TWI620928B - 用於測定膜滯留程度及／或孔結構之樹狀體共軛物 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示用於測定膜滯留程度及/或孔結構之樹狀體共軛物、測定膜程度/孔結構之方法及包括樹狀體共軛物之套組。

Description

用於測定膜滯留程度及/或孔結構之樹狀體共軛物
本發明係關於樹狀體共軛物、使用樹狀體共軛物測定膜之滯留程度及/或孔結構的方法及包括樹狀體共軛物之套組。
以電子方式提交之材料以引用的方式併入
與本申請案同時提交且如下鑑別之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表以全文引用的方式併入本文中：一個1620位元組ASCII(文本)文件，其命名為「720484_SeqListing_ST25.TXT」，創建於2015年7月10日。
可使用諸如洩漏測試及金粒子測試之測試測定膜完整性。然而，此等測試可具有缺點。舉例而言，金粒子測試可由於用於偵測金粒子之儀器的限制而具有有限靈敏性及/或需要高金粒子激發濃度。另外，儘管完整性測試可用於判定膜是否具有大孔或撕裂，但其不能測定膜滯留程度或測定孔結構以確定孔徑或孔等級。
本發明可用於改善先前技術之缺點中之至少一些。本發明之此等及其他優點將由下述描述而顯而易見。
本發明之一具體實例提供一種用於測定膜之滯留程度及/或 孔結構的方法，該方法包含(a)使包含共軛於樹狀體之單股DNA(樹狀體共軛物)之激發溶液(challenge solution)穿過微孔膜，得到包含樹狀體共軛物之滲透溶液；(b)獲得相等體積之：(i)包含樹狀體共軛物之激發溶液；及(ii)包含樹狀體共軛物之滲透溶液；(c)將(i)與PCR試劑組合，得到激發溶液/PCR混合物，及將(ii)與PCR試劑組合，得到滲透溶液/PCR混合物；(d)分別使用激發溶液/PCR混合物及滲透溶液/PCR混合物進行複數個PCR循環，以擴增單股DNA；(e)量測單股DNA濃度，該濃度與樹狀體共軛物濃度相關；(f)定量激發溶液中之樹狀體共軛物濃度(quantCo)；及定量滲透溶液中之樹狀體共軛物濃度(quantCp)；及(g)基於quantCp與quantCo之比較測定膜之滯留程度及/或孔結構。
10‧‧‧儲集器
15‧‧‧通道
25‧‧‧反應腔室
50‧‧‧加熱位置
50A、50B、50C、50D‧‧‧加熱盤之區域
100‧‧‧圓筒
500‧‧‧偵測器
圖1展示根據本發明之一具體實例的說明性樹狀體共軛物，其包含藉由共價醯胺鍵共軛於單股DNA的樹狀體粒子(以具有5.4nm之直徑示出)。
圖2說明根據本發明之一具體實例的通用方法。
圖3展示使用具有不同標稱孔等級值之各種微孔耐綸介質在5mL/min之恆定流速下進行滯留測試之結果。
圖4展示使用具有不同標稱孔等級值之各種微孔高密度聚乙烯介質在5mL/min之恆定流速下進行滯留測試之結果。
圖5展示使用具有不同標稱孔等級值之各種微孔耐綸介質在5psi之恆定壓力下進行滯留測試之結果。
圖6展示使用具有不同標稱孔等級值之各種微孔聚芳基碸介質在5psi 之恆定壓力下進行滯留測試之結果。
圖7展示根據本發明之一具體實例的說明性樹狀體共軛物，其包含藉由順丁烯二醯亞胺-硫醇鍵共軛於單股DNA的樹狀體粒子(以具有5.4nm之直徑示出)。
圖8展示使用另一樹狀體共軛物化學物質及微孔耐綸介質在5mL/min之恆定流速下進行滯留測試之結果。
圖9展示使用具有樹狀體之另一序列及微孔耐綸介質在5mL/min之恆定流速下進行滯留測試之結果。
圖10展示使用具有不同標稱孔等級值之各種微孔聚芳基碸介質在5mL/min之恆定流速下進行滯留測試之結果。
圖11展示使用各種激發濃度之共軛物在5mL/min之恆定流速下進行滯留測試之結果。
圖12A、圖12B及圖12C分別展示具有複數個反應腔室及一個儲集器之可旋轉圓筒的俯視圖，其中反應腔室經由通道連接於儲集器，該可旋轉圓筒適合於可用於根據本發明之具體實例進行PCR循環的例示性PCR裝置；在具有可加熱至不同溫度以進行PCR之複數個獨立區域的加熱盤上佈置的該圓筒之截面側視圖；及具有可加熱至不同溫度以進行PCR之4個獨立區域的說明性加熱盤。
根據本發明之一具體實例，提供一種測定膜結構滯留程度及/或孔結構的方法，該方法包含(a)使包含共軛於樹狀體之單股DNA(樹狀體共軛物)之激發溶液穿過微孔膜，得到包含樹狀體共軛物之滲透溶液； (b)獲得相等體積之：(i)包含樹狀體共軛物之激發溶液；及(ii)包含樹狀體共軛物之滲透溶液；(c)將(i)與PCR試劑組合，得到激發溶液/PCR混合物，及將(ii)與PCR試劑組合，得到滲透溶液/PCR混合物；(d)分別使用激發溶液/PCR混合物及滲透溶液/PCR混合物進行複數個PCR循環，以擴增單股DNA；(e)量測單股DNA濃度，該濃度與樹狀體共軛物濃度相關；(f)定量激發溶液中之樹狀體共軛物濃度(quantCo)；及定量滲透溶液中之樹狀體共軛物濃度(quantCp)；及(g)基於quantCp與quantCo之比較測定膜之滯留程度及/或孔結構。在一較佳具體實例中，PCR循環為qPCR循環。
典型地，基於藉由比較quantCp與quantCo之對數下降值進行之quantCp與quantCo的比較測定膜之滯留程度及/或孔結構。
在方法之一些具體實例中，樹狀體共軛物之單股DNA與樹狀體的比率為1：1。
必要時，方法之具體實例可包含使激發溶液在恆定流速或恆定壓力下穿過微孔膜。
儘管方法之具體實例(尤其關於進行PCR擴增)可使用多種裝置進行，但說明性地在如下裝置內，該裝置包含具有複數個反應腔室及一個儲集器之可旋轉圓筒，反應腔室經由通道連接於儲集器，其中反應腔室之至少一部分包含引子；及具有可加熱到至少兩種不同溫度之至少兩個獨立區域的加熱盤，相等體積之包含樹狀體共軛物之激發溶液及包含樹狀體共軛物之滲透溶液可各與PCR試劑組合以分別得到激發溶液/PCR混合物及滲透溶液/PCR混合物；且可分別使用激發溶液/PCR混合物及滲透溶液 /PCR混合物進行複數個PCR循環，以擴增單股DNA，方法之一具體實例可包含除引子外，用含有樹狀體共軛物及用於進行擴增反應之PCR試劑的流體至少部分填充儲集器；將流體分配至其中包含引子之反應腔室；及旋轉可旋轉圓筒以依次使各反應腔室之內含物達到由加熱盤之至少兩個獨立區域限定之至少兩種溫度，在該等區域中單股DNA擴增。
在方法之一些具體實例中，其中加熱盤具有可加熱到至少三種不同溫度之至少三個獨立區域，方法包括旋轉可旋轉圓筒以依次使各反應腔室之內含物達到由加熱盤之至少三個獨立區域限定之至少三種溫度。
根據另一具體實例，提供一種套組，該套組包含有包含複數種共軛於單股DNA之樹狀體的溶液；具有複數個反應腔室(含有經乾燥引子及較佳經乾燥探針)及一個儲集器之可旋轉圓筒，其中反應腔室經由通道連接於儲集器；及qPCR主混合物。在套組之一個具體實例中，qPCR主混合物包含參考染料、聚合酶、MgCl2及dNTP。
有利地，相比於其他測試，由於偵測粒子之儀器(例如偵測金、矽膠及乳膠粒子之儀器，包括感應耦合電漿質譜(ICP-MS)粒子計數儀器)的有限靈敏性，該等測試需要激發溶液中具有高水準之粒子，現在可使用更實際之低粒子激發濃度(例如約1,000至約10,000個粒子/毫升)進行測試，且可測試極緊密孔結構高效膜以僅測定基於篩分之滯留效能。
樹狀體為重複分枝鏈分子，典型地為高度對稱球形化合物，且可認為具有三個主要部分：核心、內殼及外殼。其可藉由代來分類，代係指其合成期間進行的重複分枝循環之數目。此外，樹狀體之代數愈高，表面上之官能基暴露得愈多。多種樹狀體粒子適用於本發明，其中必要時， 樹狀體可經官能化以共軛於單股DNA。適合官能基包括例如胺基、羥基及/或丁二醯胺酸官能基。適合樹狀體包括例如市售樹狀體。在一個具體實例中，樹狀體包含聚醯胺基胺(PAMAM)樹狀體，諸如第5代PAMAM樹狀體。
圖1說明PAMAM樹狀體與羧酸封端之單股DNA序列反應以藉由共價醯胺鍵將DNA固定於胺基官能化樹狀體上。
樹狀體粒子可具有任何適合直徑，典型地，直徑為至少約2nm，但可使用較小直徑粒子，在可獲得時較佳單分散尺寸直徑。
根據本發明之具體實例，單股DNA不限於任何特定序列或任何特定數目之鹼基。然而，序列應經選擇以使得其不太可能天然存在於激發溶液中，且典型地，單股DNA之長度為至少約50個鹼基(例如對於藉由qPCR擴增之效率而言)。
DNA與樹狀體之比率應使得其不會顯著改變共軛物之尺寸。較佳地，DNA與樹狀體之比率為1：1，例如使得PCR量測之DNA濃度與樹狀體粒子之濃度直接相關。然而，亦可使用諸如10：1或甚至更高之比率。
自由DNA之存在(下文稱為「自由DNA濃度(free-DNA concentration)」)可影響方法之靈敏性。舉例而言，若對數去除值(log removal value，LRV)宜為4或4以上，則較佳自由DNA濃度水準為<0.001%；對於約3之適宜LRV，自由DNA濃度水準為約0.01%；對於約2之適宜LRV，自由DNA濃度水準為約0.1%；且對於約1之適宜LRV，自由DNA濃度水準為約1%。
本發明之具體實例尤其適用於水溶液。
欲分析之膜可具有任何滯留程度，例如對數去除率(LRV)；或孔結構，例如孔徑(例如由起泡點證明或如例如美國專利4,340,479中所述藉由KL證明或藉由毛細凝聚流動孔率測量術證明)、平均流動孔(MFP))徑(例如使用孔率儀特性化，例如Porvair孔率儀(Porvair plc,Norfolk,UK)，或可以商標POROLUX(Belgium)購得之孔率儀)、孔等級、孔直徑(例如在使用如例如美國專利4,925,572中所述經改良之OSU F2測試特性化時)或去除率中數。所用孔結構取決於欲使用粒子之尺寸、欲處理流體之組成及所處理流體之所要流出程度。
本發明之具體實例適合於分析疏水性膜及親水性膜。
多種膜、尤其聚合膜適用於本發明且為此項技術中已知。適合聚合物可包括例如聚芳烴；碸(例如聚碸，包括芳族聚碸，諸如聚醚碸(PES)、聚醚醚碸、雙酚A聚碸、聚芳基碸(PAS)及聚苯基碸)、聚醯胺、聚醯亞胺、聚偏二鹵乙烯(包括聚偏二氟乙烯(PVDF))、聚烯烴(諸如聚丙烯及聚甲基戊烯)、聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯腈(包括聚烷基丙烯腈)、纖維素聚合物(諸如醋酸纖維素及硝酸纖維素)、氟聚合物(諸如聚四氟乙烯(PTFE))及聚醚醚酮(PEEK)。聚合物膜可包括聚合物之混合物，例如疏水性聚合物(例如碸聚合物)及親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮)。
可為疏水性或親水性之膜可具有任何臨界濕潤表面張力(CWST，如例如美國專利4,925,572中所定義)，且如例如美國專利5,152,905、5,443,743、5,472,621及6,074,869中另外揭示。
使用聚合酶鏈反應(PCR)、較佳定量PCR(qPCR)擴增DNA可使用此項技術中已知之裝置及方法進行。適合裝置包括(但不限於)購自Thermo Fisher Scientific Inc.(Applied Biosystems® 7900HT、7300、7500、7500快速、StepOneTM及StepOnePlus、QuantStudio®)；Roche(LightCycler® 480、96、1536、Carousel及Nano系統)；Qiagen(Rotor-Gene QTM系統)；及Bio-Rad(CFXTM及ChromoTM系統)之裝置。
進行PCR之一個較佳裝置描述於美國專利6,821,771中(其包括具有複數個反應腔室及一個儲集器之可旋轉圓筒，反應腔室經由通道連接於儲集器；及具有可加熱到至少兩種不同溫度之至少兩個、較佳至少三個獨立區域的加熱盤)，其使用例如購自Pall公司，Port Washington,NY,USA之GENEDISC盤。圖12A、12B及12C分別展示具有複數個反應腔室25及一個儲集器10之可旋轉圓筒100的俯視圖，其中反應腔室經由通道15連接於儲集器，該可旋轉圓筒適合於可用於根據本發明之具體實例進行PCR循環的例示性PCR裝置；在具有可加熱至不同溫度以進行PCR之複數個獨立區域的加熱盤50(50A、50B、50C、50D)上佈置的圓筒100之截面側視圖；及具有可加熱至不同溫度以進行PCR之4個獨立區域(50A、50B、50C、50D)的說明性加熱盤50。圖12B亦展示偵測器500，較佳螢光偵測器，其用於偵測PCR期間反應腔室中之信號(較佳螢光染料)。
說明性地，在如下裝置內，該裝置包含具有複數個反應腔室及一個儲集器之可旋轉圓筒，反應腔室經由通道連接於儲集器，其中反應腔室之至少一部分包含引子(較佳地，反應腔室亦包含探針)；及具有可加熱至複數種不同溫度之複數個獨立區域的加熱盤，相等體積之包含樹狀體 共軛物之激發溶液及包含樹狀體共軛物之滲透溶液可各與PCR試劑組合以分別得到激發溶液/PCR混合物及滲透溶液/PCR混合物；且可分別使用激發溶液/PCR混合物及滲透溶液/PCR混合物進行複數個PCR循環，以擴增單股DNA，方法之一具體實例可包含除引子外，用含有樹狀體共軛物及用於進行擴增反應之PCR試劑的流體至少部分填充儲集器；將流體分配至其中包含引子之反應腔室；及旋轉可旋轉圓筒以依次使各反應腔室之內含物達到由加熱盤之獨立區域限定之不同溫度，在該等區域中單股DNA擴增。
在方法之一些具體實例中，其中加熱盤具有可加熱到至少三種不同溫度之至少三個獨立區域，方法包括旋轉可旋轉圓筒以依次使各反應腔室之內含物達到由加熱盤之至少三個獨立區域限定之至少三種溫度。
以下實施例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其範疇。
實施例1
此實施例展現在恆定流速下測試時各種微孔親水性耐綸膜之滯留程度的測定。
圖2展示在此實施例中進行之方法的通用圖解概述。
用n-羥基丁二醯亞胺活化直徑為5.4nm之市售單分散尺寸之第5代聚醯胺基胺(PAMAM)樹狀體粒子(Sigma-Aldrich Chemicals)以在樹狀體表面上產生酯基。使經活化樹狀體與羧酸封端的長度為66個鹼基之單股DNA序列(自5'至3')CTTGCAAATCGTTCTTTGGGTCCTCTTGCGACCCTGGGAGTGAGCTTGTATGGTTGACGCCGGATT(SEQ ID：1)反應，以1：1比率藉由共價醯胺鍵將DNA固定於樹狀體上。在pH 7.0下，樹狀體上之胺 基質子化為NH3 +且為DNA上帶負電之磷酸根基團之量的約兩倍，因此使樹狀體共軛物帶正電。在聚丙烯醯胺凝膠電泳期間，樹狀體共軛物僅在中性pH下自電極之陽極側向陰極側移動證實DNA與樹狀體之比率為1：1。
藉由使用100KDa截留膜在pH 10.2下透析共軛物溶液兩次以去除自由DNA。
將DNA-樹狀體共軛物儲備液摻入1mM CAPS緩衝液(pH 10.5)中以製備共軛物濃度為1×108個粒子/毫升之工作激發溶液。
用1mM CAPS(pH 10.5)緩衝液潤濕47mm微孔耐綸濾片，將濾片置於過濾器固持器中，用適當體積之工作激發溶液填充壓力注射器，且將導管連接於經由空氣閥連接壓力容器的注射器。
藉由調節壓力以維持5mL/min之恆定流速來起始激發測試，且收集多份10mL體積之滲透部分。
測試具有不同孔等級值之5個不同耐綸濾片：40nm、20+250nm(雙層)、20nm、10nm及5nm。
藉由於超純水中連續稀釋DNA(DNA序列與連接於樹狀體者相同)製備在1×1011個複本/毫升至1×103個複本/毫升範圍內的DNA標準品。亦根據樣品、標準品及陰性對照之數目製備適當體積之qPCR反應混合物(含有主混合物(主混合物包括參考染料、聚合酶、MgCl2及dNTP)、引子及超純水)。將5μL工作激發溶液及滲透部分(使用第二滲透部分以避免對第一滲透部分之任何緩衝液稀釋作用)各添加於各別20μL qPCR混合物中且置於96孔盤中之特定孔中。將5μL超純水添加至陰性對照孔中。
使用以下序列進行qPCR：正向引子： CTTGCAAATCGTTCTTTGGG(SEQ ID：2)；反向引子：AATCCGGCGTCAACCATAC(SEQ ID：3)；及探針：CCTCTTGCGACCCTGGGAGTGAGCT(SEQ ID：4)，其中螢光染料螢光素(EAM6)連接於探針之5'端，且淬滅劑黑洞淬滅劑-1(BHQ1)連接於探針之3'端。
將96孔盤置於qPCR機(7500快速即時PCR系統；Applied Biosystems,Carlsbad,CA)中且進行40個qPCR循環(95℃ 15秒且60℃ 60秒)，且由各孔產生螢光曲線，其具有特定臨限值循環。
軟體將已知DNA標準品之臨限值循環與工作激發溶液及滲透溶液之臨限值循環匹配以計算彼等溶液中之樹狀體共軛物濃度(因為DNA與樹狀體之1：1比率使得qPCR量測之DNA濃度與樹狀體粒子之濃度直接相關)。分析資料以定量激發溶液及滲透部分中之共軛物濃度且計算介質效能。
藉由獲取滲透物中樹狀體共軛物之濃度對於工作激發溶液中樹狀體共軛物之濃度的反對數計算膜效能。
如圖3中所示，40nm、20+250nm(雙層)、20nm、10nm及5nm介質之各別平均對數去除值(LRV)為0.02±0.01、0.06±0.02、0.04±0.01、0.19±0.01及0.52±0.10。
共軛物中高於95%穿過較大孔等級耐綸介質(例如40nm、250+20nm、20nm)表明共軛物不吸附或黏附於該等介質。因此，較細孔等級耐綸介質(例如10nm及5nm)之滯留值主要歸因於篩分作用。結果亦指示恆定流速下之共軛物測試能夠在不同細孔等級耐綸介質之間辨別。
實施例2
此實施例展現在恆定流速下測試時微孔疏水性高密度聚乙烯(HDPE)膜之滯留程度的測定。
如實施例1中所述製備樹狀體共軛物。
將DNA-樹狀體共軛物儲備液摻入1mM含有0.03% Tween-20(界面活性劑)之CAPS緩衝液(pH 10.5)中以製備共軛物濃度為1×108個粒子/毫升的工作激發溶液。
用異丙醇(IPA)潤濕47mm微孔HDPE濾片，置於過濾器固持器中，且使150mL IPA在50psi下穿過該片以灌注該片，繼而使500mL去離子(DI)水穿過以洗滌該片。
使20mL 1mM含有0.03% Tween-20之CAPS緩衝液(pH 10.5)穿過該片。
用適當體積之工作激發溶液填充壓力注射器，且將導管連接於經由空氣閥連接壓力容器之注射器。
藉由調節壓力以維持5mL/min之恆定流速來起始激發測試，且收集多份10mL體積之滲透部分。
測試具有不同孔等級值之4個不同HDPE濾片：30nm、10nm、5nm及2nm。
將5μL工作激發溶液及滲透部分(使用第三滲透部分以避免對第二滲透部分之任何緩衝液稀釋作用)各添加於各別20μL qPCR混合物中且置於96孔盤中之特定孔中。將5μL超純水添加至陰性對照孔中。
進行qPCR，且如實施例1中所述計算膜效能。
如圖4中所示，30nm、10nm、5nm及2nm介質之各別平均LRV為0.01±0.001、0.05±0.03、0.14±0.04及0.40±0.15。
共軛物中高於95%穿過較大孔等級HDPE(例如30nm)表明共軛物不吸附或黏附於HDPE介質。因此，較細孔等級HDPE(例如10nm、5nm及2nm)之滯留值主要歸因於篩分作用。結果亦指示恆定流速下之共軛物測試能夠在不同細孔等級HDPE介質之間辨別。
實施例3
此實施例展現恆定壓力下測試時微孔親水性耐綸膜之滯留程度的測定。
如實施例1中通常所述測試微孔耐綸膜，不過激發測試藉由將調節劑維持在5psi之固定壓力下從而提供1mL/min之流速起始。
如圖5中所示，40nm、10nm及5nm介質之各別平均LRV為0.04±0.02、0.20±0.02及0.60±0.07。
共軛物中高於95%穿過較大孔等級耐綸介質(例如40nm)表明共軛物不吸附或黏附於該等介質。因此，較細孔等級耐綸介質(例如10nm及5nm)之滯留值主要歸因於篩分作用。結果亦指示恆定壓力下之共軛物測試能夠在不同細孔等級耐綸介質之間辨別。
實施例4
此實施例展現恆定壓力下測試時微孔聚芳基碸(PAS)膜之滯留程度的測定。
如實施例3中通常所述測試PAS膜。測試具有不同孔等級值之2個不同PAS濾片：30nm及10nm。
如圖6中所示，30nm及10nm介質之各別平均LRV為0.06±0.03及0.72±0.09。
共軛物中高於95%穿過較大孔等級PAS介質(30nm)表明共軛物不吸附或黏附於該等介質。因此，較細孔等級介質(10nm)之滯留值主要歸因於篩分作用。結果亦指示恆定壓力下之共軛物測試能夠在不同孔等級介質之間辨別。
實施例5
此實施例展現另一羧酸官能化PAMAM樹狀體可用於本發明之具體實例中。
用一端含有胺反應性丁二醯亞胺酯(亦即NHS酯)且另一端含有硫氫基反應性基團(例如順丁烯二醯亞胺)之異雙官能交聯劑活化直徑為5.4nm之市售單分散尺寸第5代聚醯胺基胺(PAMAM)樹狀體粒子(Sigma-Aldrich Chemicals)。使用如實施例1中所述之SEQ ID：1將硫氫基封端之寡聚物經由順丁烯二醯亞胺-硫醇鍵以1：1比率共價固定於樹狀體上。
藉由使用100KDa截留膜在pH 10.2下透析共軛物溶液兩次去除自由DNA。
如實施例1中通常所述使用標稱10nm孔等級耐綸膜進行該實施例。
如圖8中所示，平均LRV為0.20±0.02，證實膜之10nm孔等級。結果展示滯留值僅取決於共軛物尺寸，且不取決於共軛物序列之性質、官能性及DNA-樹狀體鍵之類型。
實施例6
此實施例展現可根據本發明之一具體實例使用另一單股DNA序列。
如實施例1中所述製備經活化樹狀體且與以下衍生自細菌酸熱脂環芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)之基因組的羧酸封端之長單股DNA序列(5'至3')CTTGCTGGACAGTGACTGACTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTGGAAACCCAATAAGCAGTCCGGG(SEQ ID：5)反應而以1：1比率藉由共價醯胺鍵將DNA固定於樹狀體上。
如實施例1中通常所述使用標稱10nm孔等級耐綸膜進行該實施例。
使用以下序列進行qPCR：正向引子：CTTGCTGGACAGTGACTGAC(SEQ ID：6)；反向引子：CCCGGAGTGCTTATTGGGTTTCC(SEQ ID：7)；及探針：CCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTG(SEQ ID：8)，其中螢光染料螢光素(FAM6)連接於探針之5'端，且淬滅劑黑洞淬滅劑-1(BHQ1)連接於探針之3'端。
如圖9中所示，平均LRV為0.24±0.01，證實膜之10nm孔等級。結果展示滯留值僅取決於共軛物尺寸，且不取決於共軛物序列之性質、官能性及DNA-樹狀體鍵之類型。此亦藉由如圖3及圖8中所示參考10nm孔等級耐綸膜之類似結果強化。
實施例7
此實施例展現在恆定流速下測試時各種微孔聚芳基碸 (PAS)膜之滯留程度的測定。
如實施例1中通常所述測試PAS膜。測試具有不同孔等級值之2個不同PAS濾片：30nm及10nm。
如圖10中所示，30nm及10nm介質之各別平均LRV為0.05±0.01及0.22±0.01。
共軛物中高於95%穿過較大孔等級PAS介質(30nm)表明共軛物不吸附或黏附於該等介質。因此，較細孔等級介質(10nm)之滯留值主要歸因於篩分作用。結果亦指示恆定壓力下之共軛物測試能夠在不同孔等級介質之間辨別。
實施例8
此實施例展現可使用多種樹狀體共軛物濃度分析本發明之具體實例中的膜，且測試代表篩分效能。
製備經活化樹狀體且與如實施例1中通常所述之羧酸封端之長單股DNA序列反應。
製備5種不同DNA-樹狀體共軛物激發濃度，且該實施例通常在5mL/min之恆定流速下如實施例1中通常所述使用標稱10nm孔等級耐綸膜進行。激發濃度為2×104個粒子/毫升、2×105個粒子/毫升、2×106個粒子/毫升、2×107個粒子/毫升及2×108個粒子/毫升。
如圖11中所示，2×104個粒子/毫升、2×105個粒子/毫升、2×106個粒子/毫升、2×107個粒子/毫升及2×108個粒子/毫升激發濃度之LRV分別為0.18、0.15、0.14、0.15及0.18。
結果證實膜之10nm孔等級，且展示該測試與粒子激發濃度 無關，從而呈現介質之真實篩分效能。另外，如此低之共軛物濃度的定量僅可能藉由qPCR實現。
本文中所引用之所有參考文獻(包括公開案、專利申請案及專利)特此以引用之方式併入，該引用程度如同個別及特定地指示各參考文獻以引用之方式併入且於本文中全文闡述一般。
除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)使用術語「一(a/an)」及「該(the)」及「至少一(at least one)」及類似指示物應視為覆蓋單數與複數。除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則使用後接一或多個項目之清單之術語「至少一」(例如「A及B中之至少一者(at least one of A and B)」)應視為意謂選自所列項目之一個項目(A或B)或所列項目中之兩者或兩者以上的任何組合(A及B)。除非另外說明，否則術語「包含(comprise)」、「具有(have)」、「包括(include)」及「含有(contain)」應視為開放術語(亦即意謂「包括(但不限於)(including,but not limited to)」)。除非本文另外指示，否則本文中值範圍之敍述僅意欲充當個別提及屬於該範圍內之各各別值的簡寫方法，且各各別值併入本說明書中，如同在本文中個別地敍述一般。除非本文中另外指示或者上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合之次序進行。除非另外主張，否則使用本文中所提供之任何及所有實施例或例示性語言(例如，「諸如(such as)」)僅意欲較好地闡明本發明而不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應理解為指示任何未主張之要素對於實踐本發明而言必不可少。
本發明之較佳實施例描述於本文中，包括本發明者已知之進 行本發明的最佳方式。在閱讀以上描述之後，彼等較佳具體實例之變化形式對於一般技術者可變得顯而易見。本發明者期望熟習此項技術者適當時採用此類變化形式，且本發明者意欲以不同於本文中特定所述之方式實踐本發明。因此，在適用法律允許時，本發明包括其隨附申請專利範圍中所述之標的物的所有修改及等效形式。此外，除非本文中另外指示或者上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素以其所有可能變化形式之任何組合。
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Claims (12)

  1. 一種用於測定膜之滯留程度及/或孔結構的方法，該方法包含：(a)使包含共軛於樹狀體之單股DNA(樹狀體共軛物)的激發溶液(challenge solution)穿過微孔膜，得到包含該等樹狀體共軛物之滲透溶液；(b)獲得相等體積之：(i)該包含樹狀體共軛物之激發溶液；及(ii)該包含樹狀體共軛物之滲透溶液；(c)將(i)與PCR試劑組合，得到激發溶液/PCR混合物，及將(ii)與PCR試劑組合，得到滲透溶液/PCR混合物；(d)分別使用該激發溶液/PCR混合物及該滲透溶液/PCR混合物進行複數個PCR循環，以擴增該單股DNA；(e)量測單股DNA濃度，該濃度與樹狀體共軛物濃度相關；(f)定量該激發溶液中之樹狀體共軛物濃度(quantCo)；及定量該滲透溶液中之樹狀體共軛物濃度(quantCp)；及(g)基於該quantCp與該quantCo之比較測定該膜之滯留程度及/或孔結構。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等PCR循環為qPCR循環。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中(g)包含比較quantCp及quantCo之對數下降值。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該等樹狀體共軛物中單股DNA與樹狀體的比率為1：1。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其包含使該激發溶液在恆定流速下穿過該微孔膜。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其包含使該激發溶液在恆定壓力下穿過該微孔膜。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中(c)及(d)包含使用如下裝置，其包含具有複數個反應腔室及一個儲集器之可旋轉圓筒，該等反應腔室經由通道連接於該儲集器，其中該等反應腔室之至少一部分包含引子；及具有可加熱到至少兩種不同溫度之至少兩個獨立區域的加熱盤，該方法包含：除引子外，用含有樹狀體共軛物及用於進行擴增反應之PCR試劑的流體至少部分填充該儲集器；將該流體分配至其中包含該等引子之該等反應腔室；及旋轉該可旋轉圓筒以依次使各反應腔室之內含物達到由該加熱盤之該至少兩個獨立區域限定之至少兩種溫度，其中該單股DNA擴增。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該加熱盤具有可加熱到至少三種不同溫度之至少三個獨立區域，且該方法包括旋轉該可旋轉圓筒以依次使各反應腔室之內含物達到由該加熱盤之該至少三個獨立區域限定之至少三種溫度。
  9. 如申請專利範圍第7項之方法，其中除該等引子以外，該等反應腔室之至少一部分亦包含探針。
  10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中除該等引子以外，該等反應腔室之至少一部分亦包含探針。
  11. 一種用於測定膜之滯留程度及/或孔結構的套組，其包含：包含複數種共軛於單股DNA之樹狀體的溶液；具有複數個含有經乾燥引子之反應腔室及一個儲集器的可旋轉圓筒，其中該等反應腔室經由通道連接於該儲集器；及qPCR主混合物。
  12. 如申請專利範圍第11項之套組，其中該等反應腔室進一步含有經乾燥探針。
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