TWI675097B - 隔絕層組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種隔絕層組合物及其用途。前述隔絕層組合物包含聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液，其可有效隔絕培養基與汙染源的接觸，並可以改善植物組織培養的培養基乾裂的狀況。因此所述隔絕層組合物可用以作為植物組織培養之隔絕層。

Description

隔絕層組合物及其用途
本發明係關於一種組合物及其用途，特別是關於一種包含聚乙酸乙烯酯乳液樹脂的組合物及其作為植物組織培養隔絕層的用途。
植物組織培養是一種將植物體的部分細胞或組織與母體分離，在適當的條件下加以培養，使它們能夠生長、發育、分化與增殖的技術。原理是來自植物細胞的全能性分化能力，也就是植物體內的某一類細胞，能夠獨立發育並且分化成為完整的植物成體。植物組織培養能夠以少量的母體培養出大量的植物，這使植物組織培養有許多的用途，例如基礎植物學與遺傳學研究，以及農業上的育種與品種保留。
由於微生物的感染是最常見的培養失敗原因，一般進行植物組織培養需要在無菌操作台上進行，並且所有的器具，例如鑷子與培養瓶，都需要經過殺菌或是消毒，以免所要培養的組織受到細菌和真菌的感染。除了器材之外，如果所要培養的植物組織是來自一般室外種植的植株，那麼 這些植物組織也需要以消毒水消毒。操作中所使用的水，也是經過滅菌的蒸餾水。
為確保組織培養瓶內的組織培養植物不受微生物感染，並使組織培養瓶維持在無菌狀態，操作完的組織培養植物通常需密封於組織培養瓶內，以隔絕外界的微生物。然而，植物需要氧與二氧化碳來健全其生長，將組織培養植物限制在有限的密閉空間裡，要使組織培養植物長得健康是很困難的。在植物的生長過程中亦會釋出微量的乙烯，當乙烯累積到一定濃度時將會對植株的生長產生負面的效應，因此在有限的空間裡透氣對組織培養植物相當重要。此外，組織培養瓶在密閉環境中容易累積水氣或水滴而維持一定濕度，成為微生物孳生的適當環境，因此使組織培養瓶中滅菌未完全的微生物得以生長造成組織培養植物的汙染。
本發明之目的是在提供一種可作為植物組織培養之隔絕層的隔絕層組合物，可有效隔絕培養基與汙染源的接觸，並可以改善植物組織培養的培養基乾裂的狀況。
本發明之一態樣在於提供一種隔絕層組合物，其包含聚乙酸乙烯酯乳液樹脂(polyvinyl acetate emulsion resin)、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液，其中所述凝膠形成劑為甘油和聚丙烯酸甘油酯的混合物。
依據前述之隔絕層組合物，其中所述玻尿酸稀釋液的體積百分濃度(V/V)可為1%。
依據前述之隔絕層組合物，其中聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑與玻尿酸稀釋液可以2：1：0.5：0.5至2：2：1：1之重量比例混合。較佳地，聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑與玻尿酸稀釋液可以2：1：0.5：1之重量比例、2：1：0.5：0.5之重量比例或2：1.5：0.7：0.6之重量比例混合。
本發明之另一態樣在於提供一種如前段所述隔絕層組合物的用途，其係作為植物組織培養之隔絕層。
依據前述之隔絕層組合物的用途，其中所述隔絕層可用以隔絕培養基與汙染源的接觸，所述汙染源可為微生物，較佳地，所述微生物可為真菌或細菌。
藉此，本發明的隔絕層組合物可作為植物組織培養的隔絕層，其係覆蓋於植物組織培養的培養基上，隔絕培養基與微生物的接觸，使組織培養植物可以培養在開放性空間中不受到細菌性或真菌性的污染。此外，可避免植物組織培養培養基中的水分因長時間置放於開放空間蒸發而乾裂的現象。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
110‧‧‧實施例1隔絕層組合物
120‧‧‧實施例2隔絕層組合物
130‧‧‧實施例3隔絕層組合物
140‧‧‧實施例4隔絕層組合物
150‧‧‧實施例5隔絕層組合物
160‧‧‧實施例6隔絕層組合物
161、162、163、164、165、166、167、168‧‧‧實施例6隔絕層組合物試驗組
170‧‧‧實施例7隔絕層組合物
171、172、173、174、175、176、177、178、179‧‧‧實施例7隔絕層組合物試驗組
210、220、230‧‧‧對照組
310‧‧‧比較例3隔絕層
311、312、313、314、315、316、317、318、319‧‧‧比較例3試驗組
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係顯示本發明之實施例1隔絕層組合物於第10天的凝固狀況以及實施例5隔絕層組合物和實施例6隔絕層組合物於第4天凝固狀況的結果圖；第2A圖和第2B圖係顯示對照組進行隔絕微生物孳生的測試結果；第3A圖、第3B圖、第3C圖和第3D圖係顯示本發明之一實施方式之實施例6隔絕層組合物進行隔絕微生物孳生的測試結果；第4A圖、第4B圖和第4C圖係顯示本發明之一實施方式之實施例7隔絕層組合物進行隔絕微生物孳生的測試結果；以及第5A圖和第5B圖係顯示比較例3進行隔絕微生物孳生的測試結果。
本發明提供一種隔絕層組合物，其包含聚乙酸乙烯酯乳液樹脂(polyvinyl acetate emulsion resin)、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液，其中所述凝膠形成劑為甘油和聚丙烯酸甘油酯的混合物。較佳地，所述凝膠形成劑可為Hispagel 200，其為Hispano Quimica S.A.公司制造的甘油和聚丙烯酸甘油酯的混合物。所述玻尿酸稀釋液的體積百分濃度(V/V)可為1%。
聚乙酸乙烯樹脂(Polyvinyl acetate resin；PVAc)是由乙酸乙烯單體(Vinyl acetate；VAc)經加成聚合反應(Addition reaction)所得之熱可塑型長鏈狀高分子樹脂，其聚合反應為一自由基聚合反應(Free-radical polymerization)。然由於乙酸乙烯單體僅微溶於水，進一步聚合而形成之聚乙酸乙烯樹脂則不溶於水，因此若欲獲得水系之膠合劑，則須採用乳化聚合之方式使形成樹脂乳液，此反應系統中包含油溶性聚乙酸乙烯樹脂單體、乳化劑(界面活性劑；保護膠體)、反應起始劑及水(分散相)等，以得到聚乙酸乙烯酯乳液樹脂。其固化乃膠合劑之水分蒸發而乾燥硬化成膜，因此使用時無須添加硬化劑即可常溫固化。
依據前述之隔絕層組合物，其中聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑與玻尿酸稀釋液可以2：1：0.5：0.5至2：2：1：1之重量比例混合。較佳地，聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑與玻尿酸稀釋液可以2：1：0.5：1之重量比例、2：1：0.5：0.5之重量比例或2：1.5：0.7：0.6之重量比例混合。
前述之隔絕層組合物因具有良好的隔絕汙染效果，因此可作為植物組織培養之隔絕層。所述隔絕層係覆蓋於植物組織培養的培養基上，可用以隔絕培養基與汙染源的接觸，而汙染源可為微生物，較佳地，微生物可為真菌或細菌。藉此，使組織培養植物可以培養在開放性空間中不受到細菌性或真菌性的污染。
茲以下列具體實施例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
[實施例與比較例] 實施例1-6
如前文所述，本發明旨在於提供一種可作為植物組織培養的隔絕層的隔絕層組合物，所述隔絕層組合物包含聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液。具體地，分別將聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液以表一所示混合比例配製實施例1隔絕層組合物110、實施例2隔絕層組合物120、實施例3隔絕層組合物130、實施例4隔絕層組合物140、實施例5隔絕層組合物150和實施例6隔絕層組合物160。於本試驗例中所使用的凝膠形成劑為Hispagel 200，所使用的玻尿酸稀釋液的體積百分濃度(V/V)為1%。
於第1天配製完後，以配製完成的黏滯性狀態評估各實施例於乾燥後的狀態是否可用以作為植物組織培養的隔絕層。若配製完成後的黏滯性較低，則後續以較長的時間使其凝固。試驗結果可發現實施例1隔絕層組合物110的黏滯性較低，偏向呈現液體狀。而實施例2隔絕層組合物120、實施例3隔絕層組合物130和實施例4隔絕層組合物140的黏滯性則較高，偏向呈現固態而太硬不好操作。而實施例5隔絕層組合物150和實施例6隔絕層組合物160的黏滯性適中，偏向呈現膏狀。兩者相比實施例5隔絕層組合物150的黏滯性小於實施例6隔絕層組合物160。
請參照第1圖，係顯示本發明之實施例1隔絕層組合物於第10天的凝固狀況以及實施例5隔絕層組合物和實施例6隔絕層組合物於第4天凝固狀況的結果圖，而實施例2隔絕層組合物120、實施例3隔絕層組合物130和實施例4隔絕層組合物140的凝固狀況結果未另圖示。凝固結果的判斷方式為將免洗筷***實施例隔絕層組合物中，再拿起筷子後觀察黏附量，以觀察實施例1隔絕層組合物110、實施例5隔絕層組合物150和實施例6隔絕層組合物160凝固後何者黏度較大且傾倒之後較不會任意流動。第1圖的結果顯示，經過10天的凝固時間後，實施例1隔絕層組合物110仍然呈現液體狀。而經過4天的凝固時間後，實施例5隔絕層組合物150和實施例6隔絕層組合物160則呈現膏狀，但實施例5隔絕層組合物150傾倒時仍會緩慢移動，而實施例6隔絕層組合物160則已固化不會任意流動，且可見實施例6隔絕 層組合物160的沾附量明顯大於實施例1隔絕層組合物110和實施例5隔絕層組合物150。後續將以實施例6隔絕層組合物160進行隔絕微生物孳生測試。
進行隔絕微生物孳生測試所使用的培養基為1/2 MS半固體培養基，其採用MS(Murashige and Skoog 1962)基本鹽類配方，但氮的含量為1/2，其中大量元素包含950mg/l的KNO3、440mg/l的CaCl2．2H2O、185mg/l的MgSO4．7H2O和85mg/l的KH2PO4。微量元素包含0.265mg/l的KI、3.1mg/l的H3BO3、11.15mg/l的MnSO4．4H2O、4.3mg/l的ZnSO4．7H2O、0.125mg/l的Na2MoO4．2H2O、0.0125mg/l的CuSO4．5 H2O以及0.0125mg/l的CoCl2．6H2O。鐵鹽有13.9mg/l的FeSO4．7H2O和18.65mg/l的NaEDTA．2 H2O。其他添加物有50mg/l的肌醇(Inositol)、0.25mg/l的菸酸(Nicotinic acid)、0.25mg/l的吡哆醇(Pyridoxin)、0.05mg/l的硫胺(Thiamine-HCL)、1mg/l的甘胺酸(Glycine)等，並添加3%的瓊脂(agarose)。植物材料為十二卷屬(Haworthia)多肉植物無菌苗，所有操作皆在無菌操作台中完成。試驗步驟如下：將植物材料植入培養基中備用，一根玻璃管植入一株植物材料，試驗組共8管。再將聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液以2：1：0.5：0.5的重量比例混合均勻，以製備本發明之隔絕層組合物(實施例6隔絕層組合物160)。再將實施例6隔絕層組合物160倒入試管中，倒入的厚度約0.5公分，使實施例6隔絕層組合物 160充分覆蓋住培養基表面形成隔絕層。再將覆蓋實施例6隔絕層組合物160後的組織培養植物放置開放性空間進行隔絕微生物孳生測試，並於第1天、第30天和第63天拍照，觀察微生物開始孳生的時間。此外，因觀察到於第30天時植物組織培養的培養基和實施例6隔絕層組合物160有乾縮的現象，為使培養基和實施例6隔絕層組合物160維持其厚度，試驗於第30天於各試驗組中加入少量自來水。試驗中另包含對照組，對照組為不加任何抗菌條件的1/2 MS半固體培養基，對照組共3管(對照組210、對照組220和對照組230)，同樣將對照組放置開放性空間進行隔絕微生物孳生測試，觀察微生物開始孳生的時間。
請再參照第2A圖、第2B圖、第3A圖、第3B圖、第3C圖和第3D圖。第2A圖和第2B圖係顯示對照組進行隔絕微生物孳生的測試結果，第2A圖和第2B圖由左至右分別為對照組210、對照組220以及對照組230，其中第2A圖為第1天的測試結果，第2B圖為第4天的測試結果。第3A圖至第3D圖係顯示實施例6隔絕層組合物160試驗組進行隔絕微生物孳生的測試結果，第3A圖至第3D圖由左至右分別為實施例6隔絕層組合物試驗組161、實施例6隔絕層組合物試驗組162、實施例6隔絕層組合物試驗組163、實施例6隔絕層組合物試驗組164、實施例6隔絕層組合物試驗組165、實施例6隔絕層組合物試驗組166、實施例6隔絕層組合物試驗組167以及實施例6隔絕層組合物試驗組168，其中第3A圖為第1天的測試結果，第3B圖為第30天加入自來水前的測試 結果，第3C圖為第30天加入自來水後的測試結果，第3D圖為第63天的測試結果。
由第2B圖的結果顯示，未加入任何抗菌條件的對照組210、對照組220和對照組230在第4天可觀察到發霉的狀況，而依照發霉的狀況，可回推應於第2天至第3天即開始發生黴菌生長的狀況。而由第3B圖至第3D圖的結果顯示，具有隔絕層的實施例6隔絕層組合物試驗組161、實施例6隔絕層組合物試驗組162、實施例6隔絕層組合物試驗組163、實施例6隔絕層組合物試驗組164、實施例6隔絕層組合物試驗組165、實施例6隔絕層組合物試驗組166、實施例6隔絕層組合物試驗組167以及實施例6隔絕層組合物試驗組168，在第30天和第63天仍未見微生物孳生的狀況，顯示本發明之隔絕層組合物可作為植物組織培養的隔絕層，能夠使組織培養植物生長於開放性空間中，並有效地避免細菌性或真菌性的污染。而由第3B圖和第3C圖的結果顯示，加入自來水可以使植物組織培養的培養基恢復原有厚度，但無法使實施例6隔絕層組合物160恢復原有厚度。
實施例7
由前述試驗結果可見以實施例6隔絕層組合物160作為植物組織培養的隔絕層，在試驗進行至第36天至第39天時，培養基會乾縮得非常明顯。推測原因可能為實施例6隔絕層組合物160和培養基因為蒸散作用而使其中水分蒸發，或因為植物的根部吸收掉養分或水分使其水分喪失。因此本試驗例為改善培養基乾縮現象，將聚乙酸乙烯酯乳液 樹脂、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液以2：1.5：0.7：0.6的重量比例混合均勻，以製備本發明之隔絕層組合物(實施例7隔絕層組合物170)，於本試驗例中所使用的凝膠形成劑為Hispagel 200，所使用的玻尿酸稀釋液的體積百分濃度(V/V)為1%。再將配製好的實施例7隔絕層組合物170倒入含有培養基和植物材料的試管中，倒入的厚度約0.5公分，使實施例7隔絕層組合物170充分覆蓋住培養基表面形成隔絕層，試驗組共9管。再將覆蓋實施例7隔絕層組合物170後的組織培養植物放置開放性空間進行隔絕微生物孳生測試，並於第1天、第22天和第43天拍照，觀察微生物開始孳生的時間。
請參照第4A圖、第4B圖和第4C圖，係顯示實施例7隔絕層組合物170進行隔絕微生物孳生的測試結果，第4A圖至第4C圖由左至右分別為實施例7隔絕層組合物試驗組171、實施例7隔絕層組合物試驗組172、實施例7隔絕層組合物試驗組173、實施例7隔絕層組合物試驗組174、實施例7隔絕層組合物試驗組175、實施例7隔絕層組合物試驗組176、實施例7隔絕層組合物試驗組177、實施例7隔絕層組合物試驗組178以及實施例7隔絕層組合物試驗組179，其中第4A圖為第1天的測試結果，第4B圖為第22天的測試結果，第4C圖為第43天的測試結果。第4B圖的結果顯示，具有隔絕層的實施例7隔絕層組合物試驗組171、實施例7隔絕層組合物試驗組172、實施例7隔絕層組合物試驗組173、實施例7隔絕層組合物試驗組174、實施例7隔絕層組合物試驗 組175、實施例7隔絕層組合物試驗組176、實施例7隔絕層組合物試驗組177、實施例7隔絕層組合物試驗組178以及實施例7隔絕層組合物試驗組179，在第22天仍未見微生物孳生的狀況，且培養基僅有略微地降低。而第4C圖的結果顯示，具有隔絕層的實施例7隔絕層組合物試驗組171、實施例7隔絕層組合物試驗組172、實施例7隔絕層組合物試驗組173、實施例7隔絕層組合物試驗組175、實施例7隔絕層組合物試驗組177、實施例7隔絕層組合物試驗組178以及實施例7隔絕層組合物試驗組179，在第43天仍未見微生物孳生的狀況，且培養基雖下降了0.5公分至0.7公分，但未出現培養基乾裂的狀況，其中實施例7隔絕層組合物試驗組175培養基的裂開狀況是為長側芽被撐開而非乾裂。試驗結果顯示本發明之實施例7隔絕層組合物170可作為植物組織培養的隔絕層，能夠使組織培養植物生長於開放性空間中，有效地避免細菌性或真菌性的污染，並可以有效地改善植物組織培養的培養基乾裂的狀況。
比較例
本試驗另以Clorox膠體作為植物組織培養中的隔絕層作為比較例，並進一步進行隔絕微生物孳生測試。Clorox膠體的配製方法為以無菌水配製5%、10%和15%的Clorox(NaOCl)溶液，再分別加入1%的瓊脂形成5% Clorox膠體(比較例1)、10% Clorox膠體(比較例2)和15% Clorox膠體(比較例3)。隔絕微生物孳生測試所使用的培養基為1/2 MS半固體培養基，植物材料為十二卷屬 (Haworthia)多肉植物無菌苗，所有操作皆在無菌操作台中完成。試驗步驟如下：先將1/2 MS半固體培養基倒入滅菌後的試管中，等待1/2 MS半固體培養基凝固之後，分別倒入比較例1、比較例2和比較例3至試管中，倒入的厚度約1~1.5公分，使比較例1、比較例2和比較例3充分覆蓋住培養基表面形成比較例隔絕層310。待Clorox膠體凝固後2天將植物材料植入，一根玻璃管一株植物材料，每組試驗組共9管。再將覆蓋比較例1、比較例2和比較例3後的組織培養植物放置開放性空間進行隔絕微生物孳生測試，並於第1天和第28天拍照，觀察微生物開始孳生的時間。
以比較例1和比較例2作為隔絕層的組織培養植物分別於試驗第3天和第4天即開始出現微生物孳生的狀況。而以比較例3作為隔絕層的組織培養植物，在試驗第10天發現有3管組織培養植物出現微生物孳生的狀況，在試驗第12天發現有6管組織培養植物出現微生物孳生的狀況，在試驗第15天發現有8管組織培養植物出現微生物孳生的狀況。並請參照第5A圖和第5B圖，係顯示比較例3進行隔絕微生物孳生的測試結果(9管中的6管)，其中第5A圖為第1天的測試結果，第5A圖由左至右分別為比較例3試驗組311、比較例3試驗組312、比較例3試驗組313、比較例3試驗組314、比較例3試驗組315、比較例3試驗組316、比較例3試驗組317、比較例3試驗組318以及比較例3試驗組319。第5B圖為第28天的測試結果，第5B圖由左至右分別為比較例3試驗組315、比較例3試驗組316、比較例3試驗 組317、比較例3試驗組313、比較例3試驗組314以及比較例3試驗組319。在試驗第28天，比較例3試驗組315、比較例3試驗組316、比較例3試驗組317、比較例3試驗組313、比較例3試驗組314以及比較例3試驗組319有嚴重的微生物污染狀況，可見以植物組織培養常用的消毒劑-Clorox作為隔絕層仍無法有效抑制微生物孳生。
綜上所述，本發明之隔絕層組合物包含聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、水、凝膠形成劑和玻尿酸稀釋液，其可作為植物組織培養的隔絕層，將其覆蓋於植物組織培養的培養基上，可以有效隔絕培養基與微生物的接觸，使組織培養植物可以培養在開放性空間中不受到細菌性或真菌性的污染，且不受微生物污染的時間可長達63天。此外，本發明之隔絕層組合物亦可以改善植物組織培養的培養基於長期放置於開放空間時，因為蒸散作用或植物根並吸收水分或養分而使其乾裂的狀況。因此本發明所揭示之隔絕層組合物具有應用於植物組織培養之潛能。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (8)

  1. 一種隔絕層組合物，其中該隔絕層組合物係由聚乙酸乙烯酯乳液樹脂(polyvinyl acetate emulsion resin)、水、一凝膠形成劑和一玻尿酸稀釋液所組成，其中該凝膠形成劑為甘油和聚丙烯酸甘油酯的混合物，該玻尿酸稀釋液的體積百分濃度(V/V)為1%，且該聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、該水、該凝膠形成劑與該玻尿酸稀釋液係以2：1：0.5：0.5至2：2：1：1之重量比例混合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的隔絕層組合物，其中該聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、該水、該凝膠形成劑與該玻尿酸稀釋液係以2：1：0.5：1之重量比例混合。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的隔絕層組合物，其中該聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、該水、該凝膠形成劑與該玻尿酸稀釋液係以2：1：0.5：0.5之重量比例混合。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的隔絕層組合物，其中該聚乙酸乙烯酯乳液樹脂、該水、該凝膠形成劑與該玻尿酸稀釋液係以2：1.5：0.7：0.6之重量比例混合。
  5. 一種如申請專利範圍第1項所述的隔絕層組合物之用途，其係作為一植物組織培養之一隔絕層。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的隔絕層組合物之用途，其中該隔絕層用以隔絕一培養基與一汙染源的接觸。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的隔絕層組合物之用途，其中該汙染源為一微生物。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的隔絕層組合物之用途，其中該微生物為一真菌或一細菌。
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