TWI714862B

TWI714862B - 一種調控glp-1/glp-1r的方法和藥物

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Publication number: TWI714862B
Application number: TW107121002A
Authority: TW
Inventors: 李季男
Original assignee: 大陸商深圳瑞健生命科學硏究院有限公司
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2021-01-01
Also published as: JP2020524161A; US11938172B2; WO2018233604A1; EP3643321A1; CA3067890A1; EP3643321A4; TW201906627A; CN111344004A; JP7335609B2; US20200206324A1; JP2023156429A

Abstract

本發明涉及纖溶酶原調控GLP-1/GLP-1R及治療GLP-1/GLP-1R相關病症的用途。

Description

一種調控GLP-1/GLP-1R的方法和藥物

本發明涉及纖溶酶原通過調控GLP-1/GLP-1R治療GLP-1/GLP-1R相關疾病的用途。

GLP-1是一種內源性促進胰島素分泌的激素，主要是由腸內L-細胞分泌。小腸L細胞胰高血糖素原基因表達產生胰高血糖素原(proglucagon,PG)，經激素原轉化酶1/3(prohormoneconvertase,PC1/3)處理後釋放GLP-1肽前體。內肽酶催化GLP-1(1-37)裂解成兩個肽段，其中GLP-1(7-37)經醯胺化酶處理後形成GLP-1(7-36)醯胺。雖然α細胞內胰高血糖素基因表達亦能產生PG，但是α細胞中的激素原轉化酶2(PC2)優先將PG轉化為胰高血糖素，故α細胞正常情況下不能合成GLP-1。但在應激或者病理生理狀態下(如2型糖尿病)，α細胞能適應性產生GLP-1。

GLP-1能促進胰島β細胞分泌胰島素和血糖正常化且不發生低血糖，抑制α細胞產生胰高血糖素，並延緩胃排空，抑制食欲，減輕體重，促進β細胞增殖，抑制其凋亡，在調節胰島細胞功能過程中發揮重要作用^[1]。

糖尿病同肥胖症具有併發趨勢，臨床上亦公認將控制患者體重列入到2型糖尿病治療指南中。研究發現在糖尿病的進展中GLP-1和胰島素的分泌間存在負反饋調節，而患2型糖尿病的病人存在腸-胰島軸的損傷，並伴隨著餐後循環血液中脂質升高^[2]。在實驗性糖尿病小鼠模型中發現，β細胞脂肪毒性損傷後影響了GLP-1的功能，高脂血症的治療可促進GLP-1誘導胰島素分泌^[3]。目前在已經過驗證的治療方案中，只有胰高血糖素樣肽受體激動劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonists,GLP-1 RAs)可以實現對患者的體重和血糖水平同時調控。GLP-1作為GLP-1受體激動劑研究的基礎，具有血糖依賴性的促進胰島素分泌作用。其可以通過抑制食欲和減緩胃排空來達到減輕體重的作用^[4]。

GLP-1不僅在外周降低血糖保護胰島細胞，改善的症狀，而且在中樞神經系統作為一種神經遞質，對細胞增殖、神經發生和細胞凋亡起到營養作用。GLP-1R在齧齒類動物及人腦內分佈較廣泛^[5]，丘腦、小腦、腦幹、穹窿、後區、外側膈核、尾殼、海馬和大腦皮層均有表達。GLP-1通過血腦屏障能在相應腦區與其受體結合發揮作用。GLP-1可調節神經細胞的多種生理過程，例如：細胞存活及神經元軸突生長；抵禦體外培養神經細胞的興奮性、氧化損傷和死亡；降低神經元β前體蛋白(β APP)；降低內源性A β水平；保護神經元抵禦多種凋亡性刺激及誘導體外培養神經細胞的分化的功能^[6]。關於A β毒性損害的動物實驗研究發現，A β可以誘發嚴重的長時程增強(long-term potention,LTP)抑制，而這一損害可以被GLP-1的類似物逆轉^[7]，齧齒類動物腦室內注射A β後，通過Morris水迷宮評估顯示出空間學習和記憶能力不足，然而，予以GLP-1類似物處理可以改善動物在這兩方面的表現^[8]。另外，科學家還發現，GLP-1及其類似物可以改善記憶和大腦中的突觸可塑性^[9]。

GLP-1受體功能調節相當複雜，它與多種內、外源性多肽相互作用，導致下游多條信號通路級聯激活。GLP-1受體基因多態性現象早就發現，而且可能和肥胖及糖尿病的發生有關^[10]。

本發明發現了纖溶酶原在調控GLP-1/GLP-1受體通路以及治療該GLP-1/GLP-1受體通路相關病症中的用途。

本發明涉及如下各項：一種通過調控GLP-1/GLP-1R治療疾病的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

項1的方法，其中所述疾病為糖代謝紊亂相關疾病、脂肪代謝紊亂相關疾病或GLP-1/GLP-1R相關神經系統疾病。

項2的方法，其中所述疾病為選自如下的一種或多種疾病：糖尿病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經痛、糖尿病性視網膜疾病、高脂血症、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗塞、腦血栓、腦出血、腦栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨質疏鬆、認知障礙、帕金森氏症候群、脊髓側索硬化症、阿茲海默症、炎性腸病、消化不良、胃腸道潰瘍。

4.一種調控GLP-1/GLP-1R功能的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

5.項4的方法，其中所述纖溶酶原促進GLP-1和/或GLP-1R 的表達。

6.一種治療GLP-1/GLP-1R相關病症的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

7.項6的方法，其中所述GLP-1/GLP-1R相關病症包括如下的一種或多種：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、認知障礙。

8.項6的方法，其中所述GLP-1/GLP-1R相關病症包括如下的一種或多種：糖尿病、糖尿病併發症、高脂血症、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗塞、腦血栓、腦出血、腦栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨質疏鬆、認知障礙、帕金森氏症候群、側索硬化症、阿茲海默症、炎性腸病、消化不良、胃腸道潰瘍。

9.根據項1-8任一項的方法，其中所述纖溶酶原為與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白質。

10.項1-9任一項的方法，其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

11.項10的方法，其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。

12.根據項1-11任一項的方法，其中所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。

13.根據項12的方法，其中所述纖溶酶原可與一種或多種選自如下的藥物或療法聯用：治療糖尿病的藥物或療法、治療動脈粥樣硬化的藥物或療法、治療心腦血管疾病的藥物或療法、治療血栓的藥物或療法、治療高血壓的藥物或療法，降血脂的藥物或療法、治療脂肪肝的藥物或療法、治療帕金森氏症的藥物或療法、治療阿茲海默症的藥物或療法、抗感染藥物或療法。

14.用於治療GLP-1/GLP-1R相關病症的藥物，包含有效量的纖溶酶原。

15.用於治療GLP-1/GLP-1R相關病症的製品或試劑盒，包含裝有有效量的纖溶酶原的容器，以及纖溶酶原治療GLP-1/GLP-1R相關病症的使用說明書。

16.項14或15的藥物、製品或試劑盒，其中所述GLP-1/GLP-1R相關病症包括如下的一種或多種：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、認知障礙。

17.項14或15的藥物、製品或試劑盒，其中所述GLP-1/GLP-1R相關病症包括如下的一種或多種：糖尿病、糖尿病併發症、高脂血症、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗塞、腦血栓、腦出血、腦栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨質疏鬆、認知障礙、帕金森氏症候群、側索硬化症、阿茲海默症、炎性腸病、消化不良、胃腸道潰瘍。

18.纖溶酶原在製備通過調控GLP-1/GLP-1R治療疾病的藥物中的用途。

19.項18的用途，其中所述疾病為糖代謝紊亂相關疾病、脂肪代謝紊亂相關疾病或GLP-1/GLP-1R相關神經系統疾病。

20.項19的用途，其中所述疾病為選自如下的一種或多種疾病：糖尿病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經痛、糖尿病性視網膜疾病、高脂血症、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗塞、腦血栓、腦出血、腦栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨質疏鬆、認知障礙、帕金森氏症候群、側索硬化症、阿茲海默症、炎性腸病、消化不良、胃腸道潰瘍。

21.纖溶酶原在製備調控GLP-1/GLP-1R功能的藥物中的用途。

22.項21的用途，其中所述纖溶酶原促進GLP-1和/或GLP-1R的表達。

23.纖溶酶原在製備治療GLP-1/GLP-1R相關病症的藥物中的用途。

24.項23的用途，其中所述GLP-1/GLP-1R相關病症包括如下的一種或多種：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、認知障礙。

25.項23的用途，其中所述GLP-1/GLP-1R相關病症包括如下的一種或多種：糖尿病、糖尿病併發症、高脂血症、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗塞、腦血栓、腦出血、腦栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨質疏鬆、認知障礙、帕金森氏症候群、側索硬化症、阿茲海默症、炎性腸病、消化不良、胃腸道潰瘍。

26.根據項18-25任一項的用途，其中所述纖溶酶原為與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白質。

27.項18-26任一項的用途，其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

28.項27的用途，其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。

29.根據項18-28任一項的用途，其中所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。

30.根據項29的用途，其中所述纖溶酶原可與一種或多種選自如下的藥物或療法聯用：治療糖尿病的藥物或療法、治療動脈粥樣硬化的藥物或療法、治療心腦血管疾病的藥物或療法、治療血栓的藥物或療法、治療高血壓的藥物或療法，降血脂的藥物或療法、治療脂肪肝的藥物或療法、治療帕金森氏症的藥物或療法、治療阿茲海默症的藥物或療法、抗感染藥物或療法。

定義：“糖尿病”是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用於機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂症候群，臨床上以高血糖為主要特點。

“糖尿病併發症”是由糖尿病過程中血糖控制不良導致的身體其他器官或組織的損害或功能障礙，其中包括肝臟、腎臟、心臟、視網膜、神經系統的損害或功能障礙等。據世界衛生組織統計，糖尿病併發症高達100多種，是目前習知併發症最多的一種疾病。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，其能夠降解纖維蛋白多聚體。

“纖溶酶原(plasminogen，plg)”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源plasminogen氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的PLG包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI數據，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-plasminogen(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域^[11,12]，有文獻報道了δ-plasminogen的氨基酸序列(序列8)^[12]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。Mini-plasminogen由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報道其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[13]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而Micro-plasminogen僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報道其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[14]，亦有專利CN102154253A報道其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-plg序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。

在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在PLG激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性PLM。具有活性的PLM可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中PLG的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。習知多種能夠作為PLG激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域的蛋白質，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。

目前，對於血液中纖維蛋白溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖維蛋白溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖維蛋白溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖維蛋白溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖維蛋白溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖維蛋白溶酶原活性成正比。此外亦可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖維蛋白溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物亦包括DNA同源物，亦稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原亦包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。所屬技術領域中具有通常知識者能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算：分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”和“預防”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠，小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

2.本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，亦可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)； Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸***表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製本發明纖溶酶原蛋白編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，亦可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，beta-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母亦可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)亦可以用於表達本發明的纖溶酶原。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immnol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工信息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除本發明纖溶酶原蛋白以外的大分子，等等。

3.藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑。

本發明的配製劑亦可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，治療如下一種或多種疾病的藥物：糖尿病、糖尿病併發症、高脂血症、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心肌梗塞、腦血栓、腦出血、腦栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨質疏鬆、認知障礙、帕金森氏症候群、阿茲海默症、炎性腸病、消化不良和胃腸道潰瘍。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸與□乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

4.給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內，鼻內，表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類製劑調節至與鼻粘膜相容的pH和等滲狀態。

在一些情況中，可以以下方式修飾或配製本發明的纖溶酶原藥物組合物，從而提供其穿過血腦屏障的能力。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。亦可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與促進穿過血腦屏障的藥劑配製在一起。在一些情況中，本發明的纖溶酶原直接或經接頭與促進穿過血腦屏障的載體分子、肽或蛋白質融合。在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與結合內源血腦屏障(BBB)受體的多肽融合。連接纖溶酶原與結合內源BBB受體的多肽，促進穿過BBB。結合內源BBB受體的合適的多肽包括抗體，例如單複製抗體，或其抗原結合片段，其特異性結合內源BBB受體。在一些情況中，所述抗體是囊封於脂質體中的。參見例如美國專利公開文本No.2009/0156498。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量亦涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量亦包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估、定期評估治療效果和安全性。

5.製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含本發明纖溶酶原。所述製品較佳包括一個容器，標簽或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原。所述容器上或所附的標簽說明所述組合物用於治療本發明所述病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

圖1 A-C 14-15周齡db/db小鼠給予纖溶酶原28天胰腺GLP-1免疫染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島GLP-1的表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。結果表明，纖溶酶原能夠促進相對年輕糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達。

圖2 A-B 23-25周齡db/db小鼠給予纖溶酶原28天胰腺GLP-1免疫染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島GLP-1的表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組。結果表明，纖溶酶原能夠促進相對年老糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達。

圖3 A-C PLG^+/+小鼠在T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島GLP-1染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島GLP-1的表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異顯著(**表示P<0.01)。結果表明，纖溶酶原能夠促進I型糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達。

圖4 A-C 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰高血糖素免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，胰高血糖素在正常對照小鼠中表達在胰島周邊α細胞區域。與給纖溶酶原組相比，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組與PBS組相比，胰島形態更接近正常小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著抑制胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，從而促進胰島損傷的修復。

圖5 A-D 27周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰高血糖素免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，胰高血糖素在正常對照小鼠中表達在胰島周邊α細胞區域。與給纖溶酶原組相比，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果具有統計學差異(*表示P<0.05)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組與PBS組相比，其形態更接近正常小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著抑制胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，從而促進胰島損傷的修復。

圖6 A-D 給予纖溶酶原28天後PLG^+/+小鼠在T1DM模型中胰島胰高血糖素免疫組化染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性表達明顯多於給纖溶酶原組，且平均光密度定量分析結果統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠顯著減少糖尿病小鼠胰島α細胞分泌胰高血糖素，促進胰島損傷的修復。

圖7 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原第11、32天血糖檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠的血糖明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，隨著給藥時間的延長，給溶媒PBS對照組小鼠血糖有升高趨勢，而給纖溶酶原組血糖逐漸降低。說明纖溶酶原具有降血糖的作用。

圖8 給予纖溶酶原對糖尿病鼠血清果糖胺濃度的影響。檢測結果顯示，給予纖溶酶原後血清果糖胺的濃度明顯降低，與給藥前相比，統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能顯著降低糖尿病小鼠的血清果糖胺水平。

圖9 27周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血清果糖胺檢測結果。檢測結果顯示，給纖溶酶原組血清果糖胺的濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，統計差異接近顯著(P=0.06)。說明纖溶酶原能顯著降低糖尿病小鼠的血清果糖胺水平。

圖10 27周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血漿糖化血紅蛋白檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠糖化血紅蛋白的OD值明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原具有降低糖尿病小鼠血漿糖化血紅蛋白的作用。

圖11 27周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原10天後IPGTT檢測結果。結果顯示，腹腔注射葡萄糖後，給纖溶酶原組小鼠血糖水平低於給溶媒PBS對照組，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠組。說明纖溶酶原能明顯改善糖尿病小鼠糖耐受能力。

圖12 T1DM模型PLG^+/+小鼠給予纖溶酶原10天後禁食後血糖檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組，且統計差異極顯著(***表示P<0.001)。說明纖溶酶原能顯著降低PLG^+/+小鼠在T1DM模型中的血糖水平。

圖13 T1DM模型PLG^+/+小鼠給予纖溶酶原28天後IPGTT檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠注射葡萄糖後血糖濃度明顯高於給纖溶酶原組，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠。說明纖溶酶原能提高PLG^+/+小鼠在T1DM模型中的糖耐受能力。

圖14 T1DM模型小鼠給予纖溶酶原20天後血糖檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異顯著(P=0.04)。說明纖溶酶原能促進T1DM小鼠葡萄糖分解能力，從而降低血糖。

圖15 27周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後血清胰島素檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組血清胰島素水平明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能有效促進胰島素的分泌。

圖16 A-E 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰臟的HE染色圖片及胰島面積比統計分析結果。A、B為給溶媒PBS對照組，C、D為給纖溶酶原組，E為胰島面積定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組大部分的胰島發生萎縮，萎縮的胰島細胞被腺泡(箭頭標識)所代替，胰島邊緣的腺泡增生，致胰島與腺泡之間分界不清；給纖溶酶原組大部分的胰島較之於對照組面積大，且胰島內未有腺泡增生，只有少數的胰島內殘存有少量的腺泡，胰島與腺泡之間邊界清晰。比較給纖溶酶原組和對照組的胰島占胰腺的面積比發現，給藥組比對照組大近乎一倍。說明纖溶酶原能促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島損傷的修復，從而通過修復損傷的胰島治療糖尿病。

圖17 A-C 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島天狼星紅染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠胰島膠原沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能改善糖尿病動物胰島的纖維化。

圖18 A-B 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島Caspase-3免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組Caspase-3的表達(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能減少胰島細胞的凋亡，保護糖尿病小鼠胰臟組織。

圖19 A-C 17-18周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰島素免疫組化染色結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異接近顯著(P=0.15)。說明纖溶酶原能夠促進胰島功能修復，促進胰島素的產生和分泌。

圖20 A-C 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島的胰島素免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能促進胰島功能修復，促進胰島素的產生和分泌。

圖21 A-C 27周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島的胰島素免疫組化染色結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)。說明纖溶酶原能有效促進胰島功能修復，促進胰島素的產生和分泌。

圖22 A-D 24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰腺組織NF-κB免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)接近正常對照小鼠，並且明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

圖23 A-D 17-18周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島胰高血糖素免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，胰高血糖素在正常對照小鼠中表達在胰島周邊α細胞區域。與給纖溶酶原組相比，給溶媒PBS對照組胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，胰高血糖素陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果統計差異極顯著(**表示P<0.01)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組與PBS組相比，胰島形態更接近正常小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著抑制胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，從而促進胰島損傷的修復。

圖24 A-D 17-18周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島IRS-2免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)；給纖溶酶原組IRS-2表達水平較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少17-18周齡糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

圖25 A-D 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)；給纖溶酶原組IRS-2表達水平較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

圖26 A-C 27周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島 IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組；給纖溶酶原組IRS-2表達水平較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

圖27 A-C給予纖溶酶原28天後PLG^+/+ T1DM小鼠胰島IRS-2免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組；給纖溶酶原組IRS-2表達水平較給溶媒PBS組更接近正常對照組小鼠。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少PLG^+/+ T1DM小鼠胰島β細胞損傷。

圖28 A-C 27周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島中性粒細胞免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能減少中性粒細胞的浸潤。

圖29 A-C T1DM模型中PLG^-/-小鼠給予纖溶酶原28天後胰島中性粒細胞免疫組化染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原能減少PLG^-/-小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤。

圖30 A-C 在T1DM模型中PLG^+/+小鼠給予纖溶酶原28天後胰島中性粒細胞免疫組化染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原能減少PLG^+/+小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤。

圖31 A-C T1DM模型中PLG^-/-小鼠給予纖溶酶原28天後胰島胰島素免疫組化染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原能促進在T1DM模型中的PLG^-/-小鼠胰島素的合成與分泌。

圖32 A-C PLG^+/+小鼠在T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島胰島素免疫組化染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組。說明纖溶酶原促進T1DM模型中PLG^+/+小鼠胰島素的合成與表達。

圖33A-C PLG^-/-小鼠在T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島NF-κB免疫組化染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進炎症修復因子NF-κB的表達，從而促進胰島炎症的修復。

圖34A-B 17-18周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島NF-κB免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。實驗結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進相對年輕(17-18周齡)糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

圖35A-C 27周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島NF-κB免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進相對年老(27周齡)糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

圖36A-C 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島TNF-α免疫組化觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。研究結果顯示，給纖溶酶原組TNF-α的陽性表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能促進TNF-α的表達，從而促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島損傷修復。

圖37A-C 27周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後胰島TNF-α免疫組化染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。研究結果顯示，給纖溶酶原組TNF-α的陽性表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能促進TNF-α的表達，從而促進27周齡糖尿病小鼠胰島損傷修復。

圖38A-B PLG^-/-小鼠T1DM模型中給予纖溶酶原28天後胰島TNF-α免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。研究結果顯示，給纖溶酶原組TNF-α的陽性表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能促進TNF-α的表達，從而促進PLG^-/-小鼠T1DM模型中胰島損傷修復。

圖39A-C PLG^-/- T1DM模型小鼠給予纖溶酶原28天後胰島IgM免疫組化觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。本實驗研究結果顯示，給纖溶酶原組IgM的陽性表達(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組。說明纖溶酶原能降低IgM的表達，從而減少PLG^-/-小鼠在T1DM模型中胰島損傷。

圖40A-C 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島TUNEL染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。本實驗結果顯示，正常對照組TUNEL陽性染色極低。給纖溶酶原組的陽性細胞數(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組。正常對照組凋亡率約為8%，給溶媒PBS組凋亡率約為93%，給纖溶酶原組凋亡率為約16%。說明纖溶酶原組能顯著減少糖尿病小鼠胰島細胞的凋亡。

圖41 T1DM模型小鼠給予纖溶酶原20天後血清胰島素檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血清胰島素濃度明顯低於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異接近顯著(P=0.08)。說明纖溶酶原能促進T1DM小鼠胰島素的分泌。

圖42A-D 24-25周齡的糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後胰島GLP-1R染色觀察結果。A為正常對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島GLP-1R表達(箭頭標識)明顯少於正常對照小鼠，給纖溶酶原組小鼠胰島GLP-1R的表達雖然亦少於正常對照組，但明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異極為顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。實驗結果表明纖溶酶原能夠促進糖尿病小鼠胰島GLP-1R的表達。

圖43A-D 高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天胰腺GLP-1R免疫染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島GLP-1R表達(箭頭標識)明顯少於正常對照小鼠，給纖溶酶原組小鼠胰島GLP-1R的表達雖然亦少於空白對照組，但明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異極為顯著(**表示P<0.01)。實驗結果表明纖溶酶原能夠促進高脂血症模型小鼠胰島GLP-1R的表達。

圖44A-C 14-15周齡db/db小鼠給予纖溶酶原28天胰腺GLP-1R免疫染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島GLP-1R的表達明顯少於給纖溶酶原組，且統計差異接近顯著(P=0.09)。結果表明，纖溶酶原能夠促進相對年輕(14-15周齡)糖尿病小鼠胰島GLP-1R的表達。

圖45A-C 動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後肝臟GLP-1R免疫組化染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟GLP-1R的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異極為顯著(***表示P<0.001)。該結果表明，纖溶酶原能夠促進動脈粥樣硬化模型小鼠GLP-1R的表達，有可能促進肝臟脂肪合成、分泌、吸收或氧化，減少血中脂類水平，改善高脂血症。

圖46A-C高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天肝臟GLP-1R免疫染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟GLP-1R的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異接近顯著(P=0.09)。該結果表明，纖溶酶原能夠促進高脂血症模型小鼠肝臟GLP-1R的表達，有可能促進肝臟脂肪合成、分泌、吸收或氧化，減少血中脂類水平，改善高脂血症。

圖47A-C MPTP誘導的帕金森模型小鼠給予纖溶酶原14天後黑質GLP-1R免疫染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠黑質GLP-1R的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。該結果表明，纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠黑質GLP-1R的表達。

圖48給予纖溶酶原28天高熱量飼料誘導的肥胖模型小鼠體重變化計算結果。結果展示為第29天體重減去第1天體重的數值。結果顯示，空白對照組體重改變並不明顯，給纖溶酶原組體重明顯下降，與給溶媒PBS對照組相比，統計差異顯著(*為P<0.05)。說明纖溶酶原能夠促進肥胖模型小鼠體重的降低。

圖49 給予纖溶酶原28天高熱量飼料誘導的肥胖模型小鼠體重指數統計結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠體重指數明顯低於給溶媒 PBS對照組，且統計差異顯著(*為P<0.05，**為P<0.01)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠的體重指數更加接近空白對照組。說明纖溶酶原能夠顯著降低肥胖模型小鼠的體重指數，減輕肥胖。

圖50 給予纖溶酶原28天高熱量飼料誘導的肥胖模型小鼠Lee's指數統計結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠Lee's指數明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*為P<0.05)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠的Lee's指數更加接近空白對照組。說明纖溶酶原能夠顯著降低肥胖模型小鼠的Lee's指數，減輕肥胖。

圖51給予纖溶酶原28天高熱量飼料誘導的肥胖模型小鼠腹腔脂肪係數統計結果。結果顯示，給纖溶酶原組腹腔脂肪係數明顯低於給溶媒PBS對照組，統計差異顯著(*為P<0.05)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠腹腔脂肪含量更加接近空白對照組。說明纖溶酶原能夠顯著降低肥胖模型小鼠腹腔脂肪的沉積。

圖52A-D給予纖溶酶原28天高熱量飼料誘導的肥胖模型小鼠腹腔脂肪H&E染色脂肪空泡面積統計結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組平均脂肪空泡的面積明顯小於給溶媒PBS對照組，統計差異極為顯著(**表示P<0.01)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組脂肪空泡面積更加接近空白對照小鼠。說明纖溶酶原能夠顯著地降低肥胖模型小鼠脂肪細胞的大小，減少腹腔脂肪沉積。

圖53A-C 24-25周糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後肝臟油紅O染色圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟的脂質沉積面積要顯著小於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能減少脂肪在糖尿病小鼠肝臟中的沉積。

圖54A-C ApoE動脈粥樣硬化模型小鼠給予纖溶酶原30天後肝臟油紅O染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組，且定量分析統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能減少脂肪在動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟中的沉積。

圖55A-C 16周高脂血症模型小鼠給予纖溶酶原30天後肝臟油紅O染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組，且定量分析統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能改善脂肪在高脂血症模型小鼠肝臟中的沉積。

圖56 A-D Cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠給予纖溶酶原14天腦胼胝體LFB染色結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，空白對照組胼胝體髓鞘形態基本正常，給纖溶酶原組胼胝體髓鞘陽性著色(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*為P<0.05)。說明纖溶酶原能夠促進cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠胼胝體髓鞘的再生。

圖57A-D Cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠給予纖溶酶原14天腦神經絲蛋白(NFP)免疫染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠胼胝體NFP的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組，統計差異顯著(*為P<0.05)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組胼胝體NFP的表達更加接近空白對照組。說明纖溶酶原能夠促進NFP的表達，從而促進神經纖維再生。

圖58A-C 糖尿病燒傷模型小鼠給予纖溶酶原後燒傷皮膚蛋白基因產物9.5(Protein gene product 9.5,PGP 9.5)免疫染色結果。A為PGP9.5染色代表性圖片。其中，A中的a-c分別為給溶媒PBS對照組第4、8、15天代表性圖片，d-f為給纖溶酶原組第4、8、15天代表性圖片；B為給藥第4天和第8天免疫染色定量分析結果；C為給藥第15天定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠燒傷皮膚PGP9.5陽性表達高於給溶媒PBS對照組，且在第8天兩組小鼠PGP9.5的表達接近差異顯著，在第15天兩組差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能夠促進糖尿病燒傷皮膚神經再生。

實施例

以下實施例中使用的人纖溶酶原來自捐贈者血漿，基於文獻^[15-17]所描述的方法並進行過程技術優化，從血漿中純化所得。纖溶酶原單體的純度>95%。

實施例1 纖溶酶原促進14-15周齡糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達

14-15周齡db/db雄性小鼠12隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各6隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1抗體(Wuhan Boster Biological Technology,PB0742)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一種腸促胰島素的激素，在正常情況下表達量低，其表達能夠促進胰島素的分泌且抑制胰高血糖素的分泌^[18]。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖1A)小鼠胰島GLP-1的表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖1B)，且統計差異顯著(圖1C)(*表示P<0.05)。結果表明，纖溶酶原能夠促進相對年輕(14-15周齡)糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達。

實施例2 纖溶酶原促進23-25周齡糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達

23-25周齡db/db雄性小鼠13隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組(7隻)和給溶媒PBS對照組(6隻)。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1抗體(Wuhan Boster Biological Technology,PB0742)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖2A)小鼠胰島GLP-1的表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖2B)。結果表明，纖溶酶原能夠促進相對年老(23-25周齡)糖尿病小鼠胰島GLP-1的表達。

實施例3 纖溶酶原促進T1DM模型中PLG ^+/+ 小鼠胰島GLP-1表達

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各4隻。兩組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]。注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1(Wuhan Boster Biological Technology,PB0742)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖3A)小鼠胰島GLP-1的表達明顯少於給纖溶酶原組(圖3B)，且統計差異顯著(圖3C)(**表示P<0.01)。結果表明，纖溶酶原能夠促進T1DM小鼠胰島GLP-1的表達。

實施例4 纖溶酶原減少24-25周齡糖尿病小鼠胰島α細胞的增殖，恢復胰島α細胞的正常分佈並降低胰高血糖素的分泌

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，db/db小鼠稱重後隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天；正常對照組小鼠不做給藥處理。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam,ab92517)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰島α細胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分佈於胰島周邊區域。

結果顯示，與給纖溶酶原組(圖4C)相比，給溶媒PBS對照組(圖4B)胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組的胰島形態比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖4A)。說明纖溶酶原能夠顯著抑制24-25周齡糖尿病小鼠胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，提示纖溶酶原能促進胰島損傷的修復。

實施例5 纖溶酶原抑制27周齡糖尿病小鼠胰島α細胞的增殖，恢復胰島α細胞的正常分佈並降低胰高血糖素的分泌

27周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，db/db小鼠稱重後隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天；正常對照組小鼠不做給藥處理。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam,ab92517)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，與給纖溶酶原組(圖5C)相比，給溶媒PBS對照組(圖5B)胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果具有統計學差異(*表示P<0.05)(圖5D)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組的胰島形態比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖5A)。說明纖溶酶原能夠顯著抑制27周齡糖尿病小鼠胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，提示纖溶酶原能促進胰島損傷的修復。

實施例6 纖溶酶原減少PLG ^+/+ 小鼠T1DM模型中胰高血糖 素的分泌

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠15隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(5隻)和模型組(10隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam,ab92517)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰島α細胞合成分泌胰高血糖素，主要分佈於胰島周邊區域。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖6B)胰高血糖素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給纖溶酶原組(圖6C)，且平均光密度定量分析結果統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖6D)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖6A)。說明纖溶酶原能夠顯著減少STZ誘導的T1DM小鼠胰島α細胞分泌胰高血糖素。

實施例7 纖溶酶原降低糖尿病小鼠血糖

24-25周齡db/db雄性小鼠8隻，隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻和給溶媒PBS對照組3隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第10、31天禁食16小時後，在第11、32天用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)進行血糖檢測。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠的血糖明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，隨著給藥時間的延長，給溶媒PBS對照組小鼠血糖有升高趨勢，而給纖溶酶原組血糖逐漸降低(圖7)。說明纖溶酶原具有降低糖尿病動物血糖的作用。

實施例8 纖溶酶原降低糖尿病小鼠果糖胺水平

24-25周齡db/db雄性小鼠5隻，給藥前一天每隻小鼠眼球靜脈叢取血50μl用以檢測血清果糖胺濃度，並記為第0天，第1天開始給予纖溶酶原，按照2mg/0.2ml/隻/天尾靜脈注射人源纖溶酶原，連續給藥31天。第32天摘除眼球取血，檢測血清果糖胺的濃度。果糖胺濃度使用果糖胺檢測試劑盒(南京建成，A037-2)進行檢測。

果糖胺濃度反映1~3周內血糖的平均水平。結果顯示，給予纖溶酶原後血清果糖胺的濃度明顯降低，與給藥前相比統計差異極顯著(**表示P<0.01)(圖8)。說明纖溶酶原能有效降低糖尿病動物血清果糖胺水平。

實施例9 纖溶酶原降低27周齡糖尿病小鼠血清果糖胺水平

27周齡db/db雄性小鼠9隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。第1天開始給纖溶酶原或PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，檢測血清果糖胺的濃度。果糖胺濃度使用果糖胺檢測試劑盒(南京建成，A037-2)進行檢測。

檢測結果顯示，給纖溶酶原組血清果糖胺的濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，統計差異接近顯著(P=0.06)(圖9)。說明纖溶酶原能降低27周齡糖尿病小鼠的血清果糖胺濃度。

實施例10 纖溶酶原降低糖尿病小鼠糖化血紅蛋白水平

27周齡db/db雄性小鼠9隻，小鼠稱重後根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。分組後開始給藥定為第1天，開始給予纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第35天小鼠禁食16小時，第36天摘眼球取血，用以檢測血漿糖化血紅蛋白的濃度。

糖化血紅蛋白含量通常可以反映患者近8~12周的血糖控制情況。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠糖化血紅蛋白的OD值明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)(圖10)。說明纖溶酶原具有降低糖尿病小鼠血漿糖化血紅蛋白的作用。

實施例11 纖溶酶原改善糖尿病小鼠糖耐受能力

27周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m小鼠3隻。db/db小鼠稱重後根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥10天；正常對照小鼠不做給藥處理。第11天小鼠禁食16小時後，每隻小鼠按5g/kg體重腹腔注射5%葡萄糖溶液，在0，30，60，90，120，180分鐘用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)檢測血糖濃度。

腹腔糖耐受檢測(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可檢測機體對葡萄糖的耐受能力。現有技術習知糖尿病患者糖耐量是下降的。

實驗結果顯示，腹腔注射葡萄糖後給纖溶酶原組小鼠血糖水平要低於給溶媒PBS對照組，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠組(圖11)。說明纖溶酶原能明顯改善糖尿病小鼠糖耐受能力。

實施例12 纖溶酶原降低PLG ^+/+ 小鼠在T1DM模型中血糖水平

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各5隻。兩組小鼠禁食4小時後單次腹腔注射200mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)誘導T1DM^[19]。STZ注射12天後開始給藥並記為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原 1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥10天。在第11天小鼠禁食6小時後，用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)測定血糖。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異極顯著(***表示P<0.001)(圖12)。說明纖溶酶原能顯著降低PLG^+/+小鼠T1DM模型的血糖水平。

實施例13 纖溶酶原改善T1DM模型小鼠糖耐受能力

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠15隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(5隻)和模型組(10隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。第28天小鼠禁食6小時後，按照5g/kg體重腹腔注射5%葡萄糖溶液，在注射後0、15、30、60、90分鐘用血糖試紙(Roche，Mannheim，Germany)檢測血糖濃度。

腹腔糖耐受檢測(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可檢測機體對葡萄糖的耐受能力。現有技術習知糖尿病患者糖耐量下降。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠注射葡萄糖後血糖濃度明顯高於給纖溶酶原組，且與給溶媒PBS對照組相比，給纖溶酶原組糖耐受曲線更加接近正常小鼠(圖13)。說明纖溶酶原能提高PLG^+/+小鼠T1DM模型的糖耐受能力。

實施例14 纖溶酶原提高T1DM模型小鼠葡萄糖分解能力

9-10周齡C57雄性小鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組以及給纖溶酶原組，每組各4隻。給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)誘導T1DM^[19]。STZ注射12天後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。連續給藥19天，在第20天小鼠禁食6小時後，以2g/kg體重灌胃20%的葡萄糖，60分鐘後，眼眶靜脈叢采血並離心取上清，以葡萄糖檢測試劑盒(上海榮盛361500)測定血糖。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠血糖明顯高於給纖溶酶原組小鼠血糖，且統計差異顯著(P=0.04)(圖14)。說明纖溶酶原能提高T1DM小鼠葡萄糖分解能力，從而降低血糖。

實施例15 纖溶酶原促進糖尿病小鼠胰島素分泌

27周齡db/db雄性小鼠9隻，實驗開始當天記為第0天，稱重並根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第35天小鼠禁食16小時後，在第36天摘眼球取血，離心取上清，運用胰島素檢測試劑盒(Mercodia AB)按照使用說明檢測血清胰島素水平。

檢測結果顯示，給纖溶酶原組血清胰島素水平明顯高於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖15)。說明纖溶酶原能顯著促進糖尿病小鼠胰島素的分泌。

實施例16 纖溶酶原對糖尿病小鼠胰腺的保護作用

24-25周齡db/db雄性小鼠7隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組3隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(H&E染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在200和400倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖16A，16B)大部分的胰島發生萎縮，萎縮的胰島細胞被腺泡(箭頭標識)所代替，胰島邊緣的腺泡增生，致胰島與腺泡之間分界不清；給纖溶酶原組(圖16C，16D)大部分的胰島較之於對照組面積大，且胰島內未有腺泡增生，只有少數的胰島內殘存少量的腺泡，胰島與腺泡之間邊界清晰。比較給藥組和對照組的胰島占胰腺的面積比發現，給纖溶酶原組比對照組大近乎一倍(圖16E)。說明纖溶酶原可促進糖尿病小鼠胰島損傷的修復。

實施例17 纖溶酶原減少糖尿病小鼠胰島膠原沉積

24-25周齡db/db雄性小鼠16隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組10隻，給溶媒PBS對照組6隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅染色60分鐘後，流水沖洗，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精和氨水分化返藍，流水沖洗，烘乾後封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

天狼星紅染色可使膠原持久染色，作為病理切片特殊染色方法，天狼星紅染色可以特異顯示膠原組織。

染色結果顯示，給纖溶酶原組小鼠(圖17B)胰島膠原沉積(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組(圖17A)，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖17C)。說明纖溶酶原能降低糖尿病動物胰島的纖維化。

實施例18 纖溶酶原減少糖尿病小鼠胰島細胞凋亡

24-25周齡db/db雄性小鼠6隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組2隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠Caspase-3抗體((Wuhan Boster Biological Technology,BA2142)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其表達越多表明處於凋亡狀態的細胞越多^[20]。

本發明的實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖18B)Caspase-3的表達(箭頭標識)明顯低於給溶媒PBS對照組(圖18A)。說明纖溶酶原能夠減少胰島細胞的凋亡。

實施例19 纖溶酶原促進17-18周齡糖尿病小鼠胰島素的表達和分泌

17-18周齡db/db雄性小鼠8隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各4隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam，ab63820)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖19B)胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖19A)，且統計差異接近顯著(P=0.15)(圖19C)。說明纖溶酶原能夠促進胰島功能修復，促進胰島素的表達和分泌。

實施例20 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島素的表達和分泌

24-25周齡db/db雄性小鼠8隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻和給溶媒PBS對照組3隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam，ab63820)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖20B)胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖20A)，且統計差異顯著(P=0.02)(圖20C)。說明纖溶酶原能有效修復胰島功能，促進胰島素的表達和分泌。

實施例21 纖溶酶原促進糖尿病小鼠胰島素合成分泌功能的修復

27周齡db/db雄性小鼠9隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻給溶媒PBS對照組5隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第35天小鼠禁食16小時後，在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam，ab63820)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖21B)胰島素的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖21A)，且統計差異極顯著(P=0.005)(圖21C)。說明纖溶酶原能有效修復糖尿病小鼠胰島功能，提高胰島素的表達和分泌。

實施例22 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島多向核轉錄因子NF-κB的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠10隻，根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻和給溶媒PBS對照組6隻，另取4隻db/m作為正常對照組，正常對照組不做處理。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水孵育15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；之後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠NF-κB(Cell Signaling，8242)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片200倍光學顯微鏡下觀察。

NF-κB為轉錄因子蛋白家族成員，在炎症修復過程中發揮著重要作用^[21]。

本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖22C)NF-κB的表達(箭頭標識)接近正常對照小鼠(圖22A)，明顯高於給溶媒PBS對照組(圖22B)，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖22D)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

實施例23纖溶酶原減少17-18周齡糖尿病小鼠胰島α細胞的增殖，恢復胰島α細胞的正常分佈並降低胰高血糖素的分泌

17-18周齡db/db雄性小鼠8隻以及db/m雄性小鼠3隻，db/db 小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各4隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗體(Abcam,ab92517)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，與給纖溶酶原組(圖23C)相比，給溶媒PBS對照組(圖23B)胰高血糖素陽性細胞(箭頭標識)明顯增多，陽性細胞浸潤到胰島的中央區域，且平均光密度定量分析結果具有統計學差異(**表示P<0.01)(圖23D)；給纖溶酶原組胰高血糖素陽性細胞散在的分佈於胰島周邊，給纖溶酶原組的胰島形態比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖23A)。說明纖溶酶原能夠顯著抑制17-18周齡糖尿病小鼠胰島α細胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰島α細胞分佈紊亂，提示纖溶酶原促進胰島損傷的修復。

實施例24纖溶酶原促進17-18周齡糖尿病小鼠胰島胰島素受體底物2(IRS-2)的表達

17-18周齡db/db雄性小鼠7隻以及db/m雄性小鼠3隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組3隻，給溶媒PBS對照組4隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam，ab134101)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰島素受體底物2((Insulin Receptor Substrate-2,IRS-2)是一種能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，是胰島素信號轉導途徑中重要分子，且對胰島β細胞的生存非常重要。IRS-2在胰島β細胞表達增加時對其具有保護效應，且對功能性胰島β細胞的維持至關重要^[22-23]。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖24B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖24C)，且統計差異極顯著(**表示P<0.01)(圖24D)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖24A)。說明纖溶酶原能有效增加17-18周齡糖尿病小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例25纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島IRS-2的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥31天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam，ab134101)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖25B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖25C)，且統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖25D)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖25A)。說明纖溶酶原能有效增加24-25周齡糖尿病小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例26纖溶酶原促進27周齡糖尿病小鼠胰島IRS-2的表達

27周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam，ab134101)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖26B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖26C)；給纖溶酶原組IRS-2表達水平接近正常對照組小鼠(圖26A)。說明纖溶酶原能有效增加27 周齡糖尿病小鼠胰島細胞IRS-2的表達。

實施例27纖溶酶原促進PLG ^+/+ T1DM小鼠胰島IRS-2的表達

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠15隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(5隻)和模型組(10隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗體(Abcam，ab134101)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IRS-2免疫組化結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠(圖27B)胰島IRS-2陽性表達(箭頭標識)明顯少於給纖溶酶原組(圖27C)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖27A)。說明纖溶酶原能有效增加胰島細胞IRS-2的表達，改善胰島素信號轉導，減少PLG^+/+ T1DM小鼠胰島β細胞損傷。

實施例28 纖溶酶原減少24-26周齡糖尿病小鼠胰島中性粒細胞的浸潤

24-26周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m小鼠3隻，db/db小鼠隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。EDTA修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加大鼠抗小鼠中性粒細胞抗體(cedarlane，CL8993AP)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗大鼠IgG(HRP)抗體(Abcam,ab97057)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

中心粒細胞是非特異性細胞免疫系統中重要成員，當炎症發生時，它們被趨化性物質吸引到炎症部位。

中心粒細胞免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖28C)陽性表達細胞少於給溶媒PBS對照組(圖28B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖28A)。說明纖溶酶原能減少糖尿病小鼠胰島中性粒細胞的浸潤。

實施例29 纖溶酶原減少PLG ^-/- 小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤

9-10周齡PLG^-/-雄性小鼠10隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(3隻)和模型組(7隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組(3隻)和給纖溶酶原組(4隻)。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。EDTA修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加大鼠抗小鼠中性粒細胞抗體(cedarlane，CL8993AP)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗大鼠IgG(HRP)抗體(Abcam,ab97057)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5 分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

中心粒細胞免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖29C)陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組(圖29B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖29A)。說明纖溶酶原能減少PLG^-/-小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤。

實施例30 纖溶酶原減少PLG ^+/+ 小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠15隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(5隻)和模型組(10隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。EDTA修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加大鼠抗小鼠中性粒細胞抗體(cedarlane，CL8993AP)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗大鼠IgG(HRP)抗體(Abcam,ab97057)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

中心粒細胞免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖30C)陽性表達細胞(箭頭標識)少於給溶媒PBS對照組(圖30B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖30A)。說明纖溶酶原能減少PLG^/+小鼠在T1DM模型中胰島中性粒細胞的浸潤。

實施例31纖溶酶原促進在T1DM模型中的PLG ^-/- 小鼠胰島素的合成與分泌

9-10周齡PLG^-/-雄性小鼠10隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(3隻)和模型組(7隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組(3隻)和給纖溶酶原組(4隻)。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam，ab63820)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖31C)胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖31B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖31A)。說明纖溶酶原能促進在T1DM模型中的PLG^-/-小鼠胰島素的合成與分泌。

實施例32 纖溶酶原促進T1DM模型中PLG ^+/+ 小鼠胰島素的合成與表達

9-10周齡PLG^+/+雄性小鼠15隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(5隻)和模型組(10隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰島素抗體(Abcam，ab63820)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖32C)胰島素陽性表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖32B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖32A)。說明纖溶酶原促進T1DM模型中PLG^+/+小鼠胰島素的合成與表達。

實施例33 纖溶酶原促進PLG^-/- 小鼠T1DM模型中胰島多向核轉錄因子NF-κB的表達

9-10周齡PLG^-/-雄性小鼠10隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(3隻)和模型組(7隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組(3隻)和給纖溶酶原組(4隻)。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗體(Cell Signaling，8242)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖33C)NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖33B)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進胰島炎症的修復。

實施例34 纖溶酶原促進17-18周齡糖尿病小鼠胰島多向核轉錄因子NF-κB的表達

17-18周齡db/db雄性小鼠7隻，小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組3隻，給溶媒PBS對照組4隻。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗體(Cell Signaling，8242)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖34B)NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖34A)。說明纖溶酶原能促進多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進相對年輕(17-18周齡)糖尿病小鼠胰島炎症的修復。

實施例35 纖溶酶原促進27周齡糖尿病小鼠多向核轉錄因子NF-κB的表達

27周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗體(Cell Signaling，8242)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖35C)NF-κB的表達(箭頭標識)明顯高於給溶媒PBS對照組(圖35B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖35A)。說明纖溶酶原能促進相對年老(27周齡)糖尿病小鼠多向核轉錄因子NF-κB的表達，從而促進其胰島炎症的修復。

實施例36纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰島TNF-α的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗體(Abcam，ab34674)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)主要由活化的單核/巨噬細胞產生，是一種重要的促炎症因子^[24]。

本實驗研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖36C)TNF-α的陽性表達明顯高於給溶媒PBS對照組(圖36B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖36A)。說明纖溶酶原能促進24-25周齡糖尿病小鼠TNF-α的表達，促進胰島損傷的修復。

實施例37 纖溶酶原促進27周齡糖尿病小鼠胰島TNF-α的表達

27周齡db/db雄性小鼠9隻以及db/m雄性小鼠3隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組4隻，給溶媒PBS對照組5隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥35天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第36天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗體(Abcam，ab34674)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖37C)TNF-α的陽性表達明顯高於給溶媒PBS對照組(圖37B)，且給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近正常對照組(圖37A)。說明纖溶酶原能促進27周齡糖尿病小鼠TNF-α的表達，促進胰島損傷的修復。

實施例38 纖溶酶原促進PLG ^-/- 小鼠在T1DM模型中胰島TNF-α的表達

9-10周齡PLG^-/-雄性小鼠10隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(3隻)和模型組(7隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組(3隻)和給纖溶酶原組(4隻)。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗體(Abcam，ab34674)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

本實驗研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖38B)TNF-α的陽性表達明顯高於給溶媒PBS對照組(圖38A)。說明纖溶酶原能促進PLG^-/-小鼠在T1DM模型中胰島TNF-α的表達，促進胰島損傷的修復。

實施例39 纖溶酶原減輕PLG ^-/- 小鼠在T1DM模型中胰島損傷

9-10周齡PLG^-/-雄性性小鼠10隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組(3隻)和模型組(7隻)。模型組小鼠禁食4小時後，按照200mg/kg體重單次腹腔注射STZ(sigma S0130)誘導I型糖尿病^[19]，空白對照組單次腹腔注射0.25ml檸檬酸鈉溶液(pH4.5)。STZ注射12天後用血糖儀測量血糖，模型組小鼠根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組3隻，給纖溶酶原組4隻。分組後開始給藥並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天；空白對照組小鼠不做給藥處理。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam,ab97230)室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗 3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IgM抗體在清除凋亡和壞死細胞過程中發揮著重要作用，組織器官損傷局部IgM抗體的水平與損傷程度呈正相關^[25-26]。因此，檢測組織器官局部IgM抗體的水平能夠反映該組織器官的損傷情況。

研究結果顯示，給纖溶酶原組(圖39C)IgM的陽性表達明顯低於給溶媒PBS對照組(圖39B)，給纖溶酶原組比給溶媒PBS組更接近空白對照組(圖39A)。說明纖溶酶原能降低IgM的表達，提示纖溶酶原能減輕PLG^-/-小鼠在T1DM模型中的胰島損傷。

實施例40 纖溶酶原減少24-25周齡糖尿病小鼠胰島細胞的凋亡

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，室溫孵育7min，0.01M PBS洗3次，每次3分鐘。滴加TUNEL試劑盒(羅氏)試劑1和試劑2混合液體(5：45)，於37℃恒溫孵育40min，0.01M PBS洗3次，每次3分鐘。滴加甲醇配製的3%雙氧水溶液(過氧化氫：甲醇=1：9) 室溫避光孵育20分鐘，0.01M PBS洗3次，每次3分鐘。滴加tunel試劑盒試劑3，37℃恒溫孵育30min，0.01M PBS洗3次，DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

TUNEL染色可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況。

本實驗結果顯示，正常對照組TUNEL陽性染色極低(圖40A)。給纖溶酶原組(圖40C)的陽性細胞數(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖40B)。正常對照組凋亡率約為8%，給溶媒PBS組凋亡率約為93%，給纖溶酶原組凋亡率約為16%。說明纖溶酶原組能顯著減少糖尿病小鼠胰島細胞的凋亡。

實施例41纖溶酶原改善T1DM模型小鼠胰島素分泌

9-10周齡C57雄性小鼠13隻，小鼠禁食4小時後按照200mg/kg體重單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(sigma，S0130)誘導T1DM^[19]。STZ注射12天後測量血糖，並根據血糖隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組(6隻)和給纖溶酶原組(7隻)。分組後開始給藥，並定為給藥第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。連續給藥20天，在第21天小鼠禁食6小時後，眼球靜脈叢取血，離心取上清，運用胰島素檢測試劑盒(Mercodia AB)，按照使用說明檢測血清胰島素濃度。

結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠胰島素濃度明顯低於給纖溶酶原組小鼠，且統計差異接近顯著(P=0.08)(圖41)。說明纖溶酶原能促進T1DM小鼠胰島素的分泌。

實施例42 纖溶酶原促進24-25周齡糖尿病小鼠胰腺GLP-1R的表達

24-25周齡db/db雄性小鼠11隻以及db/m雄性小鼠5隻，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組6隻，db/m小鼠作為正常對照組。開始給藥定為第1天，並開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS或不注射任何液體，連續給藥31天；正常對照小鼠不做給藥處理。在第32天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰高血糖素樣肽1受體(glucagon-like peptide 1 receptor，GLP-1R)是胰高血糖素受體家族成員之一，是一種G蛋白偶聯受體，能通過促進胰島素的分泌調節血糖水平^[27-28]。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖42B)小鼠胰島GLP-1R表達 (箭頭標識)明顯少於正常對照小鼠(圖42A)，給纖溶酶原組(圖42C)小鼠胰島GLP-1R的表達雖然亦少於正常對照組，但明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異極為顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)(圖42D)。實驗結果表明纖溶酶原能夠促進糖尿病小鼠胰島GLP-1R的表達。

實施例43 纖溶酶原促進高脂血症模型小鼠胰腺GLP-1R的表達

9周齡雄性C57小鼠17隻，飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)4周，誘導高脂血症^[29-30]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型，成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。另取相同周齡的雄性野生型小鼠5隻作為空白對照組，實驗期間飼餵普通維持飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，小鼠根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組(9隻)和給溶媒PBS對照組(8隻)。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥30天；空白對照組小鼠不做給藥處理。於第31天犧牲小鼠，取材胰腺於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗 3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖43B)小鼠胰島GLP-1R表達(箭頭標識)明顯少於正常對照小鼠(圖43A)，給纖溶酶原組(圖43C)小鼠胰島GLP-1R的表達雖然亦少於空白對照組，但明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異極為顯著(**表示P<0.01)(圖43D)。實驗結果表明纖溶酶原能夠促進高脂血症模型小鼠胰島GLP-1R的表達。

實施例44 纖溶酶原促進14-15周齡糖尿病小鼠胰腺GLP-1R的表達

14-15周齡db/db雄性小鼠12隻，實驗開始當天記為第0天並稱重，db/db小鼠根據體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各6隻。第1天開始給纖溶酶原或PBS，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原2mg/0.2ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥28天。在第29天犧牲小鼠，取胰臟在4%多聚甲醛中固定。固定後的胰臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖44A)小鼠胰島GLP-1R的表達明顯少於給纖溶酶原組(圖44B)，且統計差異接近顯著(圖44C)(P=0.09)。結果表明，纖溶酶原能夠促進相對年輕(14-15周齡)糖尿病小鼠胰島GLP-1R的表達。

實施例45 纖溶酶原促進動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟GLP-1R的表達

6周齡18-22g的雄性APOE小鼠19隻，高脂模型飼料(TP2031，南通特洛菲飼料科技有限公司)飼餵16周，建立動脈粥樣硬化模型^[31-32]。在給藥前三天稱量所有小鼠稱重並眼球靜脈叢取血50μL，測定血漿TC、HDL，計算動脈粥樣硬化指數。隨機取一隻小鼠，剩餘小鼠根據動脈粥樣硬化指數隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組各9隻。分組後開始給藥，並記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥30天。於第31天犧牲小鼠，取材肝臟於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖45B)小鼠肝臟GLP-1R的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖45A)，且統計差異極為顯著(圖45C)(***表示P<0.001)。該結果表明，纖溶酶原能夠促進動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟GLP-1R的表達，有可能促進肝臟脂肪合成、分泌、吸收或氧化，減少血中脂類水平，改善高脂血症。

實施例46 纖溶酶原促進高脂血症模型小鼠肝臟GLP-1R的表達

9周齡雄性C57小鼠17隻，飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)4周，誘導高脂血症^[29-30]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型，成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，小鼠根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組(9隻)和給溶媒PBS對照組(8隻)。分組後開始給藥，並記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，連續給藥30天。於第31天犧牲小鼠，取材肝臟於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP) 抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖46B)小鼠肝臟GLP-1R的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖46A)，且統計差異接近顯著(P=0.09)(圖46C)。該結果表明，纖溶酶原能夠促進高脂血症模型小鼠肝臟GLP-1R的表達，有可能促進肝臟脂肪合成、分泌、吸收或氧化，減少血中脂類水平，改善高脂血症。

實施例47 纖溶酶原促進帕金森模型小鼠黑質GLP-1R的表達

取9周齡C57雄性小鼠12隻，造模前提前一天稱重，小鼠按照30mg/kg體重每天腹腔注射5mg/ml MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[33-34]。MPTP溶液配製：用注射器吸取10ml去離子水，加入到100mg MPTP粉末(sigma，M0896)中，配製成10mg/ml的母液，然後吸取1ml母液於安瓶中，再加入1ml去離子水，最終濃度為5mg/ml。造模完成後小鼠隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各6隻小鼠，並開始給藥，記為第1天，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原溶液，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積PBS，持續給藥14天。第15天，小鼠犧牲後，快速取出大腦於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度為4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘， 0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

帕金森氏症的特點是黑質紋狀體神經元多巴胺能信號缺失，而黑質紋狀體亦表達GLP-1R^[35]。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖47B)小鼠黑質GLP-1R的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖47A)，且統計差異顯著(圖47C)(*表示P<0.05)。該結果表明，纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠黑質GLP-1R的表達。

實施例48纖溶酶原對肥胖小鼠體重和脂肪含量的影響

小鼠模型和分組

取8周齡的C57雄性小鼠14隻，根據體重隨機分為兩組，空白對照組4隻和模型組10隻。空白對照組小鼠飼餵正常的維持飼料；模型組小鼠飼餵脂肪熱量45%高脂飼料造模(TP23000，南通特洛菲飼料科技有限公司)12周，建立肥胖模型^[36]。此文中脂肪熱量45%高脂飼料簡稱為高熱量飼料。12周後，模型組小鼠稱重，根據體重再次隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各5隻。人源纖溶酶原溶於PBS中。給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1mL/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，空白對照組不進行任何處理。上述實驗動物連續給藥28天(開始給藥定為第1天)，第29天進行如下處理和檢測。

檢測和結果

體重檢測

上述實驗動物在第1和29天稱量體重，計算體重的改變。結果展示為第29天體重減去第1天體重的數值。

結果顯示，空白對照組體重改變並不明顯，給纖溶酶原組體重明顯下降，與給溶媒PBS對照組相比，統計差異顯著(*為P<0.05)(圖48)。說明纖溶酶原能夠促進肥胖模型小鼠體重的降低。

體重指數測定

在第29天對上述小鼠稱量體重後，測量小鼠體長，計算體重指數。體重指數=體重(kg)/體長²(m)。

體重指數是目前國際上常用的衡量人體胖瘦程度以及是否健康的一個標準。體重指數同樣可作為肥胖模型動物胖瘦程度的指標^[37-38]。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠體重指數明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠的體重指數更加接近空白對照組(圖49)。說明纖溶酶原能夠顯著降低肥胖模型小鼠的體重指數，減輕肥胖。

Lee’s指數測定

上述小鼠在第29天稱量體重後，測量小鼠體長，計算Lee's指數。

。

Lee's指數是反應肥胖程度的有效指數^[39-40]。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠Lee's指數明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*為P<0.05)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組小鼠的Lee's指數更加接近空白對照組(圖50)。說明纖溶酶原能夠顯著降低肥胖模型小鼠的Lee's指數，減輕肥胖。

腹腔脂肪量檢測

上述小鼠在第29天稱量體重後，犧牲取材腹腔脂肪稱重。腹腔脂肪係數(%)=(腹腔脂肪重量/體重)*100。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠腹腔脂肪係數明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*為P<0.05)，並且接近空白對照組小鼠脂肪係數(圖51)。說明纖溶酶原能夠顯著降低肥胖模型小鼠腹腔脂肪的沉積。

腹腔皮下脂肪空泡的面積檢測

在第29天犧牲上述小鼠，取材其腹腔脂肪於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為4μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。運用Image-pro plus圖像處理軟件，分析脂肪空泡的面積。

肥胖機體能量攝入超過能量消耗時，大量的脂質蓄積在脂肪細胞中，導致脂肪脂肪組織擴張即脂肪細胞增大，脂肪空泡面積增大^[41]。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖52C)脂肪空泡的面積明顯小於給溶媒PBS對照組(圖52B)，統計差異極為顯著(**表示P<0.01)(圖52D)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組脂肪空泡面積更加接近空白對照小鼠(圖52A)。說明纖溶酶原能夠顯著減少肥胖模型小鼠脂肪細胞的大小，減少腹腔脂肪沉積。

實施例49 纖溶酶原減少脂質在肝臟中的沉積研究一

24-25周齡雄性db/db小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射給予相同體積的PBS，連續給藥35天。在第36天犧牲小鼠取肝臟組織於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15分鐘，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30秒，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

油紅O染色可顯示脂質沉積，反映脂質沉積的程度^[42]。

染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖53B)小鼠肝臟的脂質沉積面積顯著小於給溶媒PBS對照組(圖53A)，且統計差異顯著(P=0.02)(圖53C)。說明纖溶酶原能減少脂肪在糖尿病小鼠肝臟中的沉積。

實施例50纖溶酶原減少脂質在肝臟中的沉積研究二

6周齡雄性ApoE小鼠13隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，TP2031)16周以誘導動脈粥樣硬化模型^[31-32]。成模後的小鼠繼續飼餵高脂高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組7隻，給纖溶酶原組6隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。給藥期間小鼠繼續飼餵模型飼料。於第31天犧牲小鼠，取材肝臟組織於4% 多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15分鐘，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30秒，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

染色結果顯示，給纖溶酶原組(圖54B)小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖54A)，且定量分析統計差異顯著(P=0.02)(圖54C)。說明纖溶酶原能減少脂肪在動脈粥樣硬化模型小鼠肝臟中的沉積。

實施例51 纖溶酶原減少脂質在肝臟中的沉積研究三

6周齡雄性C57小鼠11隻飼餵高脂高膽固醇飼料(南通特洛菲，貨號TP2031)16周以誘導高脂血症模型^[29-30]，此模型定為16周高脂血症模型。成模後的小鼠繼續飼餵高膽固醇飼料。在給藥前三天每隻取血50μl以檢測總膽固醇(T-CHO)含量，並根據T-CHO含量隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組6隻，給纖溶酶原組5隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。。給藥期間小鼠繼續飼餵模型飼料。給藥30天，並於第31天犧牲小鼠，取肝臟於4%多聚甲醛固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15分鐘，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30秒，甘油明膠封片。切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖55B)小鼠肝臟脂肪沉積明顯少於給溶媒PBS對照組(圖55A)，且定量分析統計差異顯著(*表示P<0.05)(圖55C)。說明纖溶酶原能消減脂肪在高脂血症模型小鼠肝臟中的沉積。

實施例52纖溶酶原促進cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠胼胝 體髓鞘再生

取8周齡C57雄性小鼠20隻，隨機分為2組，空白對照組6隻，模型組14隻。空白對照組小鼠飼餵正常維持飼料，模型組小鼠飼餵0.2% cuprizone模型飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)，飼餵6周，誘導小鼠髓鞘脫落模型^[43]。6周後模型組小鼠根據體重再次隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，空白對照組小鼠不做注射處理，連續給藥14天。給藥期間所有小鼠飼餵正常維持飼料。開始給藥定為第1天，第15天解剖小鼠取腦於4%多聚甲醛固定，脫水包埋。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。腦組織冠狀切片厚度為3μm，脫蠟至水後，用髓鞘染色液進行LFB染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下，觀察拍照。

LFB(luxol fast blue)染色運用固藍染色法染髓鞘，是研究皮質脊髓束定位、髓鞘病變、損傷和再生修復形態學觀察的有效方法^[44-45]。

結果顯示，空白對照組(圖56A)胼胝體髓鞘形態基本正常，給纖溶酶原組(圖56C)胼胝體髓鞘陽性著色(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖56B)，且統計差異顯著(圖56D)(*為P<0.05)。說明纖溶酶原能夠促進cuprizone誘導脫髓鞘模型小鼠胼胝體髓鞘的再生。

實施例53纖溶酶原促進受損神經中神經絲蛋白的表達

取8周齡C57雄性小鼠20隻，隨機分為2組，空白對照組6隻，模型組14隻。空白對照組小鼠飼餵正常維持飼料，模型組小鼠飼餵0.2% cuprizone模型飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)，飼餵6周，誘導小鼠髓鞘脫落模型^[43]。6周後模型組小鼠根據體重再次隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各7隻。給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，空白對照組小鼠不做注射處理，連續給藥14天。給藥期間所有小鼠飼餵正常維持飼料。開始給藥定為第1天，第15天解剖小鼠取腦於4%多聚甲醛固定，脫水包埋。固定後的組織樣本經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。腦組織冠狀切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔源抗NFP抗體(Abcam，ab207176)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後PBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

神經絲蛋白(Neurofilament protein,NFP)是構成神經細胞軸突中間絲的蛋白質。其功能是提供彈性使神經纖維易於伸展和防止斷裂，在維持細胞骨架、穩定細胞形態和軸突轉運方面均有十分重要意義^[46]。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖57C)小鼠胼胝體NFP的表達(箭頭標識)明顯多於給溶媒PBS對照組(圖57B)，統計差異顯著(*為P<0.05)(圖57D)，且與給溶媒PBS對照組相比給纖溶酶原組胼胝體NFP的表達更加接近空白對照組(圖57A)。說明纖溶酶原能夠促進NFP的表達，從而促進神經纖維再生。

實施例54 纖溶酶原促進皮膚神經再生

取雌性db/db小鼠30隻，實驗前測未禁食血糖(血糖大於等於15mM)並稱量體重，小鼠分別按照血糖和體重隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各15隻。所有小鼠按照50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉小鼠。小鼠麻醉後，在背部脫去一部分毛髮。銅塊在沸水中加熱至95-100℃，取出後立即垂直輕觸於小鼠脫毛部位6秒鐘，接觸時不要有額外壓力，建立皮膚燒傷模型^[47]。建立模型5min後開始給藥，給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS。開始給藥定為第1天，第4、8天兩組小鼠各取5隻，犧牲後取材燒傷皮膚。第15天犧牲剩餘小鼠，取材燒傷皮膚。皮膚於4%多聚甲醛固定24-48小時，進行石蠟包埋。切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。以3%雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10%的羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液。兔源抗PGP9.5抗體(Abcam，ab10404)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後PBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

蛋白基因產物9.5(Protein gene product 9.5,PGP 9.5)，是一種神經纖維中的特異性泛素羥基水解酶，作為一種神經軸突標記物，抗PGP9.5抗體可以與任何無髓鞘或有髓鞘的神經纖維相結合^[48-49]。

結果顯示，給纖溶酶原組小鼠燒傷皮膚PGP9.5陽性表達高於給溶媒PBS對照組，且在給藥第8天兩組小鼠PGP9.5的表達接近差異顯著，在給藥第15天兩組差異顯著(*表示P<0.05)(圖58)。說明纖溶酶原能夠促進糖尿病燒傷皮膚神經再生。A為PGP9.5染色代表性圖片，a-c分別為給溶媒PBS對照組第4、8、15天代表性圖片，d-f為給纖溶酶原組第4、8、15天代表性圖片；B為給藥第4天和第8天免疫染色定量分析結果；C為給藥第15天定量分析結果。

參考文獻：

[1]Habener JF, Stanojevic V. α cells come of age. Trends Endocrinol Metab, 2013, 24: 153-163.

[2]Tura A, Muscelli E, Gastaldelli A et al. Altered pattern of the incretin effect as assessed by modeling in individuals with glucose tolerance ranging from normal to diabetic. Diabetologia, 2014, 57: 1199-1203.

[3]Kang ZF, Deng Y, Zhou Y et al. Pharmacological reduction of NEFA restores the efficacy of incretin-based therapies through GLP-1 receptor signaling in the beta cell in mouse models of diabetes. Diabetologia, 2013, 56: 423-433.

[4]Wilding J. Managing patients with type 2 diabetes and obesity. Practitioner, 2015, 259: 25-28.

[5]Perry TA, Greig NH. A new Alzheimer’s disease interventive strategy: GLP-1 [J]. Curr Drug Targets,2004,5(6):565-571.

[6]During MJ, Cao L, Zuzga DS et al. Glucagon-like peptide-1 receptor is involved in learning and neuroprotection[J].Nat Med,2003,9(9):1173-1179.

[7]Gault VA, Holshcer C. GLP-1 agonists facilitate hippocampal LTP and reverse the impairment of LTP induced by beta-amyloid [J]. Eur J Pharmacol, 2008, 587:112-117.

[8]Wang XH, Li L, Holsher C et al. Val8-glucagon-like peptide-1 protects against ab1-40-induced impairment of hippocamapllate-phase long-term potentiation and spatial learning in rats [J]. Neuroscience, 2010, 170:1239-1248.

[9]Holscher C. Incretin anlogues that have been developed to treat type 2 diabetes hold promise as a novel treatment strategy for Alzheimer's disease [J]. Recent Pat CNS Drug Discov, 2010,5:109-117.

[10]Jensterle M, Pirs B, Goricar K et al. Genetic variability in GLP-1 receptor is associated with inter-individual differences in weight lowering potential of liraglutide in obese women with PCOS: a pilot study. Eur J Clin Pharmacol, 2015 May 21.

[11]Marder V J, Novokhatny V. Direct fibrinolytic agents: biochemical attributes, preclinical foundation and clinical potential [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2010, 8(3): 433-444.

[12]Hunt J A, Petteway Jr S R, Scuderi P, et al. Simplified recombinant plasmin: production and fu-nctional comparison of a novel thrombolytic molecule with plasma-derived plasmin [J]. Thromb Haemost, 2008, 100(3): 413-419.

[13] Duboscq C1, Genoud V, Parborell MF et al. Impaired clot lysis by rt-PA catalyzed mini-plasminogen activation. Thromb Res. 1997 Jun 15;86(6):505-13.

[14]Nagai N, Demarsin E, Van Hoef B, et al. Recombinant human microplasmin: production and potential therapeutic properties [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2003, 1(2): 307-313.

[15] KennethC Robbins,Louis Surmmaria,David Elwyn et al.Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin. Journal of Biological Chemistry , 1965 , 240 (1) :541-550.

[16]Summaria L, Spitz F, Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976 Jun 25;251(12):3693-9.

[17]HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC. Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr;235:1005-10.

[18]Ghinwa Barakat, Mohamed E Moustafa, Ibrahim Khalifeh ea al. Effects of exendin-4 and selenium on the expression of GLP-1R,IRS-1, and preproinsulin in the pancreas of diabetic rats. J Physiol Biochem. 2017 Jun 7.

[19] Brian L. Furman . Streptozotocin-Induced Diabetic Models UNIT 5.47 in Mice and Rats. Curr. Protoc. Pharmacol. 70:5.47.1-5.47.20.

[20] Parvesh Chaudhry, Mohan Singh, Sophie Parent et al. Prostate Apoptosis Response 4 (Par-4), a Novel Substrate of Caspase-3 during Apoptosis Activation. Mol Cell Biol. 2012 Feb; 32(4): 826-839.

[21] Patrick Viatour, Marie-Paule Merville, Vincent Bours et al. Phosphorylation of NF-kB and IkBproteins: implications in cancer and inflammation..TRENDS in Biochemical Sciences , 2005 , 30 (1) :43-52.

[22]Withers DJ,Gutierrez JS, Towery H, et al. Disruption of IRS-2 causes type 2diabetes in mice. Nature 1998;391:900-904.

[23]Withers DJ, Burks DJ, Towery HH et al. White MF. Irs-2 coordinates Igf-1 receptor-mediated beta-cell development and peripheral insulin signalling. Nat Genet 1999;23:32-40.

[24]Jacob CO1, Aiso S, Michie SA, McDevitt HO et al. Prevention of diabetes in nonobese diabetic mice by tumor necrosis factor (TNF): similarities between TNF-alpha and interleukin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Feb;87(3):968-72.

[25]Zhang M, Takahashi K, Alicot EM, Vorup-Jensen T, Kessler B, et al. Activation of the lectin pathway by natural IgM in a model of ischemia/reperfusion injury. J Immunol.2006. 177: 4727-4734.

[26] Kim SJ, Gershov D, Ma X, Brot N, Elkon KB (2002) I-PLA2 Activation during Apoptosis Promotes the Exposure of Membrane Lysophosphatidylcholine Leading to Binding by Natural Immunoglobulin M Antibodies and Complement Activation. The Journal of Experimental Medicine 196: 655-665.

[27]D J Drucker, J Philippe, S Mojsov et al. Glucagon-like peptide I stimulates insulin gene expression and increases cyclic AMP levels in a rat islet cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May; 84(10): 3434-3438.

[28]Mojsov S, Weir GC, Habener JF. Insulinotropin: glucagon-like peptide I (7-37) co-encoded in the glucagon gene is a potent stimulator of insulin release in the perfused rat pancreas. J Clin Invest. 1987 Feb;79(2):616-9.

[29] Dominika Nackiewicz, Paromita Dey, Barbara Szczerba et al. Inhibitor of differentiation 3, a transcription factor regulates hyperlipidemia associated kidney disease. Nephron Exp Nephrol. 2014; 126(3): 141-147.

[30] Ming Gu1, Yu Zhang., Shengjie Fan et al. Extracts of Rhizoma Polygonati Odorati Prevent High-Fat Diet-Induced Metabolic Disorders in C57BL/6 Mice. PLoS ONE 8(11): e81724.

[31] Yutaka Nakashima, Andrew S. Plump, Elaine W. Raines et al. Arterioscler Thromb. 1994 Jan;14(1):133-40.

[32] Yvonne Nitschke, Gabriele Weissen-Plenz, Robert Terkeltaub et al. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. J. Cell. Mol. Med. Vol 15, No 11, 2011 pp. 2273-2283.

[33]Vernice Jackson-Lewis1 & Serge Przedborski, Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s Disease, Nature protocols VOL.2 NO.1,2007(141)

[34]N. A. Tatton and S. J. Kish,In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia aigra compacta of 1-methyl-4-phenyl -1,2,3,6-tetrahydropyridine- treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labeling and acridine orange staining .Neuroscience Vol. 77, No. 4, pp. 1037-1048, 1997.

[35]Li, Y., Perry, T., Kindy, M.S et al. (2009). GLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 1285-1290.

[36] Eun Young Lee ,Yeon Wook Kim,Anti-obesity effects of KR-66195, a synthetic DPP-IVinhibitor, in diet-induced obese mice and obese-diabetic ob/ob mice,Metabolism chlinical and experimental 63(2014)793-799.

[37] Duan DM, Wu S, Hsu LA et al. Associations between TRPV4 genotypes and body mass index in Taiwanese subjects. Mol Genet Genomics. 2015 Aug;290(4):1357-65.

[38] Goossens GH. The role of adipose tissue dysfunction in the pathogenesis of obesity-related insulin resistance. Physiol Behav. 2008 May 23;94(2):206-18.

[39] Yang Z, Li W, He C. Potential effect of chronic Helicobacter pylori infection on glucose metabolism of Mongolian gerbils. World J Gastroenterol. 2015 Nov 28;21(44):12593-604.

[40] Hu Y, Rosa GJ, Gianola D. A GWAS assessment of the contribution of genomic imprinting to the variation of body mass index in mice. BMC Genomics. 2015 Aug 5;16:576.

[41] Goossens GH. The role of adipose tissue dysfunction in the pathogenesis of obesity-related insulin resistance. Physiol Behav. 2008 May 23;94(2):206-18.

[42] Siobhan M. Craige, PhD, Shashi Kant et al. Endothelial NADPH oxidase 4 protects ApoE-/- mice from atherosclerotic lesions. Free Radic Biol Med. 2015 December ; 89: 1-7.

[43]M. Lindner, S. Heine, K. Haastert et al. Sequential myelin protein expression during remyelination reveals fast and efficient repair after central nervous system demyelination , Neuropathology and Applied Neurobiology (2008), 34, 105-114.

[44] Sun SW, Liang HF, Trinkaus K et al. Noninvasive detection of cuprizone induced axonal damage and demyelination in the mouse corpus callosum. Magn Reson Med. 2006 Feb;55(2):302-8.

[45] Vallières N1, Berard JL, David S et al. Systemic injections of lipopolysaccharide accelerates myelin phagocytosis during Wallerian degeneration in the injured mouse spinal cord. Glia. 2006 Jan 1;53(1):103-13.

[46]Gotow T.Neurofilaments in health and disease. Med Electron Microsc. 2000;33(4):173-99.

[47] Yue Shen, Yongzhi Guo, Peter Mikus et al. Plasminogen is a key proinflammatory regulator that accelerates the healing of acute and diabetic wounds. Blood. 2012 Jun 14;119(24):5879-87.

[48]Hasan W1, Cowen T, Barnett PS et al. The sweating apparatus in growth hormone deficiency, following treatment with r-hGH and in acromegaly. Auton Neurosci. 2001 Jun 20;89(1-2):100-9.

[49] Loo LS1, Ng YK, Zhu YZ et al. Cortical expression of endothelin receptor subtypes A and B following middle cerebral artery occlusion in rats. Neuroscience. 2002;112(4):993-1000.

<110> 深圳瑞健生命科學研究院有限公司

<120> 一種調控GLP-1GLP-1R的方法和藥物

<130> PCT/CN2017/089067

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)核酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的胺基酸序列

<400> 14

Claims

一種有效量的纖溶酶原製備調控受試者GLP-1/GLP-1R功能的藥物的用途，其中所述纖溶酶原促進GLP-1、GLP-1R或其組合的表達，其中，所述纖溶酶原為與序列2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，並且具有纖溶酶原活性的蛋白質；或者所述纖溶酶原為包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
如請求項1所述的用途，其中所述受試者為糖尿病、高脂血症、動脈粥樣硬化、肥胖症、脂肪肝或帕金森氏症受試者。
一種有效量的纖溶酶原製備促進受試者髓鞘再生的藥物的用途，其中，所述纖溶酶原為與序列2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，並且具有纖溶酶原活性的蛋白質；或者所述纖溶酶原為包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
如請求項3所述的用途，其中所述受試者神經髓鞘損傷。
一種有效量的纖溶酶原製備促進受試者神經纖維再生的藥物的用途，其中，所述纖溶酶原為與序列2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，並且具有纖溶酶原活性的蛋白質；或者所述纖溶酶原為包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
如請求項5所述的用途，其中所述纖溶酶原促進受損神經中神經絲蛋白的表達。
如請求項5所述的用途，其中所述纖溶酶原促進皮膚神經纖維的再生。
如請求項1-7中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。
如請求項1-7中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物或治療方法聯用。
如請求項1-7中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原可與一種或多種選自如下的藥物或療法聯用：治療糖尿病的藥物或療法、治療動脈粥樣硬化的藥物或療法、治療心腦血管疾病的藥物或療法、治療血栓的藥物或療法、治療高血壓的藥物或療法，降血脂的藥物或療法、治療脂肪肝的藥物或療法、治療帕金森氏症的藥物或療法、抗感染藥物或療法。