TWI640315B - 抗糖化劑的製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題係提供含有特定的乳酸菌的發酵代謝物的抗糖化劑、壽命延長劑和老化抑制劑。
本發明之解決手段係本發明的一個實施方式的抗糖化劑、壽命延長劑和老化抑制劑具有含有以乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H-61株的發酵代謝物作為有效成份的特徵。
Description
本發明係關於含有特定的乳酸菌的發酵代謝物的抗糖化劑、壽命延長劑和老化抑制劑。
在迎來老齡化社會、促進健康的背景之下,對抑制老化、延長壽命的關注逐漸聚焦。例如,在專利文獻1中,揭示了以蝦青素為有效成份的壽命延長劑、抗氧化功能改善劑。
此外,作為促進健康的功能性食品,益生菌被廣為人知。益生菌一般定義為“通過改善宿主腸道菌群的平衡,對宿主動物有正面效益的活性微生物添加物”(參照非專利文獻1)。根據該定義,益生菌係乳酸菌的活菌體,活著到達腸道,因刺激腸道菌群的運動,能提高腸道免疫力,發揮有益作用。例如,在專利文獻2中,揭示了通過抑制骨質密度降低或皮膚潰瘍的發生從而抑制老化的乳酸菌。
或者,即使是死菌體也會顯示出有益的作用,也有將
益生菌的定義擴大的見解(參照非專利文獻2)。例如,專利文獻2中,揭示了死菌體也有與活菌體同樣的效果的旨趣。
因此,近年來,除了益生菌,提出了生物數據庫(參照非專利文獻3)。生物數據庫定義為直接,或者通過腸道菌群,起到免疫刺激,降低膽固醇的作用,降血壓作用,調節腸道作用,抗腫瘤作用,抗血栓‧造血作用等的生物調節,生物防禦,疾病預防‧恢復,控制老化等的活性食品成份。即,生物數據庫,與益生菌不同,不僅僅能對腸道菌群發揮作用,還能直接作用於腸道免疫力,能期待其促進健康。鑒於上述定義,死菌體,作為生物數據庫也能達到上述有益的作用。
此外,作為生物數據庫的一例,除含有死菌等的乳酸菌的菌體成份外,還能列舉乳酸菌發酵代謝物及這些的混合物等。
專利文獻1 專利4604207號
專利文獻2 特開2012-72132號公報
非專利文獻1 Fuller,(1989)J.Appl.Bacteriol., 66,365-378
非專利文獻2 Salminen et al.,(1999) Trends Food Sci. Technol.,10,107-110
非專利文獻3光岡知足編Probiotic.prebiotic.biogenic財團法人日本雙歧桿菌中心2006年6月
在此,乳酸菌發酵代謝物,因具有不同於菌體的成份,關於具體的作用的認識較少。
鑒於以上情況,本發明的目的在提供一種含有特定的乳酸菌的發酵代謝物的抗糖化劑、壽命延長劑和老化抑制劑。
為了達成上述目的,本發明的一實施方式的抗糖化劑具有含有以乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H-61株的發酵代謝物作為有效成份的特徵。
本發明的抗糖化劑,因含有上述乳酸菌的發酵代謝物作為有效成份,具有非常高的抑制晚期糖化終產物(Advanced Glycation End-products;AGEs)生成的活性。AGEs是指Glucose(葡萄糖)等的還原糖,與蛋白質的氨基發生非酶反應(美拉德反應)生成的物質,被稱為誘發心肌梗塞、腦梗塞、骨質疏鬆、白內障、糖尿病併發症的原因物質。本發明的抗糖化劑因可抑制AGEs的生成,能夠防止這些疾患的
發生。
上述發酵代謝物也可不含有菌體。
本發明的發酵代謝物,即使不含有菌體,也具有非常高的抗糖化作用。
上述發酵代謝物,也可在至少含有豆漿、牛奶、山羊奶以及綿羊奶中的任意一個的培養基中發酵上述乳酸菌而生成。
本發明的一實施方式的壽命延長劑,具有以乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H-61株的發酵代謝物作為有效成份的特徵。
本發明的壽命延長劑,能夠延長生物的壽命,能夠增加從誕生到死亡的期間。
此外,壽命的延長也可由於抗糖化。
如上所述,上述發酵代謝物,具有抗糖化的作用,能夠防止由心疾患、腦疾患等為死因的疾患的發生,由於抗糖化而得以延長壽命。
此外,上述發酵代謝物也可不含有菌體。
上述發酵代謝物,也可在至少含有豆漿、牛奶、山羊奶以及綿羊奶中的任意一個的培養基中發酵上述乳酸菌而生成。
本發明的一實施方式的老化抑制劑,具有以乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H-61株的發酵代謝物作為有效成份的特徵。
此外,上述發酵代謝物具有抗糖化的作用,能夠防止由心疾患、腦疾患等為死因的疾患的發生,抑制老化,也可由於抗糖化。
圖1係為表示在含有本發明的發酵代謝物的培養液中,培養的線蟲的壽命曲線的圖表。
以下,對本發明的實施形態進行說明。
本發明,通過發明者們的廣泛研究,發現乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H-61株(下面稱為H-61株)的發酵代謝產物,具有抗糖化作用和壽命延長作用、以及以這些為起因的抑制老化作用,得以完成。從前的研究,獲得了關於乳酸菌的菌體自體的抑制老化、增進健康的認識(參照專利文獻2等)。但是,菌體異常稀少,或者幾乎沒有關於不含菌體的乳酸菌的發酵代謝物的知識。本發明,因發現乳酸菌的發酵代謝物自體具有,從菌體無法預期的顯著的抗糖化作用、延長壽命作用、以及伴隨著這些的抑制老化作用,得以完成。
本發明的H-61株,寄託與獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄託中心,受託號為NITE P-92(參照專利文獻2)。此外,上述H-61株也寄託與獨立行政法人農業生物資源研究所的農業生物資源基因庫,號碼為MAFF No.400007。
本發明的發酵代謝物為,在任意的條件下使H-61株發酵後,除去菌體的物質,菌體非常少或者不含有菌體。即,本發明的發酵代謝物,主要含有乳酸、各種氨基酸等。“不含菌體”發酵代謝物是指,實質地不含有菌體,例如,發酵後,用直徑為0.1-0.5um以下的過濾器過濾培養液得到的濾液,以及該濾液的處理物。且也包含過濾前按常規方法同質化培養液的物質。
用於本發明的發酵代謝物的製造的發酵培養基,可為例如,牛奶、豆漿、山羊奶、綿羊奶或者這些的混合物的物質。這樣,能提高H-61株的發酵效率。
本發明的發酵代謝物也可用例如,按照通常的方法培養上述菌株,使之發酵後,殺菌,過濾發酵液的方法來製造。發酵條件不做特別限定。例如,上述發酵代謝物,可為在20℃-40℃的發酵溫度下發酵得到的物質。此外,上述發酵代謝物,可為在70個小時以上,理想的為70個小時-700個小時發酵得到的物質。
上述發酵液,按照通常的方法加熱殺菌以及懸濁、過濾。過濾,如上所述,採用直徑為0.1-0.5um以下的過濾器。且,可用直徑較大的過濾器過濾後,再用上述的過濾器進行過濾。
本發明的發酵代謝物,包含在上述濾液中。且,上述濾液,可根據攝取形式適宜地實施用蒸發器的脫乙醇處理或加熱殺菌處理等。上述濾液以下稱之為發酵代謝物含有液。
本發明的抗糖化劑,具有含有上述發酵代謝物作為有效成份的特徵。上述抗糖化劑具有非常高的晚期糖化終產物(Advanced Glycation End-products;AGEs)生成抑制活性。AGEs是指Glucose(葡萄糖)等的還原糖,與蛋白質的氨基發生非酶反應(美拉德反應)生成的物質。AGEs積聚在血管中就成為了心肌梗塞、腦梗塞的一個原因、積聚在骨骼中就成為骨質疏鬆的一個原因、積聚在眼睛中就成為白內障的一個原因。此外,AGEs也被稱為是糖尿病性視網膜病、糖尿病性腎病等的糖尿病併發症的原因物質。即,抑制AGEs的生成,能夠有效地抑制死因多為心臟疾患、腦疾患、糖尿病併發症等的發生,與抑制老化、延長壽命相關聯。
本發明的壽命延長劑具有含有上述發酵代謝物作為有效成份的特徵。本發明的壽命延長劑,能夠延長生物的壽命,能夠增加從誕生到死亡的期間。本發明的壽命延長劑,能夠使生物的平均壽命增加例如1.1-1.5倍。本發明的壽命延長劑的延長壽命的一個原因是抗糖化,其他的也能考慮到因各種作用而產生。
本發明的老化抑制劑,具有含有上述發酵代謝物作為有效成份的特徵。如上述,能夠抑制由於AGEs的積聚導致的與衰老相關聯的血管疾患、腦疾患等發生。因此,本發明的老化抑制劑的抑制老化的一個原因是抗糖化,其他的也能考慮到因各種作用而產生。
本發明的抗糖化劑、壽命延長劑以及老化抑制劑,根
據使用目的能夠用不同的方法製劑化,例如,冷凍乾燥粉末、噴霧乾燥的粉末、懸浮在液體中等的方法均能適用。此外,伴隨著製劑化,也可加入適宜的添加物。
本發明的抗糖化劑、壽命延長劑以及老化抑制劑可組合為,上述發酵代謝物含有液一天每1kg體重攝取0.001-2ml,理想的為0.01ml-0.2ml。且劑量能根據被給藥人(動物)的年齡、症狀的程度、給藥形態進行調整。且,本發明的抗糖化劑、壽命延長劑以及老化抑制劑,能夠採用在牛奶、豆漿等中培養的上述發酵代謝物含有液作為發酵乳。
(實施例1)
豆漿倒入500ml容器中用通常的方法加熱滅菌,冷卻後用作豆漿培養基。H-61株按照通常方法,預先7天培養。然後將培養好的H-61株接種到豆漿培養基中,在約35℃下培養一晝夜,使菌體增殖到1×109CFU/ml。然後按照通常方法加熱殺菌,加入乙醇均質化處理,進行1次過濾。再將該1次過濾液用0.2um直徑的中空纖維膜進行2次過濾。該2次過濾液通過蒸發器進行脫乙醇處理,加入90%的乳酸,用通常方法進行加熱殺菌。這樣就製造完成了實施例1的發酵代謝物含有液。
(實施例2)
實施例2。除取代豆漿、採用牛奶(脫脂奶粉)的牛奶
培養基以外,均與實施例1同樣地製造發酵代謝物含有液。
(試驗例1 AGEs生成抑制活性測定)
用實施例1和實施例2,進行AGEs生成抑制活性的測定。
首先,準備樣本。製作作為本試驗例的樣本的與實施例1及實施例2分別相關的發酵代謝物含有液(以下稱為原液),以及用緩衝液將各原液10倍稀釋的液體及100倍稀釋的液體(參照後述表1)。緩衝液,採用磷酸緩衝液(PH7.4)。
各個樣本,用螢光測定法測定AGEs生成抑制活性。即,在360mg/mL的葡萄糖的水溶液0.5mL、40mg/mL的BSA(Bovine Serum Albumin)水溶液1.0mL、磷酸緩衝液(PH7.4)2.5mL以及純水0.5mL中添加各個樣本0.5mL,生成測定液。製作加入純水0.5mL代替樣本的控制液。接著,各測定液及控制液在60℃下、經40小時培養。之後,培養後的測定液及控制液,在螢光分光光度計中以激發波長270nm、螢光波長440nm測定螢光強度。相對控制液的螢光強度,算出添加各樣本時的螢光強度的減少率,作為AGEs生成抑制率。
表1為顯示本試驗例的結果的圖表。如表所示,實施例1及實施例2均能看到AGEs生成抑制活性。稀釋率越低AGEs生成抑制率越高,採用豆漿發酵的實施例1與採用牛奶發酵的實施例2得到同樣的結果,因此,能確認本實驗例的抗糖化活性是由本發明的H-61的發酵代謝物產生的。
在實施例1及實施例2的原液中,具有幾乎100%的AGEs生成抑制率。因此,能確認本發明的H-61的發酵代謝物具有非常高的AGEs生成抑制活性。
(試驗例2 線蟲壽命測定)
測定在實施例1與實施例2中線蟲的壽命。
線蟲(Caenorhabditis elegans)作為壽命較短在3-4周(培養溫度20℃),全基因組已被解明的生物模型被使用。在老化和氧化應激的關係方面進行了很多研究,也用來探索對壽命有影響的物質。本實驗例中,採用fer-15變異株。fer-15變異株具有在25℃以上不能生產下一代的特徵,具有測定壽命時不會混入下一代線蟲的益處。
首先,準備表2的組成的S-medium。S-medium中的Trace metals solution的組成如表3所示。S-medium中使作為餌料的大腸桿菌OP-50株懸浮,作為線蟲的培養液。用該培養液將線蟲培養到成蟲(20℃、200rpm)。之後,如表4所示,在S-buffer中回收線蟲,洗淨後,用NaOH溶液及
液氯漂白劑(商品名稱Haiter花王株式會社)使線蟲的身體溶解,從體內回收卵。回收後的卵在20℃下培養一晚使之孵化。孵化出的L1幼蟲,用培養瓶在26℃、100rpm下以大腸桿菌OP-50株為餌進行同步培養。此時,將每個培養瓶線蟲調節為2000條。卵回收後第5日將氨芐青黴素及各樣本加入到培養瓶中。各樣本,添加實施例1及實施例2的發酵代謝物含有液(原液),使培養液中終濃度被11倍稀釋以及101倍稀釋。控制液添加純水。之後,每隔數日取一定量的培養液,調查線蟲的生存數,第5日的生存數作為100%,描繪生存曲線,算出平均壽命及最長壽命。
【表3】
圖1為顯示線蟲的壽命曲線的圖表,表5為表示線蟲的平均壽命、最長壽命以及壽命延長率的圖表。壽命延長率,如將控制液的平均壽命作為100%時的各樣本的平均壽命的這些圖表所示,針對控制液線蟲的壽命有意地延長,本發明的各實施例確認了壽命延長作用。尤其是,參照壽命延長率,11倍稀釋後的實施例1的物質,30%以上延長了平均壽命,101倍稀釋後的實施例1的物質以及11倍稀釋後的實施例2的物質,20%以上延長了平均壽命。此外,101倍稀釋後的實施例2的物質,10%以上延長了平均壽命。
【表5】
此外能看到培養液中的發酵代謝物含有液的濃度越高越有延長壽命的傾向。這樣,確認了本實驗例中的壽命延長是由於本發明的發酵代謝物。
加之還確認了在含有豆漿的培養基中發酵的實施例1比在含有牛奶的培養基中發酵的實施例2具有稍高的壽命延長作用。
根據上述,確認了本發明的發酵代謝物具有非常高的抗糖化作用和壽命延長作用。壽命延長作用被認為是由各種作用機制來實現的,而作為作用機制的一種,認為與抗糖化作用有關。此外,也認為與其他的抗氧化、酪氨酸酶抑制活
性、膠原酶抑制活性、脂肪酶抑制活性、血管緊張素轉換酶抑制活性等相關。
實施例1和實施例2分別用了含有豆漿和含有牛奶的培養基,但即使是含有與牛奶具有同樣構成的山羊奶、綿羊奶的培養基,或者其他的培養基中發酵H-61株的發酵代謝物,都能得到與實施例1及實施例2同樣的結果。
本發明的發酵代謝物因為具有壽命延長作用及抗糖化作用,所以能稱其具有與這些相關的老化抑制作用。
(考察)
參照專利文獻1,報告了上述H-61株的活菌體和死菌體具有抑制骨密度降低的效果、抑制皮膚潰瘍發生的效果、以及抑制以這些為起因的老化的效果。該情況下,活菌體和死菌體中共同含有的成份,即主要構成菌體的蛋白質、核酸、其他的微量成份作用於腸道免疫力等,發現了上述作用。但是與專利文獻1相關的骨質密度降低抑製劑、皮膚潰瘍抑製劑以及老化抑製劑,收集培養的上述H-61株、採用洗淨的菌體(參照專利文獻1的[0015][0018][0020]段落),因此實質上不含有上述H-61株生成的發酵代謝物。
本發明,確認了除去菌體的發酵代謝物具有非常高的抗糖化作用及延長壽命作用。當然,菌體和發酵代謝物含有的成份有很大不同,菌體含有主要構成菌體的蛋白質、脂類等,與之相對,發酵代謝物主要含有乳酸、各種氨基酸。因此,本發明的發酵代謝物,至少通過與菌體不同的機理,發
揮了顯著的抗糖化作用及延長壽命作用。因而,乳酸菌的發酵代謝物自體具有抑制老化的作用等,本發明展示了這一新的知識。
Claims (3)
- 一種抗糖化劑的製造方法,係用以製造含有乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)H-61株的發酵代謝物作為有效成份之抗糖化劑,並包含有:培養含有前述乳酸菌之培養基而使前述乳酸菌發酵之步驟;以及藉由過濾含有前述乳酸菌之發酵物而去除菌體之步驟。
- 如請求項1所記載之抗糖化劑的製造方法,其中過濾前述菌體之步驟係用直徑為0.1um至0.5um以下的過濾器過濾。
- 如請求項1或2所記載的抗糖化劑的製造方法,其中含有前述乳酸菌之培養基至少含有豆漿、牛奶、山羊奶以及綿羊奶的任意一個。
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