TW202223085A - 用於腦腫瘤治療的溶瘤性ｉ型單純皰疹病毒 - Google Patents

用於腦腫瘤治療的溶瘤性ｉ型單純皰疹病毒 Download PDF

Info

Publication number
TW202223085A
TW202223085A TW110145204A TW110145204A TW202223085A TW 202223085 A TW202223085 A TW 202223085A TW 110145204 A TW110145204 A TW 110145204A TW 110145204 A TW110145204 A TW 110145204A TW 202223085 A TW202223085 A TW 202223085A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
ohsv
gene
copy
tumor
agent
Prior art date
Application number
TW110145204A
Other languages
English (en)
Inventor
陳曉慶
劉園園
國瑛 周
Original Assignee
大陸商深圳市亦諾微醫藥科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商深圳市亦諾微醫藥科技有限公司 filed Critical 大陸商深圳市亦諾微醫藥科技有限公司
Publication of TW202223085A publication Critical patent/TW202223085A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/763—Herpes virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16632—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明公開了一種用於腦腫瘤治療的經基因工程化的溶瘤性HSV-1病毒，其缺乏兩份拷貝的γ34.5基因和內部反向重複區並且任選地將免疫刺激和/或免疫治療基因併入。所述溶瘤性HSV-1病毒表現出優異的抗腫瘤活性，特別是在腦腫瘤中。本發明還公開了一種包含溶瘤性HSV-1病毒和藥學上可接受的載體的藥物組合物，以及使用所述藥物組合物用於腦腫瘤治療的方法。

Description

用於腦腫瘤治療的溶瘤性I型單純皰疹病毒
本發明涉及一種用於腫瘤治療的溶瘤病毒，特別是涉及一種用於腦腫瘤治療的基因工程化的溶瘤性I型單純皰疹病毒(oHSV-1)。本發明還涉及使用本文公開的重組溶瘤性病毒治療腦腫瘤的方法、及其藥物組合物和應用。
腦的原發性腫瘤由中樞神經系統中的不同類型的細胞產生。成神經管細胞瘤(Medulloblastoma)衍生自神經元細胞的前體，而星形細胞瘤(astrocytoma)衍生自神經膠質細胞的星形細胞亞群，少突神經膠質瘤衍生自神經膠質細胞的少突神經膠質前體亞群。其它類型的原發性腫瘤衍生自形成腦的內襯和外襯的細胞，例如分別來自室管膜細胞的室管膜瘤和來自包含腦膜的細胞的腦膜瘤。衍生自星形膠質細胞的多形性膠質母細胞瘤(GBM)是最常見和最致命的原發性腦腫瘤，因此被歸類為WHO IV級星形細胞瘤。
目前惡性多形性膠質母細胞瘤(GBM)的治療方式是腫瘤切除，然後是化療和放療。儘管溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)在GBM的臨床試驗中已被證明是安全的，但其功效並不理想，主要是由於腫瘤切除後病毒傳播不足。多形性膠質母細胞瘤(GBM)是成人中最常見的腦腫瘤，儘管在分子理解方面取得了巨大進步，但它仍然是最難治療的惡性腫瘤之 一。儘管GBM腫瘤切除是一種重要的治療干預措施，但腫瘤切除後放射和替莫唑胺(temozolomide)化療的標準治療僅提供不太多的臨床益處。因此，迫切需要開發能夠在腫瘤減瘤(debulking)後直接施用到GBM腫瘤切除腔中的新型局部療法。
先前的研究試圖使用臨床批准的Gliadel晶片(含有化學治療劑BCNU的聚酐晶片)在切除的GBM的腔中進行局部治療，其顯示出有限的治療效果。在持續尋找能夠消除腫瘤切除後此類腫瘤殘留物的療法的過程中，溶瘤病毒在臨床前研究中顯示出巨大的潛力。這些病毒通常是基因工程化的，以便僅在腫瘤細胞中復制並殺死腫瘤細胞，這種方法非常適合活躍增殖的腫瘤細胞位於非增殖或緩慢增殖的正常細胞的腦中。在治療性病毒中，oHSV是最有希望用於GBM治療的候選病毒之一，因為其是一種固有的嗜神經病毒，並且其溶瘤作用不太依賴於特定的宿主細胞受體、突變或細胞內途徑。此外，oHSV具有經過充分研究的基因組和用於***另外的治療基因以進一步增強其溶瘤效力的重要的轉基因能力。儘管迄今為止針對GBM進行的I期和Ib期oHSV臨床試驗已顯示出抗腫瘤活性的跡象，但臨床反應率並不理想。
發明人驚奇地發現，與現有的oHSV-1病毒相比，缺失兩份拷貝(copy)的γ34.5基因和反向內部重複區的oHSV-1，在針對腦腫瘤方面，相對於非腦腫瘤而言，具有出乎意料地優越的抗腫瘤活性。
一方面，本文提供了一種包含經修飾的基因組的溶瘤性I型單純皰疹病毒(oHSV-1)，其中該修飾包含：(a)基因組的末端重複序列中 的γ34.5基因的拷貝的改變，使得γ34.5基因的所述拷貝不能表現功能性ICP34.5蛋白，以及(b)基因組的內部反向重複區的缺失，使得雙拷貝(multicopy)基因中的每一個的一份拷貝和內部反向重複區內的重複的非編碼序列的一份拷貝缺失，其中該雙拷貝基因包含編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因，以及其中基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因都是完整的，使得所有單拷貝基因能夠表現各自的功能性蛋白。
在一些實施方式中，改變包含γ34.5基因的拷貝的全部或部分的編碼區或調節區的缺失。
在一些實施方式中，重複的非編碼序列包括ICP0的內含子(intron)、LAT結構域和“a”序列。
在一些實施方式中，UL和US成分中的所有單拷貝基因包括UL成分中的UL1至UL56基因和US成分中的US1至US12基因。
在一些實施方式中，oHSV-1選自F毒株、KOS毒株和17毒株。在一些實施方式中，內部反向重複區的缺失導致F毒株的基因組中核苷酸117005至132096的切除。
在一些實施方式中，oHSV-1具有原型(P)的基因組異構體並且缺失從UL成分中最後一個基因(例如UL56)的終止密碼子開始至US成分中第一個基因(例如US1)的啟動子的內部反向重複區。
在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1，其中該併入不干擾HSV-1基因組的天然基因的表現。在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。
在一些實施方式中，免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一些實施方式中，免疫刺激劑是IL-12。
在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑。在一些實施方式中，抗PD-1劑包括抗PD-1抗體或其抗原結合片段，例如Fab、scFv、(scFv)2、Fab'或F(ab')2。在一些實施方式中，抗CTLA-4劑包括抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，例如Fab、scFv、(scFv)2、Fab'或F(ab')2。在一些實施方式中，抗PD-1抗體或抗CDLA-4抗體包括經修飾的抗體形式，包括抗體藥物偶聯物(ADC)、雙特異性抗體和納米抗體(或VHH)。
在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區和/或UL成分中的UL3和UL4基因之間。
在一些實施方式中，將編碼IL-12和抗PD-1劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。在一些實施方式中，編碼IL-12的異源性核酸序列被併入內部反向重複區，並且編碼抗PD-1劑的異源性核酸序列被併入UL成分中的UL3和UL4基因之間。
在另一方面，提供了一種用於腦腫瘤治療的藥物組合物，其包含有效量的本文公開的任何oHSV-1和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
在另一方面，提供了本文公開的任何oHSV-1在製備用於腦腫瘤治療的藥物中的應用。在一些實施方式中，腦腫瘤選自神經膠質瘤、 膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
在另一方面，提供了本文公開的任何oHSV-1用於腦腫瘤治療的應用。在一些實施方式中，腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
在另一方面，提供了一種用於個體中腦腫瘤治療的方法，其包含向個體施用治療有效量的本文公開的任何oHSV-1或本文公開的任何藥物組合物。
在一些實施方式中，在施用本文公開的oHSV-1或本文公開的藥物組合物之前、同時或之後向對象施用第二療法。在一些實施方式中，第二療法是化學治療、放射治療、免疫治療和/或手術干預。在一些實施方式中，個體是人類。在一些實施方式中，腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
從以下結合附圖的詳細描述中，本發明的這些和其他方面和優點是顯而易見的，其中：
圖1示出了oHSV-1構建體T3011、C5252、C8282、C1212和 R3616的基因組結構。
圖2示出了C5252、C8282和C1212缺乏ICP34.5蛋白表現的結果。Vero細胞的六孔盤被模擬感染或以每個細胞1 PFU的HSV-1(F)、R3616、C5252、C8282、C1212被感染。分別在感染後6、12和24小時(H)收穫細胞。通過免疫印跡(Western blot)檢測ICP34.5蛋白表現。
圖3示出了C5252對人惡性神經膠質瘤細胞增殖的體外抑制評估結果。每個樣品有6個重複孔，這些結果得到了另一項獨立實驗的證實。將U87-MG、U138-MG、U373-MG、D54-MG和U251-MG接種到96孔盤(5000個細胞/孔)上並用一系列滴度的C5252/C1212(0.01、0.1、1、10、33.33、100PFU/單元)感染。感染48小時後，通過Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay確定U87-MG、U373-MG、U138-MG、D54-MG和U251-MG的抑制率，併計算IC50。
圖4示出了C5252對正常細胞和腫瘤細胞的抑製作用的結果。將U373-MG、ACHN、HA和HRGEC接種到96孔盤(5000個細胞/孔)上並用一系列滴度的C5252(0.01-500 PFU/細胞)感染。感染48小時後，通過Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay確定U373-MG、ACHN、HA和HRGEC的相對細胞活性，併計算IC50。
圖5示出了在C57BL/6小鼠中GL261皮下植入模型的治療中C8282的功效研究的結果。32隻雌性C57BL/6J小鼠右側皮下被接種GL261腫瘤細胞(1×106)。當腫瘤體積達到~70mm3時，將小鼠隨機分為4組，每組8隻。用C8282(綠色線：5×104、藍色線：5×105或紅色線：5×106 PFU/動物，共3次，Q3d)對小鼠進行瘤內治療。每週測量兩次腫瘤體積和體重。腫瘤 體積和體重表示為平均值±SEM。
圖6示出了在裸鼠中正交的(orthotropic)U87人神經膠質瘤模型的治療中C5252的功效研究的結果。30隻雌性Balb/c裸鼠在左側紋狀體腦內接種5μL U87-Luc腫瘤細胞。接種後2週，根據IVIS圖像系統獲取的感興趣區域(ROI)中的發光信號，將小鼠隨機分為3組，每組8隻。每3天用C5252(藍色線：3×104 PFU/小鼠，5μL或紅色線：3×105 PFU/小鼠，5μL)治療小鼠，共6次(D1、4、7、10、13、16)。IVIS每週進行一次以監測腫瘤生長。
要注意的是，術語“一”或“一個”或“一種”實體是指該實體中的一個或多個或一種或多種；例如，“溶瘤性HSV-1”被理解為表示一種或多種溶瘤性HSV-1病毒。因此，術語“一個”或“一種”、“一個或多個”或“一種或多種”和“至少一個”或“至少一種”可以在本文中互換使用。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。可以通過比較每個序列中可以比對的位置來確定同源性。當比較序列中的位置被相同的鹼基或氨基酸佔據時，那麼分子在該位置是同源的。序列之間的同源程度與序列共有的匹配或同源位置的數目相關。“不相關的”或“非同源的”序列與本文的其中一個序列共用小於40%的同一性，優選小於25%的同一性。
一個多核苷酸或多核苷酸區域(或一個多肽或多肽區域)與另一個序列具有特定百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的“序列同一性”是指，當比對時，在比較 兩個序列時該百分比的鹼基(或氨基酸)是相同的。該比對和百分比同源性或序列同一性可以使用本領域已知的軟件程式來確定。
如本文所用，“抗體”或“抗原結合多肽”是指特異性識別並結合一種或多種抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整抗體及其任何抗原結合片段或其單鏈。因此，術語“抗體”包括任何具有抗原結合生物學活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的蛋白質或肽。這樣的實例包括，但不限於，重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)或其配體結合部分，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恆定區，框架(FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。術語抗體還包括在啟動時具有抗原結合能力的多肽或多肽複合物。
如本文所用，術語“抗體片段”或“抗原結合片段”是抗體的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等等。不管結構如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合。術語“抗體片段”包括適體、鏡像異構體和雙抗體。術語“抗體片段”還包括通過與特定抗原結合形成複合物而起到類似抗體的作用的任何合成的或基因工程化的蛋白質。
本文的抗體、抗原結合多肽或其變體或衍生物包括，但不限於，多克隆、單克隆、多特異性、人源、人源化、靈長類化或嵌合的抗體、單鏈抗體、抗原決定位結合片段(例如Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs(sdFv))、包含VK或VH結構域的片段、由Fab表現文庫產生的片段以及抗獨特型(抗-Id)抗體(包括，例如，針對本文公開的LIGHT抗體的抗Id抗體)。本文的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、 或亞類(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。例如，抗PD-1抗體可以指Fab片段或其scFv。
“特異性結合”或“具有特異性”通常是指抗體經由其抗原結合結構域與抗原決定位(epitope)結合，並且該結合需要抗原結合結構域和抗原決定位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體通過其抗原結合結構域結合至抗原決定位比結合至隨機的、不相關的抗原決定位時更容易時，則該抗體被認為與抗原決定位“特異性結合”。術語“特異性”在本文中用於定量某種抗體與某個抗原決定位結合的相對親和力。例如，可以認為抗體“A”對給定抗原決定位具有比抗體“B”更高的特異性，或者抗體“A”可以被描述為相比於結合相關抗原決定位“D”以更高的特異性結合抗原決定位“C”。
如本文所用，如本文中可互換使用的“癌症”或“腫瘤”是指可根據本公開內容治療並涉及異常細胞生長的一組疾病，其可能侵入或擴散至身體的其他部位。並非所有的腫瘤都是癌性的；良性腫瘤不會擴散到身體的其他部位。可能的體徵和症狀包括：新的腫塊、不正常的出血、長時間的咳嗽、不明原因的體重減輕和排便改變等等。有超過100種不同的已知癌症影響人類。本發明優選地適用於實體瘤，更優選地適用於腦腫瘤。
如本文所用，術語“處理”或“治療”是指治療性治療和預防性措施，目的是預防或減緩(減輕)不希望的生理變化或紊亂，例如癌症的進展。有益的或期望的臨床結果包括，但不限於，緩解症狀、減輕疾病程度、穩定(即不惡化)疾病狀態、延緩或減緩疾病進展、改善或緩解疾病狀態、以及症狀消失(無論是部分還是全部)，無論是可檢測的還是無法檢 測的。“治療”也意味著與不接受治療時所預期的生存期相比延長生存期。需要治療的病人包括那些已經患有疾病或病症的人，以及那些容易患有疾病或病症的人，或者那些預防疾病或病症的人。
“對象”或“個體”或“動物”或“患者”或“哺乳動物”是指期望進行診斷、預後或治療的任何對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括人、家畜、農場動物和動物園動物、競技動物或寵物，如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
如本文所使用的，諸如“需要治療的患者”或“需要治療的對象”等短語包括受益於施用本發明的用於例如檢測、診斷程式和/或治療的oHSV-1或組合物的對象，例如哺乳動物對象。
本領域普通技術人員還應該理解，可以修飾如本文所公開的修飾的基因組，使得它們在核苷酸序列上與它們所衍生出的經修飾的多核苷酸不同。例如，從指定的DNA序列衍生的多核苷酸或核苷酸序列可以是相似的，例如與起始序列具有一定的百分比同一性，例如它可以與起始序列具有60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
此外，可以進行核苷酸或氨基酸取代、缺失或***，以在“非必需”氨基酸區域進行保守取代或改變。例如，衍生自指定蛋白質的多肽或氨基酸序列，除了一個或多個單獨的氨基酸取代、***或缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多個單個氨基酸取代、***或缺失)之外，其餘部分可以與起始序列相同。在某些實施方式中，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相對於起始序列具有1至5個、1至10個、1至15個或1至20個單獨的氨基酸取代、***或缺失。
溶瘤性I型單純皰疹病毒
HSV-1基因組由兩個共價連接的成分組成，分別為L和S。每個成分由特有序列(L成分為UL，S成分為US)構成，特有序列的兩側為反向重複序列，即末端重複序列和內部重複序列。L成分的反向重複序列稱為ab和b’a’。S成分的反向重複序列稱為a’c’和ca。反向重複序列b’a’和a’c’構成內部反向重複區。已知L和S成分的反向重複區含有兩份拷貝的五種基因和大量的轉錄但不編碼(encoding)蛋白質的DNA，這五種基因分別編碼蛋白質ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和OFR O，所述DNA包括例如ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列等。
末端重複序列之間的同源重組導致HSV-1基因組的L和S成分的倒位，產生四種等摩爾濃度的線性異構體。異構體稱為P(原型)、IL(L成分的倒位)、IS(S成分的倒位)和ISL(L和S成分的倒位)。HSV-1基因組編碼大約90個獨特的轉錄單位(基因)，其中大約一半是在允許的組織培養環境中病毒複製所必需的。其餘的對於培養中細胞的生長是非必要的。然而，這些所謂的“非必需的”基因很可能不是對於在動物系統中複製所必需的。它們通常編碼參與病毒-宿主相互作用的功能，例如誘導免疫逃避和宿主細胞關閉(shut-off)。
感染細胞蛋白34.5(ICP34.5)是一種由γ34.5基因(也稱為γ134.5)編碼的蛋白質，其阻斷對病毒感染的細胞應激(stress)反應。當細胞被HSV感染時，蛋白激酶R被病毒的雙鏈RNA啟動。然後蛋白激酶R磷酸化一種稱為真核起始因子2A(eIF-2A)的蛋白質，使eIF-2A失活。EIF-2A是轉譯所必需的，因此通過關閉eIF-2A，細胞防止病毒劫持其自身的蛋白質 製造機器。病毒反過來形成ICP34.5來打敗防禦；其啟動蛋白磷酸酶1A使eIF-2A去磷酸化，使轉譯再次發生。缺乏γ34.5基因的HSV將不能夠在正常細胞中複製，因為其不能製造蛋白質。HSV-1基因組中有兩份拷貝的γ34.5基因，位於UL成分的兩側，一個位於末端重複序列，另一個位於內部重複序列。
一方面，本發明提供了一種溶瘤性I型單純皰疹病毒(oHSV-1)，其經基因修飾以使兩份拷貝的γ34.5基因都不能表現功能性ICP34.5蛋白，並且oHSV-1被進一步修飾以刪除基因組的內部反向重複區。內部反向重複區的缺失導致包括編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因的雙拷貝基因的每一個的一份拷貝和內部反向重複區中重複的非編碼序列的一份拷貝被刪除。然而，基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因(包括UL1到UL56和US1到US12)都是完整的，因此它們能夠表現各自的功能性蛋白。
在一些實施方式中，修飾包含基因組的末端重複序列中的γ34.5基因的拷貝的改變，使得γ34.5基因的所述拷貝不能表現功能性ICP34.5蛋白。“不能表現功能性ICP34.5蛋白”是指在工程化病毒中在蛋白質或mRNA水準無法檢測到γ34.5，或者病毒表現了ICP34.5蛋白但其是無功能的或是部分功能的。實現上述目的的措施在基因工程領域中是容易獲得的並且是技術人員已知的。例如，改變可以包含γ34.5基因的所述拷貝的編碼區或調節區中的一個或多個核苷酸的***、突變或添加，或者γ34.5基因的所述拷貝的編碼區或調節區的全部或部分的缺失。在一些實施方式中，改變包含γ34.5基因的所述拷貝的編碼區或調節區的全部或部分的缺失。
本文公開的oHSV-1缺乏兩份拷貝的γ34.5基因。另一份拷貝的γ34.5基因位於UL成分的內部重複序列內，其通過基因組的內部反向重複區的缺失而缺失。如上所述，內部反向重複區由UL成分的內部重複序列和US成分的內部重複序列組成。雙拷貝基因(包括編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因)的一份拷貝和重複的非編碼序列的一份拷貝位於內部反向重複區內。因此，內部反向重複區的缺失將導致雙拷貝基因的一份拷貝(包括γ34.5基因的另一份拷貝)和重複的非編碼序列的一份拷貝的缺失。在一些實施方式中，重複的非編碼序列包括例如ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列。因此，在一些實施方式中，基因組的內部反向重複區的缺失導致ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O中的每一個的一份拷貝以及ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列中的每一個的一份拷貝的缺失。因此，ICP0、ICP4、ORF P和ORF O中的每一個的另一份拷貝以及ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列中的每一個的另一份拷貝被保留在工程化的oHSV-1基因組中。
在本發明中，以精確的方式進行內部反向重複區的缺失，以確保基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因(包括UL1到UL56和US1到US12)都是完整的，以便它們能夠表現各自的功能性蛋白質。在這種情況下，“基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因都是完整的”是指這些單拷貝基因中的每一個的ORF和每個ORF的表現所需的調節序列(例如啟動子和增強子)是完整的，以確保ORF的表現是成功的，並且從ORF轉譯的蛋白質是功能性的。“完整”意味著單拷貝基因中的每一個的編碼序列至少是功能性的，但並不意味著序列必須與天然存在的序列100%相同。通過在“非必需” 區域包括例如保守性取代或變化，該序列可以與天然存在的序列相比具有核苷酸序列的稍微變化。在這種情況下，該序列可以與天然存在的序列具有90%、95%、98%或99%的同一性。
鑑於單拷貝基因中的每一個在HSV-1基因組中的位置是本領域已知的並且取決於HSV-1病毒的毒株和基因組異構體，本領域技術人員將會理解，內部反向重複區中被缺失的核苷酸的確切起始位置和終止位置將因毒株和毒株以及異構體和異構體而不同，但可以很容易地通過本領域已知的技術來確定。應該理解的是，本發明並非意在限於任何特定的HSV-1病毒的基因組異構體或毒株。相反，本發明推測HSV-1病毒的所有毒株和異構體都是有用的。
例如，在使用HSV-1 F毒株的實施方式中，其基因組通過GenBank登錄號GU734771.1獲得，內部反向重複區的缺失導致基因組中核苷酸117005至132096的切除。本領域技術人員還將理解，其他毒株也可用於本發明，只要其基因組DNA被測序。定序技術很容易在文獻和市場上獲得。例如，在另一個實施方式中，可以在HSV-1毒株17上進行缺失，其基因組可以通過GenBank登錄號NC_001806.2獲得。在另一個實施方式中，可以在KOS1.1毒株上進行缺失，其基因組可以通過GenBank登錄號KT899744獲得。
在一些實施方式中，在預定位置處精確地進行缺失，從而實現從L成分中的最後一個基因(例如P異構體的情況下的UL56)至S成分中的第一個基因(例如P異構體的情況下的US1)的DNA片段的切除。鑑於HSV-1存在四種不同的異構體(即異構體P、IS、IL和ISL)，第一個基因和最後一 個基因的名稱因異構體而不同。在本發明的上下文中，UL成分中的基因的編號(即第一個和最後一個)被定義為從UL成分的末端重複序列到UL成分的內部重複序列的方向，並且US成分中基因的編號被定義為從US成分的內部重複序列至US成分的末端重複序列的方向。因此，在異構體原型(P)的情況下，UL成分中的第一個基因將是例如UL1基因，以及UL成分中的最後一個基因將是例如UL56，以及US成分中的第一個基因將是例如US1基因，以及US成分中的最後一個基因將是例如US12。在異構體IS的情況下，UL成分中的第一個基因將是例如UL1基因，以及UL成分中的最後一個基因將是例如UL56，以及US成分中的第一個基因將是例如US12基因，以及US成分中的最後一個基因將是例如US1。在異構體IL的情況下，UL成分中的第一個基因將是例如UL56基因，以及UL成分中的最後一個基因將是例如UL1，以及US成分中的第一個基因將是例如US1基因，以及US成分中的最後一個基因將是例如US12。在異構體ISL的情況下，UL成分中的第一個基因將是例如UL56基因，以及UL成分中的最後一個基因將是例如UL1，以及US成分中的第一個基因將是例如US12基因，以及US成分中的最後一個基因將是例如US1。
內部反向重複區的缺失不會對US或UL成分中的單拷貝基因造成損害，這樣單拷貝基因的編碼序列和調節序列(包括單拷貝基因的表現所必需的啟動子序列)是完整的。例如，在異構體P的情況下，缺失導致從諸如UL56基因的終止密碼子的末端開始至諸如US1基因的啟動子序列的起始的DNA片段的切除。例如，在異構體IL的情況下，缺失導致從諸如UL1基因的啟動子序列的起始開始至諸如US1基因的啟動子序列的起始的DNA片段的切除。
工程化的oHSV-1基因組中所有單拷貝基因以及ICP0、ICP4、ORF P和ORF O中的每一個的另一份拷貝以及ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列中的每一個的另一份拷貝的保留提供了更強健的病毒，無論是在***的外源基因併入之前或之後。因此，oHSV-1在最大程度上抵抗諸如溫度、壓力、UV光等的環境因素。它還最大程度地擴大了溶瘤性HSV-1有效的癌細胞範圍。
本領域已知的各種基因操作方法可以被用來獲得如本發明所述的經修飾的HSV-1載體。例如，使用細菌人工染色體(BAC)技術。作為另一個實施例，COS質粒可以被用於本發明。WO 2017/181420公開了一種通過BAC技術構建的oHSV-1載體，其全部內容通過引用併入本文。
可以被***到野生型病毒中的外源DNA序列的量是有限的，因為其干擾了DNA包裝成病毒粒子。在指定區域中的精確缺失為外源DNA序列的***提供了理想的空間。根據本發明的一個實施方式，缺失去除了溶瘤病毒載體的至少15k bp，使得可以容納相似量的外源DNA序列。其他研究表明，野生型基因組可耐受另外的7KB的DNA。
在一些實施方式中，編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列被併入基因工程化的oHSV-1。在本發明中，異源性核酸序列的併入不干干擾HSV-1基因組的天然基因(例如上述任何單拷貝基因或其他雙拷貝基因)的表現。
在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區。在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入UL或US成分中相鄰的單拷貝基因之間。在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區 以及UL或US成分中相鄰的單拷貝基因之間。在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區以及UL3和UL4基因之間。
在一些實施方式中，oHSV-1包含編碼免疫刺激劑的異源性核酸序列。在一些實施方式中，免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一個實施方式中，免疫刺激劑是IL-12。在一個實施方式中，免疫刺激劑是人的IL-12或人源化的IL-12。
在一些實施方式中，oHSV-1包含編碼免疫治療劑的異源性核酸序列。在一些實施方式中，免疫治療劑係選自抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。在一個實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑。
在一些實施方式中，oHSV-1包含編碼免疫刺激劑和免疫治療劑的異源性核酸序列。在一些實施方式中，免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一個實施方式中，免疫刺激劑是IL-12。在一個實施方式中，免疫刺激劑是人的IL-12或人源化的IL-12。在一些實施方式中，免疫治療劑係選自抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。在一個實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑。
在實施方式中，當只有一個編碼免疫刺激劑或編碼免疫治療劑的異源性核酸序列被***時，該異源性核酸序列優選被併入到基因組的缺失的內部反向重複區中。在一個實施方式中，異源性核酸序列具有與缺失的片段相似的長度。在一個實施方式中，異源性核酸序列具有比缺失的片段的長度長或短20%的長度。在另一個實施方式中，異源性核酸序列具有比缺失的片段長或短15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%的長度。
在一個實施方式中，異源性核酸序列具有小於約18k bp、約 17k bp或約16k bp的長度。在一個實施方式中，異源性核酸序列具有大於約10k bp、11k bp、12k bp、13k bp或14k bp的長度。在一個實施方式中，異源性核酸序列具有約14k bp至約16k bp之間的長度。在一個實施方式中，異源性核酸序列具有約15k bp的長度。
在一些實施方式中，oHSV-1包含編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的至少兩種異源性核酸序列。在一些實施方式中，oHSV-1包含編碼兩種不同免疫刺激劑的異源性核酸序列。例如，在一個實施方式中，oHSV-1包含編碼IL-12和GM-CSF的異源性核酸序列。在另一個實施方式中，oHSV-1包含編碼IL-15和GM-CSF的異源性核酸序列。在另一個實施方式中，oHSV-1包含編碼IL-12和IL-15的異源性核酸序列。
在一些實施方式中，oHSV-1包含編碼兩種不同免疫治療劑的異源性核酸序列。在一個實施方式中，例如，oHSV-1包含編碼抗PD-1劑和抗CTLA-4劑兩者的異源性核酸序列。
在實施方式中，當併入多於一種的編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列時，優選將第一異源性核酸序列***到基因組的缺失的內部重複區中。第二或另外的異源性核酸序列可以被***到基因組的L成分中。在一個實施方式中，第二異源性核酸序列被***到L成分的UL3和UL4基因之間。在一個實施方式中，第二異源性核酸序列被***到L成分的UL37和UL38基因之間。
在一個實施方式中，第一異源性核酸序列編碼***到基因組的缺失的內部重複區中的IL-12。在一個實施方式中，第二異源性核酸序列編碼***到L成分的UL3和UL4基因之間的抗PD-1劑。
可以理解的是，將一個或多個異源性核酸序列***到溶瘤性HSV-1基因組中並不干擾天然HSV-1基因的表現，並且異源性核酸序列被穩定地併入經修飾的HSV-1基因組中，使得可以預期異源性核酸序列的功能性表現。
編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列含有編碼肽或蛋白質的核酸以及用於表現的調節元件。通常，存在於重組基因中並且基於待用於表現的宿主細胞選擇的調節元件(包括轉錄啟動子、核醣體結合位點和終止子)與待表現的核酸序列可操作地連接。在重組表現載體內，“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列以允許核苷酸序列表現(例如在體外轉錄/轉譯系統中表現，或當病毒被引入宿主細胞時在宿主細胞中表現)的方式與調節序列連接。術語“調節序列”旨在包括啟動子、增強子和其他表現調節元件(例如聚腺苷酸化信號)。調節序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列的組成性表現的那些調節序列，以及僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表現的調節序列(例如，組織特異性調節序列)。
本領域普通技術人員可以基於例如期望的組織特異性和表現水準來選擇合適的調節元件。例如，細胞類型特異性或腫瘤特異性啟動子能夠被用於將基因產物的表現限制至特定的細胞類型。除了使用組織特異性啟動子之外，病毒的局部施用可以實現局部的表現和效應。可以使用的非組織特異性啟動子的實施例包括早期巨細胞病毒(CMV)啟動子(美國專利4,168,062號)和勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)啟動子。而且，可以使用HSV啟動子，例如HSV-1 IE啟動子。
例如，能夠被用於本技術的組織特異性啟動子的實施例包括***特異性抗原(PSA)啟動子，其對***細胞是特異性的；肌間線蛋白啟動子，其對肌細胞是特異性的；烯醇化酶啟動子，其對神經元是特異性的；β球蛋白啟動子，其對紅系細胞是特異性的；tau-globin啟動子，其對紅系細胞也是特異性的；生長激素啟動子，其對垂體細胞是特異性的；胰島素啟動子，其對胰腺β細胞是特異性的；神經膠質纖維酸性蛋白啟動子，其對星形膠質細胞是特異性的；酪氨酸羥化酶啟動子，其對兒茶酚胺能神經元是特異性的；澱粉樣前體蛋白啟動子，其對神經元是特異性的；多巴胺β-羥化酶啟動子，其對去甲腎上腺素能和腎上腺素能神經元是特異性的；色氨酸羥化酶啟動子，其對5-羥色胺/松果體細胞是特異性的；膽鹼乙醯轉移酶啟動子，其對膽鹼能神經元是特異性的；芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)啟動子，其對兒茶酚胺能/5-HT/D型細胞是特異性的；腦啡肽原啟動子，其對神經元/生精附睾細胞是特異性的；reg(胰結石蛋白)啟動子，其對結腸和直腸腫瘤以及胰腺和腎細胞是特異性的；以及甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)啟動子，其對肝和盲腸腫瘤以及神經鞘瘤、腎細胞、胰腺細胞和腎上腺細胞是特異性的。
在腫瘤細胞中特異性起作用的啟動子的實施例包括基質溶素(stromelysin)3啟動子，其對乳腺癌細胞是特異性的；表面活性蛋白A啟動子，其對非小細胞肺癌細胞是特異性的；分泌性白細胞蛋白酶抑製劑(SLPI)啟動子，其對表現SLPI的癌是特異性的；酪氨酸酶啟動子，其對黑素瘤細胞是特異性的；應激誘導的grp78/BiP啟動子，其對纖維肉瘤/致瘤細胞是特異性的；AP2脂肪增強子，其對脂肪細胞是特異性的；a-1抗胰蛋 白酶轉甲狀腺素蛋白啟動子，其對肝細胞是特異性的；白細胞介素-10啟動子，其對多形性膠質母細胞瘤是特異性的；c-erbB-2啟動子，其對胰腺、乳腺、胃、卵巢和非小細胞肺細胞是特異性的；a-B-晶狀體蛋白/熱休克蛋白27啟動子，其對腦腫瘤細胞是特異性的；鹼性成纖維細胞生長因子啟動子，其對神經膠質瘤和腦膜瘤細胞是特異性的；表皮生長因子受體啟動子，其對鱗狀細胞癌、神經膠質瘤和乳腺腫瘤細胞是特異性的；粘蛋白樣糖蛋白(DF3、MUC1)啟動子，其對乳腺癌細胞是特異性的；mts1啟動子，其對轉移性腫瘤是特異性的；NSE啟動子，其對小細胞肺癌細胞是特異性的；生長抑素受體啟動子，其對小細胞肺癌細胞是特異性的；c-erbB-3和c-erbB-2啟動子，其對乳腺癌細胞是特異性的；c-erbB4啟動子，其對乳腺癌和胃癌是特異性的；甲狀腺球蛋白啟動子，其對甲狀腺癌細胞是特異性的；甲胎蛋白(AFP)啟動子，其對肝癌細胞是特異性的；villin啟動子，其對胃癌細胞是特異性的；以及白蛋白啟動子，其對肝癌細胞是特異性的。在另一個實施方式中，使用TERT啟動子或存活蛋白(survivin)啟動子。
例如，在一些實施方式中，異源性核酸序列可操作地連接至啟動子，例如CMV啟動子或Egr-1啟動子。在一個實施方式中，編碼IL-12的核苷酸序列可操作地連接至Egr-1啟動子。在另一個實施方式中，編碼scFv-抗-hPD1的核苷酸序列可操作地連接至CMV啟動子。
在某些實施方式中，本發明的oHSV-1編碼一種或多種免疫刺激劑(也稱為免疫刺激分子)，包括細胞因子(如IL-2、IL4、IL-12、GM-CSF、IFNγ)、趨化因子(如MIP-1、MCP-1、IL-8)和生長因子。
替代地或此外，本發明的oHSV-1編碼一種或多種免疫治療 劑，例如PD-1結合劑(或抗PD-1劑)或CTLA-4結合劑(或抗CTLA-4劑)，包括其抗體或其片段，例如特異性結合PD-1的抗PD1抗體或特異性結合CTLA-4的抗CTLA-4抗體。抗PD-1抗體可以是拮抗PD-1活性的單鏈抗體。在其他實施方式中，溶瘤病毒表現拮抗PD-1配體與受體的結合的試劑，例如抗PD-L1和/或PD-L2抗體、PD-L1和/或PD-L2誘餌、或可溶性PD-1受體。
PD-1信號傳導途徑在腫瘤相關免疫功能障礙中起重要作用。腫瘤細胞的感染和裂解可以引發殺死接種腫瘤的細胞以及遠處已建立的未接種的腫瘤的細胞的高度特異性的抗腫瘤免疫反應。腫瘤及其微環境已經形成了逃避、抑制和滅活天然抗腫瘤免疫反應的機制。例如，腫瘤可能下調目標受體，將其自身包裹在纖維性細胞外基質中或上調參與調節性免疫細胞的活化或募集的宿主受體或配體。天然和/或適應性調節T細胞(Treg)參與腫瘤介導的免疫抑制。不希望受理論限制，PD-1阻斷可以抑制Treg活性並改善腫瘤反應性CTL的功效。該技術的其他方面將在下面進一步詳細描述。PD-1阻斷還可以通過阻斷T細胞(CTL和輔助細胞)和B細胞的失活來刺激抗腫瘤免疫反應。
一方面，本技術提供攜帶編碼PD-1結合劑的基因的溶瘤病毒。程式性細胞死亡1(PD-1)是最初通過經歷細胞凋亡的小鼠T細胞株的消減雜交鑑定的50-55kDa I型跨膜受體。CD28基因家族的成員PD-1在啟動的T細胞、B細胞和骨髓譜系細胞上表現。人和鼠PD-1具有約60%的氨基酸同一性，具有四個潛在的N-糖基化位點和定義Ig-V結構域的殘基的保守性。已經鑑定了PD-1的兩種配體PD配體1(PD-L1)和配體2(PD-L2)，都屬於B7超家族。PD-L1在許多細胞類型上表現，包括T細胞、B細胞、內皮 細胞和上皮細胞以及抗原呈現細胞。相反，PD-L2僅在專職抗原呈現細胞(如樹突狀細胞和巨噬細胞)上表現。
PD-1負調節T細胞活化，並且該抑制功能與其胞質結構域的免疫受體酪氨酸抑制性基序(ITIM)相關。破壞PD-1的這種抑制功能可以導致自身免疫。相反的情況也可能是有害的。在許多病理情況下，PD-1持續的負信號參與了T細胞功能障礙，如腫瘤免疫逃逸和慢性病毒感染。
宿主抗腫瘤免疫性主要受腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)影響。多條證據表明，TIL受到PD-1的抑制性調節。首先，在許多人和小鼠腫瘤系中證實了PD-L1的表現，並且該表現可以在體外通過IFN-γ進一步被上調。其次，腫瘤細胞中PD-L1的表現直接與其體外抗腫瘤T細胞的溶解抗性有關。第三，PD-1敲除小鼠對腫瘤攻擊具有抗性，來自PD-1敲除小鼠的T細胞在過繼轉移至荷瘤小鼠時在腫瘤排斥中高度有效。第四，通過單克隆抗體阻斷PD-1抑制性信號可以增強小鼠中的宿主抗腫瘤免疫性。第五，腫瘤中PD-L1的高度表現(通過免疫組織化學染色檢測)與許多人類癌症類型的不良預後相關。
溶瘤病毒療法是通過擴增腫瘤特異性抗原(溶瘤後釋放)特異性的T或B細胞群而形成宿主免疫系統的有效方法。腫瘤特異性抗原的免疫原性很大程度上取決於宿主免疫受體(B細胞受體或T細胞受體)對抗原抗原決定位的親和力和宿主耐受閾值。高親和力相互作用將通過多輪增殖和分化驅動宿主免疫細胞變成長效記憶細胞。宿主耐受機制將抵消這種增殖和擴張，以最小化局部免疫啟動導致的潛在組織損傷。PD-1抑制信號是這種宿主耐受機制的一部分，這從以下證據中可以得到支持。首先，在活 躍增殖的T細胞中PD-1表現升高，特別是具有末端分化表型(效應子表型)的T細胞中。效應細胞通常與有效的細胞毒性作用和細胞因子產生有關。其次，PD-L1對於保持外圍耐受性和局部地限制過度活躍的T細胞是重要的。因此，使用在腫瘤微環境中表現的PD-1結合劑進行PD-1抑制可以是增加TIL的活性並刺激有效和持久的抗腫瘤免疫反應的有效策略。
一方面，本技術提供了包含編碼抗PD-1劑的異源性核酸的溶瘤病毒。在一些實施方式中，抗PD-1劑含有提供特異性結合PD-1抗原決定位的抗體可變區。抗體可變區可以存在於例如完整抗體、抗體片段和抗體或抗體片段的重組衍生物中。術語“抗體”是指一種免疫球蛋白，可以是天然的、部分合成的或全部合成的。因此，本技術的抗PD-1劑包括具有特異性結合至PD-1抗原決定位的結合結構域的任何多肽或蛋白質。
不同種類的抗體具有不同的結構。可以參考IgG來說明不同的抗體區域。IgG分子含有四條多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的兩條較長的重鏈和兩條較短的輕鏈。重鏈和輕鏈各自包含恆定區和可變區。重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH1、CH2和CH3)組成。輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。在可變區內有三個負責抗原特異性的高變區。
高變區通常被稱為互補決定區(CDR)，並位於被稱為框架區(framework；FW)的更保守的側翼區之間。從NH2末端至COOH末端有四個(4)FW區和三個(3)CDR：FW1，CDR1，FW2，CDR2，FW3，CDR3，FW4。例如，框架區和CDR可以考慮Kabat和Chothia定義來鑑定。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。兩個重鏈羧基區是通過二 硫鍵連接以產生Fc區的恆定區。Fc區對於提供效應器功能是重要的。構成Fc區的兩條重鏈中的每一條通過鉸鏈區延伸到不同的Fab區。
抗PD-1劑或抗CTLA-4劑通常含有抗體可變區。這樣的抗體片段包括但不限於(i)Fab片段，由VH、VL、CH和CL結構域組成的單價片段；(ii)Fab2片段，包含在鉸鏈區通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VH結構域和VL結構域組成；(v)dAb片段，其包含VH結構域或VL結構域；(vi)scAb，含有VH和VL以及C1或CH1的抗體片段，以及(vii)基於蛋白質支架的人工抗體，包括但不限於纖連蛋白III型多肽抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過合成連接子連接，使得它們能夠被製成單一蛋白質鏈，其中VL和VH區域配對形成單價分子，稱為單鏈Fv(scFv)。因此，抗體可變區可以存在於重組衍生物中。重組衍生物的實施例包括單鏈抗體、雙抗體、三抗體(triabody)、四抗體(tetrabody)和微小抗體(miniantibody)。抗PD-1劑或抗CTLA-4劑也可以含有一個或多個識別相同或不同抗原決定位的可變區。
在一些實施方式中，抗PD-1劑或抗CTLA-4劑由使用重組核酸技術產生的溶瘤病毒編碼。可以通過不同的技術產生不同的抗PD-1劑，包括例如含有通過連接子序列連接的VH區和VL區的單鏈蛋白(如scFv)以及其抗體或其片段；以及在單獨的多肽上含有VH區和VL區的多鏈蛋白。重組核酸技術涉及構建用於蛋白質合成的核酸範本。合適的重組核酸技術在本領域中是公知的。編碼抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體的重組核酸可以在已被溶瘤病毒感染的細胞中表現，並在病毒裂解後被釋放到腫瘤微環境中。 細胞實際上作為編碼蛋白質的工廠。
包含編碼抗PD-1或抗CTLA-4劑VH區或VL區中任一個或兩個的一個或多個重組基因的核酸可以被用於產生與PD-1/CTLA-4結合的完整蛋白質/多肽。例如使用單個基因來編碼含有通過連接子連接的VH區和VL區的單鏈蛋白(如scFv)，或者例如使用多個重組區來產生VH區和VL區，從而提供完整的結合劑。
可用於本發明的示例性抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體或其片段或衍生物在本領域中是可得到的。參見例如WO 2006/121168、WO 2014/055648、WO 2008/156712、US2014/0234296或美國專利6,984,720號。
藥物組合物
在另一方面，本發明提供了一種用於腫瘤治療的藥物組合物，其包含有效量的如本文所述的基因工程化的oHSV-1和藥學上可接受的載體。
在一些實施方式中，用於腫瘤治療的藥物組合物包含有效量的基因工程化的oHSV-1和藥學上可接受的載體，其中基因工程化的oHSV-1包含經修飾的基因組，其中該修飾包含：(a)基因組的末端重複序列中的γ34.5基因的拷貝的改變，使得γ34.5基因的所述拷貝不能表現功能性ICP34.5蛋白，以及(b)基因組的內部反向重複區的缺失，使得雙拷貝基因中的每一個的一份拷貝和內部反向重複區內的重複的非編碼序列的一份拷貝缺失，其中該雙拷貝基因包含編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因，以及其中基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因都是完整的，使得所有單拷貝基因能夠表現各自的功能性蛋白。
在一些實施方式中，改變包含γ34.5基因的拷貝的全部或部分的編碼區或調節區的缺失。在一些實施方式中，重複的非編碼序列包括ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列。在一些實施方式中，UL和US成分中的所有單拷貝基因包括UL成分中的UL1至UL56基因和US成分中的US1至US12基因。
在一些實施方式中，oHSV-1選自F毒株、KOS毒株和17毒株。在一些實施方式中，內部反向重複區的缺失導致F毒株的基因組中核苷酸117005至132096的切除。
在一些實施方式中，oHSV-1具有原型(P)的基因組異構體並且缺失從UL成分中最後一個基因(例如UL56)的終止密碼子開始至US成分中第一個基因(例如US1)的啟動子的內部反向重複區。
在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1，其中該併入不干擾HSV-1基因組的天然基因的表現。在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。
在一些實施方式中，免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一些實施方式中，免疫刺激劑是IL-12。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑。
在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區和/或UL成分中的UL3和UL4基因之間。在一些實施方式中，將編碼IL-12和抗PD-1劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。在一些實施方式中，編碼IL-12的 異源性核酸序列被併入內部反向重複區，並且編碼抗PD-1劑的異源性核酸序列被併入UL成分中的UL3和UL4基因之間。
溶瘤病毒可以在合適的藥學上可接受的載體或賦形劑中製備。在常規的儲存和使用條件下，這些製劑含有防腐劑以防止微生物的生長。適於注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，該形式必須是無菌的，並且必須是流體，以達到易於注射的程度。該形式在生產和儲存條件下必須是穩定的，並且必須防止微生物(例如細菌和真菌)的污染。
載體可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油。例如通過使用諸如卵磷脂的包衣，通過在分散的情況下維持所需的細微性和通過使用表面活性劑來保持適當的流動性。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑來預防微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)，可以使可注射組合物的吸收延長。
對於腸胃外以水溶液施用，例如，溶液應適當地緩衝(如果需要的話)，並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適用於靜脈內、肌肉內、皮下、腫瘤內和腹膜內施用。就此而言，根據本發明的內容，可以使用無菌水性介質將是本領域技術人員已知的。例如，可以將一個劑量溶解在1mL的等滲NaCl溶液中，並且將其添加到1000mL的皮下灌注液中，或者在所建議的輸注位置注射。根據所治療 的對象的狀況，劑量必然會發生一些變化。無論如何，負責施用的人員將確定用於個體對象的適當劑量。此外，對於人體施用，製劑應滿足FDA生物製品標準所要求的無菌性、無熱原性、一般安全性和純度標準。
通過將活性化合物以需要的量與以上列舉的各種其它成分按需要併入合適的溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。通常，通過將各種滅菌的活性成分併入含有基礎分散介質和來自上面列舉的所需其它成分的無菌載體中來製備分散液。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從先前無菌過濾的溶液中產生活性成分及任何另外的所需成分的粉末。
本文公開的組合物可以被配製成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成)，包括與無機酸(如鹽酸或磷酸)或有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機鹼(例如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵)和有機鹼(如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。在配製時，溶液將以與劑量配方相容的方式以及治療上有效量被施用。該製劑易於以各種劑型(如可注射溶液、藥物釋放膠囊等)被施用。
如本文所用，“載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、載體、包衣、稀釋劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、混懸劑、膠體等。用於藥物活性物質的這樣的介質和藥劑的使用在本領域是公知的。除了與活性成分不相容的任何常規的介質或試劑之外，預期其他介質或試劑可以用於所述治療組合物中。補充的活性成分也可以併入組合物中。
術語“藥學上可接受的”是指當施用於人時不產生過敏或類似的不良反應的分子實體和成分。含有蛋白質作為活性成分的水性組合物的製備是本領域公知的。典型地，這樣的組合物被製備為注射劑，無論作為液體溶液或混懸液；也可以製備為適於在注射之前溶解或懸浮於液體中的固體形式。
在一些實施方式中，本文公開的組合物用於腫瘤治療。在一些實施方式中，本文公開的組合物用於實體瘤治療。在一些實施方式中，本文公開的組合物用於腦腫瘤治療。在一些實施方式中，本文公開的組合物用於腦腫瘤治療，所述腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
應用和療法
在另一方面，本發明提供了用於對像中腫瘤治療的如本文所述的基因工程化的oHSV-1。在另一方面，本發明提供了用於對像中實體瘤治療的如本文所述的基因工程化的oHSV-1。在另一方面，本發明提供了用於對像中腦腫瘤治療的如本文所述的基因工程化的oHSV-1。
在一些實施方式中，基因工程化的oHSV-1包含經修飾的基因組，其中該修飾包含：(a)基因組的末端重複序列中的γ34.5基因的拷貝的改變，使得γ34.5基因的所述拷貝不能表現功能性ICP34.5蛋白，以及(b)基因組的內部反向重複區的缺失，使得雙拷貝基因中的每一個的一份拷貝和內部反向重複區內的重複的非編碼序列的一份拷貝缺失，其中該雙拷貝 基因包含編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因，以及其中基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因都是完整的，使得所有單拷貝基因能夠表現各自的功能性蛋白。
在一些實施方式中，改變包含γ34.5基因的拷貝的全部或部分的編碼區或調節區的缺失。在一些實施方式中，重複的非編碼序列包括ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列。在一些實施方式中，UL和US成分中的所有單拷貝基因包括UL成分中的UL1至UL56基因和US成分中的US1至US12基因。
在一些實施方式中，oHSV-1選自F毒株、KOS毒株和17毒株。在一些實施方式中，內部反向重複區的缺失導致F毒株的基因組中核苷酸117005至132096的切除。
在一些實施方式中，oHSV-1具有原型(P)的基因組異構體並且缺失從UL成分中最後一個基因(例如UL56)的終止密碼子開始至US成分中第一個基因(例如US1)的啟動子的內部反向重複區。
在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1，其中該併入不干擾HSV-1基因組的天然基因的表現。在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。
在一些實施方式中，免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一些實施方式中，免疫刺激劑是IL-12。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑。
在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區和/或UL成分中的UL3和UL4基因之間。在一些實施方式中，將編碼IL-12和抗PD-1劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。在一些實施方式中，編碼IL-12的異源性核酸序列被併入內部反向重複區，並且編碼抗PD-1劑的異源性核酸序列被併入UL成分中的UL3和UL4基因之間。
在另一方面，本發明提供了如本文所述的基因工程化的oHSV-1在製備用於對像中腫瘤治療的藥物中的應用。在另一方面，本發明提供了如本文所述的基因工程化的oHSV-1在製備用於對像中實體瘤治療的藥物中的應用。在另一方面，本發明提供了如本文所述的基因工程化的oHSV-1在製備用於對像中腦腫瘤治療的藥物中的應用。
在一些實施方式中，基因工程化的oHSV-1包含經修飾的基因組，其中該修飾包含：(a)基因組的末端重複序列中的γ34.5基因的拷貝的改變，使得γ34.5基因的所述拷貝不能表現功能性ICP34.5蛋白，以及(b)基因組的內部反向重複區的缺失，使得雙拷貝基因中的每一個的一份拷貝和內部反向重複區內的重複的非編碼序列的一份拷貝缺失，其中該雙拷貝基因包含編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因，以及其中基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因都是完整的，使得所有單拷貝基因能夠表現各自的功能性蛋白。
在一些實施方式中，改變包含γ34.5基因的拷貝的全部或部分的編碼區或調節區的缺失。在一些實施方式中，重複的非編碼序列包括ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列。在一些實施方式中，UL和US成分中的所有單拷貝基因包括UL成分中的UL1至UL56基因和US成分中的US1至 US12基因。
一些實施方式中，oHSV-1選自F毒株、KOS毒株和17毒株。在一些實施方式中，內部反向重複區的缺失導致F毒株的基因組中核苷酸117005至132096的切除。
在一些實施方式中，oHSV-1具有原型(P)的基因組異構體並且缺失從UL成分中最後一個基因(例如UL56)的終止密碼子開始至US成分中第一個基因(例如US1)的啟動子的內部反向重複區。
在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和/或免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1，其中該併入不干擾HSV-1基因組的天然基因的表現。在一些實施方式中，將編碼免疫刺激劑和免疫治療劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。
在一些實施方式中，免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一些實施方式中，免疫刺激劑是IL-12。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。在一些實施方式中，免疫治療劑是抗PD-1劑。
在一些實施方式中，異源性核酸序列被併入內部反向重複區和/或UL成分中的UL3和UL4基因之間。在一些實施方式中，將編碼IL-12和抗PD-1劑的異源性核酸序列併入oHSV-1。在一些實施方式中，編碼IL-12的異源性核酸序列被併入內部反向重複區，並且編碼抗PD-1劑的異源性核酸序列被併入UL成分中的UL3和UL4基因之間。
在另一方面，本發明提供了治療或緩解對像中腫瘤的方法，其包含向此有需要的對象施用有效量的oHSV-1病毒或包含如上所述的 oHSV-1病毒的藥物組合物。在某些實施方式中，腫瘤是實體瘤。在某些實施方式中，腫瘤是腦腫瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。在一些實施方式中，腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
在某些實施方式中，oHSV-1病毒或藥物組合物是腫瘤內施用的。在一個實施方式中，將HSV-1病毒或藥物組合物以可注射溶液的形式直接注射到腫瘤塊。
本發明的方法可用於治療腦腫瘤。這包括人類顱骨(頭顱)中或中央椎管內的所有腫瘤。所述腫瘤可以源自大腦本身，也可以源自淋巴組織、血管、顱神經、大腦包膜(腦膜)、顱骨、垂體或鬆果體。在大腦本身內，所涉及的細胞可以是神經元或神經膠質細胞(包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和室管膜細胞)。腦腫瘤也可以是從主要位於其他器官的癌症擴散(轉移性腫瘤)。
在一些實施方式中，腦腫瘤是神經膠質瘤，例如室管膜瘤、星形細胞瘤、少突星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、神經節神經膠質瘤、膠質母細胞瘤(也稱為多形性膠質母細胞瘤)或混合性神經膠質瘤。神經膠質瘤是原發性腦腫瘤，根據其在顯微鏡下的外觀(特別是非典型細胞、有絲***、內皮增殖和壞死的存在)分為四個等級(I、II、III和IV)。I級和II級腫瘤，稱為“低級別神經膠質瘤”，其不具有這些特徵或具有這些特徵之一，以及其包括瀰漫性星形細胞瘤、毛細胞型星形細胞瘤、低級別星形細胞瘤、低級別少突星形細胞瘤、低級別少突神經膠質瘤、神經節膠質瘤、 胚胎髮育不良神經上皮腫瘤、多形性黃色星形細胞瘤和混合性神經膠質瘤。III級和IV級腫瘤，稱為“高級別神經膠質瘤”，其具有這些特徵中的兩個或更多個，以及其包括間變型星形細胞瘤、間變型少突神經膠質瘤、間變型少突星形細胞瘤、間變性室管膜瘤和膠質母細胞瘤(包括钜細胞膠質母細胞瘤和膠質肉瘤)。在這些實施方式的一方面，神經膠質瘤是低級別神經膠質瘤。在這些實施方式的另一方面，神經膠質瘤是高級別神經膠質瘤。在這些實施方式的另一方面，神經膠質瘤是膠質母細胞瘤。
在一些實施方式中，可以將oHSV-1與有效治療癌症的其他藥劑組合。例如，癌症的治療可以用溶瘤病毒和其它抗癌療法(例如抗癌劑或手術)來實施。在本技術中，預期溶瘤病毒療法可以與化學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑或其他生物學干預聯合使用。
“抗癌”劑能夠負面地影響對像中的癌症，例如通過殺死癌細胞、誘導癌細胞凋亡、降低癌細胞的生長速率、降低轉移的發生率或數量、減小腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌細胞的血液供應、促進針對癌細胞或腫瘤的免疫反應、預防或抑制癌症的進展或增加癌症患者的壽命。抗癌劑包括生物製劑(生物治療)、化學治療劑和放射治療劑。更普遍地，這些其它組合物將以有效殺死或抑制細胞增殖的組合量提供。該過程可以涉及使細胞與表現構建體和試劑或多種因子同時接觸。這可以通過使細胞與包括兩種藥劑的單一組合物或藥理學製劑接觸，或通過使細胞與兩種不同的組合物或製劑同時接觸來實現，其中一種組合物包括表現構建體，而另一種包含第二種試劑。
在一些實施方式中，將本文公開的oHSV-1與佐劑組合。在 一個實施方式中，佐劑是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸。細菌脫氧核糖核酸(DNA)中的未甲基化二核苷酸CpG基序具有刺激幾種免疫細胞分泌細胞因子以增強先天免疫和適應性免疫的優點。
可以在其他藥物治療之前或之後幾分鐘至幾週的時間間隔內進行病毒療法。在將其他藥劑和溶瘤病毒分別施用於細胞的實施方式中，通常將確保在每次遞送時間之間不間隔相當長的一段時間，以使得藥劑和病毒仍然能夠有利地施加對細胞的聯合作用。在這樣的情況下，預期可以在彼此間隔約12-24小時之內使細胞與兩種療法接觸。但是，在某些情況下，當各自施用間隔了幾天(2、3、4、5、6或7天)到幾週(1、2、3、4、5、6、7或8週)的時間時，可能需要顯著延長治療的時間。
在一些實施方式中，在施用本文公開的oHSV-1或本文公開的藥物組合物之前、同時或之後向對象施用第二療法。在一些實施方式中，第二療法是化學治療、放射治療、免疫治療和/或手術干預。在一些實施方式中，對像是人類。
本發明中使用的序列總結如下。
Figure 110145204-A0101-12-0036-1
Figure 110145204-A0101-12-0037-2
實施例
如下面的實施例所證明的，一種缺失兩份拷貝的γ34.5基因且進一步缺失內部反向重複區的基因工程化oHSV-1病毒，在針對各種腦腫瘤細胞方面，相對於非腦腫瘤細胞或正常細胞而言，表現出更高的抗腫瘤活性。具有本領域已知的相似基因組結構的oHSV-1病毒(例如T3011、R3616、WT毒株F)在腦腫瘤細胞殺傷方面比本文公開的oHSV-1(即C1212、C5252、C8282)效率更低，這些結果是令人驚訝的。
oHSV-1C5252、C8282和C1212的構建
oHSV-1 C5252的構建
oHSV-1T3011、C5252、C8282及C12122的基因組結構如圖1所示。
詳細來說，C5252包含γ34.5基因的缺失、在UL3和UL4之間抗人PD-1抗體表現盒的***、以及由IL-12表現盒替代的經修飾的內部重複(IR)區。重組病毒是在細菌人工染色體(BAC)系統的說明下分幾個步驟構建的。病毒構建體的細節描述如下。
使用具有兩份拷貝的γ34.5基因缺失排列的HSV-1 BAC(BAC-Δ34.5)。在野生型基因組的背景下，分別通過兩組引子(GAAGATCTAATATTTTTATTGCAACTCCCTG(SEQ ID NO：5),CTAGCTAGCTTATAAAAGGCGCGTCCCGTGG(SEQ ID NO：6))和(GCTCTAGATTGCGACGCCCCGGCTC(SEQ ID NO：7),CCTTAATTAAGGTTACCACCCTGTAGCCCCGATGT(SEQ ID NO：8))從HSV-1病毒基因組PCR擴增下述IL-12表現基因盒：上游側接核苷酸117005，下游連接核苷酸132096，並***到基因置換質粒pKO5中，產生pKO1407。然後將pKO1407電穿孔轉染到攜帶BAC-Δ34.5的大腸桿菌中以產生BAC-Δ34.5-IL12。然後，在野生型基因組的背景下，分別通過兩組引子(TCCCATGGATTTAACAAACGGGGGGGTGTCG(SEQ ID NO：9),GGCCCCCGAGGCCAGCATGACGTTATCT(SEQ ID NO：10))和(GAGTAACCGCCCCCCCCCCATGCCACCCTCAC(SEQ ID NO：11),GTGTTTTACTGCCACTACACCCCCGGGGAAC(SEQ ID NO：12))從HSV-1病毒基因組PCR擴增下述驅動PD-1 Fab基因的CMV啟動子的基因 盒：上游側接核苷酸11658，下游連接核苷酸11659，並在BglII和PacI位點連接到pKO5，以產生pKOE1002質粒。然後將pKOE1002質粒電穿孔轉染到攜帶BAC-Δ34.5-IL12的大腸桿菌中以產生BAC-5252。通過BAC-5252質粒的轉染，然後通過在Vero細胞中進行幾個步驟的噬菌斑純化和擴增，然後通過檢測IL-12和PD-1 Fab分泌(表1)和編碼蛋白ICP34.5表現(圖2)的γ34.5基因來鑒定病毒，以獲得C5252病毒。
C8282是C5252的功能相同的小鼠版本，除了在病毒基因組上的相同位置C8282攜帶IL-12的小鼠版本和小鼠抗PD-1抗體(單鏈抗體片段，scFv，含有分別具有如SEQ ID NO：13和14所示的序列的重鏈可變區和輕鏈可變區)，而C5252攜帶人IL-12和抗人PD-1抗體。
C1212是C5252的功能相同版本，除了在病毒基因組上的相同位置C1212攜帶CMV啟動子，然後是三個重複的終止密碼子和綠色螢光蛋白(GFP)，而C5252攜帶人IL-12和抗人PD-1抗體(PD-1 Fab，含有分別具有如SEQ ID NO：1-4所示的序列的重鏈可變區和恆定區以及輕鏈可變區和恒定區)。
C5252、C8282和C1212病毒的IL-12和抗PD-1抗體表現以及ICP34.5蛋白表現的確認
Vero細胞以每孔4×105個細胞的密度接種到6孔盤中。孵育過夜後，模擬感染細胞或以每個細胞1 PFU的HSV-1(F)、R3616、C5252、C8282、C1212感染細胞。分別在感染後6、12和24小時(H)收穫細胞。蛋白質在10%變性凝膠中進行電泳分離，並與抗體ICP34.5或GAPDH反應。GAPDH用作加樣對照(圖2)。在C5252、C8282和C1212感染後24小時(H) 收集的細胞上清液用於ELISA測定以檢測IL-12和抗PD-1抗體的表現水準。結果如表1所示。
表1. C5252、C8282和C1212的IL-12和抗PD-1抗體(PD-1 Ab)表現的檢測
Figure 110145204-A0101-12-0040-3
如表1所示，C5252和C8282病毒表現的IL-12和抗PD-1抗體被檢測到相當的水準。C1212是骨架病毒，檢測不到通過ELISA測定確定的IL-12以及抗PD-1抗體表現。
通過免疫印跡檢測的ICP34.5蛋白表現如圖2所示，表明ICP34.5蛋白在C5252、C8282、C1212和R3616感染樣品中缺乏表現，而在野生型(WT)F感染樣品中表現。
以上結果均表明通過IL-12、抗PD-1抗體表現和ICP34.5蛋白表現缺失確認重組病毒C5252、C8282和C1212。
體外細胞殺傷活性-腦腫瘤細胞株
A172、D54-MG、U87-MG、U138-MG和D458細胞被接種到96孔盤(4000個細胞/孔)上並用F、R3616、T3011和C5252(0.1和1.0 PFU/細胞)感染。感染48小時後(48Hp.i.)，通過CCK8-Kit確定細胞活性。抑制率=(未經感染的孔的OD-經oHSV感染的孔的OD)/(未經感染的孔的OD-空白孔的OD)×100%。空白孔僅含有培養基。實驗中的所有值均表示 為平均值±SEM。結果如表2所示。
表2. HSV-1 WTF、R3616、T3011和C5252對腦腫瘤細胞株的體外細胞殺傷活性
Figure 110145204-A0101-12-0041-4
如表2所示，oHSV-1 C5252在以1.0 PFU/細胞測試的所有腫瘤腦細胞中都是有效的細胞殺傷劑。在細胞株A172、D54-MG、U138-MG中，在測試的oHSV-1病毒中C5252表現出最高的細胞殺傷能力。對於細胞株U87-MG和D458，C5252的抗腫瘤作用與T3011相當。與也是γ34.5基因無效的oHSV-1的R3616相比，C5252在大多數測試的細胞株中的有效性幾乎是2到3倍。
體外細胞殺傷活性-非腦腫瘤細胞株
細胞被接種到96孔盤(4000個細胞/孔)上並用F、T3011和C5252(0.1和1.0 PFU/細胞)感染。感染48小時後(48H p.i.)，通過CCK8-Kit確定細胞活性。抑制率=(未經感染的孔的OD-經oHSV感染的孔的OD)/(未經感染的孔的OD-空白孔的OD)×100%。空白孔僅含有培養基。實驗中的所有值均表示為平均值±SEM。結果如表3所示。
表3. HSV-1 WTF、R3616、T3011和C5252對非腦腫瘤細胞株的體外細胞殺傷活性
Figure 110145204-A0101-12-0042-5
Figure 110145204-A0101-12-0043-6
如表3所示，當在非腦腫瘤細胞株中進行測試時，T3011和C5252針對各種非腦腫瘤細胞都是有效的腫瘤殺傷劑。注意到在本實施例中測試的所有8種細胞株中，無論是在較低或較高的感染複數(MOI)下，C5252的抗腫瘤活性基本上等同於T3011。這是出乎意料的，因為C5252是T3011的進一步減毒版本，缺失了γ34.5基因的第二份拷貝。然而，γ34.5基因的第二份拷貝的缺失對oHSV-1病毒針對非腦腫瘤細胞的抗腫瘤活性沒有顯示出不利影響，但顯著提高了其針對腦腫瘤細胞的腫瘤殺傷效果(如表2所示)。因此，本文公開的oHSV-1病毒在腫瘤殺傷方面比其來源的oHSV-1普遍地更有效。
C5252對人惡性神經膠質瘤細胞的增殖的體外抑制評估
如圖3所示，C5252對人神經膠質瘤細胞株U87-MG、U138-MG、U373-MG、D54-MG和U251-MG的敏感性基本一致，C5252和C1212針對這些神經膠質瘤細胞的IC50值小於10 MOI。C5252的抑制作用與骨架C1212相當。將異源性基因併入病毒的基因組並沒有顯著影響oHSV的複製和抑制能力，但當體內施用時，由於oHSV-1病毒表現的免疫刺激劑(IL-12)和免疫治療劑(抗PD-1抗體)的性質，將顯著說明個體的免疫系統殺死腫瘤細胞。
C5252對正常細胞和腫瘤細胞的抑制作用
如圖4所示，C5252對腫瘤細胞U373-MG和ACHN的IC50值分別為6.890和9.102 MOI，C5252對正常細胞HA和HRGEC的IC50值均大於500 MOI。本實驗的條件下，C5252對正常細胞無明顯抑制作用，但對腫瘤細胞有顯著的抑制作用。與正常細胞相比，C5252的抑制作用對人腫瘤細胞具有更高的靶向作用。結果表明，C5252選擇性殺死腫瘤細胞，同時使正常細胞不受傷害。
C8282在C57BL/6小鼠中GL261皮下植入模型的治療中的功效研究
C8282是C5252的小鼠替代品，其中將小鼠IL-12(m-IL-12)和抗小鼠PD-1(m-PD-1)抗體引入病毒基因組以替代相應的人類對應物。如圖5所示，C8282瘤內注射針對GL261皮下腫瘤模型顯示出顯著的功效。當小鼠用劑量
Figure 110145204-A0101-12-0044-37
5×106 PFU/動物的C8282治療時，動物耐受良好。5×105 PFU/動物的中等劑量水準在測試的劑量範圍中表現出最高的功效。
C5252在裸鼠中正交的U87人神經膠質瘤模型的治療中的療效研究
如圖6所示，C5252腦內注射針對裸鼠中U87-MG細胞顯示出顯著的功效。不同劑量水準無顯著差異。
應當理解，雖然本發明已經通過優選實施方式和任選的特徵被具體公開，但是對本文所呈現的內容的修改、改進和變化是本領域技術人員容易意識的，並且這些修改、改進和變化被認為是在本發明的範圍內。本文提供的材料、方法和實施例是優選的實施方式的代表，是示例性的， 並非意圖作為對本發明範圍的限制。
<110> 深圳市亦諾微醫藥科技有限公司
<120> 用於腦腫瘤治療的溶瘤性I型單純皰疹病毒
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 抗hPD-1 Fab重鏈可變區
<400> 1
Figure 110145204-A0101-12-0046-7
Figure 110145204-A0101-12-0047-8
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 抗hPD-1 Fab重鏈恆定區
<400> 2
Figure 110145204-A0101-12-0048-9
Figure 110145204-A0101-12-0049-10
Figure 110145204-A0101-12-0050-11
Figure 110145204-A0101-12-0051-14
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 抗hPD-1 Fab輕鏈可變區
<400> 3
Figure 110145204-A0101-12-0052-15
Figure 110145204-A0101-12-0053-16
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 抗hPD-1 Fab輕鏈恆定區
<400> 4
Figure 110145204-A0101-12-0054-17
Figure 110145204-A0101-12-0055-18
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 5
Figure 110145204-A0101-12-0055-19
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
Figure 110145204-A0101-12-0056-20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 7
Figure 110145204-A0101-12-0056-21
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 8
Figure 110145204-A0101-12-0057-22
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 9
Figure 110145204-A0101-12-0057-23
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 10
Figure 110145204-A0101-12-0058-24
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 11
Figure 110145204-A0101-12-0058-25
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 12
Figure 110145204-A0101-12-0059-26
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 抗mPD-1 scFv重鏈可變區
<400> 13
Figure 110145204-A0101-12-0059-27
Figure 110145204-A0101-12-0060-28
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 抗mPD-1 scFv輕鏈可變區
<400> 14
Figure 110145204-A0101-12-0061-29
Figure 110145204-A0101-12-0062-30

Claims (27)

  1. 一種溶瘤性I型單純皰疹病毒(oHSV-1)，其包含一經修飾的基因組，其中該修飾包含：
    a)該基因組末端重複序列中的γ34.5基因的一拷貝的改變，使得γ34.5基因的該拷貝不能表現功能性ICP34.5蛋白；以及
    b)該基因組的內部反向重複區的缺失，使得雙拷貝基因中的每一個的一份拷貝和內部反向重複區內重複的非編碼序列的一份拷貝缺失，其中該雙拷貝基因包含編碼ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因，
    其中該基因組的UL和US成分中的所有單拷貝基因都是完整的，使得所有單拷貝基因能夠表現各自的功能性蛋白。
  2. 如請求項1所述的oHSV-1，其中該改變包含γ34.5基因的該拷貝的全部或部分的編碼區或調節區的缺失。
  3. 如請求項1或2所述的oHSV-1，其中該重複的非編碼序列包括ICP0的內含子、LAT結構域和“a”序列。
  4. 如請求項1或2所述的oHSV-1，其中UL和US成分中的所有單拷貝基因包括UL成分中的UL1至UL56基因和US成分中的US1至US12基因。
  5. 如請求項1所述的oHSV-1，其中HSV-1選自F毒株、KOS毒株和17毒株。
  6. 如請求項1所述的oHSV-1，其中HSV-1具有原型(P)的基因組異構體。
  7. 如請求項1所述的oHSV-1，其中該內部反向重複區的缺失導 致F毒株的基因組中核苷酸117005至132096的切除。
  8. 如請求項6所述的oHSV-1，其中該內部反向重複區的缺失係從UL成分中最後一個基因的終止密碼子開始至US成分中第一個基因的啟動子。
  9. 如請求項8所述的oHSV-1，其中UL成分中最後一個基因是UL56基因。
  10. 如請求項8或9所述的oHSV-1，其中US成分中第一個基因是US1基因。
  11. 如請求項1所述的oHSV-1，其進一步將一編碼免疫刺激劑和/或一編碼免疫治療劑的異源性核酸序列併入該oHSV-1，且該併入不干擾HSV-1基因組的天然基因的表現。
  12. 如請求項11所述的oHSV-1，其進一步將該編碼免疫刺激劑的和該編碼免疫治療劑的異源性核酸序列併入該oHSV-1。
  13. 如請求項11所述的oHSV-1，其中該免疫刺激劑係選自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。
  14. 如請求項13所述的oHSV-1，其中該免疫刺激劑是IL-12。
  15. 如請求項11至14中任一項所述的oHSV-1，其中該免疫治療劑是抗PD-1劑、抗CTLA-4劑或兩者。
  16. 如請求項15所述的oHSV-1，其中該免疫治療劑是抗PD-1 劑。
  17. 如請求項11所述的oHSV-1，其中該異源性核酸序列被併入所述內部反向重複區和/或UL成分中的UL3和UL4基因之間。
  18. 如請求項12所述的oHSV-1，其中該免疫刺激劑為IL-12且該免疫治療劑為抗PD-1劑。
  19. 如請求項18所述的oHSV-1，其中IL-12的異源性核酸序列被併入所述內部反向重複區，並且抗PD-1劑的異源性核酸序列被併入UL成分中的UL3和UL4基因之間。
  20. 一種用於腫瘤治療的藥物組合物，其包含有效量的權利要求1至18的任一項所述的oHSV-1和藥學上可接受的載體。
  21. 如請求項20所述的藥物組合物，其中該腫瘤是腦腫瘤。
  22. 如請求項21所述的藥物組合物，其中該腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。
  23. 如請求項22所述的藥物組合物，其中該腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
  24. 一種如請求項1至18的任一項所述的oHSV-1用於製備腫瘤治療的藥物的用途。
  25. 如請求項24所述的應用，其中該腫瘤是腦腫瘤。
  26. 如請求項25所述的應用，其中該腦腫瘤選自神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、少突神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、原始神經外胚層腫瘤、非典型腦膜瘤、惡性腦膜瘤和神經母細胞瘤。
  27. 如請求項25所述的應用，其中該腦腫瘤是多形性膠質母細胞瘤。
TW110145204A 2020-12-04 2021-12-03 用於腦腫瘤治療的溶瘤性ｉ型單純皰疹病毒 TW202223085A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
WOPCT/CN2020/133943 2020-12-04
CN2020133943 2020-12-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202223085A true TW202223085A (zh) 2022-06-16

Family

ID=81853831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110145204A TW202223085A (zh) 2020-12-04 2021-12-03 用於腦腫瘤治療的溶瘤性ｉ型單純皰疹病毒

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202223085A (zh)
WO (1) WO2022117073A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9102126D0 (en) * 1991-01-31 1991-03-13 Smithkline Beecham Biolog Novel vaccine
US6040169A (en) * 1991-01-31 2000-03-21 Medical Research Council Herpes simplex virus-1 deletion variants and vaccines thereof
US20130202639A1 (en) * 2010-03-25 2013-08-08 Konstantin G. Kousoulas Synthetic Herpes Simplex Viruses for Treatment of Cancers
EP3380621A4 (en) * 2016-04-22 2019-05-08 Immvira Co., Limited CONSTRUCTION OF THE VECTOR OF OBLIGATES ONCOLYTIC HERPES SIMPLEX VIRUSES (OHSV) AND CANCER THERAPY CONSTRUCTIONS
CN111712250A (zh) * 2017-11-16 2020-09-25 复诺健生物科技加拿大有限公司 靶向部分修饰的溶瘤病毒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022117073A1 (en) 2022-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108350468B (zh) 用于癌症治疗的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)专性载体及其构建体的构建
JP7038664B2 (ja) 操作された腫瘍溶解性ウイルス
US11117934B2 (en) Oncolytic virus platform to treat cancers with myxoma virus
JP2021533789A (ja) 組換え粘液腫ウイルスおよびその使用法
JP2024079686A (ja) 改変された腫瘍溶解性ウイルス、組成物、およびその使用
CN114375331B (zh) 用于脑肿瘤治疗的溶瘤性i型单纯疱疹病毒
US20240092852A1 (en) Multi-armed myxoma virus
TW202223085A (zh) 用於腦腫瘤治療的溶瘤性ｉ型單純皰疹病毒
TWI666321B (zh) 用於癌症治療的溶瘤性單純皰疹病毒（ｏＨＳＶ）專性載體及其建構體的建構
JP7235334B2 (ja) 癌の治療に用いる腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）偏性ベクター及びその構築体の構築
Suryadevara CAR T-cell Immunotherapy for Brain Tumors