CN114196602B - 一种菌剂组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种菌剂组合物及其应用，涉及病害技术领域。贝莱斯芽孢杆菌物种的细菌菌株于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61434。短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。该组合物可以实现同时有效防治多种病原菌，包括植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和植物卵菌病害。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌为可商品化的生防产品，易于培养、适于工业化生产。

Description

一种菌剂组合物及其应用
技术领域
本发明涉及病害防治技术领域，具体而言，涉及一种菌剂组合物及其应用。
背景技术
番茄青枯病，是一种由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的常见细菌性土传病害之一，病菌可从植株根部或茎基部伤口侵入，造成叶片萎蔫，更有甚者导致植株死亡，收成锐减。
小麦赤霉病是由多种镰刀菌侵染所引起的常见土传病害之一，我国大部分地区的小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的，从小麦幼苗到抽穗时期均可感染，严重时会产生毒素进而影响小麦品质。
黄瓜立枯病，是一种由立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的发生在黄瓜上的病害，发病初期，病苗茎基部产生暗褐色长圆形到椭圆形病斑，明显凹陷。苗期主要病害，多在育苗中后期发生，特别是在气温低、土壤湿度大时发病严重危害较大，严重时可导致成片死亡，延误农时。
目前，上述三种病害在全世界范围内普遍发生，防治方法包括化学药物和生物防治。而生物防治中，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）作为一种新型的植物促生防病微生物越来越受关注。如专利CN110283742B中公开了一株贝莱斯芽孢杆菌BPC6菌株，其对生菜软腐病和菌核病的发病率分别降低了22%和30%，防效分别达到44%和53%。专利CN111534460A中公开了一株贝莱斯芽孢杆菌NF002菌株，该菌株对小麦赤霉病大田实验的病情指数为38%，防治效果为40.15%。虽然关于贝莱斯芽孢杆菌的研究越来越多，但主要针对叶部病害和土传病害，如白菜黑斑病、生菜菌核病等；且目前市场上暂未出现商品化的贝莱斯芽孢杆菌产品。而与贝莱斯芽孢杆菌亲缘关系较近的解淀粉芽孢杆菌，市场上已有较多商品化菌剂产品。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菌剂组合物及其应用，且本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌为可商品化的生防产品，易于培养、适于工业化生产。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种菌剂组合物在防治如下病害中的应用，病害选自如下病害中的至少一种：植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和植物卵菌病害中的应用；
菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101；
贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌M173分离自云南省玉溪市（北纬39°54′39.33″，东经116°24′48.18″）的烟草种植地采集农业土壤。于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.61434，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼五楼。
分离的菌株是一种产芽孢的***，将其接种于Luria-Bertani培养基中，30℃培养1 d。其菌落多呈白色，表面和边缘粗糙，有粘性。对该菌株的序列进行16S序列片段测定（扩增引物与测序引物均为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），测定结果参照SEQ ID NO.1所示，通过BLAST同源比对，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌M173。
SEQ ID NO.1：
TCGTAGACGAGCATAATCCGTAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCTACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTC。
短小芽孢杆菌M101菌株的样本采集自广东省广州市的水中。已送至广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）进行保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼五楼，保藏日期：2021年10月22日，保藏编号：GDMCC：No.61962。
分离的菌株将其涂布于R2A固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养，1天后挑取单菌落，继续接种于R2A固体培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养1天，然后观察菌落形态，并用光学显微镜观察菌体形态（1000×）。
该菌株为革兰氏阳性菌，菌落呈不透明的乳白色，形状为圆形。菌株呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，长约2.0微米。能运动，芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形。
随后，对该菌株的序列进行了16S序列片段(扩增引物与测序引物为 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' )测定，测定结果见序列表SEQ ID NO.2，16SrRNA序列同源性分析、***发育分析，通过BLAST同源比对，我们确定该菌株最近的种属为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，并命名为短小芽孢杆菌M101。
SEQ ID NO.2：
AGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCC。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌M173可以高效、稳定地实现植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或植物卵菌病害防治，其形成生物被膜能力强，易定植，适于工业化生产，商品化前景巨大。此外，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌M173能提升种子在存有大量病原菌的土壤环境中的发芽率，具有良好的促生作用。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述植物土传病害包括不限于尖镰孢霉冬瓜专化型（Fusarium oxysporumf. sp.cucurmerimum）、青枯劳尔氏菌、立枯丝核菌、镰刀菌、花生白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物土传病害。
在一种可选的实施方式中，镰刀菌为小麦禾谷镰刀菌。
在一种可选的实施方式中，应用温度为2-40℃；更在一种可选的实施方式中，应用温度为20-35℃。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述植物细菌病害包括不限于青枯劳尔氏菌、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)、和/或魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)引起的细菌病害；
在一种可选的实施方式中，应用温度为2-40℃；更在一种可选的实施方式中，应用温度为20-35℃。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述植物真菌病害或植物卵菌病害包括不限于立枯丝核菌、镰刀菌、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、尖镰孢霉冬瓜专化型（Fusarium oxysporumf. sp.cucurmerimum）、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。
在一种可选的实施方式中，镰刀菌为小麦禾谷镰刀菌。
在一种可选的实施方式中，应用温度为2-40℃；更在一种可选的实施方式中，应用温度为20-35℃。例如28℃或30℃。
本发明还提供了
一种菌剂组合物在促进植物生长中的应用，菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101；贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61434；
短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述植物为禾本科作物或经济作物。
在一种可选的实施方式中，禾本科作物包括不限于玉米、小麦、稻、高粱、大麦、燕麦、黑麦、谷子、黍、稗、荞麦。
经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；
在一种可选的实施方式中，茄科选自如下至少一种的茄科作物：马铃薯、辣椒和番茄；蔷薇科选自如下至少一种的蔷薇科作物：草莓和木瓜；芸香科选自如下的芸香科作物：柑橘；芭蕉科选自如下的芭蕉科作物：香蕉；葫芦科选自黄瓜；蝶形花科选自大豆，菊科选自生菜，百合科选自大蒜，姜科选自生姜，西番莲科选自百香果，凤梨科选自金菠萝，五加科选自三七，仙人掌科选自火龙果。
需要说明的是，上述的作物种类仅为发明人列举的几种可选的类型，在其他实施方式，也可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述的作物种类。
在一种可选的实施方式中，菌剂组合物中贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合体积比例为1-2:1-2。菌剂组合物中贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合体积比例为2:1。该配比的组合物能显著降低植株的死亡率，对植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和植物卵菌病害都有着非常好的生防潜力。
本发明还提供了一种菌剂，其包括贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101；贝莱斯芽孢杆菌M173物种的细菌菌株于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962；
优选地，菌剂为贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的发酵培养物，且发酵培养物中贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合浓度为106-1010CFU/mL。例如106、107、108、109、1010CFU/mL。
本发明还提供了一种种衣菌剂，种衣菌剂包括种衣剂和上述的菌剂。种衣菌剂能提升种子在存有大量病原菌的土壤环境中的发芽率，具有良好的促生效果。
种衣剂和菌剂的混合体积比为8-10:1；优选地，菌剂中贝莱斯芽孢杆菌M173 OD600的值为0.8-10，菌剂中短小芽孢杆菌M101 OD600的值为0.8-10。
在一种可选的实施方式中，上述种衣剂配方如下：蔗糖5%，PVPK30 10%，PEG 3%，分散剂MF 2%，聚乙二醇5%。各组分按照质量分数进行配比。
制备方法如下：取50mL离心管，先按上述比例加入PVPK30和少量水，振荡溶解，再按比例加入其它试剂，溶解完全，定容，即得所需种衣剂。
本发明还提供了一种灌根剂或浸种剂，灌根剂或浸种剂包括上述的菌剂。在其他实施方式中，上述灌根剂也可以是浸根剂。
在一种可选的实施方式中，浸种剂或灌根剂是指贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的培养液，或贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的冻干粉。
在其他实施方式中，上述浸种剂或灌根剂也可以是贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的悬浮液、乳液、溶液。
在一种可选的实施方式中，培养液中贝莱斯芽孢杆菌M173的浓度为107-108CFU/mL，培养液中短小芽孢杆菌M101的浓度为107-108CFU/mL。
发明人发现利用上述浸根剂浸根处理番茄苗等植物幼苗不仅能有效防治番茄青枯病，且其防治效果甚至优于新植霉素这一传统化学农药，可用于替代/部分替代传统化学农药，市场化前景广阔。
一种菌剂在制备种衣菌剂、灌根剂或浸种剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的提供的贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101可以高效、稳定地实现植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或植物卵菌病害的防治，其形成的生物被膜能力强，易定植，适于工业化生产，商品化前景巨大。此外，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101能提升种子在存有大量病原菌的土壤环境中的发芽率，具有良好的促生作用。
而采用本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101浸根处理植物，不仅能有效防治植物病害，且其防治效果甚至优于传统化学农药，可用于替代/部分替代传统化学农药，市场化前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为M173菌株在LB培养基上的菌落形态图；
图2为M173菌剂对青枯病的剪叶生防效果图；
图3为贝莱斯芽孢杆菌M173菌株对青枯病的灌根生防效果图；
图4为贝莱斯芽孢杆菌M173菌株对禾谷镰刀菌的生防效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了贝莱斯芽孢杆菌M173菌株的筛选及鉴定方法。
M173菌株的筛选方法：
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisM173分离自云南省玉溪市（北纬39°54′39.33″，东经116°24′48.18″）的烟草种植地采集农业土壤。
称取5 g土壤，加入45 mL无菌水后用涡旋震荡仪震荡5 min，再梯度稀释为10-1~10-6，取10-4、10-5和10-6三个梯度的菌液进行平板涂布，涂布于Luria-Bertani（LB）固体培养基（配方为：酵母浸粉5 g、胰酪蛋白胨10 g、氯化钠10 g、琼脂15 g、水1 L、pH=7）上，每个涂布进行三个重复，于30℃恒温培养箱中倒置培养4 d，4 d后挑出单菌落的菌株，划线接种于新的LB平板上，30℃条件下培养1天，获得菌株纯培养，用甘油管保存于-80℃冰箱内。
M173菌株的鉴定：
将分离的菌株接种于Luria-Bertani培养基中，30℃培养1 d，形态如图1所示。经鉴定，该菌株是一种产芽孢的***，其菌落多呈白色，表面和边缘粗糙，有粘性。
随后对该菌株的序列进行16S序列片段测定（扩增引物与测序引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），测定结果参照SEQ IDNO.1所示，通过BLAST同源比对，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌M173。将贝莱斯芽孢杆菌M173送至广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）进行保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼五楼，保藏日期：2021年01月15日，保藏编号：GDMCC No.61434。
实施例2
1.短小芽孢杆菌M101菌株的分离纯化。
样本采集自广东省广州市的水中。
用移液枪吸取4 mL水源样本，加入到灭过菌的36 mL浓度为0.1%（v/v）的吐温水中，涡旋振荡10 min，获得10-1浓度稀释液。用吐温水将稀释液梯度稀释至10-4、10-5和10-6浓度，然后涂布于R2A固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养，1天后挑取单菌落，继续接种于R2A固体培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养1天，然后观察菌落形态，并用光学显微镜观察菌体型态（1000×）。
R2A固体培养基：称取18.1 g R2A琼脂培养基干粉（广东环凯生物科技有限公司），补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
2.短小芽孢杆菌M101菌株的鉴定
该菌株为革兰氏阳性菌，菌落呈不透明的乳白色，形状为圆形。菌株呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，长约2.0微米。能运动，芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形。
随后，对该菌株的序列进行了16S序列片段(扩增引物与测序引物为 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' )测定，测定结果见序列表SEQ NO.1，16SrRNA序列同源性分析、***发育分析，通过BLAST同源比对，我们确定该菌株最近的种属为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，并命名为短小芽孢杆菌M101。短小芽孢杆菌M101已送至广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）进行保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼五楼，保藏日期：2021年10月22日，保藏编号：GDMCC No.61962。
实施例3
本实施例进行贝莱斯芽孢杆菌M173发酵培养物的制备。
将实施例1获得的M173菌株活化后，进行液体发酵，制得发酵培养物。该发酵培养方法简便易操作，适于工业化生产。
a. 贝莱斯芽孢杆菌M173菌株的活化。
LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。用涂布法将-80℃冰箱保存的M173菌株涂于LB平板上，30℃培养1天。挑取LB平板上长出的M173单菌落接种于LB液体培养基（配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，葡萄糖1g，加水至1L，121℃灭菌20min）中，30℃培养1天，获得M173菌种。
b. M173菌株液体发酵。
将1mL M173菌种接种于LB液体培养基，在30℃摇床无菌培养1天，获得发酵培养物。
实施例4
本实施例进行短小芽孢杆菌M101发酵培养物的制备。
将实施例2获得的短小芽孢杆菌M101菌株活化后，进行液体发酵，制得发酵培养物。该发酵培养方法简便易操作，适于工业化生产。
a. 短小芽孢杆菌M101菌株的活化。
LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g，补水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。用涂布法将-80℃冰箱保存的M173菌株涂于LB平板上，30℃培养1天。挑取LB平板上长出的M173单菌落接种于LB液体培养基（配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，葡萄糖1g，加水至1L，121℃灭菌20min）中，30℃培养1天，获得M173菌种。
b. M101菌株液体发酵。
将1mL M101菌种接种于LB液体培养基，在30℃摇床无菌培养1天，获得发酵培养物。
实施例5
本实施例进行M173、M101及其组合物对青枯劳尔氏菌R.s的剪叶生防效果验证实验。
（1）R.s 菌悬液制备：
将青枯劳尔氏菌R.s （Ralstonia solanacearum，保存在慕恩生物菌库）从甘油管中活化到TTC平板（配方为：葡萄糖5 g，蛋白胨10g，水解酪蛋白1 g，琼脂15 g，加水至1L，121℃灭菌20min，冷却至60℃后加TTC，使终浓度为0.005%（W/V））上，培养2 d后选取活性高的青枯菌落转接至SPA液体培养基（配方为：蔗糖20 g，细菌学蛋白胨5g，K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，加水至1L，调至pH为7.0~7.2，121℃灭菌20min）中，摇床上培养8-16 h后再根据OD600的吸光度值将R.s稀释至107CFU/mL，制得R.s 菌悬液备用。
（2）M173菌剂制备：
用分光光度计测定实施3制得的M173菌株发酵培养物在OD600处的吸光度值，并用LB液体培养基将其浓度调整至108CFU/mL，即得M173菌剂。
（3）M101菌剂制备
用分光光度计测定实施例4制得的M101菌株发酵培养物在OD600处的吸光度值，并用LB液体培养基将其浓度调整至108CFU/mL，即得M101菌剂。
（4）M173与M101菌剂制备
将上述步骤中制备的M173与M101菌剂按照体积比，分别配置成1:1、2:1、1:2 三种浓度，混匀。
（5）番茄苗处理：
将11d番茄苗间苗至10株/盆后，进行剪叶处理用于初步判断M173对R.s的生防效果。按照剪叶时所用剪刀的浸泡液的不同，分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和菌剂处理组，每组三次重复。对每株番茄苗进行剪叶前，将无菌剪刀浸泡在各组对应的浸泡液中1秒后，再用浸泡后的剪刀剪掉番茄苗子叶的一半。随后把剪叶后的番茄苗盆放置在30℃高温高湿的发病棚内培养7d。并从剪叶后第4d起，每天记录番茄苗死苗数，计算死亡率和相对防效。
各组所用的浸泡液如下：
空白对照组为清水40mL；
阴性对照组为清水和R.s菌悬液各20mL，混匀；
阳性对照组为新植霉素1000倍稀释液和R.s菌悬液各20mL，混匀；
菌剂处理组共5组，分别取步骤（3）和步骤（4）制得的菌剂20mL与R.s菌悬液20mL，混匀。
相对防效=（阴性对照死亡率-处理组死亡率）/阴性对照死亡率×100%。
死亡率和相对防效统计结果参照表1所示，M173菌剂对青枯病的剪叶生防效果参照图2所示。结果显示，在剪叶体系下，贝莱斯芽孢杆菌M173菌剂处理组的番茄苗死亡率为18.12%，较阴性对照组番茄苗死亡率（87.78%）低，但较阳性对照组番茄苗的死亡率（16.67%）还是高。M101菌剂处理组的番茄苗死亡率为65.01%，防效略差。另外，3个菌剂混合处理组对青枯病的防治效果皆高于阳性对照，尤其是2:1组。说明M173和M101的混合使用效果优于单一使用效果，混合菌剂能显著降低番茄苗的死亡率，对番茄青枯病有着非常好的生防潜力。
表1 各处理组对青枯病的剪叶生防效果
实施例6
本实施例进行贝莱斯芽孢杆菌M173菌株、M101短小芽孢杆菌菌株以及二者的组合物对青枯劳尔氏菌R.s 的灌根生防效果验证实验。
按照实施例5的方法制备R.s 菌悬液、M173菌剂、M101菌剂、M173与M101菌剂（体积比分别为1:1、2:1、1:2）备用。
（1）番茄苗处理
将20 d番茄苗，轻轻抖去根表面泥土，将根部浸泡于处理液中10 min，随即种入灭菌土中，每盆1株，6盆为1个处理，5重复。根据处理液不同设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和菌剂处理组。空白对照组和阴性对照组的处理液为清水，阳性对照组的处理液为新植霉素1000倍稀释液，菌剂处理组共5组，各组对应的处理液分别为M173菌剂、M101菌剂、M173与M101菌剂（体积比分别为1:1、2:1、1:2 ）。将盆栽置于25-28℃环境中缓苗7 d后用园艺小铲***根部四周土中，使番茄根部受损造成伤口。然后将阴性对照组、阳性对照组和菌剂处理组的每株苗灌入50 mL R.s菌悬液，空白对照组灌等量清水。
（2）观察记录
在出现症状的第一个迹象（番茄苗出现青枯症状）开始（一般为灌根后第5 d开始发病），每天观测记录一次番茄苗状态（根据分级标准记录发病情况），至第10 d-13 d（视实际发病情况确定），记录各处理每个病级的植株数，根据以下公式计算发病率和病情指数。
植株病情等级分为以下5级：
0级：无症状
1级：一片叶萎蔫
2级：2-3片叶萎蔫
3级：整株枯萎
4级：植株死亡
病情指数(%)=(∑(每个病级的植株数×级别数) /(总植株数×最高级别数))×100%。
防治效果(%)=((阴性对照组病情指数-实验组病情指数)/阴性对照组病情指数)×100%。
由表2和图3可知，阴性对照组的番茄苗因为仅以清水浸根而未加入任何药剂成分，其受青枯劳尔氏菌R.s感染后的发病率为41.7%，番茄苗表现出植株严重萎蔫、甚至全株枯死的现象。同阴性对照组相比，菌剂处理组的番茄苗长势更优，其中2：1组的植株发病率（12.12%）比阴性对照组降低了70.94%，对青枯病的防治效果高达65.02%，优于阳性对照（37.30%）。说明M173和M101按照适宜比例混合后浸根处理番茄苗不仅能有效防治番茄青枯病，且其防治效果甚至优于新植霉素这一传统化学农药，可用于替代/部分替代传统化学农药，市场化前景广阔。
表2 各处理组对青枯病的灌根生防效果
实施例7
本实施例进行贝莱斯芽孢杆菌M173菌株、M101短小芽孢杆菌菌株以及二者的组合物对小麦禾谷镰刀菌的生防效果验证实验。
（1）F.g菌悬液制备：
将禾谷镰刀菌F.g（Fusarium graminearum，保存在慕恩生物菌库）在PDA平板活化，28℃培养5 d后，再用CMC培养基（配方为：CMC-Na 15 g，NH4NO31g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KH2PO41 g，加水至1L，121℃灭菌20min）在25~28℃，200 rpm条件下培养7 d后用纱布过滤得到孢子悬液，用血球计数板计数，然后配制成浓度为106CFU/mL的孢子菌悬液。
（2）种衣剂的制备
配方：蔗糖5%，PVPK30 10%，PEG 3%，分散剂MF 2%，聚乙二醇5%。各组分按照质量分数进行配比。
取50mL离心管，先按上述比例加入PVPK30和少量水，振荡溶解，再按比例加入其它试剂，溶解完全，定容，即得所需种衣剂。
（3）种衣菌剂的制备
分别将实施例3和实施例4所得的M173菌株发酵培养物和M101菌株发酵培养物用分光光度计测量其在OD600处的吸光度，并用LB液体培养基将发酵培养物的OD600值调整为1，制得M173菌液和M101菌液。并将所得M173菌液和M101菌液按照体积比1:1、2:1、1:2 制得M173与M101混合菌液备用。
分别吸取40μL 上述菌液与360μL种衣剂混合，即得M173种衣菌剂、M101种衣菌剂及3组混合种衣菌剂。用等量LB液体培养基替代发酵培养物与等量种衣剂混合制得对照种衣剂。
（4）种子处理
设置空白对照组、阴性对照组和菌剂处理组。菌剂处理组用种衣菌剂对小麦种子（济麦23）进行包衣（种衣菌剂400μL /20g小麦），使M173和/或M101附着在种子表面。空白对照组种子不做任何处理，阴性对照组种子用对照种衣剂进行包衣处理。
（5）土壤准备
将每个育苗盆内加入无菌土，其中阴性对照组和菌剂处理组的无菌土内提前拌入了20mL F.g菌悬液，空白对照组拌入等量清水。然后将包衣好的种子种入育苗盆内。
发芽后统计小麦发芽率，14 d后统计小麦病情。
其病情分级情况具体为：
0 级，未发病；
1 级，第一叶鞘出现轻度症状（第一叶鞘出现褐色条纹至黑化，但黑化程度不超过50%）；
2 级，第一叶鞘发病严重（第一叶鞘黑化程度超过50%以上）；
3 级，第二叶鞘出现轻度症状（第二叶鞘出现褐色条纹至黑化，但黑化程度不超过50%）；
4 级，第二叶鞘发病严重（第二叶鞘黑化程度超过50%以上）；
5 级，第三叶鞘轻度发病（第三叶鞘出现褐色条纹至黑化，但黑化程度不超过50%）；
6 级，第三叶鞘发病严重至植株接近死亡。
参照表3和图4，阴性对照组的小麦植株病情指数为38.89%，M173处理组的病情指数为20.01%，而组合物2:1的病情指数仅为15.43%，其相对防效为60.32%。说明M173能有效防治F.g对小麦植株的侵害，且组合物2:1较M173防效更佳。另一方面，禾谷镰刀菌F.g使得阴性对照组小麦种子发芽率降低至77.42%，而含M173菌液的处理组种子发芽率在91%以上，且组合物2:1的小麦种子发芽率高达95%以上。说明M173能有效确保植物种子在F.g环境中的发芽率，而组合物2：1能进一步提升发芽率。本发明提供的种衣菌剂的存在能有效保护小麦种子免受禾谷镰刀菌F.g的影响，促进种子发芽；且M173和M101的组合物具有进一步促进种子发芽和高效防治禾谷镰刀菌的双重功效。
表3禾谷镰刀菌的生防效果对比
实施例8
本实施例进行贝莱斯芽孢杆菌M173菌株、M173与M101组合物生物被膜形成能力测试实验。
在确保贝莱斯芽孢杆菌M173菌株本身易培养、且能有效防治青枯劳尔氏菌和禾谷镰刀菌导致的土传病害的前提下，通过进一步验证M173、M173与M101组合物的生物被膜形成能力来检验其在田间土壤/植株叶面的定植能力，以期验证M173、M173与M101组合物的的防效稳定性和持续性。
分别将实施例3和实施例4所得的M173菌株发酵培养物和M101菌株发酵培养物用分光光度计测量其在OD600处的吸光度，并用LB液体培养基将发酵培养物的OD600值调整为1，制得M173菌液和M101菌液。并将所得M173菌液和M101菌液按照体积比1:1、2:1、1:2 制得M173与M101混合菌液备用。
分别吸取100 μL上述菌液至96孔板中培养24 h。用200 μL PBS溶液清洗2次后将96孔板放入60℃烘箱中1 h使生物膜固定，然后向孔中加入50 μL 0.4%结晶紫溶液染色15min后，用200 μL PBS清洗3次，最后在37℃下烘干液体，加入200 μL 70%乙醇，并用酶标仪测量600nm处的吸光度，以此评价贝莱斯芽孢杆菌M173的生物被膜形成能力。整个实验过程，设置阴性对照组和菌剂处理组，其中阴性对照组往96孔板中加入LB液体培养基，菌剂处理组共5组，每组加入对应的菌液，每组设置三个平行。
表4生物被膜形成能力
根据测得的吸光度取3次重复的平均值（D），以阴性对照组平均值的2倍作为界限值（Dc）。当菌剂处理组的平均值D处＞2×Dc时判定菌株为强生物被膜形成株；当Dc＜D处≤2×Dc时判定菌株为弱生物被膜形成株；当D处≤Dc为判定菌株为无生物被膜形成株。
由表4可知，D对=0.24，Dc=0.48，2×Dc=0.96，而除M101外的其他4组菌剂处理组的平均值＞2×Dc，即M101不具备强生物被膜形成能力，而贝莱斯芽孢杆菌M173菌株是一株具有强生物被膜形成能力的菌株，且M173与M101的组合物也具备该能力。强生物被膜形成能力表征着贝莱斯芽孢杆菌M173菌株及组合物在植株土壤环境中极容易进行定植，从而更快速、稳定、持久的产生生防效果。
实施例9
本实施例进行贝莱斯芽孢杆菌M173菌株、M101短小芽孢杆菌菌株以及二者的组合物对黄瓜立枯病的生防效果验证实验。
（1）病原菌准备
利用打孔器，在无菌环境条件下在长满立枯丝核菌培养基上打孔得到直径5 mm的菌饼，将其接到PDA（配方为：马铃薯 200 g加水煮烂、过滤， 葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，加水至1L，121℃灭菌20 min）培养基平板上，每皿一个菌饼，28℃恒温培养箱中培养7 d备用。
（2）浇灌处理
黄瓜育苗7 d后，向育苗盘中浇灌水溶肥，播种12 d时，将其拔出用剪刀将全部须根及部分主根剪掉后，挑取长势一致的黄瓜苗用灭菌土种于小花盆中，每盆3株。将实施例3和实施例4获得的M173菌株发酵培养物和M101菌株发酵培养物用分光光度计测量其在OD600处的吸光度，并用LB液体培养基将发酵培养物的OD600值调整为0.12后，制得M173菌液和M101菌液。并将所得M173菌液和M101菌液按照体积比1:1、2:1、1:2 制得M173与M101混合菌液备用。
用上述菌液浇灌黄瓜苗，每盆浇灌50mL共6×108cfu，每6盆为1个处理，每处理3重复。对照组浇灌等量清水。接菌2小时后在每盆相对位置上戳两个小孔，每孔接一个直径5mm的病原菌菌饼，然后置于28~30℃温室棚中发病7 d。
将经过高温高湿发病后的黄瓜苗根部土壤清洗干净，根据病级分级标准记录发病情况，最后将清洗后的黄瓜苗放入75℃烘箱中烘干，称量干重，统计干重增长率。
病级分级标准：
0级：黄瓜苗茎基部无病斑
1级：黄瓜苗茎基部病斑所占茎围小于1/4
2级：黄瓜苗茎基部病斑所占茎围在1/4~1/2之间
3级：黄瓜苗基部病斑所占茎围大于1/2，但未破坏整个茎围
4级：黄瓜苗根茎相接处出现凹陷或断裂，腐烂变褐等症状
发病指数=（∑（各级病株数×各病级代表数值）/（调查总株数×发病最高级数值））×100
相对防效（%）=（对照组病级指数-处理组病级指数）/对照组病级指数×100%。
表5 各处理组对黄瓜立枯病的防治效果
由表5可知，经组合物2:1发酵培养物浇灌处理的黄瓜苗病级主要介于0-1级之间，而对照组黄瓜苗病级多数处于1-2级，其黄瓜苗发病指数（44.59%）均高于处理组，组合物2:1对黄瓜立枯病的相对防效达39.78%，即本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌M173及其与M101的组合物能有效抑制立枯丝核菌对植株的侵害。
实施例10
本实施例进行贝莱斯芽孢杆菌M173菌株、M101短小芽孢杆菌菌株以及二者的组合物对冬瓜枯萎病的生防效果田间验证实验。
试验基地
东莞市农业科学研究中心（香蕉蔬菜基地）
实验作物：
冬瓜，品种莞研2号小冬瓜；大棚种植。
试验处理：
区域划分概况：
以作物棵数划分，每处理34棵苗，3重复共102颗苗(实际仍以此棚种植瓜苗数量为准)，每处理及重复组随机排列。研究所给出两方案，以实际情况为准。
实验步骤
选取相同生长时期冬瓜苗；
施用时机
试验记录
（1）发病率
两次浇灌后三周回访统计，使用慕恩生物两菌剂产品,尤其是2:1，可有效降低冬瓜枯萎病病原菌尖镰孢霉冬瓜专化型（Fusarium oxysporumf. sp.cucurmerimum）的侵害，减少冬瓜枯萎病发生率，新生叶片较对照多并且长势旺盛。
综上所述，本发明提供的组合物不仅可以拮抗青枯劳尔氏菌、禾谷镰刀菌和立枯丝核菌，有效防治番茄青枯病、小麦赤霉病、黄瓜立枯病和冬瓜枯萎病，还能促进种子发芽、提升发芽率；并能快速定植、便于工业化生产，具有广阔的应用前景。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一种菌剂组合物及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1388
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgtagacga gcataatccg tagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120
ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180
acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc 240
gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360
tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420
gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600
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gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaacccta 960
gagatagggc tttcccttcg gggacagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080
atttagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1200
ggctgcgaga ccgcaaggtt tagccaatcc cataaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260
ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg caacacccga 1380
agtcggtgag gtaaccttta tggagcc 1407

Claims (26)

1.一种菌剂组合物在防治植物细菌病害中的应用，其特征在于，
所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）M173和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M101，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
2.一种菌剂组合物在防治植物真菌病害中的应用，其特征在于所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）M173和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M101，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
3.一种菌剂组合物在防治植物土传病害中的应用，其特征在于所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）M173和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M101，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
4.一种菌剂组合物在防治植物卵菌病害中的应用，其特征在于所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）M173和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M101，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
5.一种菌剂组合物在防治植物细菌病害和植物卵菌病害中的应用，其特征在于所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）M173和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M101，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
6.一种菌剂组合物在防治植物真菌病害和植物细菌病害中的应用，其特征在于所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）M173和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M101，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
7.根据权利要求1、5、6任一项所述的应用，其特征在于，所述植物细菌病害选自青枯劳尔氏菌、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)和魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)引起的植物病害中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述菌剂组合物中所述贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合体积比例为1-2:1-2。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，菌剂组合物中所述贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合体积比例为2:1。
10. 根据权利要求2、6任一项所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病害选自由立枯丝核菌、镰刀菌、花生白绢病菌（Sclerotium rolfsii）、油菜菌核病菌、尖镰孢霉冬瓜专化型、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果树腐烂病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、番茄早疫病菌、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、西瓜枯萎病菌、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、和棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfect um)引起的植物病害中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述镰刀菌为小麦禾谷镰刀菌。
12.根据权利要求4、5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物卵菌病害选自由辣椒疫霉病菌和烟草疫霉病菌中的至少一种病菌引起的植物病害。
13.一种菌剂组合物在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述菌剂组合物包括：贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101；所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61434，所述菌剂组合物能够形成生物膜；
短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
14.根据权利要求1-6、13任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科作物或经济作物。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述禾本科作物为玉米、小麦、稻、高粱、大麦、燕麦、黑麦、谷子、黍、稗、荞麦；
所述经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述茄科选自如下至少一种的茄科作物：马铃薯、辣椒和番茄；所述蔷薇科选自如下至少一种的蔷薇科作物：草莓和木瓜；所述芸香科选自如下的芸香科作物：柑橘；所述芭蕉科选自如下的芭蕉科作物：香蕉；所述葫芦科选自黄瓜；所述蝶形花科选自大豆，所述菊科选自生菜，所述百合科选自大蒜，所述姜科选自生姜，所述西番莲科选自百香果，所述凤梨科选自金菠萝，所述五加科选自三七，所述仙人掌科选自火龙果。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述菌剂组合物中所述贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合体积比例为1-2:1-2。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，菌剂组合物中所述贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合体积比例为2:1。
19.一种菌剂，其特征在于，其包括贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101；所述菌剂能够形成生物膜，所述贝莱斯芽孢杆菌M173于2021年1月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC ：No.61434；
所述短小芽孢杆菌M101于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC：No.61962。
20.根据权利要求19所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的发酵培养物，且所述发酵培养物中所述贝莱斯芽孢杆菌M173和短小芽孢杆菌M101的混合浓度为106-1010CFU/mL。
21.一种种衣菌剂，其特征在于，所述种衣菌剂包括种衣剂和权利要求19或20所述的菌剂。
22.根据权利要求21所述的种衣菌剂，其特征在于，所述种衣剂和所述菌剂的混合体积比为8-10:1，所述菌剂中所述贝莱斯芽孢杆菌M173 OD600的值为0.8-10，所述菌剂中所述短小芽孢杆菌M101 OD600的值为0.8-10。
23.一种灌根剂或浸种剂，其特征在于，所述灌根剂或浸种剂包括权利要求19或20所述的菌剂。
24.根据权利要求23所述的灌根剂或浸种剂，其特征在于，所述浸种剂或灌根剂是指所述贝莱斯芽孢杆菌M173和所述短小芽孢杆菌M101的培养液，或贝莱斯芽孢杆菌M173和所述短小芽孢杆菌M101的冻干粉。
25.根据权利要求24所述的灌根剂或浸种剂，其特征在于，所述培养液中所述贝莱斯芽孢杆菌M173的浓度为107-108CFU/mL，所述培养液中所述短小芽孢杆菌M101的浓度为107-108CFU/mL。
26.一种如权利要求19或20所述的菌剂在制备种衣菌剂、灌根剂或浸种剂中的应用。
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