醇的重量百分濃度為0.1%，該再吸附溶液中的模版胜肽的濃度為50μg/mL。

請參照第3圖所示，濃度為0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL及100μg/mL的模版胜肽所製造獲得的免疫阻斷粒子mAIP的吸附量分別為27.6±2.6μg/mg、29.2±2.5μg/mg、31.6±4.1μg/mg、25.3±2.8μg/mg及20.9±0.5μg/mg。

值得注意的是，在該模版胜肽的濃度介於0.1~10μg/mL之間時，該免疫阻斷粒子mAIP的吸附量與該模版胜肽的濃度成正比，惟在該模版胜肽的濃度高於10μg/mL的狀況下，可能由於該模版胜肽數量過多，使得該免疫阻斷粒子mAIP表面上無法形成完整的辨識孔位，而影響該免疫阻斷粒子mAIP的辨識效果。後續所有試驗均以10μg/mL的的模版胜肽的濃度進行。

(D)吸附時間的影響

另外測試該免疫阻斷粒子mAIP與該再吸附溶液中的模版胜肽之間的吸附時間，對該免疫阻斷粒子mAIP的吸附量所造成的影響，其結果如第4圖所示，在吸附時間為1、5、10分鐘時，該免疫阻斷粒子mAIP的吸附量分別為20.5±0.2μg/mg、31.6±0.2μg/mg及33.9±13.3μg/mg，而後續增加吸附時間對吸附量並沒有明顯的變化，故後續所有試驗均以10分鐘的的吸附時間進行。

(E)再吸附溶液的濃度的影響

請參照第3表所示，混合該免疫阻斷粒子mAIP(第E1組)與包含不同濃度的模版胜肽的再吸附溶液，於10分鐘的吸附時間後，第E1組的免疫阻斷粒子mAIP的吸附量如第5圖所示，在該再吸附溶液包含濃度為50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及200μg/mL的模版胜肽時，該免疫阻斷粒子mAIP的吸附量分別為33.9±1.3μg/mg、79.6±2.8μg/mg、97.5±10.7μg/mg及109.3±5μg/mg。

又，另測試該非免疫阻斷粒子NIP(第E0組)與包含不同濃度的模版胜肽的再吸附溶液的吸附曲線，其結果同樣如第5圖所示，在該再吸附溶液包含濃度為50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及200μg/mL的模版胜肽時，該非免疫阻斷粒子NIP同樣能夠吸附該再吸附溶液中的模版胜肽，其吸附量分別為13.4±6.2μg/mg、33.5±0.2μg/mg、35.6±0.8μg/mg及62.5±0.3μg/mg，其可能理由在於：用以製備獲得該免疫阻斷粒子mAIP的聚乙烯乙基乙烯醇與該模版胜肽之間具有足以使該模版胜肽吸附於該免疫阻斷粒子mAIP的表面上的親和力，且其吸附量與該在吸附溶液中的模版胜肽的濃度有關。

此外，依上述(式一)換算該免疫阻斷粒子mAIP對包含不同濃度的模版胜肽的再吸附溶液的拓印效率，分別為2.5、2.4、2.7及1.7，顯示在該再吸附溶液包含50~150μg/mL的模版胜肽時，第E1組的免疫阻斷粒子mAIP與第E2組的非免疫阻斷粒子NIP的吸附量呈正比，使換算所得的該免疫阻斷粒子mAIP的拓印效率相近，而當該再吸附溶液中的模版胜肽的濃度為200μg/mL時，第E1組的免疫阻斷粒子mAIP的吸附量趨於飽和，因而導致拓印效率下降。

(F)免疫阻斷粒子的磁滯曲線

本試驗係如第4表所示，以超導量子干涉儀(superconducting quantum interference device，簡稱SQUID)測定該經修飾的磁性顆粒(第F0組)、該分子拓印聚合物(第F1組，移除該模版胜肽前)及該免疫阻斷粒子mAIP(第F2組，移除該模版胜肽後)的磁滯曲線(hysteresis curve)。

請參照第6圖所示，無論是第F0組的經修飾的磁性顆粒、第F1組的分子拓印聚合物或第F2組的免疫阻斷粒子mAIP都具有超順磁性。

又，第F0組的經修飾的磁性顆粒的磁通量(magnetic flux)為55.8emg/g，第F1的分子拓印聚合物因為還包含該功能性單體(EVAL)及該模版胜肽，導致非磁性物質的比例提升，使磁通量下降至51.6emg/g，而第F2組的免疫阻斷粒子mAIP則是是由於移除該模版胜肽後，使磁性物質的比例再次提升，使磁通量上升到54.5emg/g。

(G)免疫阻斷粒子的比表面積

本試驗係如第5表所示，以比表面積分析儀(specific surface area and porosimetry analyzer，簡稱BET)測定該分子拓印聚合物(第G1組，移除該模版胜肽前)及該免疫阻斷粒子mAIP(第G2組，移除該模版胜肽後)的比表面積(specific surface area)。

請參照第7圖所示，第G1組的分子拓印聚合物的比表面積約為301.4±23.9m²/g，第G2組的免疫阻斷粒子mAIP由於表面形成的辨識孔位，使其比表面積上升為337.7±35.4mg²/g。

為證實經由本發明之免疫阻斷粒子的製備方法所製備獲得的免疫阻斷粒子確實能夠應用於癌症免疫阻斷療法，進而有效地促進肝癌細胞的死亡，另進行以下試驗：

(H)細胞毒性

為了排除該磁性顆粒(四氧化三鐵)、該經修飾的磁性顆粒(經APTES修飾的四氧化三鐵，簡稱Fe₃O₄@APTES)及該光敏劑(部花青素)對細胞具有細胞毒性的可能性，係如第6表所示，將該磁性顆粒(第H1組)、該經修飾的磁性顆粒(第H2組)、該經修飾的磁性顆粒及該光敏劑的混合物(第H3組)，及使該數個功能性單體(EVAL)聚合並包覆該經修飾的磁性顆粒及該光敏劑(第H4組)所獲得的奈米粒子加入人類肝癌細胞株(HepG2細胞)中，測試HepG2細胞的存活率。

請參照第8圖所示，無論加入第H1~H4組的奈米粒子均不會影響HepG2細胞的細胞存活率，顯示該磁性顆粒、該經修飾的磁性顆粒及該光敏劑均不具有細胞毒性。

(I)於癌症免疫阻斷療法的應用

本試驗係以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽，混合該數個功能性單體(EVAL)、該光敏劑(部花青素)及該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)，以製備獲得第一實施例之免疫阻斷粒子(簡稱hAIP)，另混合該數個功能性單體(EVAL)、該光敏劑(部花青素)及該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)(即，未加入該模版胜肽)，以製備獲得一非免疫阻斷粒子(non-imprinted polymer nanoparticles，簡稱NIP)，並如第7表所示，將該第一實施例之免疫阻斷粒子hAIP、該非免疫阻斷粒子NIP與自然殺手細胞(Jurkat細胞)共同加入HepG2細胞中，測試HepG2細胞的細胞存活率。

請參照第9a圖所示，第I1-0~I1-2組的HepG2細胞的存活率均有隨奈米粒子的加入濃度而有下降，惟第I1-1及I1-2組的HepG2細胞的存活率低於第I1-0組的HepG2細胞的存活率，顯示以由如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽所形成的第一實施例之免疫阻斷粒子確實具有提升自然殺手細胞活性的作用。

另以由如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽，混合該數個功能性單體(EVAL)、該光敏劑(部花青素)及該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)，以製備獲得第二實施例之免疫阻斷粒子(簡稱mAIP)，另混合該數個功能性單體(EVAL)、該光敏劑(部花青素)及該經修飾的磁性顆粒(Fe₃O₄@APTES)(即，未加入該模版胜肽)，以製備獲得該非免疫阻斷粒子NIP，並如第8表所示，將該第二實施例之免疫阻斷粒子mAIP、該非免疫阻斷粒子NIP與自然殺手細胞(CTLL-2細胞)共同加入 HepG2細胞中，測試HepG2細胞的細胞存活率。

請參照第9b圖所示，第I2-0~I2-2組的HepG2細胞的存活率均有隨奈米粒子的加入濃度而有下降，惟第I2-1及I2-2組的HepG2細胞的存活率低於第I2-0組的HepG2細胞的存活率，顯示以由如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列所組成的模版胜肽所形成的第二實施例之免疫阻斷粒子確實具有提升自然殺手細胞活性的作用。

又，如第9a、9b圖所示，第I1-2組的HepG2細胞的存活率低於第I1-1組的HepG2細胞的存活率，且第I2-2組的HepG2細胞的存活率低於第I2-1組的HepG2細胞的存活率，顯示較佳可以將該免疫阻斷粒子與自然殺手細胞混合後，使自然殺手細胞被該免疫阻斷粒子先行活化，再共同投予該所需個體，使得經活化的自然殺手細胞可以快速地發揮其生物活性，因而具有較佳的抗癌效果。

(J)造成癌細胞死亡的分子機制

本試驗係如第9表所示，將第二實施例之免疫阻斷粒子mAIP加入HepG2細胞中，或將第二實施例之免疫阻斷粒子mAIP、該非免疫阻斷粒子NIP與自然殺手細胞(CTLL-2細胞)共同加入HepG2細胞中，以定量即時聚合酶連鎖反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，簡稱Q-PCR)測試HepG2細胞的細胞凋亡途徑(apoptosis pathway)中CASP8、CASP3及NFKB1等主要基因的表現量，並依據未加入該免疫阻斷粒子及/或自然殺手細胞的HepG2細胞的CASP8、CASP3及NFKB1等基因的表現量換算其相對表現量。

請參照第10圖所示，將第二實施例之免疫阻斷粒子mAIP與自然殺手細胞(CTLL-2細胞)共同加入HepG2細胞的第C1組的CASP8、CASP3及NFKB1等基因的表現量均有提升，其中變化最大的是CASP3相對基因表現量，第C0組為165.9±25.3%，第C1組為282±32.8，第C2組為224.6±21.7%，顯示本發明之免疫阻斷粒子可以促進細胞凋亡途徑的進行。

(K)第一實施例之免疫阻斷粒子hAIP及第二實施例之免疫阻斷粒子mAIP的比較

本試驗係如第10表所示，將第一實施例之免疫阻斷粒子hAIP與自然殺手細胞(Jurkat細胞)共同加入HepG2細胞中，或將第二實施例之免疫阻斷粒子mAIP與自然殺手細胞(CTLL-2細胞)共同加入HepG2細胞中後，測試HepG2細胞的細胞存活率。

請參照第11圖所示，第K1、K2組的HepG2細胞的存活率均有隨奈米粒子的加入濃度而有下降，其中以第一實施例之免疫阻斷粒子hAIP的效果較佳。

綜上所述，本發明的免疫阻斷粒子的製備方法，可以獲得表面具有能夠辨識PD-1蛋白質的辨識孔位之免疫阻斷粒子，因此當該免疫阻斷粒子投予一所需個體時，即能夠在該所需個體的體內阻斷癌細胞的自我保護機制，促進自然殺手細胞的活性，該免疫阻斷粒子能夠應用於癌症免疫阻斷療法，為本發明之功效。

再者，本發明的免疫阻斷粒子還可以同時包含該光敏劑，因此當該免疫阻斷粒子投予該所需個體後，更可以對該所需個體施予該光能，使該光敏劑受到光照而激活，產生能夠誘發光毒性的自由基，促進癌細胞的死亡，該免疫阻斷粒子能夠同時應用於癌症免疫阻斷療法及光動力療法，為本發明之功效。

又，本發明的免疫阻斷粒子的製備方法，可以獲得包含該磁性顆粒的分子拓印聚合物，因此工者能夠藉由施以外界磁場分離純化該免疫阻斷粒子(例如，利用磁石進行吸附)，達成提升該免疫阻斷粒子在進行分離純化時的便利性之功效。

此外，本發明的免疫阻斷粒子能夠阻斷PD-1與PD-L1的專一性結合，因而可以作為一種癌症免疫阻斷療法的活性成分，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立高雄大學

<120> 免疫阻斷粒子的製備方法及該免疫阻斷粒子的用途

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 3

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens(人類)

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus(小鼠)

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus(小鼠)

<400> 6

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus(小鼠)

<400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus(小鼠)

<400> 8

Claims

一種免疫阻斷粒子的製備方法，包含：混合數個功能性單體、一模版胜肽、一光敏劑、一磁性顆粒及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將該模版胜肽、該光敏劑及該磁性顆粒包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物，其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，該光敏劑可以為部花青素，該磁性顆粒的磁化率大於±0.1emu/g，且該磁性顆粒的表面經(3-氨基丙基)三乙氧基矽烷進行修飾；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的模版胜肽，以獲得該免疫阻斷粒子，該免疫阻斷粒子的表面具有對應該模版胜肽的數個辨識孔位；其中，該模版胜肽包含如SEQ ID NO：4或8所示之胺基酸序列。
如請求項1之免疫阻斷粒子的製備方法，其中，各該功能性單體為乙烯莫耳百分比為5~50mol%的聚乙烯乙烯醇。
如請求項1之免疫阻斷粒子的製備方法，其中，該溶劑為水。
一種免疫阻斷粒子的用途，係應用於製備治療肝癌的藥物，其中，該免疫阻斷粒子係以如請求項1~3中任一項所述之免疫阻斷粒子的製備方法所製備獲得。
如請求項4之免疫阻斷粒子的用途，其中，該免疫阻斷粒子係以口服投予、靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射的方式投予一所需個體。
如請求項5之免疫阻斷粒子的用途，其中，該免疫阻斷粒子係以每週每公斤之所需個體投予0.001~1000毫克的劑量投予該所需個體。
如請求項5或6之免疫阻斷粒子的用途，其中，該免疫阻斷粒子係與自然殺手細胞混合後，共同投予該所需個體。
如請求項5或6之免疫阻斷粒子的用途，其中，將該免疫阻斷粒子投予該所需個體後，以波長為460~580nm的光照射該所需個體的患部0.01~30分鐘。