TWI638889B - 枯草桿菌khy8菌株及其增量培養方法與用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株及其增量培養方法與用途；KHY8菌株之培養方法包含以特定成分之培養基，於一特定培養條件下培養3~8日，以獲得高菌量濃度之枯草桿菌發酵液；KHY8菌株對蓮霧黑腐病菌、芒果炭疽病菌、芒果畸形病菌、紅龍果濕腐病菌、紅龍果果腐病菌、水稻稻熱病菌、蓮霧果腐病菌、鳳梨青黴菌、褐根病菌、芒果黑斑病菌、十字花科黑腐菌、小白菜軟腐病菌及茄科細菌性斑點病菌等植物病原菌具抗生活性，能抑制多種植物病原菌之生長，並可實際應用作為防治芒果黑斑病、炭疽病及水稻稻熱病等植物病害之生物農藥。

Description

枯草桿菌KHY8菌株及其增量培養方法與用途

本發明係關於一種具有抑制多種植物病原生長效果之枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株及其增量培養方法與用途。

農業上使用的化學農藥雖然方便，但卻容易造成使用者中毒、環境汙染甚至殘留於作物上導致食用者中毒等狀況，因此減少以化學藥劑防治病原菌一直是農業發展的目標。生物農藥係指可作為植物保護之天然物質，例如動物、植物、微生物及其衍生的產品；例如萃取自植物的除蟲菊精、魚藤精，或是蘇力菌與斜紋夜蛾性費洛蒙等等，因可用於抑制植物病原菌生長、害蟲侵犯或是雜草防治等等，故都可視為生物農藥。

中華明國專利第TW I417052(B)號發明專利係一種液化澱粉芽孢桿菌( Bacillus amyloliquefaciens)菌株及其用途，可用於抑制多種植物病原菌的生長，包含石榴立枯病菌、葵百合立枯絲核菌、胡麻葉枯病菌、蓮霧果腐病菌、番石榴瘡痂病菌等等。又，中華民國專利第TW I444141(B)號發明專利係為蠟蚧輪枝菌( Lecanicillium muscarium)V-5菌株、使用該菌株之害蟲防制方法及含有該菌株之微生物農藥，V-5菌株可以防治粉蝨類、蚜蟲類、葉蜹、薊馬類、銹蜹類、斑潛蠅、蠹蟲類、夜蛾類及天牛類等植物害蟲的侵害。再者，中華民國專利第TW I510619(B)號發明專利係一種可用於防治瓜類蔬菜幼苗猝倒病與十字花科根瘤病的蕈狀芽孢桿菌( Bacillus mycoides)，能抑制胡瓜猝倒病菌產生孢子，並避免甘藍幼苗的根毛感染等。

今，發明人乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，據此研創出本發明之具有抑制多種植物病原菌生長效果之枯草桿菌KHY8菌株、能大量生產KHY8菌株的培養方法，以及以KHY8菌株作為用以防治芒果黑斑病、芒果炭疽病及水稻稻熱病之生物農藥的用途。

本發明係關於一種枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株(以下簡稱KHY8)，以及含有KHY8之生物農藥。KHY8寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910711；KHY8對蓮霧黑腐病菌( Lasiodiplodia theobromae)、芒果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides)、芒果畸形病菌( Fusarium mangiferae)、番石柳黑星病菌( Phyllosticta psidiicola)、番石榴瘡痂病菌( Pestalotiopsis psidii)、紅龍果濕腐病菌( Gilbertella.persicaria)、紅龍果果腐病菌( Biporlaris sp.)、水稻稻熱病菌( Magnaporthe grisea)、蓮霧果腐病菌( Pestalotiopsis euginae)、鳳梨青黴菌( Penicillium spp.)、褐根病菌( Phellinus noxius)、芒果黑斑病菌( Xanthomonas campestrispv. mangiferaindica)、十字花科黑腐病菌( Xanthomonas campestrispv. campestris)、小白菜軟腐病菌( Pectobacterium carotovorum)、水稻白葉枯病菌( Xanthomonas campestrispv. oryzae)、茄科細菌性斑點病菌( Xanthomonas campestrispv. vesicatoria)等植物病原菌具抗生活性，能抑制多種植物病原菌之生長。

本發明亦提供培養高濃度枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株(以下簡稱KHY8)之方法，包含：將1~5 mL、濃度為 10 ⁷~10 ¹⁰cfu/mL之KHY8菌體懸浮液作為接種原，加入一培養基中，於25~35℃、轉速100~300 rpm、溶氧量0.5~10 ppm之條件下，進行液態發酵培養3~8日，其中該培養基係包含0.1~1 wt%大豆蛋白、0.1~1 wt%酵母粉、0.1~1.5 wt%糖蜜、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH ₂PO ₄)、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K ₂HPO ₄)、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO ₄)、0.1~1 wt%氯化鈣(CaCl ₂·2H ₂O)及逆滲透水。

本發明進一步提供一種枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株(以下簡稱KHY8)用以製作為生物農藥之用途，係以一有效劑量之KHY8施予一植物以抑制植物病原菌之入侵、生長及病徵表現；其中植物病原菌可為蓮霧黑腐病菌、芒果炭疽病菌、芒果畸形病菌、番石柳黑星病菌、番石榴瘡痂病菌、紅龍果濕腐病菌、紅龍果果腐病菌、水稻稻熱病菌、蓮霧果腐病菌、鳳梨青黴菌、褐根病菌、芒果黑斑病菌、十字花科黑腐菌、小白菜軟腐病菌、水稻白葉枯病菌及茄科細菌性斑點病菌其中至少之一。

於本發明之一實施例中，生物農藥為液劑或粉劑。

於本發明之一實施例中，有效劑量之KHY8係為菌量濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/mL之液劑或是菌量濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/g之粉劑。

藉此，本發明枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株對多種植物病原菌具抗生活性，因此可用於作為生物農藥或是果實保護組成物。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明為一種枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株(以下簡稱KHY8)，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910711。KHY8對多種植物病原菌如蓮霧黑腐病菌、芒果炭疽病菌、芒果畸形病菌、番石柳黑星病菌、番石榴瘡痂病菌、紅龍果濕腐病菌、紅龍果果腐病菌、水稻稻熱病菌、蓮霧果腐病菌、鳳梨青黴菌、褐根病菌、芒果黑斑病菌、十字花科黑腐菌、小白菜軟腐病菌、水稻白葉枯病菌、茄科細菌性斑點病菌等，具抗生活性，KHY8可用於製作生物農藥，防治前述其中至少之一病原菌所引起的植物病害。

本發明亦提供大量培養高濃度枯草桿菌KHY8菌株之方法，包含將菌量濃度為10 ⁷~10 ¹⁰cfu/mL之KHY8菌體懸浮液，取1~5 mL做為接種源，加入於一培養基中，並於25~35℃、轉速100~300 rpm、溶氧量0.5~10 ppm之條件培養3~8日，其中該培養基包含0.1~1 wt%大豆蛋白、0.1~1 wt%酵母粉、0.1~1.5 wt%糖蜜、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH ₂PO ₄)、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K ₂HPO ₄)、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO ₄·7H ₂O)、0.1~1 wt%氯化鈣(CaCl ₂·2H ₂O)以及逆滲透水。

以前述KHY8培養方法所得之發酵液，可用以製作為生物農藥，其可為液劑或粉劑，並可以一有效劑量，如:菌量濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/mL之液劑，或是菌量濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/g之粉劑，施予欲保護之植物，如:芒果及水稻，以抑制病原菌入侵、生長及減緩病原菌造成之病徵表現。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一、枯草桿菌KHY8菌株及其培養方法

(一) 枯草桿菌KHY8之分離與鑑定

自臺灣各地農場及惡地地形取得15處土壤樣本，經分離篩選後純培養，再以菌落外觀型態初步分類，共得到219株微生物菌株。於馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，以下簡稱PDA) 平板上，將蓮霧黑腐病菌( Lasiodiplodia theobromae)與上述分離所得之菌株進行對峙培養，以該些菌株對蓮霧黑腐病菌之抗生活性作為菌株功效篩選指標，進行篩選後獲得30株對蓮霧黑腐病菌具有抗生活性的菌株，其中以編號KHY8之菌株對蓮霧黑腐病菌的菌絲生長具有最佳的抑制效果。請參見第一圖(A)，為KHY8於PDA平板上生長之菌落型態圖，係為邊緣呈現不規則絨狀邊之米色菌落；另請見第一圖(B)，將KHY8菌株於羊血培養平板上培養3天後，並沒有產生溶血反應，表示KHY8菌株具有一定程度的生物安全性。

另，將KHY8菌株委託行政院農業委員會藥物毒物試驗所之優良實驗室操作規範(GLP)實驗室進行KHY8菌株對大鼠肺急毒性與致病性及口服急毒性與致病性試驗，試驗結果顯示KHY8菌株對大鼠不具肺急毒性與致病性及不具口服急毒性與致病性，如附件1及附件2，屬安全菌株。前述資料可供申請登記成為生物農藥使用。

將KHY8菌株進行16s rDNA、gyrB基因、與全基因體定序，並與NCBI資料庫比對後，確認KHY8菌株為枯草桿菌( Bacillus subtilis)，其16s rDNA之序列請參見序列表之SEQ ID NO: 1；另， SEQ ID NO: 2為KHY8菌株上，帶有的枯草桿菌特殊專一性片段。

(二) 培養溫度及培養基成分對於KHY8菌株生長之影響

下列實驗以搖瓶培養系統進行培養，以測試碳素源濃度、氮素源濃度、培養基酸鹼值、培養溫度及其他添加物對於本發明KHY8菌株生長之影響，其中下列所提及之基本培養液為糖蜜培養液，成分包含1 wt%大豆蛋白、1 wt%酵母粉、1.5 wt%糖蜜、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH ₂PO ₄)、0.1 wt%磷酸氫二鉀 (K ₂HPO ₄)以及逆滲透水。

本發明之菌量計算方法如下：於無菌操作環境下取1 mL 待測菌液與9 mL 無菌水混合均勻，此即為10倍稀釋菌液，並以此方法繼續進行菌液的10倍序列稀釋；取0.1 mL之稀釋菌液滴至PDA平板，並以消毒過之三角玻璃棒將稀釋液均勻塗佈於PDA平板表面後，置於27℃下培養，待菌落生長至肉眼可見之大小時，計算各稀釋倍率之菌落數；每組實驗皆進行三重複，計算時係將三重複之菌落數加總後除以3以獲得一平均菌落數；平均菌落數再以下列計算公式推算原始菌數：

原始菌數=平均菌落數 × 稀釋倍率之倒數 × 10 (單位：cfu/mL)

此外，因枯草桿菌會產生具耐熱性之內生孢子，故計算具有內生孢子之活菌數的方法為：將待測菌液於60℃水浴30分鐘，再以上述之方法進行序列稀釋且培養，最後計算含內生孢子的活菌數；將含有內生孢子之活菌數除以總活菌數，便可獲得枯草桿菌之內生孢子形成率。

菌量計算結果將以顯著性測試進行統計分析，若未達顯著水準則以費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，測定5%之顯著差異，若各組間具有顯著差異則會標記不同的字母，若各組間不具有顯著差異則會標記相同的字母。

(1)碳素源濃度、氮素源濃度、酸鹼值以及培養溫度與KHY8菌株之生長

將菌量濃度為10 ⁹cfu/mL之KHY8菌體懸浮液，取1 mL菌體懸浮液作為接種源，加入400 mL之不同培養液中，轉速150 rpm下搖瓶培養5天，並於第5天測量菌量；除了檢測溫度影響之試驗外，其他試驗皆於27℃下進行；實驗結果請參見表一，其中「ND」代表未進行檢測(non-detect)。

以糖蜜作為培養液之碳素源，測試不同碳素源濃度對KHY8菌株生長之影響，實驗結果顯示以含1.5 wt%糖蜜培養液所得之菌量最高，為9.6 x 10 ⁸cfu/mL，其中具內生孢子之菌量為1.4 x 10 ⁸cfu/mL，其次為含2.5 wt%糖蜜培養液，所得菌量最低者為含3.5 wt%糖蜜培養液，且1.5 wt%糖蜜培養液所得之菌量與其他二組具有顯著差異。本實驗之糖蜜係購自於陽田生物科技股份有限公司。

以大豆蛋白做為培養液之氮素源，測試不同氮素源濃度對於KHY8菌株生長之影響，試驗結果顯示以含1 wt%大豆蛋白培養液所得之含內生孢子菌量最高，為9.4 x 10 ⁸cfu/mL，其次為含2 wt%大豆蛋白之培養液，所得菌量最低者為含0.5 wt%大豆蛋白培養液，且0.5 wt%大豆蛋白培養液所得之菌量顯著低於其他二組。本實驗之大豆蛋白係購自於新合食品股份有限公司。

進一步調整基本培養液之碳、氮素源濃度，以基本培養液(以下簡稱第一培養液)、基本培養液減半濃度(以下簡稱第二培養液)，及基本培養液中僅減半之碳素源與氮源濃度(以下簡稱第三培養液)，進行培養菌量測試，三種培養液之成分請參見表二；試驗結果顯示，以第三培養液處理組之KHY8菌株生長狀況最好，菌量為2.7 x 10 ⁹cfu/mL，且含內生孢子之菌量為1.8 x 10 ⁹cfu/mL，其次為第二培養液處理組，菌量為1.4 x 10 ⁹cfu/mL；而第一培養液所得到之菌量最低，為9.5 x 10 ⁸cfu/mL。

不同培養液酸鹼值對KHY8菌株生長的影響試驗中，以培養液pH=9.0處理組所得到的菌量最高為3.7 x 10 ⁸cfu/mL，且含內生孢子之菌量為3.5 x 10 ⁸cfu/mL，次高者為培養液pH=7.5處理組，其菌量為3.4 x 10 ⁸cfu/mL，而培養液pH=6.0處理組之菌量最低，為3.3 x 10 ⁸cfu/mL。

不同培養溫度對KHY8菌株生長的影響試驗中，於30℃下培養所得到的菌量最高為4.9 x 10 ⁸cfu/mL，且含內生孢子之菌量為4.5 x 10 ⁸cfu/mL，然而根據試驗結果，整體而言，在25℃~35℃範圍內，培養溫度對菌量的影響並不顯著。

表一 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 培養條件 </td><td> </td><td> 菌量(cfu/mL) </td><td> 含內生孢子之菌量(cfu/mL) </td><td> 內生孢子形成率 </td></tr><tr><td> 糖蜜 </td><td> 1.5% </td><td> 9.6 x 10⁸</td><td> 1.4 x 10⁸^a</td><td> 15% </td></tr><tr><td> 2.5% </td><td> 1.4 x 10⁸</td><td> 7.1 x 10⁷^b</td><td> 50% </td></tr><tr><td> 3.5% </td><td> 2.6 x 10⁸</td><td> 2.0 x 10⁷^b</td><td> 7.7% </td></tr><tr><td> 大豆蛋白 </td><td> 0.5% </td><td> ND </td><td> 2.8 x 10⁸^b</td><td> ND </td></tr><tr><td> 1% </td><td> ND </td><td> 9.4 x 10⁸^a</td><td> ND </td></tr><tr><td> 2% </td><td> ND </td><td> 7.5 x 10⁸^a</td><td> ND </td></tr><tr><td> 碳原濃度與氮素濃度 </td><td> 第一培養液 </td><td> 9.5 x 10⁸</td><td> 4.7 x 10⁸^b</td><td> 49.5% </td></tr><tr><td> 第二培養液 </td><td> 1.4 x 10⁹</td><td> 1.3 x 10⁹^a</td><td> 97.8% </td></tr><tr><td> 第三培養液 </td><td> 2.7 x 10⁹</td><td> 1.8 x 10^{9 a}</td><td> 67.8% </td></tr><tr><td> 酸鹼值 </td><td> pH=6.0 </td><td> 3.3 x 10⁸</td><td> 3.2 x 10^{8 a}</td><td> 97% </td></tr><tr><td> pH=7.5 </td><td> 3.4 x 10⁸</td><td> 3.3 x 10⁸^a</td><td> 97% </td></tr><tr><td> pH=9.0 </td><td> 3.7 x 10⁸</td><td> 3.5 x 10^{8 a}</td><td> 96% </td></tr><tr><td> 溫度 </td><td> 25℃ </td><td> 4.0 x 10⁸</td><td> 3.7 x 10^{8 a}</td><td> 93% </td></tr><tr><td> 30℃ </td><td> 4.9 x 10⁸</td><td> 4.5 x 10^{8 a}</td><td> 92% </td></tr><tr><td> 35℃ </td><td> 4.1 x 10⁸</td><td> 3.7 x 10^{8 a}</td><td> 90% </td></tr></TBODY></TABLE>

表二 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 培養基 </td><td> 成分 </td></tr><tr><td> 第一培養液 </td><td> 1 wt%大豆蛋白、1 wt%酵母粉、1.5 wt%糖蜜、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)與逆滲透水 </td></tr><tr><td> 第二培養液 </td><td> 0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.75 wt%糖蜜、0.05 wt%磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、0.05 wt%磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)與逆滲透水 </td></tr><tr><td> 第三培養液 </td><td> 0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.75 wt%糖蜜、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)與逆滲透水 </td></tr></TBODY></TABLE>

(2) 他添加物與KHY8菌株之生長

本試驗係測試於培養夜中添加氯化鈣(CaCl ₂·2H ₂O)或硫酸鎂(MgSO ₄·7H ₂O)後，對於KHY8菌株生長之影響。此試驗使用之基本培養液成分為0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.75 wt%糖蜜、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH ₂PO ₄)、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K ₂HPO ₄)與逆滲透水，pH值為9.0，培養條件皆為27℃、轉速150 rpm的條件下，搖瓶培養5天，再量測培養夜中的KHY8菌量；實驗結果請參見表三。

在添加不同濃度氯化鈣試驗中，以添加0.5 wt%氯化鈣處理組之菌量最多，為5.0 x 10 ⁸cfu/mL，且含內生孢子之菌量為4.6 x 10 ⁸cfu/mL，其次依序為添加0.1 wt%及1 wt%的氯化鈣處理組，所得之菌量分別約2.9 x 10 ⁸CFU/mL及6.8 x 10 ⁷cfu/mL。

在添加不同濃度硫酸鎂試驗中，以添加0.05 wt%硫酸鎂處理組之菌量最多，含內生孢子之菌量為4.1 x 10 ⁸cfu/mL，其次依序為添加0.01 wt%及0.1 wt%硫酸鎂處理組，所得之菌量為3.2 x 10 ⁸cfu/mL以及 2.1 x 10 ⁸cfu/mL。

表三 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 添加物 </td><td> 濃度 </td><td> 菌量(cfu/mL) </td><td> 含內生孢子菌量(cfu/mL) </td><td> 內生孢子形成率 </td></tr><tr><td> 氯化鈣 (CaCl₂·2H₂O) </td><td> 0.1 wt% </td><td> 2.9 x 10⁸</td><td> 2.7 x 10^{8 a}</td><td> 93% </td></tr><tr><td> 0.5 wt% </td><td> 5.0 x 10⁸</td><td> 4.6 x 10^{8 a}</td><td> 92% </td></tr><tr><td> 1 wt% </td><td> 6.8 x 10⁷</td><td> 5.8 x 10^{7 b}</td><td> 85% </td></tr><tr><td> 硫酸鎂 (MgSO₄·7H₂O) </td><td> 0.01 wt% </td><td> ND </td><td> 3.2 x 10^{8 ab}</td><td> ND </td></tr><tr><td> 0.05 wt% </td><td> ND </td><td> 4.1 x 10^{8 a}</td><td> ND </td></tr><tr><td> 0.1 wt% </td><td> ND </td><td> 2.1 x 10^{8 b}</td><td> ND </td></tr></TBODY></TABLE>

(三)液態發酵小型試量產試驗

此實驗係測試KHY8菌株於液態發酵槽中培養之生長情形，所使用之培養液的酸鹼質為pH=9.0，成分含有：0.75 wt%糖蜜、0.5 wt%大豆蛋白、0.5 wt%酵母粉、0.1 wt%磷酸氫二鉀(KH ₂PO ₄)、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K ₂HPO ₄)、0.05 wt%硫酸鎂(MgSO ₄·7H ₂O)、0.5 wt%氯化鈣(CaCl ₂·2H ₂O)及逆滲透水。

將濃度為10 ⁹cfu/mL之KHY8菌體懸浮液5 mL作為接種源，添加入4 L之培養液中，並置於7 L發酵槽中，以27℃、轉速150rpm、溶氧量為1.5 ppm的條件下培養5天，所獲得之菌量為1.7 x 10 ⁹cfu/mL，含內生孢子菌量為1.4 x 10 ⁹cfu/mL，內生孢子形成率約82%。進一步將濃度為10 ⁹cfu/mL之KHY8菌體懸浮液15 mL作為接種源，添加入8 L之培養液中，並置於10 L液態發酵槽中，以27℃、轉速150rpm、溶氧量為1.5 ppm的條件下培養5天，所獲得之菌量為2.5 x 10 ⁹cfu/mL，含內生孢子菌量為2.2 x 10 ⁹cfu/mL，內生孢子形成率約88%。

再測試於10 L液態發酵槽中培養天數與KHY8菌株生長之狀況：將濃度為10 ⁹cfu/mL之KHY8菌體懸浮液15 mL作為接種源，添加入8 L培養液中，並置於10 L之液態發酵槽進行培養，於27℃、轉速150 rpm、溶氧量為1.5 ppm的條件下培養3~6天，並於第3、第4、第5與第6日取樣檢測KHY8菌株之菌量；試驗結果顯示，以培養後第5天之菌量以及內生孢子形成率最高，惟培養第4、5、6天之各組間不具有統計上的差異，請參見表四。

表四 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 培養3天 </td><td> 培養4天 </td><td> 培養5天 </td><td> 培養6天 </td></tr><tr><td> 含內生孢子菌量(cfu/mL) </td><td> 7.2 x 10⁸^a</td><td> 1.3 x 10⁹^b</td><td> 1.7 x 10⁹^b</td><td> 1.5 x 10⁹^b</td></tr><tr><td> 內生孢子形成率 </td><td> 90% </td><td> 92% </td><td> 94% </td><td> 93% </td></tr></TBODY></TABLE>

進一步測試不同溶氧量對於KHY8菌株生長之影響：將濃度為10 ⁹cfu/mL之KHY8菌體懸浮液15 mL做為接種源，添加入8 L培養液中，並置於10 L之液態發酵槽進行培養，於27℃、轉速150 rpm的條件下，測試溶氧量分別為1.0 ppm或1.5 ppm的情況下，培養5天後，對於KHY8菌株生長的影響；試驗結果顯示在溶氧量為1.5 ppm的培養條件下，所得菌量為2.5 x 10 ⁹cfu/mL，高於溶氧量1.0 ppm處理組之1.0 x 10 ⁹cfu/mL。

另，檢測液態發酵培養時，不同轉速對於KHY8菌株生長之影響：將濃度為10 ⁹cfu/mL之KHY8菌體懸浮液15 mL作為接種源，添加入8 L培養液中，並置於10 L之液態發酵槽進行培養，於27℃、溶氧量為1.5 ppm的條件下、測試轉速分別為150 rpm與300 rpm的情況下培養5天後，對KHY8菌株生長的影響；試驗結果顯示在轉速150 rpm的培養條件下，所得菌量為2.2 x 10 ⁹cfu/mL，且內生孢子形成率為96%，高於轉速300 rpm處理組之5.0 x 10 ⁸cfu/mL與80%內生孢子形成率。

(四)KHY8液劑或粉劑之儲存安定性測試

(1)KHY8液劑儲存安定性測試

KHY8菌株經由發酵培養後的菌液本身即可作為生物農藥使用，以下所稱KHY8液劑係為KHY8發酵培養後的菌液。

將以搖瓶培養5天製作之KHY8液劑(原始菌量為2.9 x 10 ⁹cfu/mL)，於54℃儲存兩週後，其菌量仍可維持在2.0 x 10 ⁹cfu/mL。另，將以7 L液態發酵槽培養5天之KHY8液劑(原始菌量為3.3 x 10 ⁹cfu/mL)，於54℃下儲存兩週，其菌量會仍可維持在2.3 x 10 ⁹cfu/mL；而以10 L液態發酵槽培養5天製作之KHY8液劑(原始菌量為3.0 x 10 ⁹cfu/mL)，於54℃下儲存兩週後，其菌量仍可維持於2.2 x 10 ⁹cfu/mL。

以我國現行農藥管理法之生物農藥登記審查中，上述使用之「54℃下儲存兩週」之倉儲活性試驗，與「常溫下儲存兩年」之倉儲活性試驗具同等效力。

另，將以10 L液態發酵槽培養製作之KHY8液劑，委託行政院農業委員會藥物毒物試驗所之GLP實驗室進行理化性質試驗，分別檢測其顏色、氣味、物理狀態、酸鹼度、密度、黏性及包裝材腐蝕性與儲存安定性，試驗結果如附件3及附件4，此資料係供申請登記成為生物農藥使用。

(2) 粉劑製作與儲存安定性測試

將上述液態發酵槽培養之KHY8菌液以低溫噴霧乾燥機，於噴霧出口50℃之條件下進行噴霧乾燥，其中原始菌量為2.2 x 10 ⁹cfu/mL 的KHY8發酵液1 L可製備約100 g之粉劑，且粉劑所含菌量可達4.4 x 10 ¹⁰cfu/g；將製得之粉劑置於54℃下儲存兩週後，菌量會由初始的4.4 x 10 ¹⁰cfu/g降低至6.4 x 10 ⁹cfu/g。

另，以麥芽糊精為載體，使用一般噴霧乾燥機進行噴霧乾燥，並將體積進行10倍放大，則原始菌量為1.2 x 10 ⁹cfu/mL的1 L發酵液可製成1000 g之粉劑，且粉劑菌量約為1.4 x 10 ⁹cfu/g；將製得之粉劑(原始菌量為1.2 x 10 ⁹cfu/g)，於54℃下儲存兩週，其菌量會由仍可維持約1.0 x 10 ⁹cfu/g。

以我國現行之農藥管理法之生物農藥登記審查中，上述於「54℃下儲存兩週」之倉儲活性試驗，與「常溫下儲存兩年」之倉儲活性試驗具同等效力。

另，將前述以麥芽糊精為載體，使用一般噴霧乾燥機進行噴霧乾燥製作之KHY8粉劑，委託行政院農業委員會藥物毒物試驗所之GLP實驗室進行理化性質試驗，包含檢測顏色、氣味、物理狀態、酸鹼度、密度、黏性及包裝材腐蝕性與儲存安定性，試驗結果請參見附件5、附件6及附件7，此資料可供申請登記成為生物農藥使用。

(五)枯草桿菌KHY8菌株之生理生化測試

此試驗係檢測KHY8菌株(以下簡稱KHY8)的蛋白分解酵素(protease)、澱粉分解酵素(amylase)、脂肪分解酵素(lipase)與纖維素分解酵素(cellulase)之活性；將KHY8培養於特定之篩選培養基上，如SMA培養基(skim milk agar)、YSA培養基(yeast extract-soluble starch agar)、Tween-80 agar與MRA培養基(Mandel-Reese agar)，等菌落長出後進行後續觀察，此技術係為習知技術，容於此不再贅述。請參見第二圖，SMA培養基上KHY8菌株周圍產生透明圓環，表示KHY8具有蛋白分解酵素活性；YSA培養基上，KHY8菌株周圍具有大透明圓環，表示KHY8亦具有澱粉分解酵素活性；於Tween-80 agar上，KHY8菌株周圍會產生白色沉澱環，即KHY8具有脂肪分解酵素活性；而MRA培養基上，KHY8菌株周圍產生橘黃色環，表示KHY8具有纖維素分解酵素活性。

(六)枯草桿菌KHY8菌株對農藥之耐受性

本試驗係使用農藥平板法檢測枯草桿菌KHY8菌株(以下簡稱KHY8)對市售登記核准使用於芒果及水稻病蟲害防治之農藥的耐受性。農藥平板法是將菌液塗佈於含有不同農藥之PDA培養基平板，培養後觀測KHY8菌株的生長情形。試驗結果顯示，在對芒果病蟲害防治用藥之耐受性部份，KHY8對包括：免賴得、益洛寧、派滅淨、可尼丁、氟比拔克、嘉賜黴素、賜派滅、加保扶、芬普螨、得芬瑞、亞滅培、依普同、百克敏、賜派芬、貝他賽扶寧、三泰芬、護賽寧、賜諾特、克凡派、速殺氟、布芬淨、三氟敏、第滅達胺、達特南、維利黴素、賽洛寧及加保利等農藥，具有耐受性，可在該等農藥培養基平板上生長，未來於田間應用時可與該等藥劑共同施用，並改進該些藥劑因病原菌產生抗藥性而導致藥劑防治效果不佳之問題。

另，KHY8對於撲克拉、得克利、嘉賜快得寧、待克利、畢芬寧、克菌多、普克利、腐絕快得寧、撲滅松、嘉賜銅、甲基鋅乃浦、賽普護汰寧、三元硫酸銅、平克座、腈硫醌、丁基加保扶、布瑞莫、鋅錳乃浦及嘉賜銅等農藥則不具耐受性。

在對水稻病蟲害防治用藥之耐受性部份，KHY8對包括：殺紋寧、腐絕水懸、依得利、福多寧、賓克隆、免賴得、賽座滅、滅普寧、毆殺滅、芬諾尼、三賽唑、嘉賜微素、依普同、三氟敏、維利黴素等農藥，具有耐受性，可在該等農藥培養基平板上生長，未來於田間應用時可與該等藥劑共同施用，並改進該些藥劑因病原菌產生抗藥性而導致藥劑防治效果不佳之問題。而KHY8對撲克拉、得克利、克枯三賽唑、待克利、喜樂克拉、丙基喜樂松、普克利、鏈四環黴素、鋅錳乃浦等農藥則不具耐受性。

實驗二、枯草桿菌KHY8菌株之抗生活性範圍評估

此實驗之目的係為大範圍評估KHY8菌株(以下簡稱KHY8)的抗生活性，係將KHY8於PDA平板之一側劃線培養1日之後，再於KHY8對側接種欲試驗之植物病原真菌，並於27℃進行對峙培養，以觀察該病原真菌之生長情形。請參見第三圖，於PDA平板上進行對峙培養的試驗結果中，KHY8能有效抑制芒果炭疽病菌、芒果畸形病菌、番石榴黑星病菌、番石榴瘡痂病菌、紅龍果濕腐病菌、紅龍果果腐病菌、紅龍果炭疽病的生長；再請參見第四圖中，KHY8亦能抑制木瓜疫病菌、蓮霧黑腐病菌、蓮霧果腐病、鳳梨黑腐病、鳳梨青黴菌、褐根病菌(B89)與褐根病菌(2252)之生長；參見第五圖，將KHY8培養於PDA平板中央2日，再將植物病原細菌均勻噴灑於PDA平板上，於27℃培養三天之結果，顯示KHY8能有效抑制芒果黑斑病菌、十字花科黑腐菌、小白菜軟腐病菌、水稻白葉枯病菌、番茄斑點病菌與條斑點病菌之生長。第六圖係使用分離自臺灣各地的稻熱病菌( Magnaporthe grisea)分離株與KHY8菌株進行對峙培養，結果顯示KHY8亦能有效抑制稻熱病菌之不同地區菌株的生長。

實驗三、枯草桿菌分離株KHY8菌株之防治病害田間試驗

此防治測試的試驗結果將進行顯著性測試，若未達顯著水準則進行費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，測定1%及5%之顯著差異(簡稱為1%差異或5%差異)，其中不具顯著差異之組別會標記相同之英文字母，標記不同字母之組別代表該二組別間具有顯著差異。

(一)防治 芒果炭疽病與芒果黑斑病

於田間實際測試時，同一顆芒果果實上，同時可能有芒果炭疽病和芒果黑斑病發生，且皆會於果皮上產生黑色病斑，因此田間試驗中常將芒果炭疽病與芒果黑斑病的發生共同觀察。

本實驗選用之芒果品種為易受芒果炭疽病或芒果黑斑病危害之 Mangifera indica，施用於露天栽培的芒果，自芒果開花初期至果實套袋的期間，施予菌量濃度為1 x 10 ⁹cfu/mL之KHY8液劑，以測試KHY8菌株於炭疽病菌之防治，施用方式如下：於當芒果開花初期，將KHY8液劑稀釋50倍、100倍以及500倍，施用於植株地上部，包含葉表、果表以及枝條，每隔7日施用一次，總共給予10次；另，因扶吉安與維利黴素分別為目前使用於防治芒果炭疽病及黑斑病之市售農藥，故以39.5%扶吉胺水懸液(稀釋200倍)以及10%維利黴素溶液(稀釋500倍)作為比較對象。於幼果期起至最後一次施藥後14天，每14天調查葉片1次，每棵果樹隨機選取10枝條，由心葉向下取10片葉片並計算其黑斑面積，以計算罹病度；果實成熟後，每棵果樹隨機採取25顆果實，於採收當天以及採收後第3天計算同一顆果實上炭疽病斑所占的面積並換算成芒果罹病度以及防治率。

芒果罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實炭疽斑面積占1~5%，2級為果實炭疽斑面積占6~10%，3級為果實炭疽斑面積占11~25%，4級為果實炭疽斑面積26%以上；罹病度與防治率之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(4 x 總果實數)] x 100%

防治率(%)＝1－ (防治組成物組別罹病度)/(對照組罹病度)

請參見第七圖、第八圖與第九圖，分別為為枋山、枋寮與玉井三地區之芒果炭疽病及黑斑病防治效果圖分析圖；根據圖中之結果顯示，施予KHY8菌液之各組別，芒果表皮由炭疽病或黑斑病引起的黑斑情形與對照組相比皆有改善之情形，且達到的防治效果甚至可以優於扶吉安處理組或維利黴素處理組。

請參見表五，為三地區芒果黑斑病菌葉片防治率，顯示本發明之枯草桿菌KHY8菌株及其液劑確實具有抑制葉片上黑斑病癥形成的效果，並與使用10%維利黴素溶液(稀釋500倍)之組別進行比較；施用KHY8液劑之組別的防治率皆高於使用農藥維利黴素之組別，顯示KHY8液劑確實可防止芒果葉片黑斑病。

表五 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 處理方式 </td><td> 葉片黑斑病防治率(%) </td></tr><tr><td> 1^st施藥後 </td><td> 3^rd施藥後 </td><td> 5^th施藥後 </td><td> 7^th施藥後 </td><td> 9^th施藥後 </td></tr><tr><td> 玉井地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 93.75 </td><td> 36.84 </td><td> 38.89 </td><td> 41.94 </td><td> 37.5 </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 100 </td><td> 47.37 </td><td> 46.3 </td><td> 48.39 </td><td> 41.91 </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 100 </td><td> 70.53 </td><td> 61.11 </td><td> 51.61 </td><td> 52.94 </td></tr><tr><td> 維利黴素 </td><td> 100 </td><td> 51.58 </td><td> 44.44 </td><td> 45.97 </td><td> 38.97 </td></tr><tr><td> 枋山地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 9.64 </td><td> 23.88 </td><td> 28.44 </td><td> 34.72 </td><td> 35.00 </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 15.66 </td><td> 28.36 </td><td> 31.19 </td><td> 43.06 </td><td> 41.25 </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 19.88 </td><td> 30.85 </td><td> 33.49 </td><td> 51.39 </td><td> 48.75 </td></tr><tr><td> 維利黴素 </td><td> 21.08 </td><td> 33.33 </td><td> 35.32 </td><td> 34.72 </td><td> 31.25 </td></tr><tr><td> 枋寮地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 7.61 </td><td> 7.20 </td><td> 10.14 </td><td> 14.84 </td><td> 15.79 </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 8.70 </td><td> 13.60 </td><td> 21.74 </td><td> 27.74 </td><td> 32.16 </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 14.13 </td><td> 20.00 </td><td> 26.09 </td><td> 31.61 </td><td> 34.50 </td></tr><tr><td> 維利黴素 </td><td> 6.52 </td><td> 10.40 </td><td> 13.04 </td><td> 21.29 </td><td> 24.56 </td></tr></TBODY></TABLE>

再請參見表六，為三地區之芒果果實黑斑病防治之試驗結果，係與處理39.5%扶吉胺水懸液(稀釋200倍)之組別進行比較，給予50~500倍稀釋之KHY8菌液皆能有效降低芒果炭疽病的罹病度，且所達到的炭疽病防治率優於39.5%扶吉胺水懸液(稀釋200倍)處理組。

表六 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 調查時間 </td><td> 處理方式 </td><td> 罹病度 </td><td> 5%差異 </td><td> 1%差異 </td><td> 防治率 </td></tr><tr><td> 玉井地區 </td><td> 採收當天 </td><td> 水(對照組) </td><td> 97.13% </td><td> a </td><td> a </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 46.50% </td><td> b </td><td> b </td><td> 52.12% </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 36.63% </td><td> c </td><td> c </td><td> 62.29% </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 34.75% </td><td> c </td><td> c </td><td> 64.22% </td></tr><tr><td> 扶吉胺 </td><td> 48.75% </td><td> d </td><td> b </td><td> 49.81% </td></tr><tr><td> 採收後3天 </td><td> 水(對照組) </td><td> 99.50% </td><td> a </td><td> a </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 78.25% </td><td> b </td><td> b </td><td> 23.12% </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 67.75% </td><td> c </td><td> c </td><td> 32.91% </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 65.25% </td><td> d </td><td> c </td><td> 37.44% </td></tr><tr><td> 扶吉胺 </td><td> 79.38% </td><td> e </td><td> b </td><td> 20.23% </td></tr><tr><td> 枋山地區 </td><td> 採收當天 </td><td> 水(對照組) </td><td> 51.63% </td><td> a </td><td> a </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 15.88% </td><td> b </td><td> bc </td><td> 69.25% </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 12.13% </td><td> bc </td><td> b </td><td> 76.51% </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 10.38% </td><td> c </td><td> b </td><td> 79.90% </td></tr><tr><td> 扶吉胺 </td><td> 19.88% </td><td> d </td><td> c </td><td> 67.50% </td></tr><tr><td> 採收後3天 </td><td> 水(對照組) </td><td> 68.63% </td><td> a </td><td> a </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 18.25% </td><td> b </td><td> bd </td><td> 73.41% </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 15.50% </td><td> b </td><td> bc </td><td> 77.41% </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 12.00% </td><td> c </td><td> c </td><td> 82.51% </td></tr><tr><td> 扶吉胺 </td><td> 22.25% </td><td> d </td><td> d </td><td> 67.58% </td></tr><tr><td> 枋寮地區 </td><td> 採收當天 </td><td> 水(對照組) </td><td> 74.13% </td><td> a </td><td> a </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 24.63% </td><td> b </td><td> b </td><td> 66.78% </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 20.50% </td><td> c </td><td> c </td><td> 72.34% </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 17.25% </td><td> d </td><td> c </td><td> 76.83% </td></tr><tr><td> 扶吉胺 </td><td> 29.63% </td><td> e </td><td> d </td><td> 60.03% </td></tr><tr><td> 採收後3天 </td><td> 水(對照組) </td><td> 83.25% </td><td> a </td><td> a </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 38.50% </td><td> b </td><td> b </td><td> 53.75% </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 30.50% </td><td> c </td><td> c </td><td> 63.36% </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 26.63% </td><td> c </td><td> c </td><td> 68.02% </td></tr><tr><td> 扶吉胺 </td><td> 52.25% </td><td> d </td><td> d </td><td> 43.99% </td></tr></TBODY></TABLE>

請參見表七，為三地區之芒果果實黑斑病防治之另一實驗結果，此試驗中係將KHY8之防治效果與10%維利黴素溶液(稀釋500倍)之防治效果進行比較；實驗結果顯示處理KHY8之處別，其防治效果不遜於維利黴素處理之組別，其防治率甚至可高於維利黴素處理組。

表七 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 處理方式 </td><td> 果實防治率(%) </td></tr><tr><td> 玉井地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 74.39 </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 77.40 </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 81.25 </td></tr><tr><td> 維利黴素 </td><td> 76.92 </td></tr><tr><td> 枋山地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 69.01 </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 74.41 </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 76.94 </td></tr><tr><td> 維利黴素 </td><td> 65.95 </td></tr><tr><td> 枋寮地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> --- </td></tr><tr><td> KHY8_500倍 </td><td> 61.62 </td></tr><tr><td> KHY8_100倍 </td><td> 77.78 </td></tr><tr><td> KHY8_50倍 </td><td> 80.81 </td></tr><tr><td> 維利黴素 </td><td> 61.11 </td></tr></TBODY></TABLE>

(二)防治水稻稻熱病

本實驗選用之品種為田間常見之水稻品種，插秧後15天開始施藥，施予菌量濃度為1 x 10 ⁹cfu/g之KHY8粉劑，以測試其對於稻熱病之防治，其施用方式如下：於稻作插秧後15天、30天、40天、孕穗期及齊穗期，將KHY8粉劑加水稀釋200倍、400倍以及600倍，製成藥液，並將藥液施用於植株地上部，包含葉及穗，共施用5次。於各次施藥前及成熟期調查罹病度，共調查6次，其中齊穗期及成熟期僅調查穗稻熱病罹病度。將栽種水稻的小區域，取其對角線上的20叢水稻作為樣本，以調查該栽種小區之稻熱病罹病度(%)。

葉稻熱病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數共區分為0~4級:罹病指數 0 級：病斑葉面積率為0%；罹病指數 1 級：病斑葉面積率＜5%；罹病指數 2 級：5% ≦病斑葉面積率＜25%；罹病指數 3 級：25% ≦病斑葉面積率＜55%；罹病指數 4 級：病斑葉面積率≧55 %；病斑葉面積率係計算病斑葉面積與全葉面積而得，全葉面積不包括葉鞘及自然枯死葉片；病斑葉面積與葉稻熱病罹病度之計算方式如下：

病斑葉面積率＝ (葉病斑面積/全葉面積) x100%

葉稻熱病罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(4 x 總果實數)] x 100%

穗稻熱病罹病度係藉由罹病指數求得，其中，一穗中有3枝稻梗以上罹病者視為罹病穗；罹病指數共分為0~3級:罹病指數0級：罹病穗率為0%；罹病指數1級：罹病穗率＜5%；罹病指數2級：5%≦罹病穗率＜20%；罹病指數 3 級：罹病穗率≧20%；罹病穗率與穗稻熱病罹病度之計算方式如下：

罹病穗率＝(罹病穗數目/調查總穗數目) x100%

穗稻熱病罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(3 x 總果實數)] x 100%

請參見第十圖、第十一圖與第十二圖，分別為長治地區水稻田、萬丹地區水稻田以及美濃地區水稻田，以KHY8粉劑加水稀釋後噴灑，對水稻稻熱病之防治效果。另請參見表八，為三地區之試驗結果，試驗結果顯示給予以水稀釋200~600倍之KHY8粉劑皆能有效抑制水稻稻熱病的罹病度。

表八 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 處理方式 </td><td> 水稻稻熱病罹病度(%) </td></tr><tr><td> 1^st施藥前(葉) </td><td> 2^rd施藥前(葉) </td><td> 3^th施藥前(葉) </td><td> 4^th施藥前(葉) </td><td> 5^th施藥前(穗) </td><td> 成熟期(穗) </td></tr><tr><td> 長治地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> 0.00 ^a</td><td> 6.56 ^a</td><td> 21.88 ^a</td><td> 29.38 ^a</td><td> 86.67 ^a</td><td> 88.75 ^a</td></tr><tr><td> KHY8_600倍 </td><td> 0.00 ^a</td><td> 5.63 ^a</td><td> 10.31 ^b</td><td> 15.31 ^b</td><td> 58.33 ^b</td><td> 60.00 ^b</td></tr><tr><td> KHY8_400倍 </td><td> 0.00^a</td><td> 5.63 ^a</td><td> 10.00 ^b</td><td> 13.13 ^b</td><td> 51.67 ^c</td><td> 52.50 ^c</td></tr><tr><td> KHY8_200倍 </td><td> 0.00 ^a</td><td> 5.31 ^a</td><td> 9.69 ^b</td><td> 12.50 ^b</td><td> 50.42 ^c</td><td> 51.25 ^c</td></tr><tr><td> 萬丹地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> 15.94 ^a</td><td> 33.44 ^a</td><td> 48.75 ^a</td><td> 60.94 ^a</td><td> 35.42 ^a</td><td> 86.25 ^a</td></tr><tr><td> KHY8_600倍 </td><td> 16.25 ^a</td><td> 27.81 ^b</td><td> 39.06 ^b</td><td> 42.19 ^b</td><td> 29.58 ^b</td><td> 57.50 ^b</td></tr><tr><td> KHY8_400倍 </td><td> 16.88 ^a</td><td> 28.44 ^b</td><td> 38.75 ^b</td><td> 41.88 ^b</td><td> 25.00 </td><td> 51.67 ^c</td></tr><tr><td> KHY8_200倍 </td><td> 16.25 ^a</td><td> 27.50 ^b</td><td> 35.00 ^b</td><td> 38.44 ^b</td><td> 20.42 ^d</td><td> 50.83 ^c</td></tr><tr><td> 美濃地區 </td><td> 水(對照組) </td><td> 0.00 ^a</td><td> 5.00 ^a</td><td> 8.13 ^a</td><td> 24.69 ^a</td><td> 19.58 ^a</td><td> 60.42 ^a</td></tr><tr><td> KHY8_600倍 </td><td> 0.00 ^a</td><td> 5.94 ^a</td><td> 7.19 ^a</td><td> 11.56 ^b</td><td> 11.67 ^b</td><td> 32.92 ^b</td></tr><tr><td> KHY8_400倍 </td><td> 0.00 ^a</td><td> 5.31 ^a</td><td> 7.19 ^a</td><td> 10.00 ^b</td><td> 10.42 ^b</td><td> 31.67 ^b</td></tr><tr><td> KHY8_200倍 </td><td> 0.00 ^a</td><td> 6.56 ^a</td><td> 7.19 ^a</td><td> 9.69 ^b</td><td> 7.08 ^c</td><td> 30.00 ^b</td></tr></TBODY></TABLE>

實驗四、枯草桿菌KHY8菌株對於果實之保護功效

本部分之實驗結果皆使用費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，標記不同英文字者代表該二組別之間具有 5%顯著差異，標記相同英文字者代表不具有顯著差異。

(一)防治芒果炭疽病

於田間將水(對照組)、濃度為2 x 10 ⁷cfu/mL之KHY8菌液、水楊酸(500倍稀釋)或10-10式波爾多液(bouillie bordelaise)噴灑愛文芒果樹，每株樹之噴灑液體量為2公升，每週噴灑一次直到採收前10日為止，本試驗共噴灑6次；採收後將芒果放置於密閉紙箱中，室溫下保存7日後觀察。請參見表九，施予KHY8菌液之罹病率以及罹病度皆為四組當中最低者，且顯著低於無處理任何防治物之對照組。

芒果炭疽病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實炭疽病斑面積占1~5%，2級為果實炭疽病斑面積占6~10%，3級為果實炭疽病斑面積占11~25%，4級為果實炭疽病斑面積26%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(4 x 總果實數)] x 100%

罹病率(%)＝(罹病果實數 /總果實數) x 100%

表九 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 罹病率 </td><td> 罹病度 </td></tr><tr><td> 水(對照組) </td><td> 52.6% </td><td> 35.1% ^b</td></tr><tr><td> KHY8菌液 </td><td> 17.2% </td><td> 9.2% ^a</td></tr><tr><td> 水楊酸(500倍稀釋) </td><td> 35.7% </td><td> 23.8% ^ab</td></tr><tr><td> 10-10式波爾多液 </td><td> 33.3% </td><td> 11.1% ^a</td></tr></TBODY></TABLE>

另，將採收後之芒果浸泡於含有0.1% Tween 80、菌量濃度為5 x 10 ⁷cfu/mL之KHY8稀釋菌液，浸泡1分鐘後，陰乾，並置於密封紙箱，於室溫下放置7天以觀察炭疽病的發病情形。請參見表十，浸泡KHY8菌液之芒果的罹病率與罹病度皆顯著低於無處理之對照組，且KHY8菌液組的芒果果皮之黑斑數量較少，表示KHY8稀釋菌液亦可應用於果實採收後的抑菌處理。

芒果炭疽病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實炭疽病斑面積占1~5%，2級為果實炭疽病斑面積占6~10%，3級為果實炭疽病斑面積占11~25%，4級為果實炭疽病斑面積26%以上；罹病度之公式如下：：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(4 x 總果實數)] x 100%。

罹病率(%)＝(罹病果實數 /總果實數) x 100%

表十 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 罹病率 </td><td> 罹病度 </td></tr><tr><td> 水(對照組) </td><td> 88.9% </td><td> 59.3% ^b</td></tr><tr><td> KHY8菌液 </td><td> 22.2% </td><td> 14.8% ^a</td></tr></TBODY></TABLE>

(二)防治棗炭疽病

於印度棗( Zizyphus mauritiana)果實上製造20個傷口後，先噴霧處理水、濃度為5 x 10 ⁹cfu/mL之KHY8菌液或是44.2%克收欣溶液(2000倍稀釋)；24小時之後接種濃度為1 x 10 ⁶spore/mL炭疽病孢子懸浮液，並於室溫下培養7天觀察罹病度。參見表十一與第十三圖，對照組的罹病度為63.35%，克收欣之罹病度為50.0%，而KHY8菌液組的罹病度為23.3%，顯著低於對照組。

棗炭疽病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~5級，0級代表無任何病徵，1級為果實炭疽病斑面積占1~5%，2級為果實炭疽病斑面積占6~10%，3級為果實炭疽病斑面積占11~25%，4級為果實炭疽病斑面積26~50%，5級為果實炭疽病斑面積51%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(5 x 總果實數)] x 100%

表十一 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 罹病度 </td></tr><tr><td> 水(對照組) </td><td> 63.3% ^b</td></tr><tr><td> KHY8菌液 </td><td> 23.3% ^a</td></tr><tr><td> 克收欣(2000倍稀釋) </td><td> 50.0% ^ab</td></tr></TBODY></TABLE>

(三)防治蓮霧黑腐病菌

於蓮霧果實上製造20處傷口後，立即噴灑濃度約1 x 10 ⁶spore/mL之蓮霧黑腐病菌，5分鐘後再噴灑水(對照組)、濃度約5 x 10 ⁹cfu/mL之KHY8菌液、KHY8培養濾液或10%保粒黴素甲(1000倍稀釋)，將蓮霧果實於室溫下培養7天後觀察；其中KHY8培養濾液係將KHY8含菌發酵液以0.22 μm篩網過篩後所得到的液體。請參見第十四圖，對照組的每顆蓮霧果實上皆生長大量白色菌絲，噴灑保粒黴素甲的蓮霧果實上亦觀察到菌絲生長；噴灑KHY8培養濾液之果實則有少量菌絲，噴灑KHY8菌液之蓮霧果實則幾乎沒有觀察到白色菌絲。

進一步測試施予防治物時機與蓮霧黑腐病菌的防治功效：「同時處理組」係於病原菌接種後5分鐘噴灑KHY8菌液或保粒黴素甲；「預處理組」則是先施予蓮霧果實KHY8菌液或保粒黴素甲，24小時後再於蓮霧上製造傷口並接種病原菌；接種病原菌後於室溫培養7天，並觀察菌絲的生長且記錄；參見第十四圖與表十二，KHY8菌液組的罹病度皆低於保粒黴素甲組，且菌絲生長之情形也非常輕微；另，不論是給予KHY8菌液或是保粒黴素甲，預處理組的罹病度與菌絲生長皆低於同時處理組。

蓮霧黑腐病菌罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~5級，0級代表無任何病徵，1級為果實黑腐病斑面積占1~5%，2級為果實黑腐病斑面積占6~10%，3級為果實黑腐病斑面積占11~20%，4級為果實炭疽斑面積21~35%，5級為果實黑腐病斑面積36~50%以上，6級為果實黑腐病斑面積51%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(5 x 總果實數)] x 100%

表十二 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 處理方式 </td><td> 罹病度 </td></tr><tr><td> 保粒黴素甲 </td><td> 同時處理 </td><td> 63.9% </td></tr><tr><td> 預處理 </td><td> 22.2% </td></tr><tr><td> KHY8菌液 </td><td> 同時處理 </td><td> 11.1% </td></tr><tr><td> 預處理 </td><td> 2.8% </td></tr></TBODY></TABLE>

(四) 防治番石榴黑星病菌及番石榴瘡痂病

從番石榴小果期開始，全植株噴灑水(對照組)、濃度為2 x 10 ⁷cfu/mL之KHY8菌液或62.5%賽普護汰寧藥劑(2000倍稀釋)，每株平均噴灑4公升防治物，每週噴灑一次，直到番石榴套袋為止，此實驗共噴灑兩次。請參見表十三，KHY8菌液噴灑後，番石榴罹患黑星病或是瘡痂病的罹病率或是罹病度皆降低了，所達到之功效與給予62.5%賽普護汰寧藥劑相當。

番石榴黑星病與瘡痂病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實病斑面積占1~5%，2級為果實病斑面積占6~10%，3級為果實病斑面積占11~25%，4級為果實病斑面積26%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(4 x 總果實數)] x 100%

罹病率(%)＝(罹病果實數 /總果實數) x 100%

表十三 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 番石榴黑星病 </td><td> 番石榴瘡痂病 </td></tr><tr><td> 罹病率 </td><td> 罹病度 </td><td> 罹病率 </td><td> 罹病度 </td></tr><tr><td> 水(對照組) </td><td> 91.7% </td><td> 62.5% ^b</td><td> 50.0% </td><td> 39.6% ^b</td></tr><tr><td> KHY8菌液 </td><td> 71.4% </td><td> 42.9% ^ab</td><td> 35.7% </td><td> 8.9% ^a</td></tr><tr><td> 賽普護汰寧(2000倍稀釋) </td><td> 85.3% </td><td> 43.4% ^ab</td><td> 17.6% </td><td> 7.3% ^a</td></tr></TBODY></TABLE>

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明之枯草桿菌KHY8菌株對於多種植物病原菌具有抗生活性，除不具溶血特性外，亦對大鼠不具肺急毒性與致病性及口服急毒性與致病性，故其安全性極高；生長中之植物或採收後之果實經KHY8菌液處理後，皆能有效降低病害的發生，例如可有效防治芒果炭疽病、芒果黑斑病、水稻稻熱病或是蓮霧黑腐病的發生，故除了可做為作物栽培期間的生物農藥使用，亦可作為果實保護劑使用。

2.本發明之枯草桿菌KHY8能有效避免或減緩芒果果表因病原菌所產生之黑斑或腐壞，除了可延長芒果的保存期外，亦能維持芒果外觀的美觀程度，提高其經濟價值。

3.本發明之枯草桿菌的培養方法，製備得較高濃度之菌液，可作為生物農藥之液劑，並進一步將該液劑製作成生物農藥之粉劑，此2種劑型皆具有優秀的儲存安定性，極具商品穩定性。

綜上所述，本發明枯草桿菌KHY8菌株及其增量培養方法與用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊

財團法人食品工業發展研究所

民國104年11月25日

寄存編號：BCRC 910711

無

第一圖：枯草桿菌KHY8菌株於PDA培養基上菌落型態圖。

第二圖：枯草桿菌KHY8菌株之蛋白質分解酵素、澱粉分解酵素、脂質分解酵素及纖維分解酵素活性分析圖。

第三圖：枯草桿菌KHY8菌株對不同植物病原真菌之抗生活性分析圖(一)。

第四圖：枯草桿菌KHY8菌株對不同植物病原真菌之抗生活性分析圖(二)。

第五圖：枯草桿菌KHY8菌株對不同植物病原細菌之抗生活性分析圖。

第六圖：枯草桿菌KHY8菌株對多地區水稻稻熱病菌之抗生活性分析圖。

第七圖：於枋山芒果園以枯草桿菌KHY8液劑防治芒果黑斑病及炭疽病分析圖。

第八圖：於枋寮芒果園以枯草桿菌KHY8液劑防治芒果黑斑病及炭疽病分析圖。

第九圖：於玉井芒果園以枯草桿菌KHY8液劑防治芒果黑斑病及炭疽病分析圖。

第十圖：於長治地區水稻田以枯草桿菌KHY8粉劑防治水稻稻熱病分析圖。

第十一圖：於萬丹地區水稻田以枯草桿菌KHY8粉劑防治水稻稻熱病分析圖。

第十二圖：於美濃地區水稻田以枯草桿菌KHY8粉劑防治水稻稻熱病分析圖。

第十三圖：枯草桿菌KHY8菌液防治印度棗炭疽病分析圖。

第十四圖：枯草桿菌KHY8菌液或濾液防治蓮霧黑腐病分析圖。

第十五圖：枯草桿菌KHY8菌液於不同施用時機防治蓮霧黑腐病分析圖。

附件1：枯草桿菌KHY8菌株對大鼠肺急毒性與致病性試驗報告。

附件2：枯草桿菌KHY8菌株對大鼠口服急毒性與致病性試驗報告。

附件3：枯草桿菌KHY8菌株液劑之化學性質試驗報告(顏色、氣味、物理狀態、酸鹼度、密度、黏性)。

附件4：枯草桿菌KHY8菌株液劑之理化性質試驗報告(包裝材料腐蝕性與貯存安定性)。

附件5：枯草桿菌KHY8菌株可濕性粉劑之理化性質試驗報告(物理狀態、顏色、氣味、酸鹼度、體積密度)(一)。

附件6：枯草桿菌KHY8菌株可濕性粉劑之理化性質試驗報告(物理狀態、顏色、氣味、酸鹼度、體積密度)(二)。

附件7：枯草桿菌KHY8菌株可濕性粉劑之理化性質試驗報告(包裝材料腐蝕性與貯存安定性)。

國內寄存資訊

財團法人食品工業發展研究所

民國104年12月7日

寄存編號：BCRC 910711

<110> 行政院農業委員會高雄農業改良場

<120> 枯草桿菌KHY8菌株及其增量培養方法與用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1352

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta 840 agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta 900 ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtac 960 cgccctattc gaacggtact tgttcttccc taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct 1020 tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg 1080 ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag 1140 gtcggctacg catcgttgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg 1200 ggtccatctg taagtggtag ccgaagccac cttttatgtt tgaaccatgc ggttcaaaca 1260 accatccggt attagccccg gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc aggttaccca 1320 cgtgttactc acccgtccgc cgctaacatc ag 1352 ＜210＞ 2 ＜211＞ 910 ＜212＞ DNA ＜213＞ Bacillus subtilis ＜400＞ 2 cgtcggacaa gccgtaagca ctgaaatcga gccagatcag gtaaggcgca tcggctttat 60 cttctgttca tgtttttcta aaggtaagag atcaattcac aagtttactg cttataatca 120 tcaatgtact atgtgcgaag ttaatgacat atctgtactg gtagagttcg ttaaatattt 180 tagtaaagga gaatacaaaa attttaattc tcaaaagttc tattactata gtaatatata 240 aaaagcttca attaccgcta gaaaaacaat tgaattgtta atgaattatc tttaaaaaag 300 ttatcgataa tgaatactcc gaggtgataa tagtgagttt tgattatatc aaatataaag 360 aacagaatct tcttatgcca atgaaaatta gtaacaagga agaatactat aaagatttaa 420 tgaatatcga acaaagttgg acgggaagat tagacgctca aatttcaaat acatttattc 480 aggaagcaat acaactaata atcaattcta tttctttatt cgaaaatgga tacttcgact 540 gtgcatttta ttcgttaagg caatcactag aggtatctac tacaatggtt tatcttatgg 600 aattagagcc agaaaaaaga aaaactgaac tattgaaatg gaagaaaaaa agtaaatttc 660 cgatgtatgg tcaaatgata aaatttttaa ttactaatag agatacattt gctgatatga 720 aacagaaaat gagtgactat tttaataagc ttcatcttgt aaaagagcgg ctcaataaac 780 atgttcacaa acaaggattt aacacttttt atgtttcaag aaatcaaatt atgaatcgaa 840 ataagaataa tgacgattta ataagtgatt ttaattattg tacaaaaaat tgcattggag 900 caattgcggt 910

Claims (6)

1. 一種枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株，係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910711，其中KHY8係對植物病原菌具抗生活性，其中該植物病原菌係包含蓮霧黑腐病菌( Lasiodiplodia theobromae)、芒果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides) 、芒果畸形病菌( Fusarium mangiferae)、番石柳黑星病菌( Phyllosticta psidiicola)、番石榴瘡痂病菌( Pestalotiopsis psidii)、紅龍果濕腐病菌( Gilbertella persicaria)、紅龍果果腐病菌( Biporlarissp.)、水稻稻熱病菌( Magnaporthe grisea)、蓮霧果腐病菌( Pestalotiopsis euginae)、鳳梨青黴菌( Penicillium spp. )、褐根病菌( Phellinus noxius)、芒果黑斑病菌( Xanthomonas campestrispv. mangiferaindica) 、十字花科黑腐菌( Xanthomonas campestrispv. campestris)、小白菜軟腐病菌( Pectobacterium carotovorum)、水稻白葉枯病菌( Xanthomonas campestrispv. oryzae)及茄科細菌性斑點病菌( Xanthomonas axonopodispv. vesicatoria)其中至少之一。
2. 一種培養高濃度枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株之方法，包含：將枯草桿菌KHY8菌株加入一培養基中，於25~35℃、轉速100~300 rpm、溶氧量0.5~10 ppm之條件培養3~8日，其中該培養基係包含0.1~1 wt%大豆蛋白、0.1~1 wt%酵母粉、0.1~1.5 wt%糖蜜、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH ₂PO ₄)、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K ₂HPO ₄)、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO ₄)、0.1~1 wt%氯化鈣(CaCl ₂·2H ₂O)與逆滲透水。
3. 一種包含枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株之生物農藥，係包含一有效劑量之KHY8菌株，以該有效劑量之KHY8菌株施予一所需植物，以抑制植物病原菌入侵、生長及病徵表現，其中該植物病原菌係包含蓮霧黑腐病菌( Lasiodiplodia theobromae)、芒果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides) 、芒果畸形病菌( Fusarium mangiferae)、番石柳黑星病菌( Phyllosticta psidiicola)、番石榴瘡痂病菌( Pestalotiopsis psidii)、紅龍果濕腐病菌( Gilbertella persicaria)、紅龍果果腐病菌( Biporlarissp.)、水稻稻熱病菌( Magnaporthe grisea)、蓮霧果腐病菌( Pestalotiopsis euginae)、鳳梨青黴菌( Penicillium spp. )、褐根病菌( Phellinus noxius)、芒果黑斑病菌( Xanthomonas campestrispv. mangiferaindica)、十字花科黑腐菌( Xanthomonas campestrispv. campestris)、小白菜軟腐病菌( Pectobacterium carotovorum)、水稻白葉枯病菌( Xanthomonas campestrispv. oryzae)及茄科細菌性斑點病菌( Xanthomonas axonopodispv. vesicatoria)其中至少之一。
4. 如申請專利範圍第3項所述之生物農藥，其中該生物農藥係為液劑或粉劑，且該有效劑量係為KHY8菌株濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/mL之液劑或KHY8菌株濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/g之粉劑。
5. 一種枯草桿菌( Bacillus subtilis)KHY8菌株用於製備生物農藥之用途，係以一有效劑量之枯草桿菌KHY8菌株施予一植物以抑制植物病原菌生長，其中該生物農藥係為液劑或粉劑。
6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該有效劑量係為KHY8菌量濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/mL之液劑或KHY8菌量濃度為1 x 10 ⁷~1 x 10 ¹⁰cfu/g之粉劑。