CN104931690A - 一种pd-1抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用。该PD-1抗体检测试剂盒包括固相载体、抗体捕获剂和标记抗体，所述抗体捕获剂为PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1。该PD-1抗体检测试剂盒能够快速地对体外、血清以及组织匀浆液等待测样本中的PD-1抗体进行检测，检测的特异性强、灵敏度高，应用范围广泛。

Description

一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗体检测试剂盒，特别是涉及一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

在正常情况下，机体免疫反应激活产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以杀死体内的肿瘤细胞。肿瘤的免疫抑制作用是肿瘤细胞逃避机体免疫***杀伤的重要机制。肿瘤免疫学领域的最新研究发现，程序性死亡分子-1(PD-1)介导的免疫抑制反应是CTL发生凋亡、无力以及功能耗竭的重要原因。肿瘤细胞及其肿瘤相关的免疫抑制性细胞表面表达B7-H1/4分子，它们是已知的PD-1配体，当CTL进入肿瘤微环境时，CTL细胞表面的PD-1会被其配体激活，引发胞内的SHP1/2的磷酸化，进而导致细胞凋亡或功能耗竭，从而无法有效杀伤肿瘤细胞。

目前，通路阻断剂抗PD-1和B7-H1/4单克隆抗体的相关研究具有突破性的进展，研究发现其能阻断PD-1对T细胞的抑制作用，从而激活肿瘤患者体内的免疫细胞杀瘤效应，减少抑制性调节T细胞效应，以增强CTL杀伤癌细胞的功能，其已成为近年来免疫治疗的热点。多项荷瘤动物实验结果表明，阻断PD-1通路可以增强抗肿瘤效应、延长生存期、改善预后。针对PD-1通路阻断的单克隆抗体用于进展期恶性黑色素瘤的三期临床试验已经完成，其抗肿瘤效果显著，已被美国FDA批准为可上市药物。由于PD-1抗体的广谱抗癌作用，其对肾癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病、头颈癌、肠癌和脑瘤等癌症的临床疗效研究也正在二期或三期临床试验之中。

PD-1抗体作为一种新型、安全、高效的抗肿瘤药物，势必将在临床肿瘤治疗中被大量应用，科研领域也会对该药物的剂型、药代动力学等做深入的研究，因此迫切需要一种针对PD-1抗体的特异性检测方法。

双抗体夹心法酶联免疫技术是目前对蛋白质类物质进行精确定量最为有效的方法，其原理是将待测蛋白的一种抗体包被至固相载体(例如酶标板)上，用于特异性捕获待测蛋白，然后采用待测蛋白的另一种标记抗体(例如偶联HRP的二抗等)进行标定和检测。然而，PD-1抗体本身就是一种IgG抗体，其具有与相同物种来源IgG相同的结构，大部分区域(约2/3序列)为恒定区，同一物种的IgG恒定区的氨基酸序列和结构相同，不同物种的IgG恒定区根据进化程度不同具有不同程度的同源性；可变区主要是结合特异性抗原结构域，由于难以获得针对可变区的抗IgG抗体，因此一般不会采用该区的表位制备二抗。如果采用针对恒定区表位的两种抗IgG抗体，显然无法排除待测血清、组织液等样本中本身含有的IgG的干扰，因此传统的双抗体夹心法无法实现对PD-1抗体的特异性检测。目前，尚无有效的精确测量PD-1抗体浓度的方法，尤其如何测定动物或人血清中PD-1抗体的浓度成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种PD-1抗体检测试剂盒及其应用，用于解决现有技术中的双抗体夹心法无法实现对PD-1抗体的特异性检测等技术缺陷。

本发明提供一种PD-1抗体检测试剂盒，包括固相载体、抗体捕获剂和标记抗体，所述抗体捕获剂为PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

在本发明的PD-1抗体检测试剂盒中，PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白能够特异性捕获待测样本中的PD-1抗体，其可以通过普通市售获得，例如可以采用ACRO Biosystems公司生产的货号为PD1-M5228的重组蛋白；标记抗体能够特异性地与PD-1抗体结合并且偶联有产生检测信号的物质(例如辣根过氧化物酶、链霉素等)。

该试剂盒的工作原理是：将待测样本加入到预包被抗体捕获剂的固相载体后，抗体捕获剂特异性捕获待测样本中的PD-1抗体，随后加入的标记抗体特异性地与PD-1抗体结合，通过对标记抗体上偶联物质产生的检测信号进行检测，从而能够得到待测样本中PD-1抗体的浓度。

可以理解的是，在本发明的PD-1抗体检测试剂盒中，固相载体和抗体捕获剂可以独立进行包装，也可以预先将抗体捕获剂预包被在固相载体上形成预包被固相载体，从而对预包被固相载体进行包装。

在本发明中，所述标记抗体可以为辣根过氧化物酶或链霉素标记的IgG抗体；特别是，该标记抗体与PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白的来源物种相同，在一实施方式中，PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白来源于小鼠，标记抗体可为辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗大鼠IgG抗体。所述固相载体可以采用本领域常规载体，例如酶标板。

此外，本发明的PD-1抗体检测试剂盒还可以包括参照品，参照品有利于保证检测的准确性，例如可以是PD-1抗体标准品、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。其中，PD-1抗体标准品可以是美国Bioxcell公司生产的克隆号为RMP1-14的PD-1抗体，其是小鼠恶性肿瘤模型治疗实验中用于PD-1阻断最常用的治疗抗体，抗肿瘤效果显著；阳性对照品可以是阳性血清、阳性组织匀浆液等；阴性对照品可以是阴性血清、阴性组织匀浆液等。

进一步地，本发明的PD-1抗体检测试剂盒还可以包括测定所需的常规试剂，例如可以包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、封闭液、显色液和终止液中的一种或多种。

在一实施方式中，包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，每升溶液中含有Na₂CO₃ 1.59g和NaHCO₃ 2.93g；洗涤缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，每升溶液中含NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，进一步可含吐温-200.5mL；封闭液为含1mg/mL牛血清白蛋白的pH7.4的上述磷酸盐缓冲液；终止液为2mol/L的硫酸。

本发明还提供上述任一所述的PD-1抗体检测试剂盒在PD-1抗体检测上的应用。具体地，该应用可以体现在科研实验中对PD-1抗体浓度的测定、PD-1抗体临床应用中的药物代谢动力学研究等。

本发明还提供一种PD-1抗体检测方法，采用上述的PD-1抗体检测试剂盒进行，所述PD-1抗体检测方法包括如下顺序进行的步骤：

1)将所述PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白预包被在所述固相载体上，制得预包被固相载体；

2)向所述预包被固相载体中加入待测样本，孵育，随后洗涤；

3)向所述预包被固相载体中加入所述标记抗体，孵育，随后洗涤；

4)向所述预包被固相载体中加入显色液，孵育，随后加入终止液，并测定OD₄₅₀。

可以理解的是，如所采用的试剂盒中抗体捕获剂预包被在固相载体上形成预包被固相载体，则检测方法可省略上述步骤1)。

进一步地，所述PD-1抗体检测试剂盒还包括PD-1抗体标准品，所述PD-1抗体检测方法还包括：

对所述PD-1抗体标准品进行梯度稀释，并采用步骤1)至步骤4)测定各梯度稀释液的OD₄₅₀，得到PD-1抗体标准品浓度与OD₄₅₀的线性关系；

根据所测定的待测样本的OD₄₅₀和所述线性关系，得到所述待测样本中PD-1抗体的浓度。

进一步地，可以采用如下方法制备所述预包被固相载体：

采用包被缓冲液对所述PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白进行稀释，控制稀释后的重组蛋白溶液的浓度不低于15.625ng/mL，将稀释后的重组蛋白溶液加入到所述固相载体上进行包被；

包被结束后，采用洗涤缓冲液对固相载体进行洗涤，随后向固相载体中加入封闭液进行封闭，封闭结束后洗涤并干燥，制得所述预包被固相载体。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的试剂盒采用抗原-抗体夹心法，通过采用PD-1抗体针对的抗原，即PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白实现对PD-1抗体的特异性捕获，从而克服了传统双抗体夹心法无法排除待测样本中本身含有的IgG的干扰这一技术难题，从而实现了对PD-1抗体的特异性检测。

2、本发明的试剂盒中，PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白和标记抗体均能够特异性地与PD-1抗体结合，从而保证了检测的高特异性和高灵敏度，检测限可低至15.625ng/mL。

3、本发明的试剂盒使用方法简易、快速，只需2个小时左右即可以完成样本检测，并且使用范围广泛，可对实验室常用缓冲液、血清、组织匀浆液等样本中PD-1抗体进行检测，并可用于临床应用中的药物代谢动力学研究。

附图说明

图1为生理盐水中各梯度PD-1抗体稀释液的浓度与OD₄₅₀的线性关系图；

图2为血清中各梯度PD-1抗体稀释液的浓度与OD₄₅₀的线性关系图；

图3为组织匀浆液中各梯度PD-1抗体稀释液的浓度与OD₄₅₀的线性关系图；

图4为小鼠腹腔注射PD-1抗体后不同时间血清中PD-1抗体浓度曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1PD-1抗体检测试剂盒

1、材料及其来源：

抗体捕获剂：小鼠PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白，ACRO Biosystems公司生产，货号为PD1-M5228，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；

固相载体：酶标板，Coster公司生产；

标记抗体：HRP偶联的山羊抗大鼠IgG抗体，KPL公司生产，货号为141612。

2、PD-1抗体检测试剂盒

本实施例的PD-1抗体检测试剂盒由上述固相载体、抗体捕获剂和标记抗体组成，分别独立包装并放置于盒体中。

实施例2PD-1抗体检测试剂盒及其制备方法

本实施例的PD-1抗体检测试剂盒是在实施例1的PD-1抗体检测试剂盒的基础上所进行的改进，其将抗体捕获剂预包被在固相载体上形成预包被固相载体，该试剂盒由上述预包被固相载体、标记抗体和下述组分组成：

PD-1抗体标准品：美国Bioxcell公司生产，克隆号为RMP1-14；

包被缓冲液：每升含Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，PH值为9.6；

洗涤缓冲液(PBS)：每升含NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，pH值为7.4；进一步可添加吐温-200.5mL(PBST)；

封闭液：向上述PBS中添加1mg/mL牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司生产)；

显色液：KPL公司生产，货号为520001，其中包括A液和B液；

终止液：2mol/L的硫酸；

上述各组分分别独立包装并放置于盒体中。

其中，上述预包被固相载体的制备方法为：

1、采用上述包被缓冲液将小鼠PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白稀释成浓度为0.01mg/mL的重组蛋白溶液，向酶标板每孔中加入100μL该重组蛋白溶液后，封板，随后置于4℃冰箱过夜。

2、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBS洗板两次，随后向酶标板每孔中加入200μL上述封闭液，于37℃孵育1小时后，倒掉酶标板中的溶液，并采用上述洗涤缓冲液PBS洗板两次后，拍板，常温晾干，封板后即制得预包被酶标板，置于4℃保存。

实施例3生理盐水中PD-1抗体浓度的检测

采用实施例2的PD-1抗体检测试剂盒进行检测，方法具体为：

1、将上述PD-1抗体标准品用生理盐水梯度稀释为浓度分别为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL和15.625ng/mL的梯度稀释液；此外，采用上述PBST按每mL加入0.2μL HRP偶联的山羊抗大鼠IgG抗体制备标记抗体工作液。

2、取各梯度稀释液100μL，分别加入上述预包被酶标板的板孔中，封板，于37℃孵育1小时。

3、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，向每孔加入100μL上述标记抗体工作液，封板，于37℃孵育30分钟。

4、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，向每孔加入上述显色液的A液和B液各50μL，封板，37℃孵育15分钟。

5、取出酶标板，向每孔加入30μL上述终止液，置于酶标仪中读取OD₄₅₀，结果见表1。

表1 生理盐水中各梯度PD-1抗体稀释液的OD₄₅₀值

PD-1抗体浓度(ng/mL)	OD450值
		1000	1.4263
500	0.7509
		250	0.4227
125	0.2051
		62.5	0.1251
31.25	0.0834
		15.625	0.0515

根据上述表1数据制作线性关系图，如图1所示，并得到线性方程，其中R²＝0.999，说明生理盐水中PD-1抗体浓度与OD₄₅₀之间呈极强的线性关系。由此说明，本发明的试剂盒能有效测定生理盐水中的PD-1抗体浓度，并且在待测样本PD-1抗体浓度不低于15.625ng/mL的范围时可实现精确检测，检测灵敏度高。

此外，可以理解的是，待测样本中PD-1抗体浓度的适用范围没有上限，当待测样本浓度高于1000ng/mL时可按一定比例稀释至上述线性范围内进行检测，并且在检测后可按稀释比计算待测样本PD-1抗体的实际浓度。

实施例4血清中PD-1抗体浓度的检测

采用实施例2的PD-1抗体检测试剂盒进行检测，方法具体为：

1、将上述PD-1抗体标准品用小鼠血清梯度稀释为浓度分别为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL和15.625ng/mL的梯度稀释液；此外，采用上述PBST按每mL加入0.2μL HRP偶联的山羊抗大鼠IgG抗体制备标记抗体工作液。

2、向各梯度稀释液中加3倍体积的生理盐水进行稀释、混匀，随后各取100μL，分别加入上述预包被酶标板的板孔中，封板，于37℃孵育1小时。

3、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，向每孔加入100μL上述标记抗体工作液，封板，于37℃孵育30分钟。

4、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，向每孔加入上述显色液的A液和B液各50μL，封板，37℃孵育15分钟。

5、取出酶标板，向每孔加入30μL上述终止液，置于酶标仪中读取OD₄₅₀，结果见表2。

表2 血清中各梯度PD-1抗体稀释液的OD₄₅₀值

PD-1抗体浓度(ng/mL)	OD450值
		1000	0.9609
500	0.5727
		250	0.3651
125	0.2265
		62.5	0.1855
31.25	0.1603

根据上述表2数据制作线性关系图，如图2所示，并得到线性方程，其中R²＝0.9978，说明血清中PD-1抗体浓度与OD₄₅₀之间呈极强的线性关系。由此说明：本发明的试剂盒能有效测定血清中的PD-1抗体浓度，并且在待测样本PD-1抗体浓度不低于31.25ng/mL的范围时可实现精确检测，检测灵敏度高。

实施例5肿瘤组织匀浆液中PD-1抗体浓度的检测

采用实施例2的PD-1抗体检测试剂盒进行，方法具体为：

1、将上述PD-1抗体标准品用黑色素瘤匀浆梯度稀释为浓度分别为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL和15.625ng/mL的梯度稀释液；此外，采用上述PBST按每mL加入0.2μL HRP偶联的山羊抗大鼠IgG抗体制备标记抗体工作液。

2、向各梯度稀释液中加入等体积的生理盐水进行稀释、混匀，随后各取100μL，分别加入上述预包被酶标板的板孔中，封板，于37℃孵育1小时。

3、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，向每孔加入100μL上述标记抗体工作液，封板，于37℃孵育30分钟。

4、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，向每孔加入上述显色液的A液和B液各50μL，封板，37℃孵育15分钟。

5、取出酶标板，向每孔加入30μL上述终止液，置于酶标仪中读取OD₄₅₀，结果见表3。

表3 肿瘤组织匀浆液中各梯度PD-1抗体稀释液的OD₄₅₀值

PD-1抗体浓度(ng/mL)	OD450值
		1000	1.6969
500	0.9673
		250	0.5537
125	0.4055
		62.5	0.2231

根据上述表3数据制作线性关系图，如图3所示，并得到线性方程，其中R²＝0.9967，说明组织匀浆液中PD-1抗体浓度与OD₄₅₀之间呈极强的线性关系。由此说明：本发明的试剂盒能有效测定组织匀浆液中的PD-1抗体浓度，并且在待测样本PD-1抗体浓度不低于62.5ng/mL的范围时可实现精确检测，检测灵敏度高。

实施例6小鼠血清药物动力学研究

试验小鼠为C57BL/6小鼠，共5只，分别编号为1#，2#，3#，4#，5#；采用实施例2的PD-1抗体检测试剂盒进行检测，方法具体为：

1、采用生理盐水将PD-1抗体标准品配制成1mg/mL，向2#、3#、4#、5#小鼠分别腹腔注射0.1mL，2#在1天后、3#在3天后、4#在7天后、5#在14天后分别眼眶采血，于4℃冷置后2000g离心取血清，分别记作2#、3#、4#、5#血清。

2、对1#小鼠眼眶采血，于4℃冷置后2000g离心取血清，采用该血清将PD-1抗体标准品梯度稀释为125ng/mL作为标准品，记作1#血清。

3、向上述1#至5#血清中分别加9倍体积的生理盐水稀释、混匀，各血清平行取样三次，每次各取100μL，分别加入至上述预包被酶标板的板孔中，封板后，37℃孵育1小时。

4、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，每孔加入100μL上述标记抗体工作液，封板，37℃孵育30分钟。

5、倒掉酶标板中的溶液，采用上述洗涤缓冲液PBST洗板5次，拍板后，每孔加入上述显色液的A液和B液各50μL，封板，37℃孵育15分钟。

6、取出酶标板，每孔加入30μL终止液，置于酶标仪读取OD₄₅₀值，按照实施例4得到的线性方程计算PD-1抗体浓度，结果见表4。

表4 小鼠腹腔注射PD-1抗体后不同时间血清中PD-1抗体浓度

根据表4数据制作曲线图，如图4所示。结果表明：注射PD-1抗体后在不同时间点进行的小鼠血清三次平行取样检测中，各血清的PD-1抗体浓度检测结果基本一致，相对误差≤2.07％。由此说明，本发明的试剂盒和检测方法灵敏度高，并且可用于PD-1抗体的药物代谢动力学研究。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，包括固相载体、抗体捕获剂和标记抗体，所述抗体捕获剂为PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白预包被在所述固相载体上。

3.根据权利要求1所述的PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标记抗体为辣根过氧化物酶或链霉素标记的IgG抗体。

4.根据权利要求1所述的PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。

5.根据权利要求1所述的PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括PD-1抗体标准品、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的PD-1抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、封闭液、显色液和终止液中的一种或多种。

7.权利要求1至6任一所述的PD-1抗体检测试剂盒在PD-1抗体检测上的应用。

8.一种PD-1抗体检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的PD-1抗体检测试剂盒进行，所述PD-1抗体检测方法包括如下顺序进行的步骤：

1)将所述PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白预包被在所述固相载体上，制得预包被固相载体；

2)向所述预包被固相载体中加入待测样本，孵育，随后洗涤；

3)向所述预包被固相载体中加入所述标记抗体，孵育，随后洗涤；

4)向所述预包被固相载体中加入显色液，孵育，随后加入终止液，并测定OD₄₅₀。

9.根据权利要求8所述的PD-1抗体检测方法，其特征在于，所述PD-1抗体检测试剂盒还包括PD-1抗体标准品，所述PD-1抗体检测方法还包括：

对所述PD-1抗体标准品进行梯度稀释，并采用步骤1)至步骤4)测定各梯度稀释液的OD₄₅₀，得到PD-1抗体标准品浓度与OD₄₅₀的线性关系；

根据所测定的待测样本的OD₄₅₀和所述线性关系，得到所述待测样本中PD-1抗体的浓度。

10.根据权利要求8或9所述的PD-1抗体检测方法，其特征在于，采用如下方法制备所述预包被固相载体：

采用包被缓冲液对所述PD-1细胞膜外结构域的重组蛋白进行稀释，控制稀释后的重组蛋白溶液的浓度不低于15.625ng/mL，将稀释后的重组蛋白溶液加入到所述固相载体上进行包被；

包被结束后，采用洗涤缓冲液对固相载体进行洗涤，随后向固相载体中加入封闭液进行封闭，封闭结束后洗涤并干燥，制得所述预包被固相载体。