CN114369556A

CN114369556A - 一株芽孢杆菌、由该芽孢杆菌制成的生防菌剂及其应用

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Publication number: CN114369556A
Application number: CN202210125856.6A
Authority: CN
Inventors: 刘继
Original assignee: Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2022-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2042-02-10
Also published as: CN114369556B

Abstract

本发明涉及一株芽孢杆菌、由该芽孢杆菌制成的生防菌剂及其应用，属于生物菌剂技术领域。本发明提供的芽孢杆菌为QY‑1，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23381，保藏时间为2021年9月10日。本发明的芽孢杆菌QY‑1无论是活菌体还是上清液，还是细胞裂解液，均对多种不同病原菌均具有较好的抑菌作用，其杀菌谱广。同时，该芽孢杆菌QY‑1生活能力强，对营养源、温湿度、酸碱度适用范围广泛。对果蔬无致病性，同时对广谱杀菌剂的耐受性较好，具有较好的应用前景。

Description

一株芽孢杆菌、由该芽孢杆菌制成的生防菌剂及其应用

技术领域

本发明属于生物菌剂技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌、由该芽孢杆菌制成的生防菌剂及其在果蔬栽培期及贮运期抑制病原菌方面的应用。

背景技术

果蔬在种植过程中容易受到土传病菌的侵害，经常会受到来自于细菌、真菌感染的威胁，尤其以真菌性病害最为常见，常见症状有坏死(叶斑、叶枯)、腐烂(根腐、果腐)和萎蔫(根、茎基、维管束组织受侵)等。目前多采用化学杀菌剂、培育抗病品种、间混套作、嫁接等方法进行病害的防治，但这些防治措施各有利弊。

新鲜果蔬在采后和长期贮藏过程中由于其生理生化特性发生变化，会遭受不同程度的侵染性病害(病原微生物侵染)。果蔬采后侵染性病害是由于果蔬在栽培期、初加工时期及贮运期被病原菌侵染所引起的。其中部分栽培期病害在果实成熟过程中表现症状并严重影响产量，部分栽培期病害在果实完全成熟前未表现肉眼可见的病征，但在采后贮运过程中造成极大损失。

目前，控制果蔬采后侵染性病害的主要方法是在栽培期、临采收期甚至采后使用化学农药，但是这将造成严重的面源污染和食品安全问题，因此生物防治是兼顾环境友好、人类健康和经济效益的优选方案。

生物防治是利用活体生防菌及其代谢活性物质来控制病害发生的一种技术，生防菌可在作物植株及根际定殖生长，形成生物屏障保护作物免受病菌侵害，其代谢活性物质一方面抑制杀死病原真菌，另一方面诱导植株提高病害抗性。

然而，现有的生防菌株和生防菌剂并不能代替化学农药进行病害的防治，现有的菌剂主要有以下问题：

(1)生防菌对水果病害防治没有针对性；

现有的生防菌及菌剂并未标注来源于何种作物的种植环境，不同作物的病害差异巨大，生防菌的抑菌谱存在局限性，因此生防菌能够抑制的病原菌种类不清晰，生防菌是否有抑菌效果就成为了随机事件。

(2)生防菌营养源、适宜生境、耐药性不明确；

现有的生防菌及菌剂并未标注最佳及极端营养源、最佳及极端生境、对常用化学杀菌剂、杀虫剂、除草剂的耐药性。该问题造成了生防菌或者菌剂施用后，菌种无法定植或者菌种很快被各类农药杀灭的情况，生防菌的存活也成为了随机事件。

(3)生防菌混合种类过多无法快速形成竞争优势；

由于现有的生防菌对水果病害防治没有针对性，在生产上常会使用很多种生防菌复配形成复合菌剂使用，但是生防菌的效果需要一定的生物量作为保证，使用复合菌剂将造成营养竞争与空间竞争，在该种情况下即使存在有针对性的生防菌，其生物量也不足以对病原菌形成较强的抑制作用。

因此，针对现有单一生防菌存在的抑菌谱较窄、使用局限性大、菌种无法定植、容易被各类农药杀死的问题，而复合菌剂又存在生物量低、各菌种之间营养竞争与空间竞争大、导致对水果病害防治效果差的问题，如何进一步开发出更为高效的可针对果蔬栽培期及贮运期病原菌抑制的单一生防菌，成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一株能够应用于果蔬栽培期及贮运期病害防治的生防菌株，以及由其制备成的生防菌剂和应用。本发明的技术目的是解决单一生防菌存在的抑菌谱窄、使用局限性大、菌种无法定植、容易被各类农药杀死的问题，以及复合菌剂存在的生物量低、各菌种之间营养竞争与空间竞争大、导致对水果病害防治效果差的问题。

本发明的发明人经过大量的实验研究和摸索，获得了一株芽孢杆菌，该芽孢杆菌为QY-1，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心编号为：CGMCC No.23381，保藏时间为：2021年9月10日。

本发明提供的一株芽孢杆菌QY-1，对果蔬病原菌具有广谱的抑菌性，抑制病原菌的种类达到32种。该芽孢杆菌QY-1无论是在果蔬栽培期还是贮运期对各种病原菌都有很好的抑菌效果，菌株定植效果好，能够高效用于果蔬的病害防治和抑菌保鲜，并且该菌株的营养源容易获得、耐极端温度能力强、对农药的抗药性强。且该单一菌株不存在复合菌之间各菌种生物量低、各菌种之间营养竞争与空间竞争大的问题，应用效果极其显著。

本发明提供的上述芽孢杆菌的保守序列如序列表中SEQ NO.1所示。

本发明还进一步提供了包含上述芽孢杆菌的生防菌剂。

本发明还进一步提供了该生防菌剂在防治果蔬病原菌引起的果蔬病害方面的应用以及该芽孢杆菌在制备果蔬保鲜剂方面的应用。

具体的，所述应用是在果蔬栽培期和贮运期采用生防菌剂对果蔬病原菌进行抑制，来防治病害和实现抑菌保鲜。

具体的，所述果蔬病原菌包括Acremonium Sclerotigenum、Aureobasidiummelanogenum、Botryosphaeria laricina、Botrytis cinerea、Botrytisfabae、Byssochlamys spectabilis、Cladosporium cladosporioides、Diaporthe eres、Fusariumdecemcellulare、Fusarium proliferatum、Galactomyces geotrichum、Glomerellaacutata、Lasiodiplodia theobromae、Moniliniapolystroma、Mucor circinelloides、Penicillium camemberti、Penicillium chrysogenum、Penicillium verruculosum、Rhizopus stolonifer、Aspergillus niger、Colletotrichum gloeosporioides、Alternaria alternata、Penicillium expansum、Penicillium multicolor、Schizophyllum commune、Arthrinium urticae、Aspergillus flavus、Talaromycesvariabilis、Microdochium nivale、Fusarium sp.、Penicillium sp.、Cladosporiumbruhnei。

具体的，所述病原菌能够引起的果蔬病害包括：葡萄致腐病(AcremoniumSclerotigenum)、芒果枯萎病(Aureobasidium melanogenum)、草莓根腐病(Botryosphaeria laricina)、蓝莓灰霉病(Botrytis cinerea)、桑葚软腐病(Botrytisfabae)、葡萄果腐病(Cladosporium cladosporioides)、葡萄腐烂病(Diaportheeres)、苹果褐斑病(Fusarium decemcellulare)、桑葚果腐病(Fusarium proliferatum)、苹果腐烂病(Glomerella acutata)、菠萝蜜黑腐病(Lasiodiplodia theobromae)、樱桃褐腐病(Moniliniapolystroma)、柑橘毛霉病(Mucor circinelloides)、柑橘软腐病(Rhizopus stolonifer)、葡萄黑霉病(Aspergillus niger)、西瓜炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、梨黑斑病(Alternaria alternata)、猕猴桃青霉病(Penicilliumexpansum)。

本发明的生防菌剂中芽孢杆菌QY-1的作用浓度为10^6-7CFU/mL。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的芽孢杆菌QY-1活菌体对上述多种病原菌均有很好的抑菌作用，其中芽孢杆菌QY-1活菌体针对19种病原菌的抑菌率达到100％，可以完全抑制病原真菌的生长，抑菌效果极其显著；活菌体的抑菌率大于90％的有6种病原菌，具有很好的抑菌效果；活体菌的抑菌率大于80％的有7种病原菌，仍然具备较好的抑菌效果。

(2)本发明的芽孢杆菌QY-1上清液对不同病原真菌均具有一定的抑菌效果。其中芽孢杆菌QY-1上清液针对病原菌的抑菌率大于90％的有21种病原菌，具有很好的抑菌效果；上清液的抑菌率大于80％的有10种病原菌，仍能具备较好的抑菌效果；上清液抑菌率低于80％的仅有1种病原菌，抑菌效果表现略差，但仍有一定的抑菌性。

(3)本发明的芽孢杆菌QY-1细胞裂解液对不同病原真菌均有一定的抑菌效果，但抑菌效果均略低于QY-1菌株上清液。其中，芽孢杆菌QY-1细胞裂解液抑菌率大于90％的有17种病原菌，抑菌效果很好；细胞裂解液抑菌率大于80％的有12种病原菌，具备较好的抑菌效果；细胞裂解液抑菌率低于80％的有3种病原菌，抑菌效果稍差。

附图说明

图1为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中A1.1:AcremoniumSclerotigenum+QY-1处理；A1.2:Acremonium Sclerotigenum空白对照；A2.1:Aureobasidium melanogenum+QY-1处理；A2.2:Aureobasidium melanogenum空白对照；A3.1:Botryosphaeria laricina+QY-1处理；A3.2:Botryosphaeria laricina空白对照；A4.1:Botrytis cinerea+QY-1处理；A4.2:Botrytis cinerea空白对照。

图2为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中A5.1:Botrytis fabae+QY-1处理；A5.2:Botrytis fabae空白对照；A6.1:Byssochlamys spectabilis+QY-1处理；A6.2:Byssochlamys spectabilis空白对照；A7.1:Cladosporium cladosporioides+QY-1处理；A7.2:Cladosporium cladosporioides空白对照；A8.1:Diaporthe eres+QY-1处理；A8.2:Diaporthe eres空白对照。

图3为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中A9.1:Fusariumdecemcellulare+QY-1处理；A9.2:Fusarium decemcellulare空白对照；A10.1:Fusariumproliferatum+QY-1处理；A10.2:Fusarium proliferatum空白对照；A11.1:Galactomycesgeotrichum+QY-1处理；A11.2:Galactomyces geotrichum空白对照；A12.1:Glomerellaacutata+QY-1处理；A12.2:Glomerella acutata空白对照。

图4为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中A13.1:Lasiodiplodiatheobromae+QY-1处理；A13.2:Lasiodiplodia theobromae空白对照；A14.1:Moniliniapolystroma+QY-1处理；A14.2:Monilinia polystroma空白对照；A15.1:Mucorcircinelloides+QY-1处理；A15.2:Mucor circinelloides空白对照；A16.1:Penicilliumcamemberti+QY-1处理；A16.2:Penicillium camemberti空白对照。

图5为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中A17.1:Penicilliumchrysogenum+QY-1处理；A17.2:Penicillium chrysogenum空白对照；A18.1:Penicilliumverruculosum+QY-1处理；A18.2:Penicillium verruculosum空白对照；A19.1:Rhizopusstolonifer+QY-1处理；A19.2:Rhizopus stolonifer空白对照；B1.1:Aspergillus niger+QY-1处理；B1.2:Aspergillus niger空白对照。

图6为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中B2.1:Colletotrichumgloeosporioides+QY-1处理；B2.2:Colletotrichum gloeosporioides空白对照；B3.1:Alternaria alternata+QY-1处理；B3.2:Alternaria alternata空白对照；B4.1:Penicillium expansum+QY-1处理；B4.2:Penicillium expansum空白对照；B5.1:Penicillium multicolor+QY-1处理；B5.2:Penicillium multicolor空白对照。

图7为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中B6.1:Schizophyllumcommune+QY-1处理；B6.2:Schizophyllum commune空白对照；C1.1:Arthrinium urticae+QY-1处理；C1.2:Arthrinium urticae空白对照；C2.1:Aspergillus flavus+QY-1处理；C2.2:Aspergillus flavus空白对照；C3.1:Talaromyces variabilis+QY-1处理；C3.2:Talaromyces variabilis空白对照。

图8为芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌的抑菌效果，其中C4.1:Microdochiumnivale+QY-1处理；C4.2:Microdochium nivale空白对照；C5.1:Fusarium sp.+QY-1处理；C5.2:Fusarium sp.空白对照；C6.1:Penicillium sp.+QY-1处理；C6.2:Penicillium sp.空白对照；C7.1:Cladosporiumbruhnei+QY-1处理；C7.2:Cladosporiumbruhnei空白对照。

图9为芽孢杆菌QY-1不同pH培养的悬浊度；

图10为芽孢杆菌QY-1在蓝莓果实上进行活体抑菌试验结果，其中左图为空白对照，右图为QY-1菌液处理。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

一、菌株来源

于2019年成都市邛崃市水口镇南宝山蓝莓种植基地分多次采集蓝莓健康及患病的叶片、花、果实装于无菌封口袋内，进行微生物分离鉴定，最初的目的是为了分离得到蓝莓中的病原微生物。但是分别在夏季和秋季的分离中均出现了单一种类细菌污染导致的真菌无法生长现象，两次分离得到的该细菌均为同一菌株，即本发明提供的菌株。

二、菌株的鉴定

提取细菌的DNA，以如下引物进行该菌株的16S rDNA序列测序：

27F：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R：TACGGCTACCTTGTTACGAC

测序获得的保守序列经进化树分析，初步判定为Bacillus amyloliquefaciens或者Bacillus velezensis，其基因序列如SEQ NO.1所示。

在进行抑菌实验后，为了进一步保护该菌株，对菌株进行了全序列测序，并根据序列分析将其定义为Bacillus velezensis。

将该株命名为芽孢杆菌QY-1的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心编号为：CGMCCNo.23381，保藏时间为：2021年9月10日。

三、菌株的抑菌试验

(一)芽孢杆菌QY-1的活菌体抑菌试验

菌株抗菌类型丰富，对草莓、蓝莓、葡萄上的病原菌有较好防治作用。

1.试验设计

由于生防菌株的主要应用方式是使用活体菌株喷施于土壤或者植物表面，因此仅就使用活体菌株的抑菌效果与使用多菌灵的抑菌效果进行了比较。

将QY-1菌株单菌落接种到LB培养基中，在150rpm的28℃恒定摇动培养24h，用血球计数板将细胞悬液密度确定为1×10^7-8CFU/mL。在PDA培养基中加入QY-1菌株细胞悬液，震荡混匀制成平板，每个平板QY-1菌株细胞密度为1×10^6-7CFU/mL。用6mm无菌打孔器取灰葡萄孢霉的菌饼放置在含有QY-1菌株的PDA平板中央，以含有100mg/L多菌灵的PDA平板作为阳性对照，以不含有QY-1菌体的PDA平板培养基作为空白对照，每个处理3个重复。将放置菌饼的平板用自封袋封口，置于26℃恒温培养箱培养，待对照组平板菌丝长满时测定抑菌带宽度。

计算菌丝生长的抑制率R：

R(％)＝(R1-R2)/R1×100％

其中R是抑制菌落直径的百分比，R1是空白对照的菌落直径，R2是处理组的菌落直径。

2.试验结果

试验结果如表1和图1-8所示。由图1-8及表1可以看出，芽孢杆菌QY-1活菌体对不同病原菌均有很好的抑菌作用。QY-1活菌体对Acremonium Sclerotigenum、Aureobasidiummelanogenum、Botryosphaeria laricina、Botrytis cinerea、Botrytisfabae、Byssochlamys spectabilis、Cladosporium cladosporioides、Diaporthe eres、Fusariumdecemcellulare、Fusarium proliferatum、Galactomyces geotrichum、Glomerellaacutata、Lasiodiplodia theobromae、Moniliniapolystroma、Mucor circinelloides、Penicillium camemberti、Penicillium chrysogenum、Penicillium verruculosum和Rhizopus stolonifer的抑菌效果最为显著，抑菌率为100％，可以完全抑制病原真菌的生长。其中，QY-1活菌体对Aspergillus niger、Colletotrichum gloeosporioides、Alternaria alternata、Penicillium expansum、Penicillium multicolor和Schizophyllumcommune的抑菌率大于90％，具有很好的抑制作用；对Arthrinium urticae、Aspergillus flavus、Talaromyces variabilis、Microdochium nivale、Fusarium sp.、Penicillium sp.和Cladosporium bruhnei的抑菌效果仍然较好，抑菌率大于80％。

与100mg/L多菌灵的抑菌率相比，QY-1活菌体对Acremonium Sclerotigenum、Botrytis cinerea、Botrytis fabae、Byssochlamys spectabilis、Cladosporiumcladosporioides、Diaporthe eres、Galactomyces geotrichum、Glomerella acutata、Lasiodiplodia theobromae、Monilinia polystroma、Aspergillus niger、Penicilliumexpansum、Penicillium multicolor、Schizophyllum commune、Arthrinium urticae、Aspergillusflavus、Talaromyces variabilis、Fusarium sp.、Penicillium sp.和Cladosporium bruhnei的抑菌效果更为突出，抑菌率均明显大于100mg/L多菌灵处理。而100mg/L多菌灵处理后，对Colletotrichumgloeosporioides和Alternaria alternata的抑菌效果更好，抑菌率均大于芽孢杆菌QY-1活菌体处理。在对Aureobasidiummelanogenum、Botryosphaeria laricina、Fusarium decemcellulare、Fusariumproliferatum、Mucorcircinelloides、Penicillium camemberti、Penicillium chrysogenum、Penicilliumverruculosum、Rhizopus stolonifer和Microdochium nivale进行QY-1活菌体和100mg/L多菌灵抑菌处理后，抑菌效果相似。

表1芽孢杆菌QY-1活菌体及多菌灵对不同病原菌的抑菌效果

(二)芽孢杆菌QY-1的上清液抑菌试验

上清液的抑菌测试主要用于判断生防菌对于病原菌的抑制效果是否是由于营养竞争造成的，当上清液具有较广泛的抑菌效果时，表明该菌株能够向其生存环境分泌出抑制病原菌的物质。

上清液抑菌试验主要测试胞外抑菌物质的抑菌效果，该方法主要排除营养竞争因素，并且是评价生防菌生防效果的重要指标。

1.试验设计

将培养12h后的芽孢杆菌QY-1，通过反复离心机过滤方式将活菌体去除干净，制成QY-1上清液。吸取200μL上清液均匀涂布于PDA平板上，用6mm无菌打孔器取不同病原菌菌饼放置在PDA平板表面中央，以等量无菌水作为对照，每个处理重复三次。将制备好的平板置于26℃恒温培养箱培养，待对照组平板菌丝长满时测定抑菌带宽度。

计算菌丝生长的抑制率R

R(％)＝(R1-R2)/R1×100％

2.试验结果

芽孢杆菌QY-1上清液对不同病原真菌的抑菌效果如表2所示。其中，QY-1上清液对Acremonium Sclerotigenum、Aureobasidium melanogenum、Botryosphaeria laricina、Botrytis cinerea、Botrytisfabae、Byssochlamys spectabilis、Cladosporiumcladosporioides、Diaporthe eres、Fusarium decemcellulare、Fusariumproliferatum、Galactomyces geotrichum、Glomerella acutata、Lasiodiplodia theobromae、Moniliniapolystroma、Mucor circinelloides、Penicillium camemberti、Penicilliumchrysogenum、Penicillium verruculosum、Rhizopus stolonifer、Aspergillus niger和Colletotrichum gloeosporioides的抑菌效果最好，抑菌率均大于90％。芽孢杆菌QY-1上清液对Alternaria alternata、Penicillium expansum、Penicillium multicolor、Schizophyllum commune、Arthrinium urticae、Aspergillus flavus、Talaromycesvariabilis、Microdochium nivale、Fusarium sp.和Penicillium sp.抑菌效果较好，抑菌率均大于80％。而对于Cladosporium bruhnei，芽孢杆菌QY-1上清液表现出略差的抑菌效果，抑菌率低于80％。

表2芽孢杆菌QY-1上清液对不同病原真菌的抑菌效果

(三)芽孢杆菌QY-1细胞裂解液抑菌试验

1.试验设计

细胞裂解液抑菌试验主要测试菌体内是否含有抑菌物质，以证明细胞外的抑菌物质是由菌体产生。

向芽孢杆菌QY-1活菌体中加入10ml无菌生理盐水摇匀，将摇匀后的溶液放入50ml离心管中，在超声波细胞粉碎机中对QY-1菌株细胞进行粉碎。将细胞粉碎后的溶液用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤器过滤1次，获得液体即为芽孢杆菌QY-1细胞裂解液，4℃保存待用。

吸取200μL细胞裂解液均匀涂布于PDA平板上，用6mm无菌打孔器取不同病原真菌霉菌饼放置在PDA平板表面中央，以等量无菌水作为对照，每个处理重复三次。将制备好的平板置于26℃恒温培养箱培养，待对照组平板菌丝长满时测定抑菌带宽度。菌丝生长的抑制率R公式同上。

2.试验结果

试验结果见表3，从表3可以看出，芽孢杆菌QY-1细胞裂解液对不同病原真菌均有一定的抑菌效果，但抑菌效果均略低于QY-1菌株上清液。其中，芽孢杆菌QY-1细胞裂解液对Acremonium Sclerotigenum、Aureobasidium melanogenum、Botryosphaeria laricina、Botrytis cinerea、Botrytisfabae、Byssochlamys spectabilis、Cladosporiumcladosporioides、Diaporthe eres、Fusarium decemcellulare、Fusarium proliferatum、Galactomyces geotrichum、Glomerella acutata、Lasiodiplodia theobromae、Moniliniapolystroma、Mucor circinelloides、Penicillium camemberti和Penicilliumverruculosum的抑菌效果很好，抑菌率大于90％。QY-1细胞裂解液对Penicilliumchrysogenum、Rhizopus stolonifer、Aspergillus niger、Colletotrichumgloeosporioides、Alternaria alternata、Penicillium expansum、Penicilliummulticolor、Schizophyllum commune、Arthrinium urticae、Aspergillus flavus、Microdochium nivale和Fusarium sp.的抑菌效果较好，抑菌率均大于80％。而对于Talaromyces variabilis、Penicillium sp.和Cladosporium bruhnei，芽孢杆菌QY-1裂解液表现出的抑菌效果稍差，抑菌率均低于80％。

表3芽孢杆菌QY-1细胞裂解液对不同病原真菌的抑菌效果

四、生防菌的生活特性

芽孢杆菌QY-1的生活能力强，主要表现在营养源、温湿度、酸碱度适用性广泛。

1.田间营养源适应性

(1)试验设计

根据蓝莓果树生长的最适土壤环境，拟定了以下土壤营养条件：有机碳23.59％，全氮0.98％，全磷0.85％，全钾2.75％，水分条件田间持水量70％。根据上述条件，对C、N、P、K元素养分进行如下单因素变量设计，每个因素设置4个不同梯度(见表4)：

(2)试验结果

试验结果如表5。由表5可以看出，芽孢杆菌QY-1在不同营养源环境下培养60天后，均表现出较强的生存能力。在营养源为有机碳23.59％，全氮0.98％，全磷0.85％，全钾2.75％的条件下，芽孢杆菌QY-1能够很好的生存超过60天。QY-1菌株在碳、氮、磷、钾元素含量较低的情况下可以存活。在分别缺乏碳、氮、磷、钾元素的情况下，芽孢杆菌QY-1在土壤中均能存活60天以上，表明QY-1菌株并不依赖于某种特定营养元素生存，在某种元素含量极低或者缺失的状态下，芽孢杆菌QY-1仍能够存活60天以上。

表4芽孢杆菌QY-1田间营养源单因素水平表

注：各单因素中，非变量因素维持最适蓝莓生长的营养条件配方。

表5 60天芽孢杆菌QY-1营养源适应性情况

注：“+”表示有活菌，“-”表示无活菌。

2.酸碱度适应性

(1)试验设计

用1mol/L HCl或1mol/LNaOH分别调成pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，灭菌后分别接种1mL芽孢杆菌QY-1种子培养液于100mL调至不同pH的LB液体培养基中，于37℃，150r/min的摇床中培养，12h后用紫外可见分光光度计在600nm波长下测其吸光度及透过率。以不接菌的LB液体培养基为空白对照，每处理3个重复。悬浊度＝(100-透过率)×100％。

(2)试验结果

试验结果见表6和图9。由表5和图9可以看出，芽孢杆菌QY-1在pH＝5-7的条件下，12h后培养液悬浊度均大于50％，表明芽孢杆菌QY-1在pH＝5-7的条件下表现出较好的生存能力。在pH＝4和pH＝8的条件下，12h后培养液悬浊度分别为21.35％和29.08％，说明芽孢杆菌QY-1在偏酸和偏碱条件下可以生长，但生长较为缓慢。当pH＞9时，12h后培养液悬浊度小于10％，表明芽孢杆菌QY-1在碱性较强环境下基本很难生长。适宜生长的pH值为5-8，该pH值范围基本包括了适宜所有果蔬生长的土壤pH值范围。

表6芽孢杆菌QY-1不同pH培养适应性测定

3.田间温湿度适应性

(1)试验设计

在无菌的沙土管中，加入营养条件为有机碳23.59％，全氮0.98％，全磷0.85％，全钾2.75％的无菌营养液，并将水分控制在30％、50％、70％、90％。分别接种1mL QY-1种子培养液，并盖好封口膜，分别于10℃、20℃、40℃、60℃条件下培养，每个处理重复3次。分别在30d、60d、90d取土壤样品溶于生理盐水中，取100μL上清液在LB平板上进行涂布，观察有无活菌及其数量。

(2)试验结果

试验结果见表7。由表7可以看出，芽孢杆菌QY-1在不同田间含水量和温度条件下，60天后的存活情况表明该菌株在各种温度，尤其是高温下的存活能力较强；在各种湿度下尤其是30％以上的土壤含水量下存活能力较强。当含水量为10％时，芽孢杆菌QY-1不能存活超过60天，但是土壤含水量10％在正常的果蔬栽培土壤中不可能出现。而温度在20-60℃、含水量在10-90％的条件下，芽孢杆菌QY-1在土壤环境下60天后均能表现出较好的存活能力。

该菌株对高温的耐受能力较强，对低温及温度极低环境不适应，但是10％以下的土壤含水量情况不会出现在正常作物产区，因此本菌株的生活力适用于绝大多数作物土壤。当空气湿度大时，该菌株可与无机营养液混合喷施于作物表面作为叶面肥及保护剂。

表7 60天芽孢杆菌QY-1不同田间含水量适应性情况

注：“+”表示有活菌，“-”表示无活菌。

五、对果蔬的无致病性

以蓝莓为例，将芽孢杆菌QY-1在健康的蓝莓果实上进行活体抑菌试验。其结果如图10，可见，蓝莓果实在经过芽孢杆菌QY-1活菌处理7天后对果实表面的病原菌有抑制效果，本菌株未造成果实致病作用，果实外观、硬度均为正常后熟水平。在常温放置7天后，经过芽孢杆菌QY-1处理的蓝莓果实没有发生霉变，仅有轻微的失水现象，而对照组果实出现大量霉变。

六、对广谱杀菌剂的耐受性

1.试验设计

将中生霉素、进口农用链霉素、多菌灵、吡唑醚菌酯、嘧核苷类抗生素、苯醚甲环唑、戊唑醇、三环唑吡唑醚菌酯、丙环唑、咪鲜胺、腈菌唑、氟硅唑、氟环唑、嘧菌酯、代森联、百菌清和代森锰锌，共17种化学杀菌剂加入LB液体培养基中，使农药浓度分别为0.1％、1％、5％；以无杀菌剂的LB液体培养基作为对照接种相同浓度的QY-1菌株。于37℃，150r/min的摇床中培养，24h后用接种环蘸取LB液体培养基在LB平板上划线并观察QY-1菌株生长情况，每处理3个重复。

2.试验结果

试验结果如表8，从表8可知，芽孢杆菌QY-1对不同杀菌剂的耐药性不同。其中，1％百菌清和代森锰锌以及5％的中生霉素、链霉素、多菌灵、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、戊唑醇、三环唑吡唑醚菌酯、丙环唑、咪鲜胺、腈菌唑、氟硅唑、氟环唑、嘧菌酯和代森联与芽孢杆菌QY-1共同培养24h后，芽孢杆菌QY-1在LB平板上均能长出，表明芽孢杆菌QY-1对这16种常用的杀菌药物在低浓度条件下的耐药性较好，可以在这16种药物喷施的环境下存活。而芽孢杆菌QY-1在0.1％嘧核苷类抗生素处理后，无法存活。

表8芽孢杆菌QY-1对普通杀菌剂的耐受性

注：表中“+”表示存活，“-”表示无法存活。

序列表

<110> 郫县宇意农业科技有限公司

<120> 一株芽孢杆菌、由该芽孢杆菌制成的生防菌剂及其应用

<141> 2022-02-10

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1425

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

cgatccttct tggatccaac gggcaccgct ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120

tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180

tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240

tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300

tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360

cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420

cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480

cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact cccccagggc ggagtgctta 600

atgcgttagc tgcagcacta aggggccgga aaccccctaa ccacttagca cttcatcgtt 660

tacggcgtgg actaccaggg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgcttcctca 720

gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca 780

tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca 840

atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc 900

cctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 960

acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc 1020

acttgttctt ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg 1080

ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 1140

ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc 1200

gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg 1260

tagccgaagc caccttttat gtctgaacca tgcggttcag acaaccatcc ggtattagcc 1320

ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc 1380

cgccgctaac atcagggagc aagctcccat ctgtccgctt gagga 1425

Claims

1.一株芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为QY-1，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心编号为：CGMCC No.23381，保藏时间为：2021年9月10日。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌的基因保守序列如SEQNO.1所示。

3.一种生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂包含如权利要求1或2所述的芽孢杆菌。

4.权利要求3所述的生防菌剂在防治果蔬病原菌引起的果蔬病害方面中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是在果蔬栽培期和贮运期采用生防菌剂对果蔬病害进行防治。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述果蔬病原菌包括AcremoniumSclerotigenum、Aureobasidium melanogenum、Botryosphaeria laricina、Botrytiscinerea、Botrytis fabae、Byssochlamys spectabilis、Cladosporium cladosporioides、Diaporthe eres、Fusarium decemcellulare、Fusarium proliferatum、Galactomycesgeotrichum、Glomerella acutata、Lasiodiplodia theobromae、Moniliniapolystroma、Mucor circinelloides、Penicillium camemberti、Penicillium chrysogenum、Penicillium verruculosum、Rhizopus stolonifer、Aspergillus niger、Colletotrichumgloeosporioides、Alternaria alternata、Penicillium expansum、Penicilliummulticolor、Schizophyllum commune、Arthrinium urticae、Aspergillus flavus、Talaromyces variabilis、Microdochium nivale、Fusarium sp.、Penicillium sp.和/或Cladosporium bruhnei。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原菌引起的果蔬病害包括葡萄致腐病、芒果枯萎病、草莓根腐病、蓝莓灰霉病、桑葚软腐病、葡萄果腐病、葡萄腐烂病、苹果褐斑病、桑葚果腐病、苹果腐烂病、菠萝蜜黑腐病、樱桃褐腐病、柑橘毛霉病、柑橘软腐病、葡萄黑霉病、西瓜炭疽病、梨黑斑病、猕猴桃青霉病。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生防菌剂中芽孢杆菌QY-1的作用浓度为1×10^6-7CFU/mL。

9.权利要求1或2所述的芽孢杆菌在制备果蔬保鲜剂方面的应用。