TWI703149B

TWI703149B - 用於抑制cdk7之化合物

Info

Publication number: TWI703149B
Application number: TW107138486A
Authority: TW
Inventors: 大衛安德魯寇特; 卡羅斯蒙泰羅; 巴哈瑞溫柯瑪瑞門詩虔卓派特爾; 大衛麥可雷米克; 維平亞達
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-09-01
Also published as: PE20210392A1; US10472370B2; US20210032257A1; KR20200070323A; US10787460B2; JOP20200122A1; US20190144456A1; MY197700A; PL3710446T3; EP3710446A1; CN111344292A; HRP20221152T1; CA3080910A1; CL2020001218A1; JOP20200122B1; US20200017513A1; ES2925219T3; IL274540B; SG11202003677UA; DK3710446T3

Abstract

本發明提供新穎的CDK7抑制劑及其醫藥組合物：

Description

用於抑制CDK7之化合物

本發明係關於適用於抑制周期蛋白依賴型激酶7(CDK7)之化合物、醫藥組合物及治療與CDK7活性相關之疾病之方法。

周期蛋白依賴型激酶(CDK)為一類主要的激酶且在癌細胞增殖及使致癌轉錄失調中至關重要。CDK7與周期蛋白H及MATI結合形成三聚周期蛋白激活激酶(CAK)，其藉由磷酸化其他參與細胞周期控制之CDK來發揮其功能。此等錯合物控制細胞周期中兩個後續階段之間的特定轉變。CDK7牽涉到細胞周期的時間控制及轉錄活性兩者。CDK7藉由RNA聚合酶Ⅱ(RNAPII)的Rbp1次單元磷酸化牽涉到轉錄起始過程。不受制的細胞增殖及失調的轉錄係癌症標誌。選擇性地靶向CDK7可藉由同時抑制活性轉錄及細胞周期進程來提供優勢。因此，CDK7係治療癌症，特別係侵襲性及難治性癌症之有前景的目標。

對抗CDK7之小分子抑制劑已於文獻(參見例如WO 2015/154022、WO 2016/142855、WO 2016/160617、WO 2016/193939及WO 2017/044858)中報告。仍需要提供可用於增殖性病症諸如癌症之治療中之CDK7抑制劑。另外，需要提供與其他CDK相比對CDK7具有選擇性的CDK7抑制劑。

本發明提供為選擇性CDK7抑制劑的新穎化合物。該等新型化合物可以滿足對癌症，尤其係轉錄失調之癌症之強有效治療的需要。本發明亦可以滿足對尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌及/或神經膠質瘤之強有效治療之需要。

本發明提供一種下式化合物：

或其醫藥學上可接受之鹽。尤佳為苯磺酸鹽。亦較佳為半乙二磺酸鹽水合物鹽。

本發明亦提供一種治療癌症，特別係治療轉錄失調之癌症之方法。較佳地，癌症為尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。更佳地，癌症為結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最佳地，癌症為乳癌。

本發明亦提供一種治療患者體內之尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之方法，其包含檢測來自患者之生物樣本中之ARID1A、KMT2C、KMT2D及/或RB1基因中是否存在至少一種功能缺失突變，並且若樣本在ARID1A、KMT2C、KMT2D及/或RB1基因中之任一者中檢測到至少一種功能缺失突變，則向患者投與治療有效量之本發明之化合物或鹽，特別係[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，該鹽為苯磺酸鹽或半乙二磺酸鹽水合物鹽。更佳地，癌症為結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最佳地，癌症為乳癌。較佳地，生物樣本為腫瘤樣本且該樣本藉由基因組/DNA定序來測定。較佳地，在向患者第一次投與化合物或其鹽，較佳為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽之前，自患者獲得樣本。較佳地，該鹽為苯磺酸鹽或半乙二磺酸鹽水合物鹽。較佳地，基因為ARID1A基因。較佳地，基因為KMT2C基因。較佳地，基因為KMT2D基因。較佳地，基因為RB1基因。

本發明亦提供一種治療患者體內之尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之方法，其包含向患者投與治療有效量之本發明之化合物或鹽，特別係[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽，其限制條件為來自患者之生物樣本含有ARID1A、KMT2C、KMT2D及/或RB1基因中之至少一種功能缺失突變。較佳地，該鹽為苯磺酸鹽或半乙二磺酸鹽水合物鹽。更佳地，癌症為結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最佳地，癌症為乳癌。較佳地，生物樣本為腫瘤樣本且該樣本藉由基因組/DNA定序來測定。較佳地，在向患者第一次投與化合物或其鹽，較佳為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽之前，自患者獲得樣本。較佳地，該鹽為苯磺酸鹽或半乙二磺酸鹽水合物鹽。較佳地，基因為ARID1A基因。較佳地，基因為KMT2C基因。較佳地，基因為KMT2D基因。較佳地，基因為RB1基因。

本發明亦提供一種治療患者體內之尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之方法，其包含向患者投與治療有效量之本發明之化合物或鹽，特別係[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽，其限制條件為若來自患者之生物樣本在ARID1A、KMT2C、KMT2D及/或RB1基因中檢測到至少一種功能缺失突變，則選擇患者以供治療。較佳地，該鹽為苯磺酸鹽或半乙二磺酸鹽水合物鹽。更佳地，癌症選自由以下組成之群：結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。最佳地，癌症為乳癌。較佳地，生物樣本為腫瘤樣本且該樣本藉由基因組/DNA定序來測定。較佳地，在向患者第一次投與化合物或其鹽，較佳為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽之前，自患者獲得樣本。較佳地，該鹽為苯磺酸鹽或半乙二磺酸鹽水合物鹽。較佳地，基因為ARID1A基因。較佳地，基因為KMT2C基因。較佳地，基因為KMT2D基因。較佳地，基因為RB1基因。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在又一實施例中，組合物進一步包含一或多種其他治療劑。在又一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症之醫藥組合物，其包含本發明之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在再一實施例中，本發明提供一種用於治療轉錄失調之癌症之醫藥組合物，其包含本發明之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在該等實施例中，癌症為尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。

在一較佳實施例中，癌症為結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在一更佳實施例中，癌症為乳癌。

此外，本發明提供一種用於治療癌症之本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其亦包含使用來自患者之生物樣本實行活體外測定，確定ARID1A、KMT2C、KMT2D及RB1基因中是否存在至少一種失活突變，並且若該等基因中之任一者中存在至少一種失活突變，則向患者投與治療有效量之化合物或其鹽。在該實施例中，癌症用於尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之治療中。較佳地，生物樣本為腫瘤樣本且該樣本藉由基因組/DNA定序來測定。較佳地，以約1mg至2g之劑量向患者投與化合物或其鹽。較佳地，在向患者第一次投與化合物或其鹽之前，自患者獲得樣本。較佳地，選擇在ARID1A基因中具有失活突變之患者。較佳地，選擇在KMT2C基因中具有失活突變之患者。較佳地，選擇在KMT2D基因中具有失活突變之患者。較佳地，選擇在RB1基因中具有失活突變之患者。

此外，本發明提供一種供治療使用，特別係供治療轉錄失調的癌症使用的本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在又一實施例中，本發明提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製造治療轉錄失調的癌症之藥劑的用途。在該等實施例中，癌症為尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。在一較佳實施例中，癌症為結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在一更佳實施例中，癌症為乳癌。

在再一實施例中，本發明提供一種供治療使用，特別係供治療癌症使用的本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在又一實施例中，本發明提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製造治療癌症之藥劑的用途。在該等實施例中，癌症為尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。在一較佳實施例中，癌症為結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在一更佳實施例中，癌症為乳癌。此外，本發明提供用於治療尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤之藥劑之製造，其亦包含使用來自患者之生物樣品實行活體外檢測，確定ARID1A、KMT2C、KMT2D及RB1基因中是否存在至少一種失活突變，並且若該等基因中之任一者中存在至少一種失活突變，則向患者投與治療有效量之化合物或其鹽。較佳地，生物樣本為腫瘤樣本且該樣本藉由基因組/DNA定序來測定。較佳以約1mg至2g之劑量向患者投與化合物或其鹽。較佳地，在向患者第一次投與化合物或其鹽之前，自患者獲得樣本。較佳地，選擇在ARID1A基因中具有至少一種失活突變之患者。較佳地，選擇在KMT2C基因中具有至少一種失活突變之患者。較佳地，選擇在KMT2D基因中具有至少一種失活突變之患者。較佳地，選擇在RB1基因中具有至少一種失活突變之患者。

本發明提供一種呈結晶鹽形式之本發明之化合物，亦即[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯。本發明亦提供結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物。本發明亦提供呈結晶形式之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物，其特徵在於使用20±0.2°之CuKa輻射，X射線粉末繞射圖具有在18.5°處出現之特徵峰以及選自由21.5°、16.7°及15.2°組成之群的一或多個峰。本發明亦提供結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽。本發明亦提供呈結晶形式之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7- 基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽，其特徵在於使用2θ±0.2°之CuKa輻射，X射線粉末繞射圖具有在21.5°處出現之特徵峰以及選自由12.4°、17.3°及15.8°組成之群的一或多個峰。本發明亦提供結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯鹽酸鹽。本發明亦提供呈結晶形式之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯鹽酸鹽，其特徵在於使用2θ±0.2°之CuKa輻射，X射線粉末繞射圖具有在18.9°處出現之特徵峰以及選自由5.5°、15.5°及9.7°組成之群的一或多個峰。

本發明亦包涵適用於合成本發明之化合物之中間物及方法。

如本文中所用之術語「治療(treating)」(或「治療(treat)」或「治療(treatment)」)係指限制、減緩、停止或逆轉存在之症狀、病況或病症之進展或嚴重性。

如本文中所用，術語「癌症」及「癌性」係指或描述患者體內典型地藉由不受調控之細胞增殖表徵之生理病況。包括於此定義中之為良性及惡性癌症。藉由「早期癌症」或「早期腫瘤」意謂不為晚期或轉移性或經分類為0、I、或II期癌症之癌症。癌症之實例包括但不限於：尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。

本發明之化合物可反應形成醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之鹽及製備其之常見方法為此項技術中所熟知(參見例如P.Stahl 等人，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection and Use,第2修訂版(Wiley-VCH,2011)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences,1977年1月，第66卷，第1期)。

熟習此項技術者應瞭解，如(I)中所示的本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽由含有如由以下*所表示的對掌性中心的核心構成：

雖然本發明涵蓋所有個體鏡像異構物，以及包括外消旋體之該等化合物之鏡像異構物的混合物，但本發明之較佳化合物由以下(II)表示：

或其醫藥學上可接受之鹽。

熟練的業內人士亦將瞭解，所有對掌性中心之卡恩-英戈爾德-普利洛(Cahn-Ingold-Prelog)(R)或(S)名稱將視具體化合物之取代模式而改變。單鏡像異構物可以對掌性試劑開始或藉由立體選擇性或立體特異性合成技術來製備。或者，單鏡像異構物可藉由標準對掌性層析或結晶技術在本發明之化合物合成中之任何適宜點處自混合物中分離。本發明之化合物之單鏡像異構物為本發明之較佳實施例。

本發明之化合物較佳經調配為藉由多種途徑投與之醫藥組合物。該等醫藥組合物及其製備方法為此項技術中所熟知(參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A.Gennaro等人編，第21版，Mack出版公司，2005))。更尤佳為包含下式化合物之醫藥組合物，

或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載體或稀釋劑。

本發明之一較佳實施例為

或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明之一尤佳實施例係關於化合物，亦即(3S)-1-[(2E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基4{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基]胺基}哌啶-1-甲酸酯：

或其醫藥學上可接受之鹽。尤佳為半乙二磺酸鹽水合物鹽或苯磺酸鹽。

本發明之另一尤佳實施例係關於化合物，亦即(3S)-1-[(2E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-7-基]胺基}哌啶-1-甲酸酯：

本發明之又一尤佳實施例係關於化合物，亦即(3R)-1-[(2E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-7-基]胺基}哌啶-1-甲酸酯(如由以下(III)所示)：

本發明之另一尤佳實施例係關於化合物，亦即(3R)-1-[(2E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基4-{[5-甲基-3-(丙-2-基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-7-基]胺基}哌啶-1-甲酸酯：

本發明之化合物在寬劑量範圍內通常有效。例如，每日劑量處於約1mg至約2g範圍內。在一些情況下，可充分大於低於前述範圍下限之劑量位準，而在維持有利益處/風險概況之其他情況下仍可採用更大劑量，且因此以上劑量範圍並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。應理解，實際上投與之化合物量將由醫師，鑒於相關情況，包括待治療之病況、所選擇之投與途徑、所投與之實際的一或多種化合物、個體患者之年齡、體重及反應及患者症狀之嚴重性來決定。

個體異構物及鏡像異構物可由一般熟習此項技術者中之一者在本發明之化合物合成中之任何適宜點處，藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析之方法來分離或分解(參見例如，J.Jacques等人，「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」,John Wiley and Sons,Inc.,1981及E.L.Eliel及S.H.Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds」,Wiley-Interscience,1994)。

另外，本文中所述之某些中間物可含有一或多個保護基。不同的保護基在各次出現時視特定反應條件及欲實行之特定轉化而定可相同或不同。保護及去保護條件已為熟習此項技術者所熟知且描述於文獻(參見例如Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene之「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」，第四版，John Wiley and Sons,Inc.2007)中。

某些縮寫定義如下：「¹H NMR」係指¹H-核磁共振；「eq」係指當量；「THF」係指四氫呋喃；「DCM」係指二氯甲烷；「MeCN」或「ACN」係指乙腈；「DMSO」係指二甲亞碸；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「TEA」係指三甲胺；「HATU」係指I-[雙(二甲胺基)亞甲基]-I 8- 1,2,3-***并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化-六氟磷酸鹽；「MeOH」係指甲醇；「TLC」係指薄層層析法；「UV」係指紫外線；「LC柱」係指液相層析柱；「DMEA」係指二甲基甲胺；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「DMF」係指二甲基甲醯胺；「SCX」係指強陽離子交換；「ca.」係指約或大約；「RBF」係指圓底燒瓶；「ATP」係指三磷酸腺苷；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「HEPES」係指(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ATCC」係指美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)；「RT」係指室溫；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「BSA」係指牛血清白蛋白；「FBS」係指胎牛血清；「RNAase」係指核糖核酸酶；「cDNA」係指互補DNA；「GST」係指麩胱甘肽S-轉移酶；「His」係指組胺酸；「GSH」係指麩胱甘肽；及「HBSS」係指漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution)。

本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可藉由此項技術中已知的多種程序來製備，且製備及實例如下。可以不同方式組合所描述之途徑中之各者的特定合成步驟，或將其與來自不同流程之步驟結合，以製備本發明之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽。以下流程中各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法來回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。試劑及起始材料對一般熟習此項技術者中之一者而言可容易獲得。

以下製備及實例進一步說明本發明且表示本發明之化合物之典型合成。

製備及實例

製備1

3-異丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇之合成。

在23℃下，向4-異丙基-1H-吡唑-3-胺(600g，4.79莫耳)在乙醇(4.2L)中之溶液中添加乙氧化鈉(979g，14.4莫耳，3.0當量)及丙二酸二乙酯(998g，6.23莫耳，3.0當量)，並將混合物加熱至80℃(內部溫度)達15小時。將混合物冷卻至25℃，添加1M HCl水溶液(2.0L)(最終pH=2.0)，過濾，用水洗滌固體(2.0L)並乾燥，以獲得呈白色固體狀之3-異丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(600g，65%)。ES/MS m/z 194(M+H)。

製備2

5,7-二氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶之合成。

在50℃下，向3-異丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(500g，2.58莫耳)在MeCN(1.25L)中之懸浮液中添加POCl₃(2.00L，25.8莫耳，10當量)及N,N-二甲基苯胺(162mL，2.58莫耳，1.0當量)，並將混合物加熱至100℃達36小時。冷卻至23℃，逐滴倒入1：1冰/磷酸鹽緩衝劑(1M，pH=8，10L)中並攪拌15小時。過濾，用水洗滌固體(5.0L)並乾燥以獲得呈褐色固體狀之5,7-二氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(375g，63%)。ES/MS m/z(³⁵Cl/³⁷Cl)230/232(M+H)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 1.32(d,6H),3.19(dq,1H),7.58(s,1H),8.31(s,1H)。

5,7-二氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶之替代合成。

向4-異丙基-1H-吡唑-5-胺(5g，39.9mmol)及丙二酸二乙酯(6.74mL，43.9mmol)在乙醇(150mL)中之溶液中添加在乙醇中之21%乙氧化鈉(17.9mL，47.9mmol)並在RT下攪拌。5分鐘後，在90℃下加熱並攪拌。18小時後，冷卻至RT並在減壓下濃縮。用水溶解殘餘物並添加1N鹽酸至pH=3。過濾白色沈澱物並在減壓、50℃下乾燥18小時。將所得固體，亦即3-異丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(4.92g，25.5mmol，0.638)懸浮於***(48mL)中並添加N,N-二甲基苯胺(2.3mL)。在110℃下使混合物回流。2小時後，冷卻至RT並在減壓下濃縮。將殘餘物倒在冰/水溶液上並用DCM萃取(兩次)。組合有機層並用鹵水洗滌，經硫酸鎂乾燥。過濾並在減壓下濃縮以得到殘餘物。藉由急驟層析(矽膠)，用乙基己烷：乙酸酯溶離來純化殘餘物，以提供呈褐色固體狀之5,7-二氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(4.45g，19.3mmol)。MS(m/z)：230,232(M+1)。¹H NMR(400.21MHz,DMSO)：8.31(s,1 H),7.58(s,1 H),3.19(m,1 H),1.32(d,J=7.0Hz,6H)。

製備3

第三丁基4-[(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成。

在23℃下，向5,7-二氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(130g，542mmol)在2-丙醇(1.0L)中之懸浮液中添加N,N-二異丙基乙胺(189mL，140g，1080mmol，2當量)及第三丁基4-胺基哌啶-1-甲酸酯(114g，570mmol，1.05當量)，並攪拌混合物18小時。過濾，用MTBE(200mL)洗滌固體並乾燥，以獲得呈黃色固體狀之第三丁基4-[(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(182g，85%產率)。ES/MS m/z(³⁵Cl/³⁷Cl)394/396(M+H)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 1.28(d,6H),1.42(s,9H),1.61(m,2H),1.83(m,2H),2.87(m,1H),3.10(dq,1H),3.32(m,1H),3.85(m,1H),3.98(m,2H),6.34(s,1H),8.01(s,1H),8.07(d,1H)。

製備4

第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成。

在23℃下，向第三丁基4-[(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(156g，396mmol)在THF(936mL)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(69.1mL，51.2g，396mmol，1當量)、4-二甲胺基吡啶(4.84g，39.6mmol，0.1當量)及二-第三丁基二碳酸鹽(200 mL，190g，871mmol，2.2當量)，並在50℃(內部溫度)下加熱混合物21小時。冷卻至23℃並在真空中濃縮以獲得呈橙色固體狀之第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(195g，99%)。ES/MS m/z(³⁵Cl/³⁷Cl)438/440(M+H-56)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 1.20(s,9H),1.31(d,6H),1.35(s,9H),1.46(m,2H),1.88(m,2H),2.75(m,1H),3.19(dq,1H),3.32(m,1H),3.95(m,1H),4.18(m,2H),7.20(s,1H),8.19(s,1H)。

第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之替代合成。

向5,7-二氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(3.1g，13mmol)在乙醇(32mL)中之溶液中添加第三丁基4-胺基哌啶-1-甲酸酯(2.8g，14mmol)。在下80℃加熱。18小時後，冷卻至RT並在減壓下濃縮。藉由急驟層析(矽膠)，用乙酸乙酯：DCM溶離來純化殘餘物，以提供呈白色固體狀之第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯。質譜(m/e)：394,396(M+1)。向第三丁基4-[(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(940mg，2.386mmol)及4-二甲胺基吡啶(290mg，2.33mmol)在THF(7mL)中之溶液中添加第三丁氧基羰基第三丁基碳酸鹽(1.14g，5.22mmol)。在60℃下加熱混合物。30分鐘後，冷卻至RT並在減壓下濃縮。藉由急驟層析(矽膠)，用DCM溶離來純化殘餘物，以提供呈淡黃色油狀之第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(1.1g)。質譜(m/z)：438(M-t-Bu)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)：8.19(s,1H),7.20(s,1H),5.76(s,1H),4.17(m,1H),3.95(m,2 H),3.19(m, 1 H),1.87(m,2 H),1.47(m,2 H),1.35(s,9 H),1-31(d,6H),1.19(s,9H)。

製備5

第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成。

在90℃(內部溫度)下，向第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(190g，385mmol)在1,4-二噁烷(1.5L)中之溶液中添加[1,1'-雙(二苯膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)DCM加合物(15.7g，19.3mmol，0.05當量)、磷酸三鉀(245g，1160mmol，3當量)及2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三硼環己烷(在THF中50質量%，75.3mL，67.6g，270mmol，0.7當量)。5天後，冷卻至23℃，經由矽藻土墊過濾並用THF漂洗固體(3×250mL)。在23℃下，用SiliaMetS®硫醇樹脂(40-63μm；裝載=1.46mmol/g；320g，467mmol)處理組合濾液，並加熱至65℃達18小時。冷卻至23℃，過濾並用DCM(2×250mL)洗滌樹脂。在真空中濃縮組合濾液，將殘餘物溶解在MTBE(1mL)中，用(200mL)水洗滌，乾燥(MgSO₄)並在真空中濃縮，以獲得呈褐色固體狀之第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(182g，100%)。ES/MS m/z 474(M+H)。

製備6

3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二鹽酸鹽之合成。

在23℃下，向第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(182g，384mmol)於2-丙醇(1.4L)中之懸浮液中添加在2-丙醇中之鹽酸(5.50mol/L，349mL，1920mmol，5當量)，並將混合物加熱至70℃(內部溫度)達3小時。冷卻至23℃，過濾，用MTBE(2×200mL)洗滌固體並乾燥，以獲得呈黃色固體狀之3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二鹽酸鹽(95g，71%產率)。組合母液，用MTBE(2L)稀釋，過濾，用MTBE(2×50mL)洗滌固體並乾燥，以獲得額外材料(8.42g，15%產率)。ES/MS m/z 274(M+H)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 1.28(d,6H),2.04(m,4H),2.61(s,3H),3.00(m,2H),3.40(m,3H),4.16(m,2H),6.68(s,1H),8.30(s,1H),8.80(m,1H),9.21(m,1H),9.86(m,1H)。

3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二鹽酸鹽之替代合成。

將7-氯-3-異丙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶(2.1kg，10.0 mol)及二異丙基乙胺(4.18L，2.4當量)溶解在異丙醇(16.8L，8mL/g)中。將第三丁基4-胺基哌啶-1-甲酸酯(2.6kg，1.3當量)充填至反應混合物中並加熱至75-80℃達16小時。將反應混合物冷卻至5-10℃並添加在異丙醇中之4M鹽酸溶液(17.5L，7.0當量)。加熱至40-45℃達4小時。冷卻至25-30℃並過濾混合物，以得到標題化合物(2.25kg，72.7%產率)。材料不經進一步純化即用於下一步驟中。¹H NMR(500MHz,D₂O)δ 8.16(s,1H),6.45(s,1H),4.29-4.26(m,1 H),3.63(d,J=15.0Hz,2H),3.26-3.12(m,3H),2.64(s,3H),2.40(d,J=15.0Hz,2H),2.08(dd,J=10.0,25.0Hz,2H),1.31(d,J=5.0Hz,6H)。

作為游離鹼之3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺之替代合成。

向第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(5-氯-3-異丙基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(689mg，1.39mmol)、2,4,6-三甲基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三硼環己烷(350mg，2.79mmol)及磷酸三鉀(1.2g，5.5mmol)之混合物中添加1,4-二噁烷(15mL)。向溶液上鼓泡N₂達5分鐘。添加[1,1'-雙(二苯膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)DCM加合物(60mg，0.072mmol)。在110℃下加熱。1.5小時後，添加更多的[1,1-雙(二苯膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(60mg，0.072mmol)並在100℃下加熱。18小時後，冷卻至RT，經由過濾槽墊過濾混合物，用乙酸乙酯漂洗並在減壓下濃縮。藉由急驟層析(矽膠)，用乙酸乙酯及DCM溶離來純化殘餘物，以提供呈橙黃色油狀之第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(537mg，1.077mmol)。質譜(m/z)：474(M+1)。

向第三丁基4-[第三丁氧基羰基-(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(537mg，1.077mmol)在DCM(12mL)中之溶液中逐滴添加三氟乙酸(2.5mL，33mmol)。在RT下攪拌。2小時後，在減壓下濃縮混合物。藉由SCX-2筒用10% DCM：MeOH，然後係MeOH(2N NH₃)溶離來純化殘餘物。在減壓下濃縮鹼性級分以提供呈淺棕色固體狀之3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(345mg，1.199mmol)。質譜(m/z)：274(M+1)。¹H NMR(400.13MHz,DMSO)：7.82(s,1 H),7.23(d,1H),6.08(s,1 H),3.58(m,1 H),3.12(m,1 H),2.97(m,2 H),2.58(m,2 H),2.39(s,3 H),2.10(m,2 H),1.28(d,6 H)。

製備7

[(3S)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成

在23℃下，向置於與含有32% NH₄OH水溶液的洗滌器捕集瓶連接的3頸RBF中之第三丁基(3S)-3-羥基吡咯啶-1-甲酸酯(76.5g，409mmol)在THF(765mL)中之溶液中添加光氣(在甲苯中20質量%，348 mL，485g，981mmol，2.4當量)達1小時。經由混合物鼓泡N₂達30分鐘，並在真空中濃縮。將殘餘物溶解在DCM(757mL)中，冷卻至0℃(內部溫度)並添加(在7分鐘內緩慢添加)預先用三乙胺(228mL，166g，1639mmol，6當量)處理過的3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二鹽酸鹽(94.6g，273.2mmol)在DCM(756.8mL)中之懸浮液。添加後移除冷卻浴，並在30分鐘後用35% HCl水溶液(20mL)及1M HCl水溶液(300mL)淬滅反應(最終pH=7)。分離有機層，用水(300mL)及NaCl飽和水溶液(300mL)洗滌，乾燥(MgSO₄)並在真空中濃縮。將殘餘物(ca. 180g)溶解在DCM(1.5L)中，在23℃下添加SiliaMetS®硫醇樹脂(40-63μm；裝載=1.46mmol/g；10g，14.6mmol，以Pd含量計140當量)，且然後將混合物加熱至40℃達2小時。過濾，用DCM(2×10mL)漂洗樹脂並在真空中濃縮組合濾液，以獲得呈黃色固體狀之[(3S)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(129g，97%)。ES/MS m/z 487(M+H)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 1.28(d,6H),1.40(s,9H),1.65(m,2H),1.88(m,2H),1.96(m,1H),2.07(m,1H),2.46(s,3H),2.90(m,2H),3.31(m,5H),3.89(m,1H),4.02(m,2H),5.10(m,1H),6.32(s,1H),8.01(s,1H)。

[(3S)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之替代合成

在15-30℃下將第三丁基(3S)-3-羥基吡咯啶-1-甲酸酯(438g，1.3當量)溶解在ACN(4.4L，10.0mL/g)中。在15-30℃下添加三乙胺(595mL，4.5當量)，接著添加4-氯甲酸硝基苯酯(490g，1.4當量)。加熱至35-40℃並攪拌混合物4小時。冷卻至15-25℃並添加3-異丙基-5-甲基- N-(哌啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(500g，1.8mol)。在15-30℃下攪拌5小時。在減壓下濃縮。添加2-甲基四氫呋喃(4.4L，10.0mL/g)，攪拌並過濾。用2M NaOH(1.1L，2.5mL/g，4次)及NaCl飽和水溶液(4.4L，10.0mL/g)依次洗滌濾液。經Na₂SO₄乾燥，過濾並在減壓下濃縮。添加異丙醇(2.2L，5mL/g)以獲得標題化合物之溶液(660g，75.4%產率)。

製備8

[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成。

在23℃下，向[(3S)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(116g，239mmol)在2-丙醇(755mL)中之懸浮液中添加在2-丙醇中之鹽酸(5.50mol/L，217mL，1190mmol，5當量)，並將混合物加熱至70℃達90分鐘。冷卻至23℃，並在真空中濃縮。將殘餘物懸浮在DCM(1.5L)中，添加1M NaOH水溶液(400mL)及50% NaOH水溶液(100mL)。攪拌15分鐘。分離有機相，乾燥(MgSO₄)並在真空中濃縮。將殘餘物(ca. 131g)懸浮在MTBE/己烷(2：1，900mL)中，並攪拌混合物18小時。過濾，用己烷(2×100mL)洗滌經過濾之固體，並乾燥以獲得呈黃色固體狀之[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(82.7g，90%產率)。ES/MS m/z 387(M+H)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 1.28(d,6H),1.60(m,3H),1.88(m,3H),2.40(s,3H),2.75(m,2H),2.91(m,4H),3.13(dq,1H),3.78(m,1H),4.02(m,2H),5.10(m,1H),6.14(s,1H),7.41(d,1H),7.87(s,1H)。

[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之替代合成。

在20-30℃下，向含有(S)-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基4-((3-異丙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基)哌啶-1-甲酸酯(819g)之異丙醇溶液中添加在異丙醇中之5.5M鹽酸(8.4L，5.0mL/g)。將反應混合物加熱至50-60℃達5小時。冷卻至30-35℃，添加MTBE(8.2L，10mL/g)並攪拌1小時。過濾，在0-5℃下向氫氧化鈉水溶液(3.0當量)中添加濕濾餅並攪拌30分鐘。添加2-甲基四氫呋喃(8.2L，10.0mL/g)並攪拌。萃取有機相並用NaCl飽和水溶液洗滌。經硫酸鈉乾燥，過濾，並在減壓下濃縮至1-2體積。添加MTBE(2.46L，3mL/g)並攪拌3小時。過濾得到標題化合物(550g)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.82(s,1H),6.12(d,J=8.1Hz,1H),5.78(s,1H),5.27-5.13(m,1H),4.26-4.01(m,2H),3.74-3.59(m,1H),3.36-3.23(m,1H),3.14-2.98(m,5H),2.90(ddd,J=11.1,8.4,5.4Hz,1H),2.52(s,3H),2.18-2.00(m,3H),1.87(dd,J=12.6,6.4Hz,1H),1.76(s,1H),1.66-1.52(m,2H),1.34(d,J=6.9Hz,6H)。

向第三丁基(3S)-3-羥基吡咯啶-1-甲酸酯(500mg，2.67mmol)及TEA(0.37mL，2.6mmol)在THF(13mL)中之冷(0℃)溶液中添加光氣(1.14mL，在甲苯中20質量%，3.20mmol)。移除冷浴並在RT下攪拌混合物。30分鐘後，在減壓下濃縮混合物並將殘餘物溶解在DCM(11mL)中。向3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(C，365mg，100質量%，0.365g)及TEA(0.3mL)在DCM(11mL)中之溶液中添加此溶液。在RT下攪拌混合物。10分鐘後，添加NaHCO₃飽和水溶液並用更多的DCM萃取。組合有機層並用NaCl飽和水溶液洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以得到殘餘物。藉由急驟層析(矽膠)，用DCM：MeOH溶離來純化殘餘物，以提供呈淡黃色油狀之[(3S)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(671mg)。質譜(m/z)：487(M+1)。

向[(3S)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(671mg，1.269mmol)在DCM(12mL)中之溶液中逐滴添加三氟乙酸(2mL，26.45mmol)。在RT下攪拌。18小時後，在減壓下濃縮混合物。將殘餘物溶解在DCM中並用10% K₂CO₃水溶液洗滌有機相。經硫酸鎂乾燥有機相，過濾並在減壓下濃縮，以提供呈白色發泡體狀之[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(274mg，0.6593mmol)。質譜(m/z)：387(M+1)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)：7.87(s,1H),7.42(d,J=9.0Hz,1H),6.13(s,1H),5.00(ddd,J=9.0,5.2,2.5Hz,1H),4.02(m,2H),3.77(m,1 H),3.13(m,1 H),2.89(m,4 H),2.72(m,2H),2.40(s,3 H),1.87(dd,J=6.8,14.1Hz,2 H),1.63(m,3 H),1.28(d,J=6.8 Hz,6 H)。

製備9

[(3R)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成

向第三丁基(3R)-3-羥基吡咯啶-1-甲酸酯(500mg，2.67mmol)及TEA(0.37mL，2.6mmol)在THF(13mL)中之冷(0℃)溶液中添加光氣(1.14mL，在甲苯中20質量%，3.20mmol)。移除冷浴並在RT下攪拌混合物。

30分鐘後，在減壓下濃縮混合物並將殘餘物溶解在DCM(11mL)中。向3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(365mg，100質量%，0.365g)及TEA(0.3mL)在DCM(11mL)中之溶液中添加此溶液。在RT下攪拌混合物。10分鐘後，添加NaHCO₃飽和水溶液並用更多的DCM萃取。組合有機層並用NaCl飽和水溶液洗滌經硫酸鎂乾燥，過濾，並在減壓下濃縮以得到殘餘物。藉由急驟層析(矽膠)，用己烷：乙酸乙酯溶離來純化殘餘物，以提供呈淡黃色油狀之[(3R)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(350mg)。質譜(m/z)：487(M+1)。

向[(3R)-1-第三丁氧基羰基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(350mg，0.72mmol)在DCM(7mL)中之溶液中逐滴添加三氟乙酸(0.8mL，0.72mmol)。在RT下攪拌。45分鐘後，在減壓下濃縮混合物。藉由SCX-2筒用10% DCM：MeOH，然後係MeOH(2N NH₃)溶離來純化殘餘物。在減壓下濃縮鹼性級分，以提供呈淺棕色固體狀之[(3R)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(246mg)。質譜(m/z)：387(M+1)。

製備10

3-異丙基-5-甲基-4H吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-酮之合成

將4-異丙基-1H-吡唑-5-胺(2.2kg，17.6mol)及乙醯乙酸乙酯(2.86kg，1.25當量)溶解於乙酸(17.6L，8.0mL/g)中。將混合物加熱至110-115℃且然後冷卻至35-40℃。添加庚烷及MTBE(44L，20mL/g，5/1比)。過濾並用庚烷(4.4L，2mL/g)漂洗固體，以得到標題化合物(2.28kg，85.5%產率)。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ 11.81(s,1H),7.77(s,1H),5.50(s,1H),3.08-3.05(m,1H),2.31(s,3H),1.22(d,J=5.0Hz,6H)。

製備11

7-氯-3-異丙基-5-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶之合成

將3-異丙基-5-甲基-4H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-酮(2.1kg，11.0mol)及N,N-二甲基苯胺(0.86kg，0.65當量)溶解在ACN(8.4L，4mL/g)中。將反應加熱至50-55℃並逐滴添加POCl₃(4.2kg，2.5當量)。調節溫度至60-65℃並攪拌混合物9小時。將混合物冷卻至25-30℃並倒入2M磷酸鉀緩衝劑(pH=8.0，42L，20mL/g)。添加MTBE(23.9L，11.4mL/g)並萃取有機相。用兩次20%檸檬酸溶液(4.2L，2.0mL/g)、10% NaHCO₃水溶液(10.5L，5.0mL/g)及NaCl飽和水溶液(10.5L，5.0mL/g)依次洗滌有機相。經Na₂SO₄乾燥有機相，過濾並在減壓下濃縮以提供標題化合物(1.8kg，78%產率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.02(s,1H),6.75(s,1H),3.27-3.25(m,1H),2.58(s,3H),1.42(d,J=8.0Hz,6H)。

製備12

3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺

在10-15℃下，向1M氫氧化鈉水溶液(19.2L，3.0當量)中添加3-異丙基-5-甲基-N-(4-哌啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺二鹽酸鹽(2.2kg，6.4mol)。攪拌反應混合物15-20分鐘，然後添加2-甲基四氫呋喃 (4.70L，10.0當量)並攪拌20-25分鐘。分離有機相並用2-甲基四氫呋喃(6.6L，3.0mL/g，3次)洗滌水相。組合有機溶液並用NaCl飽和水溶液(11L，5.0mL/g)洗滌。經Na₂SO₄乾燥有機相，過濾並在減壓下濃縮。在25-30℃下添加MTBE(6.6L，3.0mL/g)並攪拌40分鐘。過濾得到標題化合物(1.5kg，85.7%產率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.81(s,1H),6.10(d,J=8.0Hz 1H),5.75(s,1H),3.59-3.54(m,1 H),3.32-3.28(m,1 H),3.22-3.19(m,2 H),2.77-2.73(m,2 H),2.51(s,3H),2.11(d,J=8.0Hz,2H),1.56-1.50(m,3 H),1.34(d,J=8.0Hz,6H)。

實例1

[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成。

[*應注意，如此處在實例1中所示，對掌性中心改變了定向，且S鏡像異構物形式的表示與如上述結構(II)中的實例所示出的不同。]在23℃下，向[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(29.1g，75.3mmol)於THF(146mL)中之懸浮液中添加(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯酸鹽酸鹽(15.0g，90.3mmol，1.2當量)、N,N-二異丙基乙胺(31.3mL，23.4g，181mmol，2.4當量)及 HATU(42.9g，113mmol，1.5當量)，並攪拌混合物90分鐘。用磷酸鹽緩衝劑(0.5M，pH=9,150mL)稀釋，用DCM(2×375mL)萃取，乾燥(MgSO₄)，並在真空中濃縮。藉由層析法(裝載溶解於65mL DCM中之殘餘物；330g SiO₂；溶離劑：在MeOH中0%至10%之MTBE/7N NH₃；TLC：在MeOH中5：1之MTBE/7N NH₃)純化所得殘餘物(ca. 95g)。將材料(ca. 40g)溶解在DCM(400mL)中，用1M K₂HPO₄水溶液(1M，80mL)洗滌，乾燥(MgSO₄)，並在真空中濃縮。藉由層析法(裝載吸收在SiO₂(50g)中之殘餘物；330g SiO₂；溶離劑：在MeOH中0%至10%之MTBE/7N NH₃)純化殘餘物(ca. 38g)，以獲得呈白色固體狀之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(28.1g，75%)。ES/MS m/z 498(M+H)。¹H NMR(CD₃OD)δ 1.33(d,6H),1.64(m,2H),2.10(m,2H),2.18(m,1H),2.26(m,1H),2.29(s,6H),2.50(s,3H),3.11(m,2H),3.18(dd,2H),3.29(dq,1H),3.70(m,3H),3.87(m,2H),4.14(m,2H),5.31(m,1H),6.12(s,1H),6.47(m,1H),6.86(m,1H),7.88(s,1H)。[ ]_D ²⁰=+49.9°(C=2.0,MeOH)。鏡像異構物超越(e)=97%。Rt(滯留時間)=2.79分鐘(UV)；LC柱：CHIRALPAK® AS(4.6×150mm，5m)；MeOH+0.2% DMEA；流量率：1.0毫升/分鐘。

[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之替代合成。

向[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(170mg，0.4091mmol)、(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯酸鹽酸鹽(135mg，0.81512mmol)及HATU(317mg，0.8181 mmol)在N,N-二甲基甲醯胺(4mL)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(0.36mL，2.1mmol)。在RT下攪拌。5分鐘後，在減壓下濃縮混合物。藉由SCX-2筒，用10% DCM：MeOH，然後係MeOH(2N NH₃)溶離來純化殘餘物。在減壓下濃縮鹼性級分，並經由ISCO^TM反相Claricep C系列，用NH₄CO₃ pH 9/ACN溶離來純化殘餘物，以提供呈白色固體狀之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(129mg，0.255mmol)。質譜(m/z)：498(M+1)。¹H NMR(400.13MHz,MeOD)：7.88(s,1H),6.85(m,1 H),6.47(m,1 H),6.12(s,1 H),3.91-3.52(m,5 H),3.13(m,1 H),3.03(m,2 H),2.94(m,1 H),2.39(s,3 H),2.15(s,6 H),2.06(m,1 H),1.88(d,J=11.5Hz,2 H),1.66(m,2 H),1.28(d,J=6.8Hz,6H)。

在15-30℃下，將[(3S)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(550g，1.4mol)溶解在THF(5.5L，10.0mL/g)中。在15-30℃下添加(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯酸鹽酸鹽(278g，1.2當量)及TEA(1.17L，6.0當量)並攪拌40分鐘。在15-30℃下添加在EtOAc中之50%丙基膦酸酐(1.68L，1.2當量)並攪拌12小時。過濾器及溶劑在減壓下與乙酸異丙酯交換濾液。在25-30℃下添加2M NaOH水溶液(2.75L，5mL/g)並攪拌20分鐘。萃取有機相並用NaCl飽和水溶液(2.75L，5mL/g)洗滌。經Na₂SO₄乾燥，過濾並在減壓下濃縮。在15-30℃下添加庚烷(3.85L，7mL/g)及THF(16.5L，3ml/g)。攪拌1小時並過濾，以得到標題化合物(440g，63.2%產率)。¹H NMR(500MHz, CD₃OD)δ 7.86(s,1H),6.83(d,J=10.7Hz,1H),6.43(dd,J=34.3,14.9Hz,1H),6.08(s,1H),5.26(d,J=24.2Hz,1H),4.85(s,2H),4.22-4.01(m,2H),3.90-3.76(m,2H),3.61-3.47(m,1H),3.36-3.21(m,2H),3.17-3.11(m,2H),3.12-2.98(m,2H),2.47(s,3H),2.28-2.21(m,7H),2.16-2.00(m,3H),1.68-1.48(m,2H),1.30(d,J=6.2Hz,6H)。

實例2

[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯鹽酸鹽之合成。

[*應注意，如此處在實例2中所示，對掌性中心改變了定向，且S鏡像異構物形式的表示與如上述結構(II)中的實例所示出的不同。]在23℃下，向[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(0.283g，0.549mmol)在丙酮(5.5mL)中之溶液中添加HCl(在EtOAc中1M，0.589mL，0.590g，0.589mmol，1.07當量)，並攪拌混合物5小時。在真空中濃縮以獲得呈白色固體狀之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1- 甲酸酯鹽酸鹽(0.244g，81%)。ES/MS m/z 498(M+H)。

¹H NMR(CD₃OD)δ 1.34(d,6H),1.66(m,2H),2.11(m,2H),2.20(m,1H),2.30(m,1H),2.54(s,3H),2.90(s,6H),3.12(m,2H),3.28(dq,1H),3.74(m,4H),3.95(dd,2H),4.16(m,2H),4.63(m,1H),5.32(m,1H),6.22(s,1H),6.78(m,2H),7.94(s,1H)。

實例3

[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯之合成。

[*應注意，如此處在實例3中所示，對掌性中心改變了定向，且R鏡像異構物形式的表示與如上述結構(III)中的實例所示出的不同。]向[(3R)-吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(170mg，0.43mmol)、(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯酸鹽酸鹽(150mg，0.90mmol)及HATU(343mg，0.87mmol)在DMF(4mL)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(0.4mL，2.0mmol)。在RT下攪拌。5分鐘後，在減壓下濃縮混合物。藉由SCX-2筒，用10% DCM：MeOH，然後係MeOH(2N NH₃)溶離來純化殘餘物。在減壓下濃縮鹼性級分，並經由ISCO反相Claricep C系列，用NH₄CO₃ pH 9/ACN溶離來純化殘餘物，以提供呈白色固體狀之[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(188mg)。質譜(m/z)：498(M+1)。

¹H NMR(400.21MHz,DMSO)：7.86(s,1 H),7.41(m,1 H),6.63(m,1 H),6.37(m,1 H),6.13(s,1 H),5.16(m,1H),4.09-3.92(m,2H),3.78(m,2 H),3.56(m,2 H),3.13(m,1 H),3.03(m,2 H),2.93(m,1 H),2.39(s,3 H),2.14(s,6 H),2.06(m,1 H)1.88(m,2 H),1.60(m,2 H),1.28(d,J=6.8Hz,6 H)。

實例4

結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物之合成

[*應注意，如此處在實例4中所示，對掌性中心改變了定向，且S鏡像異構物形式的表示與如上述結構(II)中的實例所示出的不同。]將2.0g之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯置於8mL之丙酮中，同時在室溫下磁攪拌。在單獨小瓶中，將505mg之1,2-乙二磺酸水合物溶解在6mL丙酮中。向游離鹼溶液中添加酸溶液並在RT下混合。攪拌樣本使得徹底混合，必要時添加額外的溶劑以稀釋漿液。在50℃下使懸浮液過夜漿化。攪拌過夜後，將剩餘的濃稠白色固體漿液冷卻至20℃。藉由在濾紙上真空過濾來分離固體，並在濾紙上之適當位置乾燥所得白色固體濾餅(2.1g，88%產率)。

在配備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec偵測器，在35kV及50mA下操作之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRD圖。以2θ在4與40°之間掃描樣本，其中2θ之步長為0.008°且掃描速率為0.5秒/步，且散度為0.6mm，固定抗散射狹縫為5.28，且偵測器狹縫為9.5mm。將乾粉裝填於石英樣本固持器上，且使用玻璃載片獲得光滑表面。在室溫及相對濕度下收集結晶形式繞射圖。結晶學技術中已熟知，對於任何既定結晶形式，由於由諸如晶體形態及習性之因素所產生之較佳定向，繞射峰之相對強度可能變化。在存在較佳定向之效應之情況下，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見例如，The United States Pharmacopeia第23版，National Formulary第18版，第1843頁-第1844頁，1995。此外，結晶學技術中亦熟知，對於任何既定結晶形態，角峰位置可略微變化。例如，峰位置可能由於分析樣本時之溫度或濕度變化、樣本置換或內標存在或不存在而發生偏移。在本發明之情況下，2θ之±0.2之峰位置變化將考慮此等潛在變化而不妨礙明確鑑別所指定的結晶形式。結晶形式之確認可基於區別性峰(以2θ°為單位)，通常為更主要之峰之任何獨特組合來進行。基於8.853度及26.774度2θ之NIST 675標準峰調節在室溫及相對濕度下收集之結晶形式繞射圖。

製備的結晶型半乙二磺酸鹽水合物樣本之特徵在於使用 CuKa輻射作為具有如下表中所述之繞射峰(2θ值)，並且特別具有位於18.5°處之峰以及選自由21.5°、16.7°及15.2°組成之群的一或多個峰的XRD圖；其中繞射角之公差為0.2度。

結晶型半乙二磺酸鹽水合物之X射線粉末繞射峰

實例5

結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽之合成

[*應注意，如此處在實例5中所示，對掌性中心改變了定向，且S鏡像異構物形式的表示與如上述結構(II)中的實例所示出的不同。]將1998mg之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4- [(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯置於15mL丙酮中，同時在RT下以1000rpm攪拌。添加650mg之苯磺酸(溶解於5mL丙酮中)。在RT下以1000rpm攪拌樣本一小時，且一段時間後，溶液變得模糊，且產生濃稠的白色固體漿液。藉由在濾紙上真空過濾來分離白色固體。在70℃下在真空烘箱中乾燥樣本1小時(2.23g，85%產率)。

在15-30℃下，將[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯(440g，1.1mol)溶解在EtOAc(1.4L)及丙酮(357mL)中。加熱至50-55℃。在50-55℃下，將苯磺酸單水合物(156g，0.89當量)溶解在EtOAc(709mL)及丙酮(166mL)中並以5-10毫升/分鐘添加至反應混合物中。攪拌1小時。冷卻至15-30℃並攪拌12小時。在氮氣下過濾並乾燥濕濾餅，以得到標題化合物(525g 72.9%產率)。1H NMR(500MHz,CD₃OD)δ 7.89(s,1H),7.85-7.79(m,2H),7.43-7.39(m,3H),6.82-6.66(m,2H),6.15(s,1H),5.27(d,J=21.5Hz,1H),4.11(d,J=32.9Hz,2H),3.94-3.79(m,4H),3.33-3.18(m,2H),3.10-2.97(m,2H),2.84(s,6H),2.49(s,3H),2.25-1.94(m,5H),1.68-1.51(m,2H),1.31(d,J=6.8Hz,6H)。

本質上如實例4中所描述獲得結晶固體之XRD圖。製備的結晶型苯磺酸鹽樣本之特徵在於使用CuKa輻射作為具有如下表中所述之繞射峰(2θ值)，並且特別具有位於21.5°處之峰以及選自由12.4°、17.3°及15.8°組成之群的一或多個峰的XRD圖；其中繞射角之公差為0.2度。

結晶型苯磺酸鹽之X射線粉末繞射峰

實例6

結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯鹽酸鹽水合物之合成

[*應注意，如此處在實例6中所示，對掌性中心改變了方向，且S鏡像異構物形式的表示與如上述結構(II)中的實例所示出的不同。]將557mg之[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基]4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯置於4mL丙酮中，同時在RT下以1000rpm攪拌。添加1200μL之HCl(在乙酸乙酯中1M，1.07當量)。以1000rpm攪拌樣本過夜以得到濃稠的白色固體漿液。藉由在濾紙上真空過濾來分離白色固體。在空氣流下，在濾紙上之適當位置乾燥所得白色固體濾餅達10分鐘(385mg，64%產率)。

本質上如實例4中所描述獲得結晶固體之XRD圖。製備的結晶型鹽酸鹽水合物樣本之特徵在於使用CuKa輻射作為具有如下表中所述之繞射峰(2θ值)，並且特別具有位於18.9°處之峰以及選自由5.5°、15.5°及9.7°組成之群的一或多個峰的XRD圖；其中繞射角之公差為0.2度。

結晶型鹽酸鹽之X射線粉末繞射峰

生物測定

以下測定表明本發明之化合物為CDK7活性之抑制劑。測定之結果亦表明本發明之化合物抑制CDK7在癌細胞中傳信。另外，本發明之化合物抑制癌細胞株增殖及癌症之異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。

「IC₅₀」係指產生該藥劑可能的最大抑制反應之50%的藥劑濃度，或者係指產生與受體特異性結合之配位子之50%置換的藥劑濃度；使用螢光單元，藉由計算相對於培養盤上「最小」及「最大」對照之抑制百分比，且然後將十點劑量反應數據擬合至四參數邏輯斯蒂方程式(logistic equation)來確定相對IC₅₀值。

CDK7及CDK9激酶活性測定

此測定之目的係量測本發明之化合物抑制CDK7/周期蛋白 H/Mat1錯合物激酶活性之能力。為了證明包括於本發明內之化合物是否表現出任何對CDK7、CDK7及CDK9之親和性，在不預先將酶與化合物培育之情況下或在3小時預培育之情況下，實行生物化學測定。功能性測定為本發明之化合物是否表現出抑制CDK7及CDK9激酶活性之能力提供支持。在以下測定中採用之所有配位子、溶劑及試劑均可容易地自商業來源購得，或可由熟習此項技術者容易地合成。如下確定CDK7及CDK9之IC₅₀確定。

CDK7/周期蛋白H/MAT1之抑制之生物化學測定

在ATP//[³³P]ATP及肽基質存在之情況下，用使用經純化之人類重組酶之輻射標記過濾結合(filter binding，FB)測定來確定抑制劑之IC₅₀活性。所選擇的ATP濃度為ATP之酶Km或接近於ATP之酶Km。

反應在最終體積為每孔25μL之96孔聚苯乙烯培養盤中進行。混合5μL在20% DMSO中之測試化合物、10μL基質溶液(ATP/33PATP及CDK7/9肽)及10μL酶溶液。製備基質溶液以得到在4mM MgCl₂、0.01% TRITON^TM X-100、2mM DTT及20mM HEPES之激酶緩衝劑中稀釋的100μM ATP/[³³P]ATP(NEN 10μCi/μL，3000Ci/mmol)及250μM CDK7/9肽((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK)(SEQ ID NO：1))之最終濃度。將酶溶液製備成在激酶緩衝劑中稀釋之1nM CDK7/周期蛋白H/Mat1酶[Proqinase 0366-0360-4第002批)]之最終濃度。將測試化合物在20% DMSO中按1：3連續稀釋，以在20μM之起始濃度下創建10點曲線。使用不含測試化合物之單獨的20% DMSO緩衝劑作為高對照(在不存在任何抑制劑之情況下具有完全活性)，使用500mM EDTA以確定在不存在酶活性之情況下(低對照)之背景位準。將5μL化合物與10μL酶溶液混合後，將培養盤在22℃下培育0或180分鐘。此後，反應藉由添加10μL基質溶液來開始，並在22℃下培育50分鐘。反應藉由添加80μL之冷10%正磷酸溶液來終止。過濾培養盤(不透光，非無菌過濾培養盤)用10μL之10%正磷酸溶液來預洗滌至各孔。將100μL之混合物轉移至磷酸纖維素過濾器中並在室溫下培育45分鐘。在過濾培養盤處理器上用200μL 0.5%正磷酸洗滌過濾培養盤3次。33Pi之併入(「cpm」之計數)藉由向各孔中添加80μL之MICROSCINT^TM並在一小時後在計數器上讀取來確定。數據經由GENEDATA SCREENER^®工具進行處理。使用4參數非線性邏輯斯蒂方程式(四參數邏輯斯蒂濃度-反應曲線)分析數據：Y=底部+[(頂部-底部)/1+(x/IC₅₀)斜率]，其中Y=抑制%，X=產生y抑制%之濃度，底部=由曲線獲得之y之最小值，頂部=由曲線獲得之y之最大值且斜率=曲線在IC₅₀下之陡度。抑制%=[(最大中值-x/最大中值-最小中值)]．100。

IC₅₀：使既定反應(配位子結合、酶反應)降低50%之化合物之濃度。

實例1及3中所描述之化合物在沒有預培育的CDK7中分別顯示出0.0173μM及0.0487μM之IC₅₀。將實例1及3之CDK7酶預培育3小時後，其分別顯示出0.00237μM及0.00506μM之IC₅₀。此等數據顯示實例1及3兩者均抑制CDK7。

CDK9/周期蛋白T1激酶活性之抑制之測定：

在ATP及肽基質存在之情況下，用使用經純化之人類重組酶之輻射標記過濾結合(FB)測定來確定抑制劑之IC₅₀活性。所選擇的ATP濃度為ATP之酶Km或接近於ATP之酶Km。反應在最終體積為25微升/孔之96孔聚苯乙烯培養盤中進行。混合5μL在20% DMSO中之測試化合物、10μL基質溶液(ATP/[³³P]ATP及CDK7/9肽)及10μL酶溶液。製備基質溶液以得到在4mM MgCl₂、0.0025% TRITON^TM X-100、1.58mM DTT及15.80mM HEPES之激酶緩衝劑中稀釋的100μM ATP/[³³P]ATP(NEN 10uCi/μL，3000Ci/mmol)及200μM CDK7/9肽((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK)(SEQ ID NO：1))之最終濃度。將酶溶液製備成在激酶緩衝劑中稀釋之7.5nM CDK9/周期蛋白T1酶[Proqinase 0371-0345-1(第004批)]之最終濃度。將測試化合物在20% DMSO中按1：3連續稀釋，以在20μM之起始濃度下創建10點曲線。使用不含測試化合物之單獨的20% DMSO緩衝劑作為高對照(在不存在任何抑制劑之情況下具有完全活性)，使用500mM EDTA以確定在不存在酶活性之情況下(低對照)之背景位準。將5μL化合物與10μL酶溶液混合後，將培養盤在22℃下培育0或180分鐘。此後，反應藉由添加10μL基質溶液來開始，並在22℃下培育60分鐘。反應藉由添加80μL之冷10%正磷酸溶液來終止。過濾培養盤(不透光，非無菌過濾培養盤)用10μL之10%正磷酸溶液來預洗滌各孔。將100μL混合物轉移至磷酸纖維素過濾器中並在室溫下培育45分鐘。在過濾培養盤處理器上用200μL 0.5%正磷酸洗滌過濾培養盤3次。向各孔中添加80μL之MICROSCINT^TM並在一小時後在閃爍計數器上讀取。數據經由GENEDATA-SCREENER^®工具進行處理。使用4參數非線性邏輯斯蒂方程式(四參數邏輯斯蒂濃度-反應曲線)來分析數據：Y=底部+[(頂部-底部)/1+(x/IC₅₀)斜率]，其中Y=抑制%，X=產生y抑制%之濃度，底部=由曲線獲得之y之最小值，頂部=由曲線獲得之y之最大值且斜率=曲線在IC₅₀下之陡度。抑制%=[(最大中值-x/最大中值-最小中值)]．100 IC₅₀：使既定反應(配位子結合、酶反應)降低50%之化合物之濃度。相對IC₅₀：提供化合物之最大反應之一半的濃度。

實例1及3中所描述之化合物對CDK9(3小時預培育)分別顯示出5.93μM及2.45μM之IC₅₀。此等數據表明實例1及3不會強力抑制CDK9活性。

綜合而言，來自上文測定之數據表明實例1及3之化合物相對於CDK9選擇性地抑制CDK7。

CDK7及CDK9細胞機理測定

此等測定之目的為量測化合物抑制CDK7及CDK9在活體外癌細胞中傳信之能力。

基於磷酸-羧基端域(Rbp2)(Ser2)p-CTD(S2)細胞之Acumen測定

HCT116細胞(ATCC CCL-247)在補充有10% FBS、1% NaPyr及1% Pen/Strep之McCoy氏5A Medium Modified培養基中培養，並在96孔平底培養盤中以每孔(其體積為100L)5,000個細胞之密度來電鍍(在融合成70%之前)。然後，將e3細胞在細胞培養箱(5% CO₂，95%相對濕度(Relative Humidity，RH)及37℃)中培育過夜，並使其附著於培養盤上。第二天早上向細胞投用化合物。化合物抑制劑首先以60M溶解於含有0.6% DMSO之培養基中。隨後，在60μM至0.003μM範圍內製備化合物連續稀釋劑(1：3)。藉由自連續稀釋培養盤向與100μL培養基連接之含有細胞之測定培養盤中添加50μL，產生0.2%之最終DMSO濃度且最終化合物濃度劑量範圍在20與0.001μM之間來向細胞投用。對於最大點，使用含有0.2% DMSO之培養基，且對於最小點，使用以0.83μM最終濃度在含有0.2% DMSO之生長培養基中稀釋之參考化合物。在投用化合物之後，細胞培養盤在37℃及5% CO₂下培育4小時。謹慎地移除該生長培養基，並藉由在RT下添加100μL之4%對甲醛達30分鐘來固定細胞。細胞用PBS洗滌一次並在RT下與100μL之冷MeOH一起培育15分鐘，以進行細胞滲透。細胞用PBS(各100μL)洗滌兩次並在RT下用100微升/孔之1% BSA/PBS封閉30分鐘。每孔添加50μL之1：1000初級抗體(抗磷酸CTD Ser2 Abcam，目錄號ab5095-100)在1% BSA/PBS中之稀釋劑，將培養盤密封並在4℃下培育過夜。

第二天，細胞用PBS(100微升/孔)洗滌三次，並在RT下與50微升/孔之在PBS中之二級抗體(1：2000稀釋，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR^TM 488)一起培育1小時。用PBS(100微升/孔)洗滌3次後，每孔添加100μL之50μg/mL RNAase及1：1000碘化丙錠在PBS中之稀釋劑。將培養盤密封並在實驗台上在RT下培育1小時(避光保存)。在Acumen上分析培養盤之FL2(平均強度)及FL3(總強度)。螢光培養盤用ACUMEN EXPLORER^TM[由TTP LABTECH LTD製造之激光掃描螢光微量培養盤細胞計數器]來掃描，以量測絲胺酸2處之抗磷酸羧基端域(pCTD)。影像分析基於用於鑑別陽性細胞之細胞螢光信號。pCTD(S2)陽性細胞藉由在高於臨限值之500-530下之平均強度來鑑定。在來自碘化丙錠/DNA之575-640下之總強度用於鑑定個體細胞。測定輸出為pCTD陽性細胞%。

IC₅₀藉由使用GENE DATA^TM將各輸出之曲線擬合至四參數邏輯斯蒂來確定。實例1及3中所描述之化合物對磷酸CTD(S2)分別顯示出>20μM及3.52μM之相對IC₅₀。此等數據表明實例1及3兩者均不會強力抑制細胞中之CDK9。

基於磷酸-羧基端域(Rbp2)(Ser5)p-CTD(S5)細胞之Acumen測定

HCT116細胞(ATCC CCL-247)在補充有10% FBS、1% NaPyr及1% Pen/Strep之McCoy氏5A Medium Modified培養基中培養，並在96孔平底培養盤中以每孔(其體積為100μL)5,000個細胞之密度來電鍍(在融合成70%之前)。將細胞在細胞培養箱(5% CO₂，95%相對濕度(RH)及37℃)中培育過夜，並使其附著於培養盤上。第二天早上，向細胞投用化合物。化合物抑制劑以60μM溶解於含有0.6% DMSO之培養基中。隨後，在60μM至0.003μM範圍內製備化合物連續稀釋劑(1：3)。藉由自連續稀釋培養盤向與100μL培養基連接之含有細胞之測定培養盤中添加50μL，產生0.2%之最終DMSO濃度且最終化合物濃度劑量範圍在20與0.001μM之間來向細胞投用。對於最大點，使用含有0.2% DMSO之培養基，且對於最小點，使用以0.83μM最終濃度在含有0.2% DMSO之生長培養基中稀釋之參考化合物。在投用化合物之後，細胞培養盤在37℃及5% CO₂下培育4小時。謹慎地移除生長培養基，並藉由在RT下添加100μL之4%對甲醛達30分鐘來固定細胞。細胞用PBS洗滌一次並在RT下與100μL之冷MeOH一起培育15分鐘，以進行細胞滲透。細胞再次用PBS(各100μL)洗滌兩次並在RT下用100微升/孔之1% BSA/PBS封閉30分鐘。每孔添加50μL之1：1000初級抗體(抗磷酸CTD Ser5 Bethyl Laboratories，目錄號A300-655A)在1% BSA/PBS中之稀釋劑，將培養盤密封並在4℃下培育過夜。

第二天，細胞用PBS(100微升/孔)洗滌三次，並在室溫下與50微升/孔之在PBS中之二級抗體(1：2000稀釋，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR^TM 488)一起培育1小時。用PBS(100微升/孔)洗滌3次後，每孔添加100μL之50μg/mL RNAase(Sigma)及1：1000碘化丙錠在PBS中之稀釋劑。將培養盤密封並在實驗台上在RT下培育達1小時(避光保存)。在 Acumen上分析培養盤之FL2(平均強度)及FL3(總強度)。螢光培養盤用ACUMEN EXPLORER^TM[由TTP LABTECH LTD製造之激光掃描螢光微量培養盤細胞計數器]來掃描，以量測絲胺酸5處之抗磷酸羧基端域(pCTD)。影像分析基於用於鑑別陽性細胞之細胞螢光信號。pCTD(S5)陽性細胞藉由在高於臨限值之500-530下之平均強度來鑑定。在來自碘化丙錠/DNA之575-640下之總強度用於鑑定個體細胞。測定輸出為pCTD陽性細胞%。IC₅₀藉由使用GENE DATA^TM將各輸出之曲線擬合至四參數邏輯斯蒂來確定。

實例1及3中所描述之化合物對pCTD Ser5分別顯示出0.148μM及0.198μM之相對IC₅₀。此等數據表明實例1及3兩者均抑制CDK7細胞活性。

基於cMyc細胞之Acumen測定

HCT116細胞(ATCC CCL-247)在補充有10% FBS、1% NaPyr及1% Pen/Strep之McCoy氏5A Medium Modified培養基中培養，並在96孔平底培養盤中以每孔(其體積為100μL)5,000個細胞之密度來電鍍(在融合成70%之前)。然後，將細胞在細胞培養箱(5% CO₂，95%相對濕度(RH)及37℃)中培育過夜，並使其附著於培養盤上。第二天早上向細胞投用化合物。化合物抑制劑以60μM溶解於含有0.6% DMSO之培養基中。隨後，在60μM至0.003μM範圍內製備化合物連續稀釋劑(1：3)。藉由自連續稀釋培養盤向與100μL培養基連接之含有細胞之測定培養盤中添加50μL，產生0.2%之最終DMSO濃度且最終化合物濃度劑量範圍在20μM與0.001μM之間來向細胞投用。對於最大點，使用含有0.2% DMSO之培養基，且對於最小點，使用以0.83μM最終濃度在含有0.2% DMSO 之生長培養基中稀釋之參考化合物。在投用化合物之後，細胞培養盤在37℃及5% CO₂下培育4小時。謹慎地移除生長培養基，並藉由在RT下添加100μL之4%對甲醛達30分鐘來固定細胞。細胞用PBS洗滌一次並在RT下與100μL之冷MeOH一起培育15分鐘，以進行細胞滲透。細胞再次用PBS(各100μL)洗滌兩次，並在RT下用100微升/孔之1% BSA/PBS封閉30分鐘。每孔添加50μL之1：1000初級抗體(抗-c-Myc抗體[Y69]Abcam，目錄號ab32072)在1% BSA/PBS中之稀釋劑，將培養盤密封並在4℃下培育過夜。第二天，細胞用PBS(100微升/孔)洗滌三次，並在RT下與50微升/孔之在PBS中之二級抗體(1：2000稀釋，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR^TM 488)一起培育1小時。用PBS(100微升/孔)洗滌3次後，每孔添加100μL之50μg/mL RNAase及1：1000碘化丙錠(Invitrogene)在PBS中之稀釋劑。將培養盤密封並在實驗台上在RT下培育達1小時(避光保存)。在Acumen上分析培養盤之FL2(平均強度)及FL3(總強度)。螢光培養盤用ACUMEN EXPLORER^TM[由TTP LABTECH LTD製造之激光掃描螢光微量培養盤細胞計數器]來掃描，以量測絲胺酸5處之抗磷酸羧基端域(pCTD)。影像分析基於用於鑑別陽性細胞之細胞螢光信號。pCTD(S5)陽性細胞藉由在高於臨限值之500-530下之平均強度來鑑定。在來自碘化丙錠/DNA之575-640下之總強度用於鑑定個體細胞。測定輸出為pCTD陽性細胞%。IC₅₀藉由使用GENE DATA^TM將各輸出之曲線擬合至四參數邏輯斯蒂來確定。

實例1及3中所描述之化合物對cMyc顯示出0.0828μM及0.0573μM之相對IC₅₀。此等數據表明實例1及3兩者均抑制HCT116細胞中cMyc之轉錄。

選擇性剖析實驗：Proqinase WT輪廓儀

藉由在320種野生型蛋白激酶測定中單獨量測四種濃度下之殘餘活性值來確定化合物之激酶抑制輪廓。在20μM、2μM、0.2μM及0.02μM下單獨測試化合物。所有反應混合液(包括高對照及低對照)中之最終DMSO濃度均為1%。

蛋白激酶測定

輻射量測蛋白激酶測定(33PANQINASE^®活性測定，ProQinase)用於量測320種蛋白激酶之激酶活性。所有激酶測定均在反應體積為50μL之96孔FLASHPLATES^TM中實行。反應混合液按以下次序分4步移液：

1. 10μL之非輻射性ATP溶液(H₂O中)

2. 25μL之測定緩衝劑/[γ-33P]-ATP混合物

3. 5μL在10% DMSO中之測試樣本

4. 10μL之酶/基質混合物

所有蛋白激酶之測定均含有70mM HEPES-NaOH pH 7.5、3mM MgCl₂、3mM MnCl₂、3μM原釩酸鈉、1.2mM DTT、ATP(可變量，對應於各自激酶之表觀ATP-Km，見表1)、[γ-33p]-ATP(每孔約8×1005cpm)、蛋白激酶(可變量；見表1)及基質(可變量；見表1)。所有PKC測定(PKC-mu及PKC-nu測定除外)另外含有1mM CaCl₂、4mM EDTA、5μg/mL磷脂醯絲胺酸及1μg/mL 1,2-二油基-丙三醇。CAMK1D、CAMK2A、CAMK2B、CAMK2D、CAMK2G、CAMK4、CAMKK1、CAMKK2、DAPK2、EEF2K、MYLK、MYLK2及MYLK3測定另外含有1μg/mL調鈣蛋白及0.5mM CaCl₂。PRKG1及PRKG2測定另外含有1μM cGMP。DNA-PK測定另外含有2.5μg/mL DNA。

將蛋白激酶反應混合液在30℃下培育60分鐘。反應用50μL之2%(v/v)H₃PO₄終止，抽吸培養盤且用200μL 0.9%(w/v)NaCl洗滌該培養盤兩次。用微量培養盤閃爍計數器確定33Pi之併入(「cpm」之計數)。所有蛋白激酶測定均用BeckmanCoulter BIOMEK^® 2000/SL機器人系統來實行。所有由ProQinase提供之蛋白激酶均以全長或酶活性片段之形式在Sf9昆蟲細胞或大腸桿菌中表現為重組GST融合蛋白或His標記蛋白。所有激酶均產生自人類cDNA，並藉由GSH親和性層析法或固定金屬來純化。親和性標籤在純化期間自許多激酶中移除。蛋白激酶之純度藉由SDS-PAGE/考馬斯染色法(Coomassie staining)來檢測，特性藉由質譜法來檢驗。來自外部供應商(CAR=Carna Biosciences Inc.；INV=Life Technologies(Invitrogen Corporation^TM)；MIL=Merck Millipore(Millipore Corporation^TM)，見表1)之激酶憑藉供應商讀物來表現、純化及控制品質。用於測定之酶及基質之濃度展示於表1中。

原始數據之評估

對於各激酶，三個孔之cpm之中值定義為「低對照」(n=3)。此值反映在不存在蛋白激酶但存在基質之情況下輻射活性與培養盤之非特異性結合。另外，對於各激酶，其他三個孔之cpm之中值視為「高對照」，即在不存在任何抑制劑之情況下的完全活性(n=3)。各酶之高對照與低對照之間的差值視為100%活性。作為數據評估之部分，自高對照值以及其相應的「化合物值」中減去各激酶之低對照。各化合物孔之殘餘活性(以%為單位)藉由使用下式來計算：殘餘活性(%)=100×[(化合物之信號-低對照)/(高對照-低對照)]。非標準IC₅₀使用與XLFit加載項結合之自定義excel試算表來計算。由於數據點之數量較少，(4)XL-Fit使用其中三個參數被鎖定為固定值之四參數方程式來計算非標準IC₅₀。

方程式為：

A：活性之最小值，亦稱為底部。固定為0

B：活性之最大值，亦稱為頂部。固定為100

C：曲線之拐折點

D：希爾斜率(Hill Slope)。固定為1

Y：因變數(即你量測為信號之物)

X：自變數(即你控制之物，諸如劑量、濃度等)

計算非標準IC₅₀之方式為將隨機值分配給C參數並迭代地重複該分配。然後，該算法量測殘差平方和之差值，並將尋找其中殘差變化收斂之連續迭代。一旦滿足收斂極限，則將該解視為最優解且擬合過程結束。

CDK12及CDK13(ProQinase)本質上如上，但分別在10個濃度(2×10⁵M至6×10¹⁰M)下使用半對數稀釋劑進行測試。對於10個點，分析各濃度之殘餘活性並使用QUATTRO^® WORKFLOW^TM第3.1.1版計算化合物IC₅₀值。IC₅₀確定之擬合模型為「S形反應(可變斜率)」，其中參數「頂部」固定在100%且「底部」固定在0%。所使用之擬合方法為最小二乘擬合。數據展示於下表1中。

此等數據表明實例1之化合物對來自代表性激酶組之CDK7具有很強的選擇性。

細胞增殖測定

表2中之數據表明實例1之化合物抑制指定腫瘤細胞株之增殖及成活力。細胞株以每孔5000個細胞之密度在每孔100μL之生長介質中鍍入白色的96孔細胞培養盤中。細胞株及培養基信息參見表2。培養盤在37℃及5% CO₂下培育。第二天，藉由將化合物以1：3在DMSO中稀釋達10個點來製備測試化合物之連續稀釋劑。DMSO培養盤為最終濃度之1000倍。除了CDK7抑制劑之外，DMSO單獨柱亦被包括為最大生長對照，且10μM星形孢菌素最終柱被包括為最大生長抑制對照。然後，藉由將來自1000× DMSO培養盤之每孔2μL添加至OMEM之每孔198μL(Life Technologies,Carlsbad,CA，目錄號31985-070)來製備10×稀釋培養盤。藉由將來自10× OMEM培養盤之每孔11μL添加至含有每孔100μL生長介質之細胞培養盤中達到1×最終濃度來用所指示的化合物治療細胞。將培養盤放回37℃及5% CO₂下之培養箱中。化合物添加七天後，將培養盤自培養箱中移除並使其平衡至RT。在室溫下解凍CELL TITER GLO^®試劑，且然後藉由將一小瓶測定緩衝劑與一小瓶基質混合並輕輕打旋以混合來製備。然後將CELL TITER GLO^®試劑加入細胞培養盤中，每孔100μL，並在室溫下放置在速度設定為2之Titer Plate Shaker上15分鐘。在振盪器上培育15分鐘後，使用Wallac VICTOR2^TM讀取發光，每孔1秒。使用非線性回歸及S形劑量-反應曲線，利用Graphpad Prism 6軟件來計算半最大抑制濃度(IC₅₀)。

此等數據表明實例1之化合物以劑量依賴型方式抑制來自包括結腸、乳腺、肺、卵巢及胃之多種組織結構的癌細胞株的活體外生長。

異種移植腫瘤模型

此測定之目的在於量測腫瘤體積回應於實例1之化合物之減小。為了評估測試化合物之活體內功效，利用多個異種移植腫瘤模型。簡言之，對於大多數異種移植腫瘤模型，將在1：1 MATRIGEL®混合物中之5-10×10⁶個腫瘤細胞(總體積0.2mL)皮下注射於雌性無胸腺裸鼠(Envigo,Harlan laboratories)體內。利用替代小鼠品系建立MDAMB468(NOD SCID γ,Jackson labs)、CT26及EMT6(BALB/c,Envigo,Harlan Laboratories)異種移植。在允許腫瘤達到所需之~300-500mm³之尺寸後，將動物隨機分為6-8個群組以進行療效研究。測試化合物經由口服管飼(PO)以所指示之劑量及療程來投與。監測隨時間推移之腫瘤生長及體重，以評估療效及毒性體徵。

測試化合物以5%在1%羥乙基纖維素中之N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、0.25%聚山梨醇酯80、0.05%在純化水(HEC)中之防沫劑來調配，並藉由口服管飼(最終體積0.2mL)以表4中所指示之劑量來投與。以週為單位調配一種測試化合物並在4℃下儲存。根據上文使用之排程，使用每劑量0.2mL之體積向對照群組投與媒劑。小鼠經由口服管飼投用且腫瘤樣本在終止時收集並在-80℃下儲存。

每兩週記錄及分析腫瘤尺寸及體重。投用後2小時且在終止時，使用DBS(乾血斑)卡片收集血液。在研究終止時收集腫瘤，切割成3個部分且速凍以進行曝露及蛋白質分析，或置於RNAlater®中以進行RNA分析。將組織樣本冷凍並在-80℃下儲存。

實例1之化合物表明人類癌症異種移植模型(表3)中之顯著的抗腫瘤活性。

在治療群組中之指標腫瘤體積處於或高於基線腫瘤體積時計算△T/C%。公式為100*(T-T0)/(C-C0)。此處，T及C分別為治療群組或對照群組中之平均指標腫瘤體積。T0及C0為彼等群組中之平均基線腫瘤體積。*：顯著性(p<0.05)

生物標記研究

此研究之目的在於評估本發明之化合物之潛在的預測性生物標記。

剖析癌細胞株以評估活體外測試化合物之抗增殖活性。自COSMIC數據庫(cancer.sanger.ac.uk)及cBioportal(http：//www.cbioportal.org/)獲得ARID1A、KMT2C、KMT2D及/或RB1基因在癌細胞株中之突變、複製數及基因表現信息。細胞在生長培養基中培養，並在100微升/孔生長培養基中以5000個細胞/孔電鍍於96孔培養盤中，然後在37℃、5% CO₂下培育過夜。使用供應商推薦之此項技術中所熟知的培養基及條件來培養細胞，例如用含或不含HEPES及L-麩醯胺酸之RPMI 1640(Thermo SH30255.01)及1mM丙酮酸鈉，及10% FBS(Gibco目錄號10082)。藉由製作在DMSO中之10mM測試樣本工作溶液並在DMSO中實行10點之1：3稀釋來製備1000×中間物稀釋培養盤。藉由自1000×中間物稀釋培養盤將2μL加入198μL之OPTIMEM®+10% FBS中並混合孔來製備10×投用培養盤。然後藉由自10×投用培養盤將11μL加入 100微升/孔之細胞培養盤中達1×最終濃度來治療細胞培養盤。星形孢菌素以5μM之最終濃度用作最大生長抑制對照。將細胞培養盤在37℃、5% CO₂下培育7天。治療七天後，自-20℃移除Cell Titer-Glo®(Promega目錄號G7571)測定緩衝劑及基質並使其平衡至RT。向基質中添加測定緩衝劑並輕輕打漩以混合。向細胞培養盤中添加CELL TITER-GLO®試劑(100微升/孔)並在RT下培育15分鐘。15分鐘後，使用培養盤讀取器讀取發光。在Excel中分析數據並將其在GraphPad Prism中進行圖示。使用曼惠特尼非參數t檢定(Mann-Whitney nonparametric t test)、使用GraphPad Prism進行統計分析及p值計算。

增殖數據之總結示於表4中。測試化合物之抗增殖效應被分類為不敏感(IC₅₀

1μM)、細胞生長抑制(IC₅₀<1μM及抑制%<70%)或細胞毒性(IC₅₀<1μM及抑制%

70%)。攜帶ARID1A、KMT2C、KMT2D抑或RB1基因之失活或功能缺失(loss of function，LOF)突變之細胞株與組中的其餘細胞株相比，顯示出對實例1之顯著更強的細胞毒性反應(表5)。相比之下，非LOF細胞株顯示出回應於實例1之更強的細胞生長抑制反應(%)。

此外，利用許多攜帶此等突變之異種移植腫瘤模型以評估實例1作為單一療法之療效(表3)。

療效研究及抗腫瘤活性(△T/C)之總結示於表3中。實例1在多種腫瘤模型中顯示出強大的療效，在含有ARIDIA、KMT2C或RB1基因突變之腫瘤模型中注意到顯著的衰退。綜合而言，此等發現顯示ARID1A、KMT2C、KMT2D或RB1基因之失活突變為用實例1治療多種癌症類型提供潛在的患者選擇策略。

培養基信息：

A. RPMI 1640(Gibco 11835、Gibco 22400-089或Hyclone目錄號SH30027)+10% FBS(Gibco目錄號10082)

B. 含L-麩醯胺酸之DMEM(Thermo目錄號SH30022)+NaPyr+NEAA+HEPES+10% FBS(Gibco目錄號10082)

C. 含HEPES及L-麩醯胺酸之RPMI 1640(Gibco 22400)+1mM丙酮酸鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

D. F-12K培養基(目錄號30-2004)+10% FBS(Gibco目錄號10082)

E. EMEM(CellGro目錄號17-305-CV)+L-麩醯胺酸+丙酮酸鈉+碳酸氫鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

F. EMEM(CellGro目錄號17-305-CV)+L-麩醯胺酸+丙酮酸鈉+碳酸氫鈉+NEAA+10% FBS(Gibco目錄號10082)

G. DMEM(Gibco 11995)+1mM丙酮酸鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

H. DMEM高葡萄糖(Hyclone目錄號SH30022)+10% HI FBS(Gibco目錄號10082)+1× NEAA(Hyclone SH30328)

I. 經ATCC改質之RPMI 1640(Gibco A1049101)+1mM丙酮酸鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

J. McCoy氏5A+10% FBS(Gibco目錄號10082)

K. DMEM(Gibco 11965)+10% FBS

L. 含厄爾氏鹽(Earle's Salt)之MEM Eagle(Gibco 11095-080)+1% NEAA+1% NaPyr+10% FBS(Gibco目錄號10082)

M. 含L-麩醯胺酸及HEPES之RPMI-1640+10%加熱滅活之FBS

N. 含L-麩醯胺酸之DMEM(Thermo目錄號SH30022)+丙酮酸鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

O. MEM(Gibco 11095)+丙酮酸鈉+NEAA+10% FBS(Gibco目錄號10082)

P. 含HEPES及L-麩醯胺酸之RPMI 1640(Thermo SH30255.01或Gibco 11835)+1mM丙酮酸鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

Q. 含2.5mM L-麩醯胺酸、15mM HEPES之DMEM：F12+0.5mM NaPyruv+10% FBS

R. 49% RPMI 1640+49% Ham氏F12+2%加熱滅活之FBS

S. 45% RPMI 1640+45% Ham氏F12+10%加熱滅活之FBS

T. DMEM(Gibco 11965)+1mM丙酮酸鈉+5% FBS(Gibco目錄號10082)

U. Leibovitz氏L15(Gibco目錄號11415-064)+10% FBS(Gibco目錄號10082)，沒有CO₂

V. 含高Glu及L-gln之DMEM+10%加熱滅活之FBS+NaPyr+NEAA+HEPES

W. DMEM：F12(1：1)+ITS+10nM氫皮質酮+10nM β-***+4.5mM L-麩醯胺酸+5% FBS(Gibco目錄號10082)

X. 含L-麩醯胺酸及HEPES之RPMI-1640+10% FBS

Y. 含HEPES及L-麩醯胺酸之RPMI 1640(Gibco 22400)+1mM丙酮酸鈉+NEAA+20% FBS(Gibco目錄號10082)

Z. DMEM+2mM麩醯胺酸+1mM丙酮酸鈉(NaP)+20IU/l牛胰島素+10% FBS(Gibco目錄號10082)

AA. Williams氏E培養基(Gibco目錄號12551)+10% FBS

BB. MEM+10% FBS+NaPyr+NEAA+HEPES+1.5g/L NaHCO₃

CC. McCoy氏5A(Gibco 16600)+15% FBS(Gibco目錄號10082)

DD. 1：1 MEM(11095)：F12(CellGro 10-080-CV)+10% FBS(Gibco目錄號10082)

EE. 含麩醯胺酸及HEPES之RPMI-1640(Hyclone目錄號SH30255)+10% FBS(Gibco目錄號16000)+1× NaPyr

FF. 含L-麩醯胺酸、25mM HEPES之Iscove氏改質之杜爾貝寇氏培養基(Dulbecco's medium)[GIBCO 12440-053]+20% FBS

GG. 含HEPES及L-麩醯胺酸之RPMI 1640(不含酚紅)+1mM丙酮酸鈉+10% FBS(Gibco目錄號10082)

HH. 1：1 Ham氏F12：DMEM+L-麩醯胺酸+5% FBS(Gibco目錄號10082)

II. RPMI-1640(Hyclone目錄號SH30027)+10%加熱滅活之FBS(Gibco目錄號10082)

JJ. 含有最終濃度為1.5g/L之碳酸氫鈉的MCDB 105培養基及含有最終濃度為2.2g/L之碳酸氫鈉+15% FBS的培養基199的1：1混合物

Claims

一種化合物，其具有式(I)
，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其具有式(II)
，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項2之化合物，其具有式(II)
。
如請求項1之化合物，其具有式(III)
，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項4之化合物，其具有式(III)
。
如請求項2之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽。
如請求項2之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物。
如請求項4之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽。
如請求項4之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物。
如請求項2或請求項6之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽。
如請求項10之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽，其中使用2θ±0.2˚之CuKa輻射，X射線粉末繞射圖具有在21.5˚處出現之特徵峰以及選自由12.4˚、17.3˚及15.8˚組成之群的一或多個峰。
如請求項2或請求項7之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶型[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物。
如請求項12之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物，其中使用2θ±0.2˚之CuKa輻射，X射線粉末繞射圖具有在18.5˚處出現之特徵峰以及選自由21.5˚、16.7˚及15.2˚組成之群的一或多個峰。
如請求項4或請求項8之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶型[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯苯磺酸鹽。
如請求項4或請求項9之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其為結晶型[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯半乙二磺酸鹽水合物。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
如請求項16之醫藥組合物，其包含一或多種其他治療劑。
一種如請求項1至15中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用以治療以下各者的藥劑：尿道上皮癌、子宮癌、結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝膽癌、胰腺癌、子宮頸癌、***癌、血液癌、肉瘤、皮膚癌或神經膠質瘤。
如請求項18之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：結直腸癌、乳癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。
如請求項19之用途，其中該癌症為乳癌。
如請求項18至20中任一項之用途，其中該化合物或鹽為[(3S)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項18至20中任一項之用途，其中該化合物或鹽為[(3R)-1-[(E)-4-(二甲胺基)丁-2-烯醯基]吡咯啶-3-基] 4-[(3-異丙基-5-甲基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)胺基]哌啶-1-甲酸酯或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項18至20中任一項之用途，其中該鹽為苯磺酸鹽。
如請求項18至20中任一項之用途，其中該鹽為半乙二磺酸鹽水合物鹽。
如請求項18至20中任一項之用途，其中該治療亦包含使用來自患者之生物樣本實行活體外分析，確定ARID1A 、KMT2C 、KMT2D 及RB1 基因中是否存在至少一種失活突變，且若該等基因中之任一者中存在至少一種失活突變，則向該患者投與治療有效量之該化合物或其鹽。
如請求項25之用途，其中該生物樣本為腫瘤樣本且該樣本藉由基因組/DNA定序來分析。
如請求項25之用途，其中在向該患者第一次投與該化合物或其鹽之前，自該患者獲得該樣本。
如請求項25之用途，其中選擇在該ARID1A 基因中具有至少一種失活突變之患者。
如請求項25之用途，其中選擇在該KMT2C 基因中具有至少一種失活突變之患者。
如請求項25之用途，其中選擇在該KMT2D 基因中具有至少一種失活突變之患者。
如請求項25之用途，其中選擇在該RB1 基因中具有至少一種失活突變之患者。
如請求項25之用途，其中該藥劑用於以約1 mg至2 g之劑量向該患者投與該化合物或其鹽。