TWI705137B

TWI705137B - 植物病害防治之菌株、微生物組合物及其使用方法

Info

Publication number: TWI705137B
Application number: TW108110620A
Authority: TW
Inventors: 蔡濰安; 梁容鐘; 蔡宜峯; 邱淑媛
Original assignee: 行政院農業委員會花蓮區農業改良場
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2020-09-21
Also published as: TW202035678A

Abstract

本發明提供一種植物病害防治之菌株（芽孢桿菌HL_B03）、微生物組合物及其使用方法。其中，該菌株能夠拮抗細菌性青枯病；該微生物組合物包括該菌株及菜籽粕。該微生物組合物之使用方法包括施加該微生物組合物於預定種植農作物的土壤或農作物表面，藉此增加土壤營養且幫助農作物抵抗病害。

Description

植物病害防治之菌株、微生物組合物及其使用方法

本發明係關於一種菌株（芽孢桿菌HL_B03）、微生物組合物及其使用方法，尤其是有關於一種有助於植物病害防治之菌株、微生物組合物及其使用方法。

農作物的植物病害造成農作物的黃化、矮化、葉變形、果實變形及萎凋等問題。其中，以土傳性青枯病尤其嚴重。青枯病菌係經由植物根部侵入植物且在木質部內繁殖，最終導致木質阻塞而使得植物枯萎死亡。並且青枯病菌能在土壤中存活相當長的時間，所以一旦發生青枯病菌就很難將其根除。

傳統對於農作物的植物病害防治多採用化學性肥料，但此舉常造成土壤酸化及固化，並使土壤的微生物數量驟減，而導致土壤質地的破壞，遂影響其蓄水及保肥的能力，從而阻礙農作物的生長。進一步地，傳統的土壤燻蒸劑亦為一種化學試劑（例如溴化甲烷），其被廣泛地應用於土壤的殺菌及滅菌。雖然其防治效果極佳，但是卻有破壞臭氧層及導致土壤微生物相失衡的風險。綜上所述，開發一種能夠增進土壤營養狀況與幫助農作物抗菌之微生物組合物，實為本領域當前重要的課題。

為解決上述之問題，本發明之目的為提供一種植物病害防治之菌株（芽孢桿菌HL_B03）、微生物組合物及其使用方法，以改善習知技藝之問題，進而提升農作物的產量與品質。

根據本發明之一目的，提出一種芽孢桿菌的菌株（HL_B03），其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存標號為BCRC910810，其中，該菌株能夠拮抗細菌性青枯病。

較佳地，該菌株進一步以篩選方法獲得，篩選方法包括（1）提供含有芽孢桿菌的土壤至培養基中；（2）培養在30℃環境下24〜48小時，加入10 ⁸cfu/ml青枯病菌於培養基中；（3）挑選出拮抗圈半徑接近或大於1cm的初始菌株；（4）將初始菌株培養於含有菜籽粕（rapeseed meal）之培養基中，且培養在30℃環境下24〜48小時；以及（5）挑選出能夠產生利用圈的菌株。

根據本發明之另一目的，提出一種植物病害防治的微生物組合物，其包括芽孢桿菌的菌株（HL_B03）以及菜籽粕；其中，該菌株在微生物組合物中的比例為2〜3%，菜籽粕在微生物組合物中的比例為97〜98%。

較佳地，在植物病害防治的微生物組合物中，菜籽粕包括芥末粉（mustard powder）、油菜籽粕（rapeseed meal）及芥花籽粕（canola meal）中之至少一種。

較佳地，在植物病害防治的微生物組合物中，植物病害包括青枯病或絲瓜萎凋病。

較佳地，微生物組合物進一步包括基肥，其中，微生物組合物與基肥之重量比例為3：5〜9：10。

根據本發明之再一目的，提出一種微生物組合物之使用方法，其包括（1）施加上述微生物組合物於預定種植農作物的土壤；或者（2）施加上述微生物組合物於農作物表面。

較佳地，在微生物組合物之使用方法中，農作物包括茄科或葫蘆科農作物。

本發明之植物病害防治之菌株（芽孢桿菌HL_B03）、微生物組合物及其使用方法具有下述優點：

（1）本發明之菌株具有拮抗青枯病菌的能力，能夠有效防治該細菌所導致的青枯病。此外，該菌株為一種溶磷菌，可分解土壤中不可溶解的物質轉換成磷、鐵、鈣等，以提供農作物養分並幫助其吸收。據此，該菌株可添加於各種的肥料，增強肥料功效，進一步能夠增強農作物對植物病害的抵抗，尤其是對土傳性病菌的防治。

（2）菜籽粕為油菜籽榨油後的副產物，其具有抑菌的能力，也可作為有機質肥料。在本發明中，菜籽粕可作為土壤燻蒸劑以取代化學性的溴化甲烷。由於其為天然的有機物質，故可避免化學性試劑所致之缺點，進而能達成土壤微生物相平衡之功效。

（3）在本發明之微生物組合物中，以菜籽粕作為生物燻蒸劑，再搭配該菌株（芽孢桿菌HL_B03），兩者之組合物可以協同防治青枯病，相較於個別的使用情況，可以提供更好的抗病效果。

為使上述目的、技術特徵及實際實施後之效益更易於使本領域具有通常知識者理解，將於下文中以實施例搭配圖式更詳細地說明。

本發明之芽孢桿菌的菌株（HL_B03），其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存標號為BCRC910810。該菌株能夠拮抗細菌性青枯病。進一步地，經財團法人食品工業發展研究所進行菌種鑑定，確認該菌株為芽孢桿菌（ Bacillus velezensis）；其16s rDNA之序列顯示在序列表中的SEQ ID NO：1，並且其gyrB基因之序列顯示在序列表中的SEQ ID NO：2。

本發明之芽孢桿菌的菌株具有拮抗細菌性青枯病的能力，其係經過一種篩選方法而獲得。請參見第1圖，該圖為本發明之芽孢桿菌的菌株之篩選方法的流程圖。篩選方法可包括：（S1）提供含有芽孢桿菌的土壤至培養基中；（S2）在30℃環境下培養24〜48小時之後，加入10 ⁸cfu/ml青枯病菌於培養基中；（S3）從培養基挑選出拮抗圈半徑接近或大於1cm的初始菌株；（S4）在30℃環境下，在含有菜籽粕之培養基中培養初始菌株24〜48小時；以及（S5）從前述之培養基中挑選出能夠生長且可產生利用圈的菌株。

在本發明之篩選方法的一實施例中，採集來至宜蘭及花蓮地區內807處的土壤作為含有芽孢桿菌之土壤樣品，從每一個土壤樣品中取出1g土壤，混均勻後，再加入9ml的無菌水，以60°C水浴處理30分鐘。在此使用稀釋平板法將處理過的土壤塗抹於營養培養基（Nutrient Agar，NA）上，並放置於30°C的培養箱中培養。培養24小時後，再使用玻璃噴瓶均勻噴灑10 ⁸cfu/ml之青枯病菌於培養基，然後在30°C的培養箱中再培養24小時。接著，參見第2圖，等待出現完整的拮抗圈時，挑選出具有接近或大於1cm的拮抗圈半徑之菌株。其中，青枯病菌的來源為宜蘭地區番茄青枯病罹病株分離而得，且其編號為LE5。然後，以選出之菌株來進行後續的植物病害防治之測試。將預備用來測試的菌株培養於內含2%菜籽粕之營養培養基，經培養24小時後，選取可生長並可產生利用圈之菌株。

在本發明之菌株（芽孢桿菌HL_B03）的拮抗效果之驗證測試中，加入10g的菜籽粕於100ml的無菌水中，以配製成菜籽粕水萃取液，在30℃下，在震盪機上，以250rpm搖晃24小時，進行萃取。絲瓜萎凋病菌尖鐮胞菌（ Fusarium oxysporumf. sp. Luffae）經培養至產生孢子後，用1mL 0.01% tween20洗下孢子，並配製成尖鐮胞菌水溶液。以4,000-6,000rpm 3分鐘離心1mL 10 ⁸cfu/ml的本發明之菌株，收集上清液。以0.01% tween20作稀釋，將前述之菜籽粕水萃取液稀釋80倍，將尖鐮胞菌水溶液稀釋成10 ⁶spore/ml的濃度，以及將上清液稀釋500倍，對應地配製成四個組別的溶液，其中對照組僅含有尖鐮胞菌，菜籽粕組含有尖鐮胞菌及菜籽粕，HL_B03組含有尖鐮胞菌及本發明之菌株的上清液，菜籽粕+HL_B03組含有尖鐮胞菌、菜籽粕及本發明之菌株的上清液。將該四個組別的溶液分別滴於乾淨之凹槽玻片上，蓋上上蓋。置於保持濕度的營養培養基中，在25℃下，經24小時後調查其發芽率。每處理為6重複，試驗重複3次。

孢子發芽率的計算方式為：孢子發芽率（%）=發芽管超過孢子的一半長度之孢子數/總孢子數x100%。請參見第3圖，其係為本發明之菌株（芽孢桿菌HL_B03）對於絲瓜萎凋病菌之尖鐮胞菌孢子發芽抑制實驗的結果圖。如第3圖所示，菜籽粕及菌株（芽孢桿菌HL_B03）個別對於絲瓜萎凋病菌之尖鐮胞菌孢子均具有抑制發芽的效果，而且菜籽粕及菌株（芽孢桿菌HL_B03）之組合進一步具有協同的加成功效。

本發明之微生物組合物可包括菌株（芽孢桿菌HL_B03）及菜籽粕。其中，該菌株在微生物組合物中的比例可為2〜3%，菜籽粕在微生物組合物中的比例可為97〜98%。菜籽粕可包括芥末粉、油菜籽粕及芥花籽粕中之至少一種，但不以此為限。可防治之植物病害包括青枯病或絲瓜萎凋病，但不以此為限。此外，本發明之微生物組合物可進一步包括基肥，其中，微生物組合物與基肥之重量比例可為3：5〜9：10。較佳地，微生物組合物與基肥之重量比例可為13：20〜17：20。

在一實施例中，菜籽粕的來源包括芥末粉、油菜籽粕及芥花籽粕。使用上述之菜籽粕水萃取液的方法，製備濃度為0.1g/mL的芥末粉、油菜籽粕及芥花籽粕的菜籽粕水萃取液。個別配置含有2%前述之三個菜籽粕的營養培養基。此外，在對照組，以無菌水代替菜籽粕水萃取液，取單一菌落(single colony)的芽孢桿菌（HL_B03）至各個培養基，再以玻璃噴瓶均勻噴灑10 ⁸cfu/ml之青枯病菌於各培養基中，在30℃下培養24小時，量測拮抗圈直徑並記錄，其結果顯示於第4圖中。從第4圖可以得知，上述之三種菜籽粕對於青枯病菌均具有拮抗效果，其中，以油菜籽粕之拮抗效果為最大。

在一實施例中，將前述之油菜籽粕水萃取液稀釋500倍、600倍、800倍及1000倍後，獲得500倍、600倍、800倍及1000倍的稀釋液，以各稀釋液分別進行青枯病菌的平板拮抗試驗。其中，實驗條件與前述之不同來源之菜籽粕的實驗方法相同。請參見第5圖，該圖顯示除了1000倍的稀釋倍數之外的其他三個稀釋倍數均對青枯病菌有拮抗效果，而具有拮抗效果的最低稀釋倍數為800倍。

在本發明之微生物組合物之使用方法中，其可包括（1）施加微生物組合物於預定種植農作物的土壤中；或者（2）可包括施加微生物組合物於農作物表面；又或者可以包括前述之（1）及（2）之組合。此外，農作物可包括茄科或葫蘆科農作物，但不以此為限。舉例而言，農作物可包括馬鈴薯、茄子、番茄、黃瓜、南瓜、絲瓜或西瓜。

在本發明之微生物組合物的使用方法之一實施例中，於溫室中進行青枯病菌罹病率實驗。對照組為移植二週大之番茄至培養土種植，每穴一株，同時澆灌青枯病菌。菜籽粕處理組為於種植前培養土混合1：800比例的菜籽粕，一周後移植二週大之番茄至混好菜籽粕之培養土種植，每穴一株，同時澆灌青枯病菌；該組在第6圖的標記為菜籽粕。菌株（芽孢桿菌HL_B03）處理組為移植二週大之番茄至培養土種植，每穴一株，並同時澆灌菌株（芽孢桿菌HL_B03），每隔5天，連續澆灌3-5次；另於定植時澆灌青枯病菌；該組在第6圖的標記為HL_B03。菜籽粕及菌株（芽孢桿菌HL_B03）之組合的處理組為於種植前培養土混合1：800比例之菜籽粕，一周後移植二週大之番茄至混好菜籽粕之培養土種植，每穴一株，並同時澆灌菌株（芽孢桿菌HL_B03），每隔5天，連續澆灌3-5次；另於定植時澆灌青枯病菌；該組在第6圖的標記為菜籽粕+HL_B03。其中，青枯病菌的澆灌量與濃度一樣，均為0.01L及10 ⁶cfu/mL。前述之芽孢桿菌HL_B03的澆灌量與濃度一樣，均為0.01L及10 ⁷cfu/mL。且罹病率的計算為：罹病率（%）=罹病植株數量/總植株數量x100%。

其結果顯示於第6圖，顯示菜籽粕及菌株（芽孢桿菌HL_B03）個別對於番茄的青枯病均具有防治的效果，而且菜籽粕及菌株（芽孢桿菌HL_B03）之組合進一步具有協同的加成功效。

在本發明之微生物組合物的使用方法之另一實施例中，進行田間試驗，農作物為番茄，植物病害為青枯病，以完全逢機設計(CRD)處理試驗田區。在打田時，農友施加下述之各種肥料於田地土壤中。該田間試驗分成三個組別，分別為對照組、混合有機質肥組及雜項有機質肥組。對照組為使用200kg/分地的有機質肥與化學肥混合之基肥；混合有機質肥組為使用30-70kg/分地的有機質肥之基肥以及130-170kg/分地的微生物組合物；雜項有機質肥組為使用30-70kg/分地的化學肥之基肥以及130-170kg/分地的微生物組合物。在種植2個月之後，進行調查番茄青枯病之自然發生結果。請參見第7圖。結果顯示含有微生物組合物的組別，即混合有機質肥組及雜項有機質肥組具有較低的青枯病罹病率，其表示在大約相同的肥料使用量之下，本發明之微生物組合物能夠增強番茄對青枯病的防治。

在本發明之微生物組合物的使用方法之又一實施例中，實施例為田間試驗，農作物為絲瓜，植物病害為萎凋病，調查次數為5次，其間隔為一週。與前述之田間試驗相同，分成對照組、混合有機質肥組及雜項有機質肥組其餘與上述實施例相同之處不再贅述。其結果請參見第8圖，顯示含有微生物組合物的組別具有較低的萎凋病罹病率，其表示在相同的肥料使用量之下，本發明之微生物組合物能夠增強絲瓜對萎凋病的防治。

綜上所述，本發明提供一種植物病害防治的菌株（HL_B03）、微生物組合物及其使用方法，以達到改善土壤的營養狀態並可防治植物病害之目的。

雖然本發明已以上述實施例具體描述本發明之植物病害防治之菌株、微生物組合物及其使用方法，然而本發明所屬技術領域之通常知識者應理解，可在不違背本發明之技術原理及精神下，對實施例作修改與變化。因此本發明之權利保護範圍應如申請專利範圍所述。

S1、S2、S3、S4、S5:步驟

第1圖係為本發明之芽孢桿菌的菌株之篩選方法的流程圖。

第2圖係為經過本發明之芽孢桿菌的菌株之篩選方法所獲得之產生拮抗圈之菌株的照片。

第3圖係為本發明之菌株（芽孢桿菌HL_B03）對於絲瓜萎凋病菌之真菌孢子發芽抑制實驗的結果圖。

第4圖係為本發明之微生物組合物中不同的菜籽粕來源之拮抗效果的比較圖。

第5圖係為本發明之不同稀釋倍數的菜籽粕水萃取液搭配本發明的菌株之青枯病菌拮抗效果的比較圖。

第6圖係為本發明之微生物組合物的使用方法之一實施例的結果圖。

第7圖係為本發明之微生物組合物的使用方法之另一實施例的結果圖。

第8圖係為本發明之微生物組合物的使用方法之又一實施例的結果圖。

國內寄存資訊。

財團法人食品工業發展研究所。

民國106年12月29日。

寄存編號：BCRC910810。

S1、S2、S3、S4、S5:步驟

Claims

一種芽孢桿菌(Bacillus velezensis)的菌株(HL_B03)，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存標號為BCRC910810，其中，該菌株能夠拮抗細菌性青枯病，且該菌株係以一篩選方法獲得，該篩選方法包括：提供含有該芽孢桿菌的土壤至一培養基中；培養在30℃環境下24~48小時，加入108cfu/ml青枯病菌於該培養基中；挑選出拮抗圈半徑接近或大於1cm的一初始菌株；將該初始菌株培養於一含有菜籽粕(rapeseed meal)之培養基中，且培養在30℃環境下24~48小時；以及挑選出能夠產生利用圈的菌株。
一種植物病害防治的微生物組合物，其包括：一芽孢桿菌的菌株(HL_B03)；以及一菜籽粕；其中，該菌株在該微生物組合物中的比例為2~3%，該菜籽粕在該微生物組合物中的比例為97~98%。
如請求項2所述之微生物組合物，其中，該菜籽粕包括芥末粉(mustard powder)、油菜籽粕(rapeseed meal)及芥花籽粕(canola meal)中之至少一種。
如請求項2所述之微生物組合物，其中，該植物病害包括青枯病或絲瓜萎凋病。
如請求項2所述之微生物組合物，其進一步包括一基肥，其中，該微生物組合物與該基肥之重量比例為3：5~9：10。
一種微生物組合物之使用方法，其包括：施加如請求項2所述之該微生物組合物於預定種植一農作物的土壤；或者施加如請求項2所述之該微生物組合物於該農作物表面。
如請求項6所述之使用方法，其中，該農作物包括茄科或葫蘆科農作物。