TWI641684B

TWI641684B - 逆境人工篩選方法

Info

Publication number: TWI641684B
Application number: TW104128619A
Authority: TW
Inventors: 陳芝融; 段文宏
Original assignee: 國立臺東大學
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2018-11-21
Also published as: TW201708533A

Abstract

本發明係提供一種逆境人工篩選方法，用以生產適合培養於深層海水之釀酒酵母菌。不同於習知的酵母菌適合在pH4.5-5.0的環境中生長，本發明所提出的釀酒酵母菌突變株係能夠於pH2.0-3.0的環境中穩定生長。更進一步地，實驗結果同時顯示深層海水係有助於本發明之釀酒酵母菌突變株的穩定生長，或許，同時使用深層海水與釀酒酵母菌突變株進行釀酒，能夠有助於縮短釀酒製程之天數。此外，利用此釀酒酵母菌突變株SCI快速生長發酵之特性，亦能夠有助於縮短麵包發酵之製程。

Description

逆境人工篩選方法

本發明係關於酵母菌之技術領域，尤指一種逆境人工篩選方法，用以生產適合培養於深層海水之釀酒酵母菌。

根據中文百科在線記載，酵母菌(Saccharomyces yeast)是一群單細胞的真核微生物，主要分布在含糖質較高的偏酸性環境，如各種水果的表皮、發酵的果汁、蔬菜、花蜜、植物葉面、菜園果園土壤和酒麴之中。酵母菌是工業上最重要且應用最廣泛的一類微生物，可用來制做麵包以及含酒精的飲料，如啤酒、葡萄酒和白酒。

酵母菌本身含有豐富的蛋白質，對人類與動物來說甚具營養。製糖公司常將製糖產生的糖蜜用來培養酵母菌，做成酵母片或酵母粉。因此，在市售的健康食品之中，可以經常看到酵母粉末被標示為綜合營養素。

然而，多數細菌是不耐強酸的，空腹時，胃中的pH值是2~3，故僅有少量細菌能夠存活，即使是乳酸桿菌、鏈球菌等耐酸性菌，在胃液中每公克也僅有數百個。當食物進入時，因稀釋作用會導致酸性減弱，兩小時內菌數在胃液中每公克會急遽增至1萬至1億個，這時除了原有的細菌外，胃中又增加了許多由食物或唾液帶來的細菌。當胃液分泌增加而酸性再增強時，不耐酸菌會死去。根據中文百科在線之記載，雖然酵母菌能在pH值為3.0-7.5的範圍內生長，然而其最適合的生長環境的pH值為pH4.5-5.0。

鑑於上述原由，目前對於營養食品製造商而言最為重要的課題在於：如何培養出耐酸能力高的新穎酵母菌種。因此，本案之發明人極力加以研究發明，終於研發完成本發明之一種適合培養於深層海水之釀酒酵母菌。

本發明之主要目的，在於提供一種逆境人工篩選方法，用以生產適合培養於深層海水的釀酒酵母菌，不同於習知的酵母菌適合在pH4.5-5.0的環境中生長，本發明所提出的釀酒酵母菌的突變株SCI係能夠於pH2.0-3.0的環境中穩定生長。更進一步地，實驗結果同時顯示深層海水係有助於本發明之釀酒酵母菌突變株SCI的穩定生長，或許，同時使用深層海水與釀酒酵母菌突變株SCI進行釀酒，能夠有助於縮短釀酒製程之天數。此外，以pH2的YPD培養基及較高濃度的深層海水進行釀酒酵母菌突變株SCI之培養，利用酵母菌快速生長發酵之特性，能夠有助於縮短麵包發酵之製程。

圖1係顯示各實驗組別之培養時間-OD值的資料曲線圖。

為了能夠更清楚地描述本發明所提出之一種逆境人工篩選方法，用以生產適合培養於深層海水之釀酒酵母菌，以下將配合圖式，詳盡說明本發明之較佳實施例。

SCI釀酒酵母菌係由台灣國立臺東大學生命科學系陳芝融教授及其研發團隊所研發的一個優良的本土菌株，此釀酒酵母菌SCI具有高耐酸能力，並適合培養於深層海水(Deep Sea Water,DSW)之中。

於說明本發明之釀酒酵母菌突變株的逆境人工篩選方法之前，必須先行說明培養基的成分，係整理於下表(一)之中。

上表(一)之中，所述氮源可以是酵母萃取物、牛肉膏、蛋白腖、大豆腖、胰蛋白、玉米漿、酪蛋白、尿素、檸檬酸銨、或硫酸銨，其中較佳者為酵母萃取物(yeast extract)；並且，所述碳源可以是葡萄糖、半乳糖、D-核糖、木糖、果糖、α-乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、肌醇、山梨糖醇、D-甘露糖醇、檸檬酸、糊精、澱粉、或糖蜜，其中較佳者為葡萄糖(dextrose)。因此，較佳的培養基係為酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基(Yeast Peptone Dextrose medium,YPD medium)。特別地，本發明係以鹽酸(HCl)調整YPD培養平板(YPD plate)的pH值。在pH值大於等於3的YPD培養平板之中，其YPD培養基係包括有1.5%的瓊脂；並且，在pH值小於3的YPD培養平板之中，其YPD培養基係包括有3%的瓊脂。

繼續地，以下將開始說明本發明之用以生產適合培養於深層海水之釀酒酵母菌突變株的一種逆境人工篩選方式，其係包括幾個方法步驟。首先，係執行步驟(S01)：將菌種編號BCRC22729的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)接種至pH4的YPD培養基，接著將所述YPD培養基置入25℃的培養箱內，在16小時內可以觀測到YPD培養基之上有單一菌落生成。於此，必須特別說明的是，於前述步驟(S01)之中，若將釀酒酵母菌的原始菌株直接接種至pH2的YPD培養基並置入25℃的培養箱內，則在48小時之內仍無法觀測到YPD培養基之上有單一菌落生成。

完成步驟(S01)之後係接著執行步驟(S02)：將所述釀酒酵母菌接種至pH3的YPD培養基，接著將所述YPD培養基置入25℃的培養箱內，培養24小時，並於觀測到YPD培養基之上有單一菌落生成之後，於該pH3的YPD培養基之上選取直徑對大的菌落再次接種於另一個pH3的YPD培養基之上。接著，執行步驟(S03)：重複前述步驟的繼代培養動作，共5次。之後，可觀測到菌株於pH3的YPD培養基之上穩定生長。

繼續地執行步驟(S04)：以四區劃線法將前述步驟(S03)所得之菌株接種至pH2的YPD培養基上，並置入25℃的培養箱內，培養60小時。此時，尚無法於YPD培養基之上觀測到明顯的單一菌落生成。因此，需接著執行步驟(S05)：於該pH2的YPD培養基上挑選生長於第一區的細菌痕，將該細菌痕的菌株再次接種於pH2的YPD培養基上，並置入25℃的培養箱內，繼代培養60小時，重複前述步驟的繼代培養動作，直至培養60小時，可於pH2的YPD培養基上觀測到明顯單一菌落生成。完成步驟(S05)之後，培養60小時內可於pH2的YPD培養基上觀測到明顯單一菌落生成。

繼續地，係執行步驟(S06)：於前述之pH2的YPD培養基之中選取直徑最大的菌落，將該菌落的菌株再次接種至pH2的YPD培養基之中，並置入25℃的培養箱內進行培養，待觀測到明顯單一菌落生成之後，再次選取直徑最大的菌落接種至pH2的YPD培養基之中，直至繼代培養48小時可觀測到明顯單一菌落生成。(培養時間由60小時縮短為48小時)。完成步驟(S06)之後，培養48小時內可於pH2的YPD培養基上觀測到明顯單一菌落生成。最終，步驟(S06)之中所謂的能夠於pH2的YPD培養基之上生成單一菌落的酵母菌突變株即命名為SCI。

此酵母菌突變株SCI的該生物材料的特徵如下，在pH3的YPD平板上，以兼氣性狀態，25℃，培養24小時之後，可在平板上觀察到白色凸起粒狀、表面光滑、邊緣平整、直徑1-2mm的單一型態菌落。此酵母菌突變株SCI為不具運動性的卵圓形或者圓柱形細胞 (2~5x5~30μm)。此外，在pH2的YPD平板上，以兼氣性狀態，25℃，培養48小時之後，可在平板上觀察到白色凸起粒狀、表面光滑、邊緣平整、直徑約為0.5mm的單一型態菌落。

進一步地，為了確認此釀酒酵母菌突變株SCI是否具有其他生物特性，吾人係完成實驗一；其中，實驗一的組別共如下4組：(1)控制組(CTL group)：將釀酒酵母菌突變株SCI接種於一pH2的YPD培養基之中進行隔夜培養，接著並將隔夜培養的釀酒酵母菌突變株SCI加入新鮮pH2 YPD培養液之中，並藉由分光光度計之輔助將酵母菌突變株SCI的菌液稀釋調至OD₆₀₀=0.1；接著，將200ul的酵母菌突變株SCI的菌液置入96微量孔培養槽板(96-well microplate)之中的其中5個微量孔之中，最後將96微量孔培養槽板至於25℃的環境中，觀察酵母菌突變株SCI的生長狀況；(2)0.1%深層海水組(0.1%-DSW group)：將釀酒酵母菌突變株SCI接種於一pH2的YPD培養基之中進行隔夜培養，接著並將隔夜培養的釀酒酵母菌突變株SCI加入新鮮的pH2 YPD培養液之中，並藉由分光光度計之輔助將酵母菌突變株SCI的新鮮菌液調至OD₆₀₀=0.1；其中，所述新鮮菌液之中係含有適量的0.1%深層海水(Deep Sea Water,DSW)去鈉濃縮液；接著，並將200ul的酵母菌突變株SCI的菌液置入96微量孔培養槽板(96-well microplate)之中的其中5個微量孔之中；最後將96微量孔培養槽板至於25℃的環境中，觀察酵母菌突變株SCI的生長狀況； (3)0.5%深層海水組(0.5%-DSW group)：將釀酒酵母菌突變株SCI接種於一pH2的YPD培養基之中進行隔夜培養，接著並將隔夜培養的釀酒酵母菌突變株SCI加入新鮮的pH2 YPD培養液之中，並藉由分光光度計之輔助將酵母菌突變株SCI的新鮮菌液調至OD₆₀₀=0.1；其中，所述新鮮菌液之中係含有適量的0.5%深層海水(Deep Sea Water,DSW)去鈉濃縮液；接著，並將200ul的酵母菌突變株SCI的菌液置入96微量孔培養槽板(96-well microplate)之中的其中5個微量孔之中；最後將96微量孔培養槽板至於25℃的環境中，觀察酵母菌突變株SCI的生長狀況；(4)1%深層海水組(1%-DSW group)：將釀酒酵母菌突變株SCI接種於一pH2的YPD培養基之中進行隔夜培養，接著並將隔夜培養的釀酒酵母菌突變株SCI加入新鮮的pH2 YPD培養液之中，並藉由分光光度計之輔助將酵母菌突變株SCI的新鮮菌液調至OD₆₀₀=0.1；其中，所述新鮮菌液之中係含有適量的0.5%深層海水(Deep Sea Water,DSW)去鈉濃縮液；接著，並將200ul的酵母菌突變株SCI的菌液置入96微量孔培養槽板(96-well microplate)之中的其中5個微量孔之中；最後將96微量孔培養槽板至於25℃的環境中，觀察酵母菌突變株SCI的生長狀況。

請參閱圖1，為各實驗組別之培養時間-OD值的資料曲線圖。由圖1可以發現的是，在0-24小時的培養時間區段內，相對於1%-DSW組別的log(OD)值，0.1%-DSW組別與CTL組別的log(OD)值是相對低的；因此，實驗結果顯示，高濃度的深層海水有助於釀酒酵母菌突變株SCI之生長。然而，在48-132小時的培養時間區段內，可以發現各組別的釀酒酵母菌突變株SCI之生長已趨於飽和，其中又以0.1%-DSW組別的log(OD)值則相對較高；由此可知，0.1%-DSW組別之中的釀酒酵母菌突變株SCI的總菌數是最高的。

如此，發明人已完整且清楚地揭露本發明所提出的逆境人工篩選方法；總的來說，本發明係具有以下之優點：

(1)不同於習知的酵母菌適合在pH4.5-5.0的環境中生長，利用本發明所提出的逆境人工篩選方法所生產、分離獲得的釀酒酵母菌突變株SCI係能夠於pH2.0-3.0的環境中穩定生長。因此，本發明之釀酒酵母菌突變株SCI顯然具備潛力能夠被進一步開發為酵母片或酵母粉等營養品，並且，即使消費者在空腹時攝取該酵母片或該酵母粉，也不會發生營養攝取效果不佳的情況。

(1)此外，實驗結果同時顯示較高濃度的深層海水係有助於本發明之釀酒酵母菌突變株SCI的穩定生長，且較低濃度的深層海水有助於增加釀酒酵母菌突變株SCI的總菌數。或許，使用較低濃度的深層海水與釀酒酵母菌突變株SCI進行釀酒，係能夠利用酵母菌總菌數增加之特性加以縮短釀酒製程之天數；此外，以pH2的YPD培養基及較高濃度的深層海水進行釀酒酵母菌突變株SCI之培養，利用酵母菌快速生長發酵之特性，能夠有助於縮短麵包發酵之製程。(例如一些目前無法製作之含果醬/果粒麵包，如檸檬、鳳梨、梅子果粒麵包等)

必須加以強調的是，上述之詳細說明係針對本發明可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

Claims

一種逆境人工篩選方法，係用以對一酵母菌野生株進行一長期逆境人工篩選，以獲得一釀酒酵母菌突變株；其中，該長期逆境人工篩選方法係包括以下步驟：步驟(1)：將菌種編號BCRC22729的一釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)接種至酸鹼值為pH4的一第一酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基(Yeast Peptone Dextrose plate,YPD plate)，接著將該第一酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基置入25℃的培養箱內，在16小時內可以觀測到該第一酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上有該釀酒酵母菌的單一菌落生成；步驟(2)：將前述步驟(1)培養而得的釀酒酵母菌接種至酸鹼值為pH3的一第二酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基，接著將該第二酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基置於溫度控制在25℃的培養箱內，培養24小時；並且，於酸鹼值為pH3的該第二酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之中添加濃度至少為0.1%的深層海水，有助於該釀酒酵母菌之穩定生長；進一步地，於觀測到單一菌落生成之後，於該第二酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上選取直徑最大的菌落，將該菌落內的釀酒酵母菌接種於另一個第二酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上；步驟(3)：重複前述步驟(2)的繼代培養程序，共5次；接著，可以觀測到菌株於酸鹼值為pH3的該第二酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上穩定生長；步驟(4)：以四區劃線法將前述步驟(S3)所得之菌落內的釀酒酵母菌進一步地接種至酸鹼值為pH2的一第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基上，並置於溫度控制在25℃的培養箱內，培養60小時；其中，於酸鹼值為pH2的第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之中添加濃度至少為0.1%的深層海水，有助於該釀酒酵母菌之穩定生長；步驟(5)：於該第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基上挑選生長於第一區的至少一細菌痕，將該細菌痕內的釀酒酵母菌接種於另一個第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上，並置入25℃的培養箱內，進行歷時60小時的繼代培養；進一步地，重複前述60小時的繼代培養之程序，共1次，接著便能夠在酸鹼值為pH2的第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上觀測到明顯單一菌落生成；步驟(6)：於該第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之中選取直徑最大的菌落，將該菌落內的釀酒酵母菌接種另一個酸鹼值為pH2的第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上，並置於溫度控制在25℃的培養箱內進行培養，直至觀測到明顯單一菌落生成；進一步地，自該第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基上之中選取直徑最大的菌落，將菌落內的釀酒酵母菌接種至另一個酸鹼值為pH2的第三酵母粉腖葡萄糖瓊脂培養基之上，進行歷時48小時的繼代培養之後便能夠觀測到明顯單一菌落生成；其中，步驟(6)最終獲得之單一菌落係為該釀酒酵母菌突變株之菌落，且該釀酒酵母菌突變株係能夠於酸鹼值落於pH2.0至pH3.0的環境中穩定生長。
如申請專利範圍第1項所述之逆境人工篩選方法，其中，使用該釀酒酵母菌突變株進行一釀酒製程之時，係有助於縮短該釀酒製程之天數。
如申請專利範圍第1項所述之逆境人工篩選方法，其中，該釀酒酵母菌突變株可應用於製作含果醬或果粒之麵包。