JP2023518564A - ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する方法及び薬剤 - Google Patents
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Abstract
Description
1、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、tPAまたはuPA類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される1つ以上の治療有効量の化合物を被験者に投与することを含む、ミスフォールドタンパク質によって引き起こされる疾患(まとめてミスフォールドタンパク質疾患とも呼ばれる)を予防または治療する方法。
2、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、Glu-プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの1つ以上のkringleドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン(mini-plasminogen)、ミニプラスミン(mini-plasmin)、マイクロプラスミノーゲン(micro-plasminogen)、マイクロプラスミン(micro-plasmin)、delta-プラスミノーゲン、delta-プラスミン(delta-plasmin)、プラスミノーゲン活性化剤、tPA、及びuPAから選択されるものである、項1に記載の方法。
3、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、PAI-1、補体C1阻害剤、α2抗プラスミンまたはα2マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、項1に記載の方法。
4、前記ミスフォールドタンパク質によって引き起こされる疾患(まとめてミスフォールドタンパク質疾患とも呼ばれる)が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症およびポリグルタミン病、ゲルストマン症候群、びまん性または致命的な家族性不眠症、クールー病、嚢胞性線維症、肝障害、白内障、家族性アミロイドーシス、短鎖アシル-CoA脱水素酵素(SCAD)欠損症、家族性高コレステロール血症、運動ニューロン疾患、糖尿病、透析関連アミロイドーシス、およびアミロイドーシス関連のヒト疾患を含む、項1~3のいずれか一項に記載の方法。
5、前記ポリグルタミン病が、ハンチントン病、3型脊髄小脳失調症、及び歯状赤血球症レビー小体萎縮症を含む、項1~3のいずれか一項記載の方法。
6、前記化合物がプラスミノーゲンである、項1~5のいずれか一項に記載の方法。
7、前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、項1~6のいずれか一項に記載の方法。
8、前記プラスミノーゲンが、配列2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、項1~6のいずれか一項に記載の方法。
9、前記プラスミノーゲンが、配列14と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、項1~6のいずれか一項に記載の方法。
10、前記プラスミノーゲンがGlu-プラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、delta-プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択されるものである、項1~6のいずれか一項に記載の方法。
11、前記プラスミノーゲンが、配列2、6、8、10または12に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列2、6、8、10または12に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、項1~6のいずれか一項に記載の方法。
12、前記化合物が、1つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、項1~11のいずれか一項に記載の方法。
13、前記他の治療方法が、細胞療法(幹細胞療法を含む)、支持療法、及び物理的療法を含む、項12に記載の方法。
14、前記他の薬剤が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALS、またはハンチントン病の治療のためのその他の薬剤である、項12に記載の方法。
15、前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈を介して)、及び筋肉内に投与される、項1~14のいずれか一項に記載の方法。
1、プラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、Glu-プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン(micro-plasminogen)、delta-プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体;
2、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
3、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、tPA及びuPA、ならびにtPAまたはuPAの1つ以上のドメイン(1つ以上のkringleドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど)を含むtPAまたはuPA変異体及び類縁体をカバーする。
分数X/Y×100
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid-Phase Peptide Synthesis;3-284ページ、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723-8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンとN保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール;アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;m-クレゾール);低分子量ポリペプチド(約10個より少ない残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛-タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましい凍結乾燥された抗VEGF抗体製剤は、WO97/04801に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬や点眼薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内(例えば、頸動脈を介して)、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示することを含む。
11~12週齢、18~25gのC57BL/6Jオスマウス8匹を取り、モデリングの1日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で4匹、モデル群で4匹とした。モデリング時間は毎日午前9時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水200μlを腹腔内注射により投与し、モデル群には5mg/ml MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)溶液を35mg/kg/匹で腹腔内注射により投与し、5日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した[1]。MPTP溶液の調製:45mg MPTP(Sigma、M0896)を9mlの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度5mg/mlであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後6日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清(脳組織ホモジネート)を取り、EPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL α-シヌクレイン溶液(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、custom-expressed human α-synuclein,UniProtKB-P37840,1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mL α-シヌクレイン溶液(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1.5時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解した)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで写真を撮って定量的にスキャンした。
パーキンソン病は、現在、中脳黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの欠如及びレビー小体の出現によって引き起こされると考えられている。α-シヌクレインは、140アミノ酸残基から構成されるニューロンタンパク質であり、神経細胞の損傷を引き起こし、中枢神経系の神経変性のプロセスに関与する可能性がある。研究では、神経細胞のレビー小体と神経シナプス内で凝集したα-シヌクレインは、パーキンソン病における脳病変の特徴であることが明らかになった[2]。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のα-シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く(***はP<0.001を表す)、その重合体a、bの量はいずれも溶媒対照群より有意に低く(**はP<0.01、***はP<0.001を表す)、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のα-シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり(***はP<0.001を表す)、その重合体a及びbの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった(*はP<0.05を表し、**はP<0.01を表す)(図1)。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα-シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。
11~12週齢、18~25gのC57BL/6Jオスマウス8匹を取り、モデリングの1日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で4匹、モデル群で4匹とした。実施例1に記載されたようにパーキンソン病モデルを構築し[5]、脳組織ホモジネートを調製してEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL α-シヌクレイン溶液(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、custom-expressed human α-synuclein,UniProtKB-P37840,1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン投与群に21.5mL α-シヌクレイン溶液(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1.5時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトα-シヌクレイン抗体(Proteintech、10842-1-AP)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のα-シヌクレイン量が溶媒対照群に比べて有意に低く(**はP<0.01を表す)、その重合体の量はいずれも溶媒対照群より有意に低く(***はP<0.001を表す)、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のα-シヌクレインの量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり(**はP<0.01を表す)、その重合体の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった(***はP<0.001を表す)(図2)。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウス及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトα-シヌクレイン及びその重合体を効果的に分解できることを示している。
10~12週齢のC57BL/6Jオスマウス28匹を取り、モデリングの1日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で20匹とした。実施例1に記載されたようにパーキンソン病モデルを構築した[1]。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後6日目に、モデル群のマウスを体重に応じてランダムに2群に分け、溶媒群と投与群でそれぞれ10匹とし、投与を開始し、それを1日目として記録した。投与群マウスに1mg/100μl/匹でプラスミノーゲン溶液を尾静脈注射により投与し、溶媒群に100μl/匹で溶媒溶液を注射し、連続して14日間投与し、投与の15日目にマウスを殺処分し、マウスの黒質を採取して4%パラホルムアルデヒドで24~48時間固定した。固定された黒質(脳組織)をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。切片の黒質を位置付け、切片の厚さは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和しから1回水で洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素で15分間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。5%正常ヤギ血清(Vector Laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスα-シヌクレイン抗体(α-synuclein)(Proteintech,10842-1-AP)を滴下して4℃で一晩インキューベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒対比染色して、流水で5分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で400倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図3A)のマウスの黒質には少量のα-シヌクレインしかなく、溶媒群(図3B)のマウスの黒質中のα-シヌクレインの量は、ブランク対照群のマウスよりも有意に高かく(*はP<0.05を表す)、プラスミノーゲン投与群(図3C)のマウスの黒質中のα-シヌクレインの量は溶媒群よりも有意に低く、ブランク対照群に近く、その差は統計学的に有意であった(*はP<0.05を表す)(図3D)。これは、プラスミノーゲンがパーキンソン病モデルマウスの黒質におけるα-シヌクレインの発現を低下させ、神経損傷変性を改善できることを示している。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群、(4)プラスミノーゲン+tPA群で、各群に4つのチューブを設定した。ブランク対照群には、43.3μLの生理食塩水、16μLのプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、10μLの超純水、30.7μLのPBS緩衝液(10mM、pH7.4、Thermo Fisher、10010-031)を添加した;溶媒対照群に43.3μLAβ40(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011521、1.0mg/mL)、16μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、10μL超純水、30.7μLPBS緩衝液を添加した;プラスミノーゲン群に43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、16μLプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、10μL超純水、30.7μL PBS緩衝液を添加した;プラスミノーゲン+tPA群に、43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、8μLプラスミノーゲン溶液(1.15mg/mL)、8μL tPA溶液(1.0mg/mL)、10μLリジン溶液(0.1mM)、30.7μL PBS緩衝液を添加した。各サンプルの添加後、37℃で3時間インキュベートした後、100μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して1分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、1‰のクーマシーブリリアントブルー染色液(1gのクーマシーブリリアントブルーR250を、エタノール:氷酢酸:精製水の体積比が5:2:13の混合液1000mlに溶解した)に置いて30分間染色した後、脱色液(精製水:氷酢酸:無水エタノール=17:2:1の体積比で混合)を用いてきれいに脱色した。ゲルを生体分子イメージャーで撮影し、定量的にスキャンした。
アミロイド(Aβ)の蓄積は、アルツハイマー病の形成における重要な要因であり、そのうち40及び42残基を含むAβ40及びAβ42は、老人斑を構成する主な形態であり、すなわち、脳の海馬及び線条体に沈着して老人斑を形成することがアルツハイマー病の主な原因である[3]。脳脊髄液中のAβ40及びAβ42の含量検出は、徐々に臨床的アルツハイマー病の生理学的指標になりつつある。
その結果、溶媒対照群のAβ40量を100%として定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にAβ40が部分的に分解され、プラスミノーゲン+tPA群では、プラスミノーゲンとtPAを添加した場合、Aβ40のインビトロ分解は明らかであり、溶媒対照群と比較して有意な差があった(**はP<0.01を表す)(図4)。これは、プラスミノーゲンがPBS緩衝系中でヒトアミロイドAβ40の分解を促進できることを示している。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群、(4)プラスミノーゲン+tPA群にそれぞれ設定した。ブランク対照群には、43.3μLの生理食塩水、16μLのプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、40.7μLのウサギ(市場から購入)脳脊髄液を添加した;溶媒対照群に43.3μL Aβ40(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011521、1.0mg/mL)、16μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、40.7μLのウサギ脳脊髄液を添加した;プラスミノーゲン群に43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、16μLプラスミノーゲン溶液(0.575mg/mL)、40.7μLのウサギ脳脊髄液を添加した。プラスミノーゲン+tPA群には、43.3μL Aβ40(1.0mg/mL)、8μLプラスミノーゲン溶液(1.15mg/mL)、8μL tPA溶液(1.0mg/mL)、及び40.7μL PBS緩衝液を添加した。添加した後、各サンプルを37℃で3時間インキュベートした後、100μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
その結果、溶媒対照群のAβ40の量を100%と定義し、変化がなく、プラスミノーゲン群では、プラスミノーゲンのみを添加した場合にAβ40が部分的に分解され、74.81%に分解された(図5)。これは、プラスミノーゲンがウサギの脳脊髄液中のヒトアミロイドAβ40の分解を促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(ストック(在庫)番号:034840)(FADと略称)及びC57BL/6(正常)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートをEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Aβ40(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011521、1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mL Aβ40(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のヒトアミロイドAβ40量は溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す);正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドAβ40の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であった(P=0.001)(図6)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデル及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドAβ40の分解を効果的に促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)及びC57BL/6(正常)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートをEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Aβ42(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011526、1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mL Aβ42(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のアミロイドAβ42の量が溶媒対照群よりも低く、重合体a、b、cの量はいずれも溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった(*はP<0.05を表し、***はP<0.001を表す);正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のアミロイドAβ42の量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり(***は<0.001を表す)、重合体a、b、cの量はいずれも溶媒群より低く、その差は極めて有意であった(***は<0.001を表す(図7)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウス及び正常なマウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドAβ42及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)及びC57BL/6(正常)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートをEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク対照群、(2)溶媒対照群、(3)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Aβ42(上海強耀生物科技有限公司(ChinaPeptides Co., Ltd.,)、04010011526、1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mL Aβ42(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
Tris-Tricine-SDS-PAGEゲル調製キット(Solarbio、P1320)の説明書に従って、20%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1.5時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、マウス抗ヒトAβ42抗体(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.,10842-1-AP)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6789)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のヒトアミロイドAβ42量は溶媒対照群に比べて有意に低く、その重合体の量も溶媒群より有意に低く、その差は極めて有意であった(*はP<0.5を表す);正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のアミロイドAβ42の量は溶媒対照群よりも有意に低く、その差は極めて有意であり(***P<0.001)、その重合体の量も溶媒群より低く、その差は極めて有意であった(***P<0.001)(図8)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデル及び正常マウスの脳ホモジネートにおいて、ヒトアミロイドAβ42及びその重合体の分解を効果的に促進できることを示している。
11~12週齢の18~25gのC57BL/6Jオスマウス4匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートをEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Tau(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Tau protein,UniProtKB-P10636-8,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5μLのTau(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、10%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ由来Tauタンパク質抗体(Abcam、ab151559)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
Tauタンパク質は、最も豊富な微小管関連タンパク質である。Tauタンパク質はリン酸基含有タンパク質であり、正常な成熟脳のTauタンパク質分子には2~3個のリン酸基が含まれている。アルツハイマー病(老年性認知症)患者の脳内のTauタンパク質は異常に過剰リン酸化されており、Tauタンパク質の各分子は5~9個のリン酸基を含み得、正常な生物学的機能を失う可能性がある[4]。
その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のTauタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は有意であった(*はP<005を表し、**はP<0.01を表し、***はP<0.001を表す)(図9)。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるTauタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートをEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Tau(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Tau protein,UniProtKB-P10636-8,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5μLのTau(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(0.5mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、10%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ由来Tauタンパク質抗体(Abcam、ab151559)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のTauタンパク質の量が溶媒対照群よりも有意に低く、その差は統計的に有意であった(*はP<005、**はP<0.01を表す)(図10)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病マウスの脳ホモジネートのTauタンパク質の分解を促進できることを示唆している。
B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjaxマウス(カタログ番号:034840、Jackson Laboratoryから購入)とC57BL/6Jマウスを3回戻し交配させて子孫(B6-F3-FADと呼ぶ)を繁殖させた。20~25週齢のメスB6-F3-FADマウス18匹及び9週齢のC57BL/6Jメスマウス9匹を取った。B6-F3-FADは、体重及びY迷路試験の結果に応じて、溶媒群と投与群の2つの群にランダムに分け、各群9匹とした。9匹のC57BL/6Jをブランク対照群として使用した。群分けが完了した後、ブランク対照群のマウスと溶媒群のマウスに溶媒を尾静脈注射により投与し、各マウスの注射量は5ml/kgであった。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、各マウスに50mg/kgの用量で28日間連続して注射した。投与後の7日後、各群からマウスをランダムに選んで殺処分し、脳組織を採取し、4℃でホモジナイズし、上清であるホモジネートを取ってBCA法による総タンパク質濃度の検出及びウェスタンブロット検出を行った。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、10%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで1.5時間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗マウスTau抗体(Abcam、ab151559)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳ホモジネートに一定のレベルの異なる分子量のTauタンパク質があり、投与群のマウスの脳組織における各分子量のTauタンパク質及び総Tauタンパク質のレベルは媒体群のマウスよりも有意に低く、2つの群の35kd、35~40kd、40kd、54kdの分子量Tauタンパク質レベル及び総Tauタンパク質レベルの統計分析P値はそれぞれ、0.174、0.0406、0.052、0.067、及び0.055であった(図11)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマーモデルマウスの脳組織においてTauタンパク質の分解を促進できることを示している。
11~12週齢、18~25gのC57BL/6Jオスマウス4匹を取り、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Pro-BDNF,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21μLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)は、分子量12.3kDの塩基性タンパク質であり、119個のアミノ酸残基からなり、3対のジスルフィド結合を含み、生体内で二量体化した形で存在し、BDNF前駆体の形で合成し、BDNF前駆体(Pro-BDNF)は、酵素加水分解によって切断され、成熟したBDNFを形成する。Pro-BDNFは、切断されて形成した成熟BDNFと相反の効果を有することが文献で報告されている。Pro-BDNFはニューロンのアポトーシスを促進し、シナプス可塑性を低下させる[5]。成熟したBDNF及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である[6]。
その結果、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図12)。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいてPro-BDNFの切断を促進できることを示唆している。
11~12週齢、18~25gのC57BL/6Jオスマウス4匹を取り、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Pro-BDNF,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21μLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化されたPVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトBDNF抗体(Boster Biological Technology、PB9075)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった(**はP<0.01を表す)(図13)。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-BDNFの切断及を促進できることを示唆している。
11~12週齢、18~25gのC57BL/6Jオスマウス4匹を取った。モデリング時間は毎日午前9時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水200μlを腹腔内注射により投与し、モデル群には5mg/ml MPTP溶液を35mg/kg/匹で腹腔内注射により投与し、5日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した[6]。MPTP溶液の調製:45mg MPTP(Sigma、M0896)を9mlの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度5mg/mlであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後6日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清、すなわち脳ホモジネートを取り、新しいEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.,custom-expressed human Pro-BDNF,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μL溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21μL Pro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図14)。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてPro-BDNFの切断を促進できることを示唆している。
11~12週齢、18~25gのC57BL/6Jオスマウス8匹を取り、モデリングの1日前にすべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で4匹、モデル群で4匹とした。モデリング時間は毎日午前9時に設定され、ブランク対照群には生理食塩水200μlを腹腔内注射により投与し、モデル群には5mg/ml MPTP溶液を35mg/kg/匹で腹腔内注射により投与し、5日間連続注射してパーキンソン病モデルを構築した[6]。MPTP溶液の調製:45mg MPTP(Sigma、M0896)を9mlの生理食塩水溶液に溶解して、最終濃度5mg/mlであるように調製した。モデリングが完了した後、すなわち、モデリング後6日目に、モデリングが成功したかを確認するために、すべてのマウスについてオープンフィールド試験を行なった。全てのマウスを殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分間、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清、すなわち脳ホモジネートを取り、新しいEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群に21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%アルギニン塩酸塩、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Pro-BDNF,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21μLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したPVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトBDNF抗体(Boster Biological Technology、PB9075)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jで定量的に分析した。
その結果、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量が溶媒対照群に比べて有意に低く、その差が有意であり(*はP<0.05、***はP<0.001を表す)、プラスミノーゲン投与群のBDNF量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった(図15)。これは、プラスミノーゲンが、パーキンソン病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-BDNFの切断及び成熟BDNFの形成を促進できることを示唆している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Pro-BDNF,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン群のPro-BDNF量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図16)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてPro-BDNFの切断を促進できることを示唆している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)投与群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-BDNF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human Pro-BDNF,UniProtKB-P23560,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5mLのPro-BDNF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトBDNF抗体(Boster Biological Technology、PB9075)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をImage Jで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のPro-BDNF量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった(**はP<0.01、***P<0.001を表す);プラスミノーゲン投与群のBDNF量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は極めて有意であった(図17)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-BDNFの切断及び成熟BDNFの形成を促進できることを示唆している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを2つの群にランダムに分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分け終了後、ブランク対照群には維持飼料を、モデル群には0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源業生物科技有限公司、カタログ番号:S30349)を含むモデリング飼料を、連続して42日間与えて統合失調症モデルを誘発した[7,8]。モデリング後、すべてのマウスに対してオープンフィールド試験を行い、試験の結果に応じて、モデル群マウスを2つの群に分け、溶媒群で11匹とし、投与群で11匹とした。群分け終了後、すべてのマウスに投与を開始し、これを1日目とし、ブランク対照群のマウスに0.1ml/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群のマウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続して投与した。投与期間中にすべてのマウスに正常に維持食を与えた。36日目にマウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒドで固定し、脱水して包埋した。固定された組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚さは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和しから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水ですすいだ。3%過酸化水素で15分間インキュベートし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%ヤギ血清(Vector Laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗BDNF抗体(BosterBio,PB9075)を加えて4℃で一晩インキューベートし、PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒対比染色して、流水で5分間青色に戻してからPBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にし、封入させ、切片を光学顕微鏡下で400倍にて観察して撮影し、撮影した写真をImaging-Proソフトウェアで陽性染色し、光学密度を分析した。
成熟したBDNF及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系及び末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である[5]。
その結果、ブランク対照群(図18A)のマウスの海馬が一定レベルのBDNFを有し(矢印でマーク)、溶媒群(図18B)のマウスの海馬におけるBDNFのレベルは向上し、投与群(図18C)のマウスの海馬におけるBDNFのレベルは溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意に近かった(P=0.095)(図18D)。これは、プラスミノーゲンが統合失調症モデルマウスの海馬でBDNFのレベルの増加を促進できることを示唆している。
24週齢のC57オスマウス23匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重によって異常なマウスを除外した後、すべてのマウスを2つの群にランダムに分け、ブランク対照群で7匹、モデル群で16匹とした。すべてのマウスを麻酔し、マウスの定位アトラスに従って海馬の顆粒球層に位置付けし(前ハロゲンポイントの座標に従って位置付け:AP-2.0mm、ML±1.5mm、DV2.0mm)、各マウスの両側にゆっくりと微量注入し、モデル群のマウスにAβ1-42オリゴマー溶液を注入し、ブランク対照群のマウスに同量のPBS溶液を注入し、注入速度は0.4μL/分、注入量は2μLであった。注射後、注射器を5分間停止し、ゆっくりと引き抜き、アルツハイマーモデル[3]を構築した。Aβ1-42オリゴマー溶液(10μM)の調製:β-アミロイド(1-42)(カタログ番号:D2650、メーカー:Sigma)を取り、冷ヘキサフルオロイソプロパノールを加え、濃度を1mg/mlにし、室温で3日間置いた後、45μL/チューブ、すなわち10nmol/mLに分注し、ドラフト内に一晩置き、25℃の乾燥オーブンに1時間乾燥してから-80℃で保存した。使用時は各チューブにジメチルスルホキシド溶液10μlを加えて溶解し、注入時は滅菌PBS溶液990μLを加え、4℃で24時間静置してから使用した。脳局在注射28日後、すべてのマウスについて体重測定及びY迷路試験を行い、試験の結果によってブランク対照群及びモデル群の異常なマウスを排除し、モデル群マウスを2つの群にランダムに分け、溶媒群で6匹、投与群で7匹とし、ブランク対照群は6匹であった。溶媒群及び投与群のマウスに投与を開始し、これを1日目とし、投与群のマウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のマウスに0.1ml/匹/日で溶媒(4%アルギニン+2%グリシン溶液)を尾静脈注射により投与し、28日間連続して投与し、ブランク対照群のマウスには投与しなかった。29日目にマウスを殺処分し、脳を採取して10%ホルムアルデヒドで24~48時間固定した。固定された脳組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。黒質を位置付けし、切片の厚さは4μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和しから1回水で洗った。PAPマーカーで組織を丸で囲み、3%過酸化水素で15分間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。5%正常ヤギ血清(Vector Laboratories,Inc.,USA)で30分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスBDNF抗体(BosterBio,PB9075)を加えて4℃で一晩インキューベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベートし、0.01M PBSで2回洗浄し、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒対比染色して、流水で5分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図19A)のマウスの海馬が一定レベルのBDNFを発現し(矢印でマーク)、溶媒群(図19B)のマウスの海馬におけるBDNFの発現は、ブランク対照群よりも有意に低く、投与群(図19C)のマウスの海馬におけるBDNFの発現は溶媒群よりも有意に高く、統計的差は有意であった(*はP<0.05を表す)(図19D)。これは、プラスミノーゲンがアルツハイマー病モデルマウスの海馬でBDNFの発現を促進できることを示している。
FVB.Cg-Grm7Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1MsdTg(SMN2*delta7)4299Ahmb/J遺伝子変異マウス(以下において、SMNΔ7 SMAマウスと略称する)は、SMN1遺伝子のホモ接合変異を持ち、ヒトSMN2遺伝子を発現し、このマウスの臨床的および病理学的症状は、ヒトSMAに似ている。繁殖マウスは、米国ジャクソン研究所から購入した(血統番号(Pedigree Number ):005025)。
3日齢のSMNΔ7 SMAマウス7匹を取り、溶媒群ではマウスは4匹であり、最初の9日間には、6μlのウシ血清アルブミン溶液(5mg/ml)を毎日の午前と午後にそれぞれ1回腹腔内注射により投与し、その後は6μlのウシ血清アルブミン溶液(10mg/ml)を1日1回腹腔内注射により投与した。投与群ではマウスは3匹であり、最初の9日間には、30μg/6μlのプラスミノーゲンを毎日の午前と午後にそれぞれ1回腹腔内注射により投与し、その後は60μg/6μlのプラスミノーゲンを1日1回腹腔内注射により投与した。4匹の野生型マウスをブランク対照群とし、最初の9日間には、6μlのウシ血清アルブミン溶液(5mg/ml)を毎日の午前と午後にそれぞれ1回腹腔内注射により投与し、10日目から6μlのウシ血清アルブミン溶液(10mg/ml)を1日1回腹腔内注射により投与した。12日目に、マウスを殺処分して後肢の筋肉組織を採取し、NGFタンパク質のウエスタンブロット検出用の組織ホモジネートを調製した。SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで45分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したPVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗マウスNGF抗体(Abcam,ab52918)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、各バンドの光学密度値をImage Jで定量的に分析した。
神経成長因子(Nerve growth factor,NGF)は、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子NGFの前駆体(Pro-NGF)が、切断されて形成するNGFと相反の役割を果たしていることが報告されている。Pro-NGFはニューロンのアポトーシスを促進することができる。成熟したNGFは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている[7]。NGF/Pro-NGFの比=NGF光学密度(OD)/Pro-NGF光学密度(OD)値である。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳組織には一定のNGF/ProNGF比があり、投与群のマウスの脳組織のNGF/ProNGF比は溶媒群マウスより有意に高く、統計学的差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図20)。これは、プラスミノーゲンが、SMAモデルマウスのProNGFからNGFへの変換を促進し、成熟NGFの形成を促進できることを示唆している。
11~12週齢の18~25gのC57BL/6Jオスマウス4匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから1×PBS(Thermo Fisher、pH7.4;10010-031)を150mg組織/mL PBSで加え、4℃でホモジナイズし(1分/回、3~4回)、ホモジナイズ後、4℃(12000rpm、20min)で遠心分離し、上清の脳ホモジネートを新しいEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-NGF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed Pro-NGF,配列はUniProtKB-P01138に由来,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.μLのPro-NGF溶液(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、15%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで30分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトNGF抗体(Abcam,ab52918)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をImage Jで定量的に分析した。
NGFは、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子NGFの前駆体(Pro-NGF)が、切断されて形成するNGFと相反の役割を果たしていることが報告されている。Pro-NGFはニューロンのアポトーシスを促進することができる[8]。成熟したNGFは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている[9]。
その結果、正常マウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のPro-NGF量が有意に低く、その差は極めて有意であった(*はP<0.05、***はP<0.001を表す);プラスミノーゲン群のNGF量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった(図21)。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-NGFの切断及び成熟NGFの形成を促進できることを示唆している。
11週齢のB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax(FAD)(在庫番号:034840)(FADと略称)マウス4匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに置いた。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL Pro-NGF(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed Pro-NGF,UniProtKB-P01138,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.μLのPro-NGF(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、15%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLのサンプルを採取しえローディングした。電気泳動条件は、30Vで30分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、PVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトNGF抗体(Abcam,ab52918)を加えて室温で2時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をImage Jで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン群のPro-NGF量が有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す);プラスミノーゲン投与群のNGF量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった(図22)。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、Pro-NGFの切断及び成熟NGFの形成を促進できることを示唆している。
11週齢のC57BL/6(正常)マウス4匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL SOD-1タンパク質(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human SOD-1,UniProtKB-P00441,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5μLのSOD-1(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
スーパーオキシドジスムターゼ-1(SOD-1)は、銅イオンと亜鉛イオンに結合する金属タンパク質であり、反応性の高い活性酸素種スーパーオキシドを酸素分子と過酸化水素に変換する際に重要な役割を果たす。神経難病である筋萎縮性側索硬化症(ALS)患者の一部においてSOD-1遺伝子が変異し、異常な三次元構造を有するミスフォールドされたSOD-1が、脊髄の運動神経に蓄積することが知られている。さらに、SOD-1をコードする遺伝子に変異のない、原因不明の散発性ALS患者の脳脊髄液中に、非常に毒性の高いミスフォールドSOD-1が検出された。つまり、SOD-1の構造異常がALSの病因に関連している可能性がある[10]。
その結果、正常なマウスの脳ホモジネートでは、プラスミノーゲン群のSOD-1の量が溶媒対照群よりも低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図23)。これは、プラスミノーゲンが、正常なマウスの脳ホモジネートにおけるSOD-1タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。
8週齢のB6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/Jトランスジェニックオスマウス(SOD1-G93Aトランスジェニックマウスと略称する)を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例6のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)投与群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL SOD-1タンパク質(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human SOD-1,UniProtKB-P00441,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン投与群に21.5μLのSOD-1(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、12%ゲルを調製した。各群のサンプルを実施例1のように電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色液で染色した後、脱色して定量的にスキャンした。
SOD1-G93Aトランスジェニックマウスは、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis,ALS)の研究に広く使用されているモデルマウスである[11]。
その結果、SOD1-G93Aトランスジェニックマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のSOD-1タンパク質の量が有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図24)。これは、プラスミノーゲンが、ALSモデルマウスの脳ホモジネートにおいて、SOD-1タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。
11週齢のC57BL/6(正常)マウス4匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL SOD-1タンパク質(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human SOD-1,UniProtKB-P00441,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.5μLのSOD-1(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、15%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで30分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したPVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトSOD-1抗体(BOSTER Biological Technology,PB0453)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jでバンド光学密度を定量的に分析した。
その結果、正常マウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン投与群のSOD-1タンパク質の量が有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図25)。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、SOD-1タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。
8週齢のB6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/Jトランスジェニックオスマウス(SOD1-G93Aトランスジェニックマウスと略称する)4匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、実施例1のように上清の脳ホモジネートを調製してEPチューブに移した。
Eppendorf(EP)チューブを取り、(1)ブランク群、(2)ブランク対照群、(3)溶媒対照群、(4)プラスミノーゲン群で、各群に5つの並列を設定した。ブランク群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLの溶媒溶液(10mMクエン酸ナトリウム、2%塩酸アルギニン、3%マンニトール、pH7.4)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;ブランク対照群には、21.5μLの生理食塩水、4.6μLのプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;溶媒対照群に21.5μL SOD-1タンパク質(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd., custom-expressed human SOD-1,UniProtKB-P00441,1.0mg/mL)、4.6μLの溶媒溶液、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した;プラスミノーゲン群に21.μLのSOD-1(1.0mg/mL)、4.6μLプラスミノーゲン溶液(2mg/mL)、及び23.9μLのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、37℃で6時間インキュベートした後、50μLの0.1%トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
SDS-PAGEゲル調製キットの説明書に従って、15%ゲルを調製した。各群のサンプルを4×ローディング緩衝液(TaKaRa、e2139)と体積比3:1で均一に混合し、100℃で5分間加熱し、冷却して2分間遠心分離した後、20μLを採取してローディングした。電気泳動条件は、30Vで30分間実行した後、100Vでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したPVDFメンブレン(GE、A29433753)に転写し、電気泳動条件は15Vで2.5時間であった。転写したPVDFメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク液)に浸し、4℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、TBST(0.01M Tris-NaCl、pH7.6緩衝液)で4回洗浄した後、ウサギ抗ヒトSOD-1抗体(BOSTER Biological Technology,PB0453)を加えて室温で3時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam、ab6721)二次抗体を加え、室温で1時間インキュベートし、TBSTで4回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にPVDFメンブレンを置き、Immobilon Western HRP Substrate(MILLIPORE、WBKLS0100)を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Image Jでバンド光学密度を定量的に分析した。
その結果、SOD1-G93Aトランスジェニックマウスの脳ホモジネートでは、溶媒対照群に比べてプラスミノーゲン群のSOD-1タンパク質の量が有意に低く、その差は極めて有意であった(***はP<0.001を表す)(図26)。これは、プラスミノーゲンが、SOD1-G93Aトランスジェニックマウスの脳ホモジネートにおいて、SOD-1タンパク質の分解を効果的に促進できることを示している。
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Claims (15)
- プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、tPAまたはuPA類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される1つ以上の治療有効量の化合物を被験者に投与することを含む、ミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する方法。
- 前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、Glu-プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの1つ以上のkringleドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン(mini-plasminogen)、ミニプラスミン(mini-plasmin)、マイクロプラスミノーゲン(micro-plasminogen)、マイクロプラスミン(micro-plasmin)、delta-プラスミノーゲン、delta-プラスミン(delta-plasmin)、プラスミノーゲン活性化剤、tPA、及びuPAから選択されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、PAI-1、補体C1阻害剤、α2抗プラスミンまたはα2マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物が、ヒトアミロイドAβ40、ヒトアミロイドAβ42、α-シヌクレイン、Tauタンパク質、SOD-1タンパク質、ポリグルタミン、ニューロセリンプロテアーゼ阻害剤(NSP)、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子、α1-アンチトリプシン、パーキンタンパク質、クリスタリン、トランスサイレチン、短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ変異体、低密度リポタンパク質受容体、ハンチンチン、ニューロフィラメントタンパク質、末梢タンパク質、α-インターネキシン、膵島アミロイドポリペプチド、β2-ミクログロブリン、血清アミロイドAタンパク質、免疫グロブリン軽鎖、ヒトリゾチーム、α-ラクトアルブミン、プロサイモシンα、アポリポプロテインE、及びアポリポプロテインJから選択される1つまたは複数のミスフォールドタンパク質およびその凝集体の分解を促進する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が成熟BDNFへのPro-BDNFの切断を促進するか、または成熟NGFへのPro-NGFの切断を促進する、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 前記化合物がプラスミノーゲンである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、ヒト全長プラスミノーゲンまたはその保存的置換変異体である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、配列2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲンのリジン結合活性またはタンパク質加水分解活性を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、配列14と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、Glu-プラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、delta-プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲンが、配列2、6、8、10または12に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列2、6、8、10または12に示されるアミノ酸配列の保存的置換変異体を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物が、1つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記他の治療方法が、細胞療法(幹細胞療法を含む)、支持療法、及び物理的療法を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の他の薬剤が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、またはパーキンソン病の治療のための薬剤である、請求項12に記載の方法。
- 前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈を介して)、または筋肉内に投与される、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
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