TWI666321B

TWI666321B - 用於癌症治療的溶瘤性單純皰疹病毒（ｏＨＳＶ）專性載體及其建構體的建構

Info

Publication number: TWI666321B
Application number: TW106136397A
Authority: TW
Inventors: 周國瑛; 陳曉慶; 劉賢杰
Original assignee: 大陸商深圳市亦諾微醫藥科技有限公司
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2019-07-21
Also published as: TW201917210A

Abstract

本發明提供了包含修飾的病毒DNA基因組的專性oHSV載體。本發明還提供了包含專性oHSV載體和編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源核酸序列的重組oHSV-1建構體。本發明的包含重組oHSV-1建構體的組合物可用於治療癌症。

Description

用於癌症治療的溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)專性載體及其建構體的建構

本發明大體上涉及使用溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)治療癌症。具體地，本發明涉及專性(obligate)HSV載體的製備，該載體可攜帶並表現多個編碼免疫共刺激分子和/或免疫治療劑的基因。本發明還涉及一種創新設計的基因組，其能夠作為用來攜帶和表現治療癌症的多種治療基因的載體。

溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)正被廣泛地進行實質固態瘤治療的研究。溶瘤性單純皰疹病毒在整體上相比傳統癌症療法有很多優點(Markert et al.,2000；Russell et al.,2012；Shen and Nemunaitis,2006)。具體而言，oHSV通常包含突變以使它們易受先天性免疫的抑制。因而，它們能夠在癌細胞中複製，而不能在正常細胞中複製，因為在這些癌細胞中，一種或多種對感染的先天免疫反應受損害，而在正常細胞中這些免疫反應是完整的。oHSV通常被直接遞送到腫瘤實體中，病毒可以在腫瘤實體中複製。因為病毒被遞送至靶組織而不是全身性地給藥，所以這種抗癌藥不會產生任何副作用。病毒的一個特徵是能夠誘導適應性免疫反應，這導致它們不能被多次給藥。oHSV已被多次給藥至腫瘤，但沒有證據顯示它們的效力喪失或誘導出副作用(如炎症反應)。HSV是大的DNA病毒，其能夠將外源DNA加入到它們的基因組中並在給藥至腫瘤後調節這些基因的表現。適合與oHSV一起使用的外源基因是那些能夠幫助對腫瘤誘導出適應性免疫反應的基因。

克服細胞先天免疫響應的缺陷決定了該病毒作為抗癌劑能夠溶瘤的腫瘤範圍。缺失的序列越多，能夠被治療的癌細胞的範圍就越窄，oHSV的有效性取決於被缺失的病毒基因的功能。大多數新近的oHSV加入了至少一個細胞基因以支持其抗癌活性(Cheema et al.,2013；Goshima et al.,2014；Markert et al.,2012；Walker et al.,2011)。

將oHSV的結構(稱為骨架)和適合***的外源基因單獨考慮便於進行研究。如上所述，骨架的結構決定了易感癌症的範圍。外源基因導致宿主將癌細胞視為適應性免疫反應的合法標靶。

HSV-1基因組由兩個共價連接的成分組成，分別為L和S。每個成分由特有序列(L成分為UL，S成分為US)構成，特有序列的兩側為反向重複序列。L成分的反向重複序列稱為ab和b’a’。S成分的反向重複序列稱為a’c’和ca。反向重複序列b’a’和a’c’構成內部反向重複區。已知L和S成分的反向重複區包含兩份拷貝的五種基因和大量的轉錄但不編碼蛋白質的DNA，這五種基因分別編碼蛋白質ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和OFR O。

現有在癌症患者中測試的病毒分為三大類別。第一種是基於ICP34.5基因的缺失使病毒毒性顯著減弱的發現而設計的((Andreansky et al.,1997；Chou et al.,1995；Chou et al.,1990；Chou and Roizman,1992)。為了確保用於治療惡性膠質瘤的安全性，G207(首個在患者中測試的病毒)通過在編碼病毒核糖核苷酸還原酶的基因中進行進一步突變而被減毒(Mineta et al.,1995)。但是，攜帶ICP34.5突變和核糖核苷酸還原酶基因突變的G207的毒性太弱，在表現野生型蛋白激酶R的癌細胞中完全停止複製(Smith et al.,2006)。

第二種設計是基於下述事實進行的：如果Us11病毒蛋白在感染早期表現，那麼它會部分補償ICP34.5缺失帶來的後果並恢復在表現野生型蛋白激酶R的細胞中生長的能力(Cassady et al.,1998a)。這種病毒的骨架設計遵循Cassady(Cassady et al.,1998b)公開的結果，其Us12基因和Us11的啟動子被刪除。因此，Us11作為立即早期基因(而不是作為晚期基因)被表現。

第三類病毒的骨架最初稱為R7020，後更名為NV1020，它是經自發突變修飾形成的，最初被用作減毒病毒活疫苗來測試的(Meignier et al.,1988；Weichselbaum et al.,2012)。該突變缺少內部反向重複區(由b’a’和a’c’構成，編碼一個拷貝的基因ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O)和編碼UL56和UL24的基因。此外，它具有細菌性序列，並且因為它原先預期用作疫苗，所以還包含編碼幾種HSV-2糖蛋白的基因。R7020在結腸癌的肝轉移病人中進行了大量的測試。此外，它還在頭頸上皮鱗狀細胞癌、無胸腺裸鼠***癌異種移植物和膽囊腫瘤模型中進行了測試(Cozzi et al.,2002；Cozzi et al.,2001；Currier et al.,2005；Fong et al.,2009；Geevarghese et al.,2010；Kelly et al.,2008；Kemeny et al.,2006；Wong et al.,2001)。

oHSV療法的成功取決於對癌細胞的破壞程度。在oHSV療法的早期開發過程中就意識到，HSV無法單獨殺死實質固態瘤中的所有癌細胞，oHSV治療不太可能可以有效地消除所有癌細胞，在臨床試驗中，oHSV對腫瘤的破壞必須包括對腫瘤的適應性免疫反應。進一步的研究顯示，由受感染的腫瘤細胞碎片引起的抗腫瘤免疫反應可通過加入細胞激素而被放大。無細胞激素基因的oHSV與加入免疫刺激性細胞激素的oHSV的比較結果證實了這種猜想(Andreanski et al.)並且最終導致將GM-CSF加入到oHSV中，用於治療黑素瘤(Andtbacka et al.,2015)。

oHSV的安全性取決於使病毒的一個或多個阻斷宿主對感染的先天性免疫反應的功能失活的基因的缺失情況。對公開資料的分析表明，迄今為止的臨床試驗中的oHSV都被過度減毒並且可以被改善(Miest and Cattaneo,2014)。

加入編碼免疫刺激性細胞激素的基因可增強對腫瘤的免疫反應，但不會有效地增強由T細胞導致的細胞毒殺作用，後者對於抗腫瘤作用至關重要。腫瘤通過PD-1和CTLA-4抑制途徑來使免疫系統沉默。PD-1在活化的T細胞上以及其他造血細胞上表現，而CTLA-4表現於活化的T細胞，包括調節性T細胞(Fife and Pauken,2011；Francisco et al.,2010；Keir et al.,2008；Krummel and Allison,1995；Walunas et al.,1994)。腫瘤使用PD-1和CTLA-4抑制途徑來逃避宿主免疫反應。為使抗腫瘤回應最大化，通過PD-1抗體來中和PD-1，在某些情況下中和存在於T細胞表面的CTLA4來活化殺手T細胞是必要的(Topalian et al.,2015)。雖然系統性給予抗PD-1或CTLA4的單鏈抗體可有效增強oHSV的療效，但這常常伴隨副作用並且無法長期多次給藥。

因此，臨床上急迫需要開發出一種安全且更加有效的oHSV並將其與免疫治療劑結合使用。

本文的一個方面涉及修飾的I型單純皰疹病毒(下文也稱為HSV-1、專性載體、載體、HSV-1病毒)，其包含修飾的HSV-1基因組。該修飾包含缺失野生型HSV-1基因組的UL56基因的啟動子至US1的啟動子之間的序列，使得(i)所有雙拷貝基因的一個拷貝被缺失，並且(ii)用於表現所述缺失後的病毒DNA中存在的所有開放閱讀框(open reading frame，ORF)所需的序列是完整的。

本文的另一個方面提供一種溶瘤I型單純皰疹病毒(HSV-1)建構體，其包含(i)用於表現病毒基因組中所有單拷貝開放閱讀框所需的序列；(ii)病毒基因組中所有雙拷貝基因中每一個的單拷貝；和(iii)編碼非編碼RNA的重複DNA(duplicated DNA)中的單拷貝。

本文的另一個方面涉及一種重組溶瘤I型單純皰疹病毒(HSV-1)，其包含(a)經修飾的HSV-1基因組，其中所述修飾包含在野生型HSV-1基因組的UL56基因的啟動子與US1基因的啟動子之間的序列缺失，使得(i)所有雙拷貝基因的一個拷貝被缺失，並且(ii)用於表現所述缺失後的病毒DNA中存在的所有開放閱讀框(open reading frame，ORF)所需的序列是完整的；以及(b)編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被穩定地加入到至少是所述經修飾的HSV-1基因組的被缺失的區域。

本文的另一個方面是一種病毒載體，其包含所有開放閱讀框 (即UL1至UL56以及US1至US12)的單拷貝並且包含位於基因組末端的“a”序列，所述病毒載體是一種專性載體，即它自身無法在高度易感的Vero細胞中複製。在***包含(a)細胞DNA編碼序列或非編碼序列或(b)含非編碼序列的病毒DNA的DNA之後，所述載體能夠複製。該專性載體能夠耐受的總DNA長度為至少15KB或高達22KB。

本文的另一個方面涉及一種藥物組合物，其包含有效量的本文的重組溶瘤HSV-1以及藥學上可接受的載體。該組合物可被配製成用於瘤內施用。

本文的另一個方面涉及一種治療癌症的方法，所述方法包括向有需要的物件施用有效量的本發明所述的重組溶瘤HSV-1或所述藥物組合物。此外，本發明還涉及所述重組溶瘤HSV-1在治療癌症的方法中的應用。

本發明的再一個方面涉及所述重組溶瘤HSV-1或藥物組合物在製備治療抗癌藥物中的應用。

本方面的這些方面和優點以及其它方面和其他優點可從下面參考附圖的詳細描述中明顯看出。

圖1. HSV-1病毒的示意圖。HSV-1，野生型HSV-1基因組結構，顯示在bp117005和bp132096之間的內部反向重複區b’a’-a’c’；IMMV201，oHSV-1基因組結構，也稱為專性載體；IMMV202，表現鼠IL 12的oHSV-1；IMMV203，表現IL 12的oHSV-1；IMMV303，表現人CTLA-4 scFv的oHSV-1；IMMV403，表現人PD-1 scFv的oHSV-1。

圖2. 基於專性載體的溶瘤HSV-1病毒的示意圖，其表現免疫刺激劑和/或免疫治療劑。IMMV502，表現人抗PD-1 scFv和鼠IL 12的oHSV-1；IMMV504，表現鼠抗CTLA-4 scFv和鼠IL 12的oHSV-1；IMMV503，表現人抗PD-1 scFv和人IL 12的oHSV-1；IMMV505，表現人抗CTLA-4 scFv和人IL 12的oHSV-1；IMMV507，表現人抗CTLA-4 scFv和人抗PD-1 scFv的oHSV-1；IMMV603，表現人抗CTLA-4 scFv、人抗PD-1 scFv和人IL 12的oHSV-1。

圖3. 抗PD-1 scFv從分泌測試建構體中的表現。具有His標籤的scFv-抗-PD-1在CMV啟動子的驅動下與來自不同天然來源的信號肽編碼區一起表現。收集細胞裂解液和上清液，進行SDS-PAGE，並用抗His抗體印跡。泳道1，GM-CSF信號肽；泳道2，Gaussia螢光素酶信號肽；泳道3，Hidden Markov Model 38(HMM38)信號肽；泳道4，抗體V基因信號肽。

圖4. 靶向PD-1的scFv-抗-PD-1的親和試驗。CMV啟動子驅動的帶His標籤的scFv-抗-PD-1與HMM38信號肽的ELISA試驗。收集上清液進行ELISA試驗，通過抗His抗體檢測。

圖5. 體外細胞生長存活率試驗。(a)T24，人膀胱癌細胞；(b)ECA109，人食管癌細胞；(c)CNE1，人鼻咽癌細胞；(d)HCT116，人結腸癌細胞；(e)Hep2，人喉癌細胞；(f)MD-MB-231，人書腺癌細胞；(g)Hela，人上皮腺癌細胞；(h)A549，人肺癌上皮細胞；(i)H460，人非小細胞肺癌細胞。

定義

要注意的是，術語“一”或“一個”實體是指該實體中的一個或多個；例如，“重組溶瘤HSV-1”被理解為表示一個或多個重組溶瘤HSV-1病毒。因此，術語“一個”、“一個或多個”和“至少一個”可以在本文中互換使用。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。可以通過比較每個序列中可以比對的位置來確定同源性。當比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸佔據時，那麼分子在該位置是同源的。序列之間的同源程度與序列共有的匹配或同源位置的數目相關。“不相關的”或“非同源的”序列與本文的其中一個序列共用小於40%的同一性，優選小於25%的同一性。

一個多核苷酸或多核苷酸區域與另一個序列具有特定百分數(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的“序列同一性”是指，當比對時，在比較兩個序列時該百分比的堿基(或氨基酸)是相同的。該比對和百分比同源性或序列同一性可以使用本領域已知的軟體程式來確定。

如本文所用，“抗體”或“抗原結合多肽”是指特異性識別並結合一種或多種抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整抗體及其任何抗原結合片段或其單鏈。因此，術語“抗體”包括任何具有抗原結合生物學活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的蛋白質或肽。這樣的實例包括，但不限於，重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)或其配體結合部分，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恒定區，框架(FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。術語抗體還包括在啟動時具有抗原結合能力的多肽或多肽複合物。

如本文所用，術語“抗體片段”或“抗原結合片段”是抗體的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等等。不管結構如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合。術語“抗體片段”包括適體、鏡像異構體和雙抗體。術語“抗體片段”還包括通過與特定抗原結合形成複合物而起到類似抗體的作用的任何合成的或基因工程化的蛋白質。

本文的抗體、抗原結合多肽或其變體或衍生物包括，但不限於，多克隆、單克隆、多特異性、人源、人源化、靈長類化或嵌合的抗體、單鏈抗體、表位結合片段(例如Fab、Fab'及F(ab')2)、Fd、Fv、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、包含VK或VH結構域的片段、由Fab表現文庫產生的片段以及抗獨特型(抗-Id)抗體。本文的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。

“特異性結合”或“具有特異性”通常是指抗體經由其抗原結合結構域與表位元結合，並且該結合需要抗原結合結構域和表位元之間的一些互補性。根據該定義，當抗體通過其抗原結合結構域結合至表位元比結合至隨機的、不相關的表位時更容易時，則該抗體被認為與表位“特異性結合”。術語“特異性”在本文中用於定量某種抗體與某個表位結合的相對親和力。例如，可以認為抗體“A”對給定表位具有比抗體“B”更高的特異性，或者抗體“A”可被描述為相比於結合相關表位“D”以更高的特異性結合表位“C”。

如本文所用，如本文中可互換使用的“癌症”或“腫瘤”是指可根據本公開內容治療並涉及異常細胞生長的一組疾病，其可能侵入或擴散至身體。並非所有的腫瘤都是癌性的；良性腫瘤不會擴散到身體的其他部位。可能的體征和症狀包括：新的腫塊、不正常的出血、長時間的咳嗽、不明原因的體重減輕和排便改變等等。有超過100種不同的已知癌症影響人類。本公開內容優選適用於實質固態瘤。腫瘤或癌症的非限制性實例包括膽囊癌、基底細胞瘤、肝外膽管癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤因肉瘤、***癌、胃癌、神經膠質瘤、肝細胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、間皮瘤、胰腺癌、直腸癌、腎癌、甲狀腺癌、惡性周圍神經細胞腫瘤、惡性外周神經鞘瘤(MPNST)、皮膚和叢狀神經纖維瘤、平滑肌瘤樣瘤、纖維瘤、子宮肌瘤、平滑肌肉瘤、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀腺未分化癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺濾泡癌，hurthle細胞癌、甲狀腺癌、腹水、惡性腹水、間皮瘤、唾液腺腫瘤、唾液腺粘液表皮樣癌、唾液腺腺泡細胞癌、胃腸道基質腫瘤(GIST)、導致身體潛在空間積液的腫瘤、胸腔積液、心包積液、腹膜積液、巨細胞瘤(GCT)、骨GCT、色素沉著絨毛結節性滑膜炎(PVNS)、腱鞘巨細胞瘤(TGCT)、腱鞘的TCGT(TGCT-TS)和其他肉瘤。在優選的實施方式中，本發明用於治療食管癌、肺癌、***癌或膀胱癌。

如本文所用，術語“治療”是指治療性治療和預防性措施，目的是預防或減緩(減輕)不希望的生理變化或紊亂，例如癌症的進展。有益的或期望的臨床結果包括，但不限於，緩解症狀、減少疾病程度、穩定(即不惡化)疾病狀態、延緩或減緩疾病進展、改善或緩解疾病狀態、以及症狀消失(無論是部分還是全部)，無論是可檢測的還是無法檢測的。“治療”也意味著與不接受治療時所預期的生存期相比延長生存期。需要治療的病人包括那些已經患有疾病或病症的人，以及那些容易患有疾病或病症的人，或那些預防疾病或病症的人。

“物件”或“個體”或“動物”或“患者”或“哺乳動物”是指期望進行診斷、預後或治療的任何物件，特別是哺乳動物物件。哺乳動物物件包括人、家畜、農場動物和動物園動物、競技動物或寵物，如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。

如本文所使用的，諸如“需要治療的患者”或“需要治療的物件”等短語包括受益於施用本公開的用於例如檢測、診斷程式和/或治療的抗體或組合物的物件，例如哺乳動物物件。

本領域普通技術人員還應該理解，可以修飾如本文所公開的修飾的基因組，使得它們在核苷酸序列上與它們所衍生出的修飾的多核苷酸不同。例如，從指定的DNA序列衍生的多核苷酸或核苷酸序列可以是相似的，例如與起始序列具有一定的百分比同一性，例如它可以與起始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。

此外，可以進行核苷酸或氨基酸取代、缺失或***，以在“非必需”區域進行保守取代或改變。例如，衍生自指定蛋白質的多肽或氨基酸序列，除了一個或多個單獨的氨基酸取代、***或缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多個單個氨基酸取代、***或缺失)之外，其餘部分可以與起始序列相同。在某些實施方案中，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相對於起始序列具有1至5個、1至10個、1至15個或1至20個單獨的氨基酸取代、***或缺失。

抗體可通過將其偶聯至化學發光化合物而被可檢測地標記。然後通過檢測在化學反應過程中出現的發光的存在來確定化學發光標記的抗原結合多肽的存在。特別有用的化學發光標記化合物的實例是魯米諾、異魯米諾、芳香吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。

經修飾的HSV-1專性載體

一方面，本發明提供了包含修飾的HSV-1基因組的HSV-1病毒，也稱為HSV-1專性載體。HSV-1基因組由兩個共價連接的組分(稱為L和S)組成。每個組分由獨特序列組成(L組分為UL，S組分為US)，兩側是反向重複序列。L組分的反向重複序列稱為ab和b'a'。S組分的反向重複序列稱為a'c'和ca。反向重複區含有雙拷貝的轉錄單元。本領域已知有至少5個具有雙拷貝的開放閱讀框，其蛋白分別被命名為ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O。反向重複序列b'a'和a'c'(b'a'-a'c')結合形成內部反向重複區。相對地，反向重複序列ab和ca在本文中被稱為外部重複區。

在本發明的一個實施方式中，所述修飾包含野生型HSV-1基因組的UL56基因的啟動子和US1基因的啟動子之間的序列缺失。實際上，所缺失的序列包括：(a)編碼至少5種蛋白(ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF-O及ORF-P)的轉錄單元的單拷貝，保留所有其他開放閱讀框；(b)整體被包含在b’a’-a’c’序列內的轉錄單元；(c)開始於獨特區域但延伸至所缺失的區域的轉錄單元。

在本文中，以精確的方式進行所述缺失，以確保缺失後病毒DNA中所有存在的開放閱讀框(open reading frame，ORF)的表現所需的序列是完整的。在這種情況下，“所有存在的開放閱讀框的表現所需的序列” 包括ORF本身和表現每個ORF所需的調節序列(例如啟動子和增強子)，以確保ORF的表現是成功的，並且所翻譯的蛋白質是功能性的。“完整”意味著如此定義的序列至少是功能性的，但並不意味著序列必須與天然存在的序列100%相同。通過在“非必需”區域包含例如保守性取代或變化，該序列可以與天然存在的序列相比具有核苷酸序列的稍微變化。在這種情況下，該序列可以與天然存在的序列具有90%、95%、98%或99%的同一性。

本領域技術人員將會理解，本發明的被缺失的核苷酸的確切起始位置和終止位置取決於HSV-1病毒的菌株和基因組異構體，並且可以容易地通過本領域已知的技術確定。應該理解的是，本公開內容並非意在限於任何特定的基因組異構體或HSV-1病毒的毒株。在一個實施方案中，缺失導致基因組中核苷酸117005至132096的切除。本領域技術人員還將理解，其他菌株也可用于本發明，只要其基因組DNA被測序。測序技術很容易在文獻和市場上獲得。例如，在另一個實施方案中，可以在HSV-1毒株17上進行缺失，其基因組可以通過GenBank登錄號NC_001806.2獲得。在另一個實施方案中，可以在KOS 1.1毒株上進行缺失，其基因組可以通過GenBank登錄號KT899744獲得。在又一個實施方案中，可以在毒株F上進行缺失，其基因組可以通過GenBank登錄號GU734771.1獲得。

在一些實施方案中，在預定位置處精確地進行缺失，從而將從L組分中的最後一個已知基因(例如UL56)的啟動子開始到S組分中第一個已知基因(如US1)的啟動子序列結束的一段DNA片段切除。這樣，UL組分中的UL1到UL56基因和US組分中US1到US12的所有ORF以及這些ORF表現所需的序列都是完整的。所述精確切除以及缺失之後病毒DNA中所有存在的開放閱讀框(open reading frame，ORF)的表現所需的序列的保留具有諸多優點。“保留”是指修飾的載體包含獨特序列(UL和US)中的所有基因以及所有雙拷貝基因(例如ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因)的僅一個拷貝。應當指出，大部分被缺失的序列不編碼蛋白質，而是佔據在所缺失的區域中的重複的非編碼序列(例如，ICP0的內含子、LAT結構域、“a”序列等)。本發明的專性載體也意在包括所述重複的非編碼序列的僅一個拷貝。

所有ORF的保留提供了更強健的病毒，無論是在***外源基因之前或之後，即最大程度上抵抗諸如溫度、壓力、UV光等的環境因素。它還使得所述溶瘤HSV-1的抗癌範圍最大化。

本領域已知的各種基因操作方法可以被用來獲得如本公開所述的修飾的HSV-1載體。例如，使用細菌人工染色體(BAC)技術。參見例如Horsburgh BC,Hubinette MM,Qiang D,et al.Allele replacement：an application that permits rapid manipulation of herpes simplex virus type 1 genome.Gene Ther,1999,6(5)：922-30。作為另一個例子，COS質粒可以用於本發明。參見例如van Zijl M.,Quint W,Briaire J,et al.Regeneration of herpes viruses from molecularly cloned subgenomic fragments.J Virol,1988,62(6)：2191-5。

本文描述的建構體的一個關鍵特性是它充當專性載體。適用於這種建構體的定義是它們不在易感細胞中繁殖，而是在***病毒或細胞DNA序列之後進行繁殖，因此作為***到載體序列中的基因的表現的載體。

重組溶瘤HSV-1病毒

可被***到野生型病毒中的外源DNA序列的量是有限的，因為它干擾了DNA包裝成病毒粒子。在指定區域中的精確缺失為外源DNA序列的***提供了理想的空間。根據本公開的一個實施方案，所述缺失去除了溶瘤病毒載體的至少15Kbp，使得可以容納相似量的外源DNA序列。其他研究表明，野生型基因組可再耐受7KB的DNA。

因此，另一方面，本公開內容提供了重組溶瘤性1型單純皰疹病毒(HSV-1)，其包含(a)經修飾的HSV-1基因組，其中所述修飾包含在野生型HSV-1基因組的UL56基因的啟動子與US1基因的啟動子之間的序列缺失，使得(i)所有雙拷貝基因的一個拷貝被缺失，並且(ii)用於表現所述缺失後的病毒DNA中存在的所有開放閱讀框(open reading frame，ORF)所需的序列是完整的；以及(b)編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被穩定地加入到至少是所述經修飾的HSV-1基因組的被缺失的區域。

在一個實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼免疫刺激劑的外源性核酸序列。在一些實施方案中，所述免疫刺激劑選自GM-CSF、IL 2、IL 5、IL 12、IL 15、IL 24和IL 27。在一個實施方案中，所述免疫刺激劑是IL 12。在一個實施方案中，所述免疫刺激劑是人IL 12或人源化的IL 12。在一個實施方案中，所述免疫刺激劑是鼠IL 12。在另一個實施方案中，所述免疫刺激劑是IL 15。

在一個實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼免疫治療劑的外源性核酸序列。在一些實施方案中，所述免疫治療劑選自抗PD-1劑和抗CTLA-4劑。在一個實施方案中，所述免疫治療劑是抗PD-1劑。在另一個實施方案中，所述免疫治療劑是抗CTLA-4劑。

當只有一個編碼免疫刺激劑或免疫治療劑的外源性核酸序列被***時，該外源性核酸序列優選被整合到基因組的被缺失的區域中。在一個實施方案中，該外源性核酸序列具有與被缺失的區域相似的長度。在一個實施方案中，該外源性核酸序列的長度比被缺失的區域的長度長或短20%。在另一個實施方案中，該外源性核酸序列的長度比被缺失的區域長或短15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。

在一個實施方案中，該外源性核酸序列具有小於約18Kbp、約17Kbp或約16Kbp的長度。在一個實施方案中，該外源性核酸序列具有大於約10Kbp、11Kbp、12Kbp、13Kbp或14Kbp的長度。在一個實施方案中，該外源性核酸序列的長度在約14Kbp至約16Kbp之間。在一個實施方案中，該外源性核酸序列具有約15Kbp的長度。

在一些實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含至少兩種編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源性核酸序列。在一些實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼兩種不同免疫刺激劑的外源性核酸序列。例如，在一個實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL-12和GM-CSF的外源性核酸序列。在另一個實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL-15和GM-CSF的外源性核酸序列。在另一個實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL12和IL15的外源性核酸序列。

在一些實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼兩種不同免疫治療劑的外源性核酸序列。在一個實施方案中，例如，重組溶瘤性HSV-1包含編碼抗PD-1劑和抗CTLA-4劑的外源性核酸序列。

在一些實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼三種不同免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源性核酸序列。例如，在一個實施方案中，重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL12、抗-CTLA4劑和抗PD-1劑的外源性核酸序列。

當引入多於一種的編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源性核酸序列時，優選將第一外源性核酸序列***到基因組的缺失區域中。第二個或另外的外源性核酸序列可被***到基因組的L組分中。在一個實施方案中，將第二外源性核酸序列***L組分的UL3和UL4基因之間。在一個實施方案中，將第二外源性核酸序列***在L組分的UL37和UL38基因之間。

在一個實施方案中，將第一外源性核酸序列***基因組的缺失區域，並將第二外源性核酸序列***UL3和UL4基因之間。在一個實施方案中，將第一外源性核酸序列***到基因組的缺失的內部反向重複區中，並將第二外源性核酸序列***L組分的UL37和UL38基因之間。在一個實施方案中，將第一外源性核酸序列***到基因組的缺失的內部反向重複區中，將第二外源性核酸序列***UL3基因和UL4基因之間，並將第三外源性核酸序列***到L組分的UL37基因和UL38基因之間。

在一個實施方案中，第一外源核酸序列編碼IL 12。在一個實施方案中，第二外源核酸序列編碼抗-CTLA4劑或抗PD-1劑。在一個實施方案中，第三種外源核酸序列編碼抗PD-1劑或抗CTLA4劑。

可以理解的是，將一個或多個外源核酸序列***到溶瘤HSV-1基因組中並不干擾天然HSV-1基因的表現，並且外源核酸序列被穩定地整合到修飾的HSV-1基因組，使得可以預期外源核酸序列的功能性表現。

編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的重組基因含有編碼蛋白質的核酸以及用於蛋白質表現的調節元件。通常，存在于重組基因中調控元件與待表現的核酸序列可操作地連接，並且基於待用於表現的宿主細胞來選擇，可包括轉錄啟動子、核糖體結合位點和終止子。在重組表現載體內，“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列以允許核苷酸序列表現(例如在體外轉錄/翻譯系統中表現，或當病毒被引入宿主細胞時在宿主細胞中表現)的方式與調節序列連接。術語“調節序列”旨在包括啟動子、增強子和其他表現調控元件(例如聚腺苷酸化信號)。調節序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列的組成性表現的那些調節序列，以及僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表現的調節序列(例如，組織特異性調節序列)。

一種新發現的調節序列是絕緣子(insulator)，其包括在細胞染色體上發現的一類DNA元件，其保護染色體的一個區域中的基因免受另一個區域的調節影響。Amelio等人在LAT區域中發現了含有一簇CTCF基序的1.5-kb區域，該區域具有絕緣子活性，特別是增強子阻斷和沉默作用(Amelio et al..A Chromatin Insulator-Like Element in the Herpes Simplex Virus Type 1 Latency-Associated Transcript RegionBinds CCCTC-Binding Factor and Displays Enhancer-Blocking and Silencing Activities.Journal of Virology,Vol.80,No.5,Mar.2006,p.2358-2368)。

啟動子是指導RNA聚合酶結合DNA並啟動RNA合成的DNA序列。一個強大的啟動子能夠引起mRNA的高頻率啟動。用於在真核細胞中加工的合適元件是聚腺苷酸化信號。也可能存在抗體相關的內含子。用於抗體或抗體片段生產的表現片匣的實例在本領域中是公知的(例如，Persic et al.,1997,Gene 187：9-18；Boel et al.,2000,J Immunol.Methods 239：153-166；Liang et al.,2001,J.Immunol.Methods 247：1 19-130；Tsurushita et al.,2005,Methods 36：69-83.)。

本領域普通技術人員可以基於例如期望的組織特異性和表現水準來選擇合適的調節元件。例如，細胞類型特異性或腫瘤特異性啟動子可用于將基因產物的表現限制至特定的細胞類型。除了使用組織特異性啟動子之外，病毒的局部施用可實現局部的表現和效應。可以使用的非組織特異性啟動子的實例包括早期巨細胞病毒(CMV)啟動子(美國專利號4,168,062)和勞氏肉瘤病毒啟動子。而且，可以使用HSV啟動子，例如HSV-1E啟動子。在一些實施方案中，啟動子選自下表中的啟動子。

例如，可用於本技術的組織特異性啟動子的實例包括***特異性抗原(PSA)啟動子，其對***細胞是特異的；肌間線蛋白啟動子，其對肌細胞是特異性的；烯醇化酶啟動子，其對神經元是特異性的；β球蛋白啟動子，其對紅系細胞是特異性的；tau-globin啟動子，其對紅系細胞也是特異性的；生長激素啟動子，其對垂體細胞是特異性的；胰島素啟動子，其對胰腺β細胞具有特異性；膠質纖維酸性蛋白啟動子，其對星形膠質細胞是特異性的；酪氨酸羥化酶啟動子，其對兒茶酚胺能神經元是特異性的；澱粉樣前體蛋白啟動子，其對神經元是特異性的；多巴胺β-羥化酶啟動子，其對去甲腎上腺素能和腎上腺素能神經元是特異性的；色氨酸羥化酶啟動子，對5-羥色胺/松果體細胞具有特異性；膽鹼乙醯轉移酶啟動子，其對膽鹼能神經元是特異性的；芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)啟動子，其對兒茶酚胺能/5-HT/D型細胞是特異性的；腦啡肽原啟動子，其對神經元/生精附睾細胞是特異性的；reg(胰結石蛋白)啟動子，其對結腸和直腸腫瘤以及胰腺和腎細胞是特異性的；和甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)啟動子，其對肝和盲腸腫瘤以及神經鞘瘤、腎細胞、胰腺細胞和腎上腺細胞是特異性的。

在腫瘤細胞中特異性起作用的啟動子的實例包括對乳腺癌細胞特異的基質溶素3啟動子；對非小細胞肺癌細胞特異的表面活性蛋白A啟動子；表現SLPI的癌特異性的分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)啟動子；對黑素瘤細胞特異的酪氨酸酶啟動子；對纖維肉瘤/致瘤細胞特異的應激誘導的grp78/BiP啟動子；對脂肪細胞特異的AP2脂肪增強子；對肝細胞特異的α-1抗胰蛋白酶轉甲狀腺素蛋白啟動子；對多形性成膠質細胞瘤特異的白細胞介素-10啟動子；對胰腺、乳腺、胃、卵巢和非小細胞肺細胞特異的c-erbB-2啟動子；對腦腫瘤細胞是特異性的α-B-晶狀體蛋白/熱休克蛋白27啟動子；對神經膠質瘤和腦膜瘤細胞特異的鹼性成纖維細胞生長因數啟動子；對鱗狀細胞癌、神經膠質瘤和乳腺腫瘤細胞具有特異性的表皮生長因數受體啟動子；對乳腺癌細胞具有特異性的粘蛋白樣糖蛋白(DF3、MUC1)啟動子；對於轉移性腫瘤是特異性的mts1啟動子；對小細胞肺癌細胞特異的NSE啟動子；對小細胞肺癌細胞特異的生長抑素受體啟動子；對乳腺癌細胞特異的c-erbB-3和c-erbB-2啟動子；對乳腺癌和胃癌特異的c-erbB4啟動子；對甲狀腺癌細胞特異的甲狀腺球蛋白啟動子；對肝癌細胞特異的甲胎蛋白(AFP)啟動子；對胃癌細胞特異的villin啟動子；和對肝癌細胞特異的白蛋白啟動子。在另一個實施方案中，使用TERT啟動子或存活蛋白(survivin)啟動子。

例如，在一些實施方案中，外源核酸序列可操作地連接至啟動子，例如CMV啟動子或Egr啟動子。在一個實施方案中，編碼mIL12的核苷酸序列可操作地連接至Egr啟動子。在另一個實施方案中，編碼scFv-抗-hPD1的核苷酸序列可操作地連接至CMV啟動子。

免疫刺激劑或免疫抑制劑

在某些實施方案中，本公開內容的oHSV-1編碼一種或多種免疫刺激劑(也稱為免疫刺激分子)，包括細胞激素(如IL-2、IL4、IL-12、GM-CSF、IFNγ)、趨化因數(如MIP-1、MCP-1、IL-8)和生長因數(如FLT3配體)。

作為選擇或此外，本公開內容的oHSV-1編碼一種或多種免疫治療劑，例如PD-1結合劑(或抗PD-1劑)或CTLA-4結合劑(或抗-CTLA-4劑)，包括抗體或其片段，例如特異性結合PD-1的抗PD1抗體或特異性結合CTLA-4的抗CTLA-4抗體。抗PD-1抗體可以是拮抗PD-1活性的單鏈抗體。在其他實施方案中，溶瘤病毒表現拮抗PD-1配體與受體的結合的試劑，例如抗PD-L1抗體和/或PD-L2抗體、PD-L1和/或PD-L2誘餌、或可溶性PD-1受體。

PD-1信號傳導途徑在腫瘤相關免疫功能障礙中起重要作用。腫瘤細胞的感染和裂解可以引發高度特異性的抗腫瘤免疫應答，其殺死接種腫瘤的細胞以及遠處已建立的未接種的腫瘤細胞。腫瘤及其微環境已經形成了逃避、抑制和滅活天然抗腫瘤免疫應答的機制。例如，腫瘤可能下調目標受體，將其自身包裹在纖維性細胞外基質中或上調參與調節性免疫細胞活化或募集的宿主受體或配體。天然和/或適應性T調節細胞(Treg)參與腫瘤介導的免疫抑制。不希望受理論限制，PD-1阻斷可抑制Treg活性並改善腫瘤反應性CTL的功效。該技術的其他方面將在下面進一步詳細描述。PD-1阻斷還可以通過阻斷T細胞(CTL和輔助細胞)和B細胞的失活來刺激抗腫瘤免疫應答。

一方面，本技術提供攜帶編碼PD-1結合劑的基因的溶瘤病毒。程式性細胞死亡1(PD-1)是最初通過經歷細胞凋亡的小鼠T細胞系的消減雜交鑒定的50-55kDa I型跨膜受體(Ishida et al.,1992,Embo J.11：3887-95)。CD28基因家族的成員PD-1在啟動的T細胞、B細胞和骨髓譜系細胞上表現(Greenwald et al.,2005,Annu.Rev.Immunol.23：515-48；Sharpe et al.,2007,Nat.Immunol.8：239-45)。人和鼠PD-1具有約60%的氨基酸同一性，具有四個潛在的N-糖基化位元點和定義Ig-V結構域的殘基的保守性。已經鑒定了PD-1的兩種配體PD配體1(PD-L1)和配體2(PD-L2)，都屬於B7超家族。PD-L1在許多細胞類型上表現，包括T細胞、B細胞、內皮細胞和上皮細胞以及抗原呈遞細胞。相反，PD-L2僅在專職抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞和巨噬細胞)上表現。

PD-1負調節T細胞活化，並且該抑制功能與其胞質結構域的基於免疫受體酪氨酸的抑制性基序(ITIM)相關(Parry et al.,2005,Mol.Cell. Biol.25：9543-53)。破壞PD-1的這種抑制功能可以導致自身免疫。相反的情況也可能是有害的。在許多病理情況下，如腫瘤免疫逃逸和慢性病毒感染，PD-1持續的負信號參與了T細胞功能障礙。

宿主抗腫瘤免疫性主要受腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)影響(Galore et al.,2006,Science 313：1960-4)。多條證據表明，TIL受到PD-1的抑制性調節。首先，在許多人和小鼠腫瘤系中證實了PD-L1的表現，並且該表現可以在體外通過IFN-γ進一步上調(Dong et al.,2002,Nat.Med.8：793-800)。其次，腫瘤細胞表現的PD-L1直接與其體外抗腫瘤T細胞的溶解抗性有關(Blank et al.,2004,Cancer Res.64：1 140-5)。第三，PD-1敲除小鼠對腫瘤攻擊具有抗性(Iwai et al.,2005,Int.Immunol.17：133-44)，來自PD-1敲除小鼠的T細胞在過繼轉移至荷瘤小鼠時在腫瘤排斥中高度有效(Blank等人，同上)。第四，通過單克隆抗體阻斷PD-1抑制性信號可以增強小鼠中的宿主抗腫瘤免疫性(Iwai et al.,supra；Hirano et al.,2005,Cancer Res.65：1089-96)。第五，腫瘤中高度的PD-L1表現(通過免疫組織化學染色檢測)與許多人癌症類型的不良預後相關(Hamanishi et al.,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：3360-5)。

溶瘤病毒療法是通過擴增腫瘤特異性抗原(溶瘤後釋放)特異性的T或B細胞群而形成宿主免疫系統的有效方法。腫瘤特異性抗原的免疫原性很大程度上取決於宿主免疫受體(B細胞受體或T細胞受體)對抗原表位的親和力和宿主耐受閾值。高親和力的相互作用將通過多輪增殖和分化驅動宿主免疫細胞變成長效記憶細胞。宿主耐受機制將抵消這種增殖和擴張，以最小化局部免疫啟動導致的潛在組織損傷。PD-1抑制信號是這種宿主耐受機制的一部分，這從以下證據中可以得到支持。首先，在活躍增殖的T細胞中PD-1表現升高，特別是具有末端分化表型(效應子表型)的T細胞中。效應細胞通常與有效的細胞毒功能和細胞激素產生有關。其次，PD-L1對於保持週邊耐受性和局部地限制過度活躍的T細胞是重要的。因此，使用在腫瘤微環境中表現的PD-1結合劑進行PD-1抑制可以是增加TIL的活性並刺激有效和持久的抗腫瘤免疫應答的有效策略。

細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)是免疫球蛋白(Ig)蛋白超家族的成員。Ig超家族是一組具有Ig分子的可變(V)或恒定(C)結構域的關鍵結構特徵的蛋白質。Ig超家族的成員包括但不限於免疫球蛋白本身、主要組織相容性複合體(MHC)類分子(即I類和II類MHC)和TCR分子。T細胞需要來自抗原呈遞細胞(APC)的兩種類型的信號用於啟動和隨後分化為效應器功能。首先，存在由T細胞上的TCR與呈遞APC上的肽的MHC分子之間的相互作用產生的抗原特異性信號。其次，存在由CD28與B7家族(B7-1(CD80)或B7-2(CD86))成員相互作用介導的抗原非依賴性信號。CTLA-4融入免疫反應的環境最初正好是回避的(evasive)。小鼠CTLA-4首先被Brunet等作為尋求優先在細胞毒性T淋巴細胞上表現的分子的一部分被鑒定和克隆(Brunet et a1.Nature 328：267-270(1987))。Dariavach等人發現人類CTLA-4並且不久就克隆出來(Dariavach et al.Eur.J.Immunol.18：1901-1905(1988))。鼠和人CTLA-4分子具有大約76%的總體序列同源性並且在其胞質結構域中具有接近完全的序列同一性(Dariavach et al.Eur.J.Immunol.18：1901-1905(1988))。

研究人員從1993年開始並於1995年達到頂峰描繪了CTLA-4 在T細胞刺激中的作用。通過使用抗CTLA-4的單克隆抗體，Walunas等人(Walunas et al.Immunity 1：405-13(1994))首先提供了CTLA-4可以作為T細胞活化的負調節劑的證據。

在癌症方面，Kwon et al.PNAS USA 94：8099-103(1997)建立了同基因小鼠***癌模型，並檢查了旨在通過增強的T細胞共刺激引發抗***癌應答的兩種不同操作：(i)通過轉導表現B7.1配體的***癌細胞提供直接共刺激和(ii)T細胞CTLA-4的體內抗體介導的阻斷，其阻止T細胞下調。已經證明CTLA-4的體內抗體介導的阻斷增強了抗***癌免疫應答。此外，Yang et al.Cancer Res 57：4036-41(1997)研究了CTLA-4功能的阻斷是否導致在腫瘤生長的不同階段增強抗腫瘤T細胞應答。基於體外和體內結果，他們發現荷瘤個體中的CTLA-4阻斷增強了產生抗腫瘤T細胞應答的能力，但是這種增強作用的表現在其模型中局限於腫瘤生長的早期階段。此外，Hurwitz et al.Proc Natl Acad Sci USA 95：10067-71(1998)研究了T細胞介導的抗腫瘤應答的產生依賴于主要組織相容性複合物/抗原的T細胞受體接合以及B7與CD28的連接。某些腫瘤(如SM1乳腺癌)難以通過抗CTLA-4免疫法來治療。因此，通過使用CTLA-4阻斷劑和由表現粒細胞-巨噬細胞集落刺激因數的SM1細胞組成的疫苗的聯合療法，觀察到親本SM1腫瘤的消退，但單獨治療無效。這種聯合療法對SM1具有持久的免疫力，並依賴於CD4(+)和CD8(+)T細胞。這些發現提示CTLA-4阻斷在宿主來源的抗原呈遞細胞的水準起作用。

抗PD-1劑和抗CTLA-4劑

一方面，本技術提供了包含編碼抗PD-1劑和/或抗CTLA-4 劑的外源核酸的溶瘤病毒。在一些實施方案中，抗PD-1劑或抗CTLA-4劑含有提供特異性結合PD-1或CTLA-4表位的抗體可變區。抗體可變區可以存在於例如完整抗體、抗體片段和抗體或抗體片段的重組衍生物中。術語“抗體”是指一種免疫球蛋白，可以是天然的、部分合成的或全部合成的。因此，本技術的抗PD-1劑或抗CTLA-4劑包括具有特異性結合至PD-1或CTLA-4表位元的結合結構域的任何多肽或蛋白質。

不同種類的抗體具有不同的結構。可以參考IgG來說明不同的抗體區域。IgG分子含有四條多肽鏈，兩條較長的重鏈和兩條通過二硫鍵相互連接的較短的輕鏈。重鏈和輕鏈各自包含恒定區和可變區。重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恒定區(CH1、CH2和CH3)組成。輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恒定區(CL)組成。在可變區內有三個負責抗原特異性的高變區。(參見例如Breitling et al.,Recombinant Antibodies,John Wiley & Sons,Inc.and Spektrum Akademischer Verlag,1999；and Lewin,Genes IV, Oxford University Press and Cell Press,1990.)

高變區通常被稱為互補決定區(“CDR”)，並位於被稱為框架區(“FW”)的更保守的側翼區之間。從NH2末端到COOH末端有四個(4)FW區和三個(3)CDR：FW1，CDR1，FW2，CDR2，FW3，CDR3，FW4。與框架區和CDR相關的氨基酸可以通過Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991；C.Chothia and A.M.Lesk,J Mol Biol 196(4)：901(1987)；or B.Al-Lazikani,et al.,J Mol Biol 273(4)：27,1997描述的方法來編號和比對。例如，框架區和CDR可以考慮Kabat和Chothia定義來鑒定。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。兩個重鏈羧基區是通過二硫鍵連接以產生Fc區的恒定區。Fc區對於提供效應器功能是重要的。(Presta,Advanced Drug Delivery Reviews 58：640-656,2006.)。構成Fc區的兩條重鏈中的每一條通過鉸鏈區延伸到不同的Fab區。

抗PD-1劑或抗CTLA-4劑通常含有抗體可變區。這樣的抗體片段包括但不限於(i)Fab片段，由VH、VL、CH和CL結構域組成的單價片段；(ii)Fab2片段，其包含在鉸鏈區由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)dAb片段，其包含VH或VL結構域；(vi)scAb，含有VH和VL以及C1或CH1的抗體片段，以及(vii)基於蛋白質支架的人工抗體，包括但不限於纖連蛋白III型多肽抗體(例如參見美國專利號6,703,199)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過合成接頭連接，使得它們能夠製成單一蛋白質鏈，其中VL和VH區域配對形成單價分子，稱為單鏈Fv(scFv)。因此，抗體可變區可以存在於重組衍生物中。重組衍生物的例子包括單鏈抗體、雙抗體、三體抗體、四抗體和微小抗體。抗PD-1劑或抗CTLA-4劑也可以含有一個或多個識別相同或不同表位的可變區。

在一些實施方案中，抗PD-1劑或抗CTLA-4劑由使用重組核酸技術產生的溶瘤病毒編碼。可通過不同的技術產生不同的抗PD-1藥劑，包括例如包含通過接頭序列連接的VH區和VL區的單鏈蛋白(如scFv)以及其抗體或其片段；和在分開的多肽上含有VH和VL區的多鏈蛋白。重組核酸技術涉及建構用於蛋白質合成的核酸範本。合適的重組核酸技術在本領域中是公知的。(參見例如Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,2005；Harlow et al.,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。編碼抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體的重組核酸可以在已被溶瘤病毒感染的細胞中表現，並在病毒裂解後釋放到腫瘤微環境中。細胞實際上作為編碼蛋白質的工廠。

包含編碼抗PD-1或抗CTLA-4劑VH區或VL區中任一個或兩個的一個或多個重組基因的核酸可用於產生與PD-1/CTLA-4結合的完整蛋白質/多肽。例如，使用單個基因來編碼包含通過接頭連接的VH區和VL區的單鏈蛋白(如scFv)，或使用多個重組區來產生VH區和VL區，從而提供完整的結合劑。

可用於本公開的示例性抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體或其片段或衍生物在本領域中是可得到的。參見例如WO 2006/121168、WO 2014/055648、WO 2008/156712、US 2014/0234296或美國專利號6,984,720。

在本公開內容中重組的oHSV-1精確地在需要它們的腫瘤中遞送免疫增強蛋白質(而不是全身性地遞送)。此外，通過減少腫瘤中的蛋白質的生產，並且很可能也減少蛋白質的攝取，細胞毒性表現可能大大降低或不存在。

示例性的抗PD-1 scFv和抗CTLA-4 scFv序列

組合物

溶瘤病毒可以在合適的藥學上可接受的載體或賦形劑中製備。在通常的儲存和使用條件下，這些製劑含有防腐劑以防止微生物的生長。適於注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末(美國專利號5,466,468)。在所有情況下，製劑必須是無菌的，並且必須是流體以便容易注射。在生產和儲存條件下必須穩定，並且必須防止細菌和真菌等微生物的污染。

載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質。例如通過使用諸如卵磷脂的包衣，通過在分散的情況下維持所需的細微性和通過使用表面活性劑來保持適當的流動性。可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來預防微生物的作用。在許多情況下，優選包括等滲透壓劑，例如糖或氯化鈉。可以通過在組合物中使用延長吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來延長可注射組合物的吸收。

對於在水溶液中的腸胃外給藥，例如，溶液應適當地緩衝(如果需要的話)，並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲透壓。這些特定的水溶液特別適用於靜脈內、肌內、皮下、腫瘤內和腹膜內給藥。就此而言，根據本公開內容，可以使用的無菌水性介質將是本領域技術人員已知的。例如，可以將一個劑量溶解在1mL的等滲透壓NaCl溶液中，並且將其添加到1000mL的皮下灌注液中，或者在所建議的輸注位置注射(參見例如"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition,pages 1035-1038 and 1570-1580)。根據所治療的受試者的狀況劑量必然會發生一些變化。無論如何，負責給藥的人員將確定個體受試者的適當劑量。此外，對於人體給藥，製劑應滿足FDA生物製品標準所要求的無菌性、無熱原性、一般安全性和純度標準。

通過將活性化合物以需要的量與上面列舉的各種其它成分按需要合併在合適的溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。通常，通過將各種滅菌的活性成分摻入含有基本分散介質和來自上面列舉的所需其它成分的無菌載體中來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從先前無菌過濾的溶液中生產出包含活性成分及任何另外的所需成分的粉末。

本文公開的組合物可以配製成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成酸加成鹽)，包括與無機酸(如鹽酸或磷酸)或有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿，例如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵，以及有機堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。在配製時，溶液將以與劑量配方相容的方式以及治療上有效的量施用。該製劑易於以各種劑型(如可注射溶液、藥物釋放膠囊)等給藥。

如本文所用，“載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、載體、包衣、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲透壓劑和吸收延遲劑、緩衝劑、載體溶液、混懸劑、膠體等。用於藥物活性物質的樣的介質和藥劑在本領域是公知的。除了與活性成分不相容的任何常規的介質或試劑之外，預期其他介質或試劑可以用於所述治療組合物中。補充的活性成分也可以摻入組合物中。

短語“藥學上可接受的”是指當施用于人時不產生過敏或類似的不良反應的分子實體和成分。含有蛋白質作為活性成分的水性組合物的製備在本領域中是充分理解的。典型地，這樣的組合物被製備成注射劑，無論作為液體溶液或混懸液；也可以製備適於在注射之前溶解或懸浮於液體中的固體形式。

療法

本公開的另一方面提供了治療或緩解癌症的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的重組溶瘤HSV-1病毒或包含如上所述的重組溶瘤HSV-1病毒的藥物組合物。同樣地，本公開提供了如上所述的用於治療或緩解癌症的方法的溶瘤HSV-1病毒。

在某些實施方案中，所述重組溶瘤HSV-1病毒或藥物組合物以瘤內方式施用。在一個實施方案中，將HSV-1病毒或藥物組合物以可注射溶液的形式直接注射到腫瘤塊。

在一些實施方案中，可將攜帶編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的基因的溶瘤病毒與有效治療癌症的其他藥劑組合。例如，癌症的治療可以用溶瘤病毒和其它抗癌療法(例如抗癌劑或手術)來實施。在本技術中，預期溶瘤病毒療法可以與化學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑或其他生物學干預聯合使用。

“抗癌”劑能夠負面地影響受試者中的癌症，例如通過殺死癌細胞、誘導癌細胞凋亡、降低癌細胞生長速率、降低轉移發生率或數量、減小腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌細胞的血液供應、促進針對癌細胞或腫瘤的免疫應答、預防或抑制癌症進展或增加癌症患者的壽命。抗癌劑包括生物製劑(生物治療)、化學治療劑和放射治療劑。更普遍地，這些其它組合物將以有效殺死或抑制細胞增殖的組合量提供。該過程可能涉及使細胞與表現建構體和試劑或多種因數同時接觸。這可以通過使細胞與包含兩種藥劑的單一組合物或藥理學製劑接觸，或通過使細胞與兩種不同的組合物或製劑同時接觸來實現，其中一種組合物包含表現建構體，而另一種包含第二種試劑。

在一些實施方案中，將攜帶編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的基因的溶瘤病毒與佐劑組合。在一個實施方案中，佐劑是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸。細菌去氧核糖核酸(DNA)中的未甲基化二核苷酸CpG基序具有刺激幾種免疫細胞分泌細胞激素以增強先天免疫和適應性免疫的優點。

可以在其他藥物治療之前或之後幾分鐘到幾周的時間間隔內進行病毒療法。在將其他藥劑和溶瘤病毒分別施用於細胞的實施方案中，通常將確保在每次遞送時間之間不間隔相當長的一段時間，以使得藥劑和病毒仍然能夠有利地施加對細胞的聯合作用。在這樣的情況下，預期可以在彼此間隔約12-24小時之內使細胞與兩種療法接觸。但是，在某些情況下，當各施用間隔了幾天(2、3、4、5、6或7天)到幾周(1、2、3、4、5、6、7或8周)的時間時，可能需要顯著延長治療的時間。

表現免疫刺激基因或免疫治療基因的oHSV的建構

經修飾的oHSV-1專性載體(IMMV201)的建構

在通過細菌人工染色體(BAC)技術產生專性載體-IMMV201中，將產生3個終止密碼子的CMV啟動子片匣ATGCAGGTGCAGTAATAGTAA的片匣***到T-Easy載體中。使用原型(P)排列的HSV-1。分別通過兩組引物(GAAGATCTAATATTTTTATTGCAACTCCCTG，CTAGCTAGCTTATAAAAGGCGCGTCCCGTGG)和(GCTCTAGATTGCGACGCCCCGGCTC，CCTTAATTAAGGTTACCACCCTGTAGCCCCGATGT)從HSV-1病毒基因組PCR擴增下述基因片匣：上游側接核苷酸117005，下游連接核苷酸132096，並***到含有上述CMV和3個終止密碼子的質粒中，然後將該基因置換質粒建構到pKO5中，產生pKO-CMV-STOP。通過將pKO-CMV-STOP電穿孔到攜帶BAC HSV的大腸桿菌RecA+中來獲得IMMV201。

BAC-IMMV201無法在哺乳動物細胞中繁殖病毒

使用OptiMEM agency(Life Technologies,Inc.)按照其說明將如上建構的2-3μg的BAC-IMMV201轉染至具有70%融合的Vero細胞中。在37℃，5%CO2培養箱中孵育4小時。溫育後，用4ml新鮮完全生長培養基(5%新生小牛血清/DMEM)代替。3-4天內沒有出現病毒斑塊。實驗重複三次，沒有出現病毒斑塊。

建構表現單個免疫刺激或免疫治療基因的oHSV-1(IMMV202,203,303,403)

驅動免疫刺激基因(鼠IL12、人IL12)或免疫治療基因(人PD-1 scFV(SEQ ID No.1或3)、人CTLA-4 scFV(SEQ ID No.5)的CMV啟動子基因片匣通過將pKO基因片匣電穿孔到攜帶IMMV201的大腸桿菌RecA+中而獲得(如圖1所示)。

建構表現兩種免疫刺激基因或免疫治療基因的oHSV-1(IMMV502,503,504,505,507)

將驅動免疫刺激基因(IL12)和免疫治療基因(PD-1 scFV，CTLA-4 scFV)的CMV啟動子片匣進一步***到IMMV202,203,303,403載體中的UL3和UL4基因之間以產生表現免疫刺激基因(IL12)和免疫治療基因的組合的重組oHSV(圖2所示)。

建構表現一種免疫刺激基因和兩種免疫治療基因的oHSV-1(IMMV603)

通過在IMMV503載體(圖2中所示)的UL37和UL38基因之間***CTLA-4 scFV，建構了表現編碼人IL12、PD-1 scFV和CTLA-4 scFV的全部三種免疫刺激cDNA和免疫治療cDNA的IMMV603。

體外試驗

PD-1 scFV的表現

在本文描述的一系列實驗中，用模擬物或質粒轉染的2×10⁶個H293T細胞含有編碼由CMV啟動子驅動的帶有His標記的scFV-抗-PD-1的 cDNA以及來自各種天然來源的信號肽編碼區。轉染後46小時收集細胞裂解物和上清液，然後進行SDS-PAGE並通過抗His抗體進行免疫印跡。將2mL上清液中的40μL，200μL細胞裂解物中的30μL載入到12%的PAGE凝膠上。在細胞培養上清液中累積的PD-1 scFV的量(圖3)反映了不同信號肽的效率。

PD-1 scFV與PD-1的結合親和力

用模擬物或質粒轉染的2×10⁶個H293T細胞含有編碼由CMV啟動子驅動的His-標記的scFV-抗PD-1的cDNA以及HMM38信號肽。轉染後46小時收集上清液，然後進行ELISA測定，用抗His抗體檢測(圖4)。分泌的PD-1 scFV以劑量依賴性方式與PD-1結合。

生長試驗的體外細胞活力

使用模擬物(陰性對照)或IMMV507(表現PD-1抗體和CTLA-4抗體的oHSV-1)分別以每個細胞0.01、0.1、1、10、100倍PFU感染接種在96孔板中的5x10³個下列人類腫瘤細胞。通過使用CCK-8試劑片匣測量細胞生長力，每24小時測量一次，直至96小時(圖5)。通過酶標儀(BiotekEpoch)在450nm處測定吸光度。

這些研究中的腫瘤細胞系：T24，人膀胱癌；ECA109，人食管癌；CNE1，人鼻咽癌；HCT116，人結腸癌；Hep2，人喉癌；MD-MB-231，人乳腺癌；Hela，人類上皮腺癌；A549，人肺癌上皮細胞；H460，人類非小細胞肺癌細胞。

IMMV507以劑量依賴性方式殺死腫瘤細胞。與oHSV-1病毒接觸後，腫瘤細胞隨時間減少。

本領域技術人員將容易意識到，本發明非常適合於獲得所提及以及本文固有的目的和優點。本文中作為目前代表性的優選實施方式描述的方法、變化形式和組合物僅是示例性的，並非對本發明的範圍的限制。對本領域技術人員來說，可發生改變和其他用途，但這也被包括在本發明的由權利要求的範圍界定的本發明的實質精神內。

本文示例性地描述的發明可適當地在不存在未在本文具體公開的任何一個或多個元素、一個或多個限制條件的情況下實施。所使用的術語和表現方式被用作描述而非限制，並非有意圖在使用這些術語和表現方式時將所顯示或描述的特徵或其一部分的任何等同物排除在外，而要認識到，各種修改都可能在本發明的範圍內。因此，要理解的是，雖然本發明已通過優選實施方式和任選的特徵被具體公開，但本領域技術人員仍可對本文公開的概念作出修改和變化，而且這些修改和變化被認為在由所附權利要求界定的本發明的範圍內。

此外，當本發明的特徵或方面以馬庫西群組或其他替代性群組的形式描述時，本領域技術人員將意識到，本發明也以該馬庫西群組或其他群組的任何單個成員或子群組成員的形式被描述。

Claims

一種經修飾的I型單純皰疹病毒(HSV-1)，其能夠作為細胞性基因或病毒性基因的載體，所述HSV-1包含經修飾的HSV-1基因組，其中所述修飾包含缺失野生型HSV-1基因組的U_L56基因的啟動子至U_S1基因的啟動子之間的序列，使得(i)所有雙拷貝基因的一個拷貝被缺失，並且(ii)用於表達所述缺失後的病毒DNA中存在的所有開放閱讀框(ORF)所需的序列是完整的。
根據申請專利範圍1所述的經修飾的HSV-1，其中所述雙拷貝基因包含編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因以及佔據在所缺失的區域中的重複的非編碼序列。
根據申請專利範圍1所述的經修飾的HSV-1，其中所述HSV-1具有原型(P)基因組異構體。
根據申請專利範圍1所述的經修飾的HSV-1，其中所述HSV-1選自任何現有HSV毒株，包括F毒株、KOS毒株和17毒株。
根據申請專利範圍3所述的經修飾的HSV-1，其中所述缺失導致F毒株基因組中的核苷酸117005至132096位置的切除。
一種重組溶瘤性I型單純皰疹病毒(HSV-1)，其包含(a)經修飾的HSV-1基因組，其中所述修飾包含在野生型HSV-1基因組的U_L56基因的啟動子與U_S1基因的啟動子之間的序列缺失，使得(i)所有雙拷貝基因的一個拷貝被缺失，並且(ii)用於表達所述缺失後的病毒DNA中存在的所有開放閱讀框(ORF)所需的序列是完整的；以及(b)編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被穩定地加入到至少是所述經修飾的HSV-1基因組的被缺失的區域。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述免疫刺激劑選自GM-CSF、IL 2、IL 5、IL 12、IL 15、IL 24和IL 27。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述免疫治療劑選自抗PD-1劑和抗CTLA-4劑。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL-12、抗PD-1剂和/或抗CTLA-4剂的外源性核酸序列。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL-12的第一外源核酸序列和編碼抗PD-1劑或抗CTLA-4剂的第二外源核酸序列。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述重組溶瘤性HSV-1包含編碼抗PD-1劑的第一外源核酸序列和編碼抗CTLA-4劑的第二外源核酸序列。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述重組溶瘤性HSV-1包含編碼IL-12的第一外源核酸序列、編碼抗PD-1劑的第二外源核酸序列和編碼抗CTLA-4劑的第三外源核酸序列。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述重組溶瘤性 HSV-1進一步包含可操作地連接至所述外源核酸序列的啟動子序列。
根據申請專利範圍10或11所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述第一外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的所缺失的區域，並且所述第二外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的U_L組分的U_L3和U_L4基因之間。
根據申請專利範圍12所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述第一外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的所缺失的區域，所述第二外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的U_L組分的U_L3和U_L4基因之間，並且第三外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的U_L組分的U_L37和U_L38基因之間。
根據申請專利範圍12所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述第一外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的所缺失的區域，所述第二外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的U_L組分的U_L37和U_L38之間，並且第三外源核酸序列被***在所述經修飾的HSV-1基因組的U_L組分的U_L3和U_L4基因基因之間。
根據申請專利範圍13所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述啟動子序列是CMV啟動子或Egr啟動子。
根據申請專利範圍6所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述免疫刺激劑和/或免疫治療劑是人源化的。
根據申請專利範圍8所述的重組溶瘤性HSV-1，其中抗PD-1劑或抗 CTLA-4劑分別包含提供對PD-1或CTLA-4表位的特異性結合的抗體可變區。
根據申請專利範圍19所述的重組溶瘤性HSV-1，其中所述抗體可變區是完整抗體、抗體片段、或所述抗體或抗體片段的重組衍生物。
一種藥物組合物，其包含有效量的申請專利範圍6至20的任一項所述的重組溶瘤性HSV-1以及藥學上可接受的載體。
根據申請專利範圍21所述的藥物組合物，其中所述組合物被配製用於瘤內施用。