TWI607755B - 麥角固醇之應用 - Google Patents

Description

麥角固醇之應用

本發明係關於使用麥角固醇以減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷、減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積、及/或提升肝臟代謝酒精能力的應用。

「飲酒」在世界各地的社交聚會及慶祝活動中是非常普遍的現象。然而，研究證實，酒精攝取會增加體內脂質生成(lipogenesis)，並減少脂肪酸的代謝與運輸，造成體內脂肪累積，導致各種脂肪代謝相關的疾病，例如高血脂症、動脈硬化心臟血管疾病、心律不整、心臟衰竭、血管阻塞、脂肪肝等。其中，又以脂肪肝最為常見，且可能進一步演變成肝炎(hepatitis)，甚至會轉變為肝臟纖維化(liver fibrosis)、肝硬化(liver cirrhosis)或肝癌(hepatic carcinoma)。

此外，已知過量攝取酒精與許多疾病的發生有關，例如可能引起酒精性心肌症(alcoholic cardiomyopathy，ACM)、冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)；直接影響腎臟功能及結構，改變其調控體內液體之體積與組成以及電解質比例的能力；造成中樞神經系統(central nervous system，CNS)退化以 及大腦功能失調；以及造成肝臟疾病的惡化等。前述可參見例如：Alcohol and lipid metabolism.Am J Physiol Endocrinol Metab.295：10-16(2008)、Alcohol abuse and heart failure.European Journal of Heart Failure.11：453-462(2009)、Alcohol’s impact on kidney function.Alcohol Health Res world.21(1)：84-92(1997)、以及DNA damage and neurotoxicity of chronic alcohol abuse.Experimental Biology and Medicine.237(7)：740-747(2012)，該等文獻之全文併於此處以供參考。

關於上述酒精對人體所產生的不良影響，市面上已有許多標榜可在經常性之酒類攝取的慢性酒精攝取情況下保護肝臟的保健食品，然而，該等保健食品絕大多數都只針對肝臟之抗氧化功能的提升，並不具有調節體內脂質恆定(lipid homeostasis)或是提升肝臟代謝酒精之能力的效果。有鑒於部分特定族群於日常生活中因無可避免的因素(例如「應酬文化」)而必須飲酒，因此，若可開發更有效之提升肝臟代謝酒精能力、調節脂質恆定、及/或抗發炎的藥劑或製劑，將有助於降低許多因為酒精攝取所造成之疾病的發生率。

本案發明人研究後發現，麥角固醇(ergstatrien-3β-ol)可有效提升肝臟代謝酒精之能力，故可用於減少或免除酒精攝取所可能造成的危害。此外，本案發明人亦發現，對於因為酒精攝取所導致之體脂肪累積或肝臟損傷的個體，麥角固醇可有效減緩及/或抑制該體脂肪累積，或減緩、抑制及/或治療該肝臟損傷，其中，該肝臟損傷包括肝臟發炎、肝臟纖維化、肝硬化及、肝癌等。

因此，本發明可以透過單一活性成分(即，麥角固醇)之使用，在相對低廉的製造成本下，達到減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷、減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積、及/或提升肝臟代謝酒精能力的效果，深具經濟效益。

本發明之一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該活性成分係麥角固醇(ergstatrien-3β-ol)以及其醫藥上可接受之酯的至少一者，且該藥劑係用於減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷，尤其是針對慢性酒精攝取所造成的肝臟損傷。

本發明之另一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該活性成分係麥角固醇以及其醫藥上可接受之酯的至少一者，且該藥劑係用於減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積，尤其是針對慢性酒精攝取所造成的體脂肪累積。

本發明之又一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造一製劑的用途，其中該活性成分係麥角固醇以及其醫藥上可接受之酯的至少一者，且該製劑係一用以提升肝臟代謝酒精能力之食品或食品添加劑。

本發明之再一目的，在於提供一種減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷的方法，其係包含於有需要之個體中投予一有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述 之組合。其中，該方法尤其是針對慢性酒精攝取所造成之肝臟損傷的減緩、抑制及/或治療。

本發明之又再一目的，在於提供一種減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積的方法，其係包含於有需要之個體中投予一有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。其中，該方法尤其是針對慢性酒精攝取所造成之體脂肪累積的減緩及/或抑制。

本發明之又再一目的，在於提供一種提升肝臟代謝酒精能力的方法，其係包含於有需要之個體中投予一有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。

本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

第1圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇(ergstatrien-3β-ol，以下簡稱為「EK100」)對於小鼠體重的影響，顯示小鼠於實驗期間(共4週)之體重變化的曲線圖，其中控制組(以「control」表示)係每日餵飼正常流質飼糧、酒精處理組(以「EtOH」表示)係每日餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)係每日餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧且管灌1毫克/公斤體重之麥角固醇、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)係每日餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧且管灌5毫克/公斤體重之麥角固醇、及麥角固醇十倍組(以 「EK100_10X」表示)係每日餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧且管灌10毫克/公斤體重之麥角固醇；第2圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠體內之三酸甘油酯(TAG)與總膽固醇(TC)含量的影響，其中第2A圖係顯示血清中之三酸甘油酯(TAG)與總膽固醇(TC)含量的長條圖，第2B圖係顯示肝臟中之三酸甘油酯(TAG)與總膽固醇(TC)含量的長條圖，第2C圖係顯示糞便中之三酸甘油酯(TAG)與總膽固醇(TC)含量的長條圖，且第2A、2B及第2C圖皆包含控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第3圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠膽酸排出量的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)小鼠糞便中膽酸含量的結果；第4圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠肝臟中脂質合成相關基因(即，LXR-α、SREBP-1c、ACC、FAS、及ME)之表現的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第5圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠 肝臟中促脂肪酸β氧化基因(即，PPAR-α、RXR-α、CPT1、及UCP2)之表現的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第6圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇後小鼠肝臟外觀的照片圖，其中第6A、6B、6C、6D及6E圖係分別顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)小鼠之肝臟外觀；第7圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇後小鼠肝臟中的脂肪累積情形的照片圖，其中第7A、7B、7C、7D及7E圖係分別顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)小鼠肝臟之蘇木素-伊紅染色(H&E stain)結果；第8圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠血清之AST活性及ALT活性的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第9圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠肝臟中TNF-α濃度以及IL-1β濃度的影響，其中第9A圖係顯示 TNF-α濃度的長條圖，第9B圖係顯示IL-1β濃度的長條圖，且第9A及9B圖皆包括控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第10圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇後對於小鼠肝臟中促發炎基因(即，TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2及α-SMA)之表現的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第11圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇後小鼠肝臟的發炎情形，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)小鼠之肝臟門脈區發炎、肝小葉區發炎與門脈周邊壞死之HAI分數；第12圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠肝臟中酒精代謝相關酵素之基因(ADH、ALDH、CYP2E1、及CAT)的表現的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第13圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠 肝臟中CYP2E1蛋白質表現量的影響，其中第13A圖係顯示西方墨點法照片圖，第13B圖係顯示定量結果的長條圖，且第13A圖及第13B圖皆包括控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；第14圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠肝臟中ADH及ALDH活性的影響，其中第14A圖係顯示ADH活性的長條圖，第14B圖係顯示ALDH活性的長條圖，且第14A圖及第14B圖皆包括控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果；以及第15圖係顯示酒精攝取以及服用麥角固醇對於小鼠血清中的酒精濃度的影響，其中顯示控制組(以「control」表示)、酒精處理組(以「EtOH」表示)、麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)、麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)、及麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)的結果。

以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範 圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物用量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。

於本說明書中，除非特別說明，否則「麥角固醇」一詞係包括麥角固醇、麥角固醇之醫藥上可接受之酯、以及前述之組合。

根據世界衛生組織(WHO)的分類，過量酒精攝取係指男性每周攝取超過8單位酒精(每單位為8克)，女性每周超過6單位酒精；而若男性每周超過21單位酒精，女性每周超過14單位酒精則屬於危害性飲酒(hazardous drink)。於本發明中，所謂「慢性酒精攝取」係指於一段時間內(例如數週、數月、甚至數年)持續性的攝取酒精，且其中之酒精攝取量不少於過量酒精攝取但低於危害性飲酒者。

研究顯示，長期過量攝取酒精會造成體脂肪含量增加以及肝臟損傷，其中之肝臟損傷包括肝臟發炎、肝臟纖維化、肝硬化、甚至肝癌。亦經證實，若能促進肝臟代謝酒精能力、調節肝臟脂質恆定、提升肝臟抗氧化能力、減少肝臟氧化自由基產生、及/或提升肝臟抗發炎的效果，即可有效保護肝臟，有利於減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷。前述可參見例如：Some novel insights into the pathogenesis of alcoholic steatosis.Alcohol.34：45-48(2004)、Molecular mechanisms of alcoholic fatty liver.Alcohol Clin Exp Res.33：191-205(2009)、Alcohol and lipid metabolism.Am J Physiol Ehdocrinol Metab.295： 10-16(2008)、The role of lipid metabolism in the pathogenesis of alcoholic and nonalcoholic hepatic steatosis.Seminar in Liver Disease.30：378-390(2010)、Chronic ethanol and nicotine interaction on rat tissue antioxidant defense system.Alcohol.25：89-97(2001)、Tumor necrosis factor in alcohol enhanced endotoxin liver injury.Alcohol Clin Exp Res.16：665-669(1992)、Alcohol and oxidative liver injury.Hepatology.43：63-74、Alcohol：its metabolism and interaction with nutrients.Annu Rev Nutr.20：395-430(2000)、Peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα)agonist treatment reverses PPARα dysfunction and abnormalities in hepatic lipid metabolism in ethanol-fed mice.J Biol Chem.278：27997-28004(2003)、以及Protective effect of cyclooxygenase-2(COX-2)inhibitors but not non-selective cyclooxygenase(COX)-inhibitors on ethanol withdrawal-induced behavioural changes.Addic Biol.10：329-335(2005)，該等文獻之全文併於此處以供參考。

此外，若可減少體內脂質生成或增加體內脂肪酸的代謝，將有助於減少體內脂肪的累積，而可減緩及/或抑制各種脂肪代謝相關疾病(例如高血脂症、動脈硬化心臟血管疾病、心律不整、心臟衰竭、血管阻塞等)的發生。

本案發明人研究發現，麥角固醇對於因為酒精攝取所導致之肝臟損傷的個體，可提供調節肝臟脂質恆定、提升肝臟抗氧化能力、減少肝臟氧化自由基產生、提升肝臟抗發炎、改善肝臟受損情形的效果。

因此，本發明係關於使用麥角固醇於製造一藥劑之用途。其中，該藥劑係用於減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷，尤其是針對慢性酒精攝取所造成的肝臟損傷。該肝臟損傷的例子包括，但不限於肝炎(hepatitis)、肝臟纖維化(liver fibrosis)、肝硬化(liver cirrhosis)、及肝癌(hepatic carcinoma)。於本發明一具體實施態樣中，該藥劑係用於減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝炎。

本案發明人另發現，麥角固醇對於因為酒精攝取所導致之體脂肪累積的個體，可提供改善體脂肪累積的效果。因此，本發明亦關於使用麥角固醇於製造一藥劑的用途，該藥劑係用於減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積，尤其是針對慢性酒精攝取所造成的體脂肪累積。於本發明一具體實施態樣中，該藥劑係用於減緩及/或抑制酒精攝取所造成的肝臟脂肪累積(即，脂肪肝)。

已知麥角固醇可由中草藥(例如：牛樟芝(Antrodia camphorata))純化分離而來，或可透過化學合成方法獲得。舉例言之，可採用市售之牛樟芝粉末，以甲醇進行萃取，再以乙酸乙酯/正己烷(乙酸乙酯：正己烷=1：9)進行矽膠管柱層析分離，沖提出麥角固醇。

根據本發明所提供之藥劑係可視所欲之投藥形式而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥物可以口服或非經口服(例如皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、或鼻腔)之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該藥劑。

以適於口服投藥之劑型為例，本發明所提供之藥劑可含有任何不會不利影響麥角固醇之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：溶劑(水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、及前述之組合)、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑、固體載劑(例如澱粉、皂土(bentonite))等。可利用任何合宜之方法，以適於口服投藥的劑型提供該藥劑，例如：錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等。

至於適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之注射劑型或點滴劑型，則可於本發明所提供之藥劑中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至該有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中、或將其乳化，提供所欲之注射劑。此外，適於經鼻腔或經皮膚投予之外用劑型，則例如乳液、乳霜、凝膠(例如水凝膠)、膏狀物(例如分散膏、軟膏)、噴霧劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)。

視需要地，可於本發明所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受 之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對麥角固醇之所欲效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用本發明所提供之藥劑，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。舉例言之，當以口服方式施用至一個體以減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷(例如肝炎)時，或者當以口服方式施用至一個體以減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積(例如肝臟脂肪累積)時，以麥角固醇計，其用量為每天約1毫克/公斤體重至約100毫克/公斤體重，較佳為每天約5毫克/公斤體重至約70毫克/公斤體重，更佳為每天約10毫克/公斤體重至約40毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重個體所須之投藥量。惟，對於急性患者而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。

此外，可將本發明藥劑製成「持續釋放(extended-release)」(亦稱為緩釋(sustained-release；SR)、持續作用(sustained-action，SA)、定時釋放(time-release，TR)、受控釋放(controlled-release，CR)、改善釋放(modified release，MR)或連續釋放(continuous-release，CR))之劑型(例如錠劑或膠囊劑)，以隨時間緩慢溶解並釋放所含的活性成分(即，麥角固醇及/或其醫藥上可接受之酯)，以降低活性成分在血液中的峰 值量，於較少的使用頻率下仍使活性成分長時間在血液中保持穩定的水平。

此外，本發明另提供一種減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的肝臟損傷的方法，其係包含於有需要之個體中投予一有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。其中，該方法尤其是針對慢性酒精攝取所造成的肝臟損傷的減緩、抑制及/或治療。

本發明又提供一種減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積的方法，其係包含於有需要之個體中投予一有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。其中，該方法尤其是針對慢性酒精攝取所造成的體脂肪累積的減緩及/或抑制。

於上述該二方法中，麥角固醇之施用型態、適用劑量、施用對象、及施用方式等，均如上述關於本發明藥劑之說明。

經發現，麥角固醇亦可提升肝臟代謝酒精之能力，緩解或免除因為酒精攝取所造成的不利或不便。因此，本發明另關於使用麥角固醇及/或其醫藥上可接受之酯於製造一製劑之用途，該製劑係用於提升肝臟代謝酒精之能力。

根據本發明所提供之製劑可以為一供添加於食品的食品添加劑，或者為一食品，且可以呈任何合宜的形式(例如：固體或流體)，並無特殊的限制。舉例言之，若該製劑為食品添加物，其可呈例如粉末、液體、懸浮液、顆粒等不同型態，以方便於食品製造過程中添加；而當該製劑為食品時，則可以為例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、***錠、果汁類、 茶類、運動飲料、營養飲料等，且可以是日常食用之一般食品或者做為營養補充食品或術後營養補充品之保健食品，但不以此為限。該食品可於攝取含有酒精之物質之前、同時、或之後食用，以提升肝臟代謝酒精的能力，緩解或免除因為酒精攝取所造成的不利或不便。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用本發明所提供之保健食品，端視投予個體之年齡、體重、及健康況狀而異。亦可針對特定族群調整本發明所提供之保健食品中麥角固醇的含量，較佳為調整至每日應服用的量。舉例言之，若一個體之每日建議使用量為約10毫克，又該保健食品每份含5毫克之麥角固醇，則該個體每日可食用大約二份該保健食品。

可於本發明保健食品之外包裝標示建議使用量、特定族群(例如肝炎患者)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。

為緩解或免除因為酒精攝取所造成的不利或不便，本發明再提供一種提升肝臟代謝酒精能力的方法，其係包含於有需要之個體中投予一有效量之麥角固醇、其醫藥上可接受之酯、或前述之組合。於此方法中，麥角固醇之施用型態、適用劑量、施用對象、及施用方式等，均如上述關於本發明製劑之說明。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。

實施例

[製備實施例]

A. 麥角固醇之準備

於室溫下，以甲醇對1.6公斤之牛樟芝發酵凍乾粉末(購自葡萄王生技公司)進行萃取，共進行三次，然後合併三次萃取所得之甲醇萃取液。以Whatman濾紙過濾該甲醇萃取液後進行減壓濃縮，以獲得一粗萃物。其後，以乙酸乙酯及水(其中，乙酸乙酯與水之體積比為1：1)對該粗萃物進行液液分配，然後移除水相而留下乙酸乙酯相。接著，對所留下的乙酸乙酯相進行管柱層析(column chromatography)分離(固定相：SiO₂；沖提液：乙酸乙酯：正己烷=1：9)，並收集沖提液，得到白色結晶。接著以丙酮進行再結晶，得到5342.2毫克純度大於99%之麥角固醇。

B. 動物試驗之小鼠模型的準備

將40隻雄性C57BL/6小鼠(年齡為8週，且每隻約20至22克)飼養於溫度為22±2℃、濕度為60至80%、明暗週期為12小時的環境下一週後，隨機分為五組(每組8隻)，分別以如下條件繼續飼養，進行實驗：(1)控制組(以「control」表示)：餵飼正常流質飼糧(組成如表1所示)任食，且每日管灌0.1毫升生理食鹽水；(2)酒精處理組(以「EtOH」表示)：餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧(組成如表1所示)任食，且每日管灌0.1毫升生理食鹽水；(3)麥角固醇一倍組(以「EK100_1X」表示)：餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧任食，且每日管灌麥角固醇(劑量：1毫克/ 公斤體重，溶於0.1毫升二次水中)；(4)麥角固醇五倍組(以「EK100_5X」表示)：餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧任食，且每日管灌麥角固醇(劑量：5毫克/公斤體重，溶於0.1毫升二次水中)；(5)麥角固醇十倍組(以「EK100_10X」表示)：餵飼Lieber-DeCarli酒精流質飼糧任食，且每日管灌麥角固醇(劑量：10毫克/公斤體重，溶於0.1毫升二次水中)。

C. 小鼠模型的觀察、紀錄、及樣本採集

C-1. 每日記錄小鼠的採食量(各組隨機挑選4隻小鼠作紀錄，取平均值)，每週最後一天紀錄小鼠之體重變化(各組8隻小鼠之平均值)，持續四週。

C-2. 於實驗進行第三週終了，採集小鼠糞便(各組8隻小鼠皆進行採集)，使用烘箱烘乾保存，以供後續實驗分析。

C-3. 於實驗進行的第四週終了，使小鼠禁食八小時，再以毛細管採血針進行眼窩靜脈叢(orbital sinus)採血(各組各8隻小鼠皆進行採血)，收集小鼠血液，將血液靜置一小時後，使用冷凍微量離心機(日本久保田株式會社(Kubota corporation)，型號：3700)進行離心(4℃、5000rpm、10分鐘)分離出上層血清，保存於-80℃下，供後續實驗分析。

C-4. 於完成C-3後，將小鼠犧牲，測量並記錄小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟的重量以及腹部與副睪的脂肪墊(fat pad)重量；使用經過滅菌之生理食鹽水清洗小鼠肝臟並以相機記錄肝臟外觀；以及將採集臟器及糞便保存於-80℃下，供後續實驗分析(各組8隻小鼠皆進行記錄、樣本採集與保存)。

D. 樣本處理、分析

D-1. 小鼠肝臟或糞便脂質萃取液之製備

取C-3所提供之各組小鼠糞便樣本或C-4所提供之各組小鼠肝臟樣本，分別置於玻璃試管中並進行以下處理：加入萃取溶液(由體積比為2：1之甲烷及甲醇配置而成)，進行超音波震盪後，以濾紙進行過濾，將所得之淡黃色液體置於另一玻璃試管中，並重複前述萃取步驟直到所得液體呈現透明無色為止。接著，以氮氣對該透明無色之液體進行乾燥，所獲得之黃色物體即為脂質，於其中加入異丙醇後，進行超音波震盪，使脂質完全回溶，獲得脂質萃取液以供後續實驗分析。

D-2. 小鼠肝臟mRNA之萃取與分析

取0.1克[製備實施例]C-4所提供之各組小鼠肝臟樣本，分別放入0.8毫升之內含RNA穩定劑的RNAlater(美國Qiagen公司)中，再使用商業套組(E.Z.N.A^TM Tissue RNA kit，購自美國Omega Bio-Tek公司)萃取其中之mRNA。接著，對所得之mRNA樣本進行反轉錄作用，以提供cDNA後，並使用特定基因之引子(如下表2所示)進行即時聚合酶連鎖反應(real time polymerase chain reaction，real-time PCR)，以觀察各基因在小鼠肝臟中的表現，該即時聚合酶連鎖反應的操作步驟如下：(i)取2微升之cDNA(50毫微克/微升)、5微升之SYBR Green(美國Molecular Probes公司，Applied Biosystems/Fast SYBR® Green Master Mix)、2微升不含核糖核酸酶的水(RNase free water)、1微升之順向引子、與1微升之反向引子，混合均勻後離心；(ii)將前述樣本置入即時聚合酶連鎖反應儀中(Applied Biosystems/StepOne Real time PCR system，購自美國Foster city公司)中，偵測各基因之表現，並以 GAPDH表現量作為正向控制組。

D-3. 小鼠肝臟均質液之製備

取0.3克[製備實施例]C-4所提供之各組小鼠肝臟樣本，分別加入2.7毫升之磷酸緩衝鹽溶液(Phosphate buffered saline，PBS)，以均質機(瑞士Polytron，PT-2100)進行均質化後離心(4℃、3000rpm、15分鐘)，以濾紙(ADVANTEC，NO.1 55 mm)過濾上清液，所得濾液即為10%之肝臟均質液，以蛋白測定方法(Bio-rad protein assay)分析蛋白質濃度後，保存於-20℃下，供後續實驗分析。

D-4. 小鼠肝臟樣本之染色

取[製備實施例]C-4所提供之各組小鼠肝臟樣本，進行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin stain，H&E stain)，操作步驟如下：(i)從肝臟樣本取約1立方公分之組織塊，放入10%中性福馬林浸泡；(ii)依序以不同濃度(即，30%、50%、75%、80%、90%、95%及100%)之酒精進行脫水；(iii)以二甲苯(xylene)溶液處理進行透明化作用；(iv)以石蠟溶液進行包埋；(v)以切片機將蠟塊切成厚度約5微米的切片，再置入溫水(約40℃)中展片後烘乾，以提供肝臟組織切片；(vi)使用二甲苯溶液處理前述切片20分鐘，以脫去石蠟；(vii)依序以不同濃度(即，100%、95%、90%、80%、75%、50%、30%)之酒精浸泡切片15分鐘；(viii)將切片取出並浸泡在去離子水中10分鐘，使組織恢復為含水狀態；(ix)將完成復水之切片置於蘇木素(hematoxylin)染劑中30秒，再以去離子水清洗；(x)將切片浸泡於伊紅(eosin)染劑中2至5分鐘，再以去離子水清洗；(xi)將切片依續浸泡於不同濃度(即，30%、50%、75%、80%、90%、95%及100%)之酒精中，以進行脫水；(xii)以二甲苯溶液進行透明化作用後，以***膠封片，並置於顯微鏡下觀察。

實施例1：觀察小鼠生理參數變化

為了解酒精攝取以及服用麥角固醇對小鼠的生理影響，比較小鼠之採食量、體重變化、臟器重量、及脂肪重量。

1-1. 小鼠之體重變化

分別將[製備實施例]C-1之各組小鼠於每週所紀錄之體重平均，結果示於第1圖。由第1圖可知，於實驗進行的第一週，各組小鼠的體重並無明顯差異(p>0.05)，但於實驗進行的第二週及第四週，相較於「控制組」，「酒精處理組」、「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠的體重明顯較低(p<0.05)。

前述結果顯示，酒精攝取會造成體重降低，其原因可能是相較於其他來源的能量，來自酒精的能量不易儲存，故會優先進入代謝路徑，同時阻斷其他代謝路徑的進行，然而，酒精雖可提供高熱量(約7千卡/克)，但不具任何養分，故大量攝取酒精可能引起營養失調，造成體重下降。此外，已有研究顯示，酒精會造成粒線體功能被破壞，使ATP合成減少，導致體內能量不足，亦可能是酒精攝取造成體重降低的原因，此可參見例如：The inhibition of gluconeogenesis following alcohol in humans.Am J Physiol.275(5 Pt 1)：897-907(1998)、Acute effects of ethanol and acetate on glucose kinetics in normal subjects.Am J Physiol.254(2 Pt 1)：175-180(1998)、及Alcoholic liver disease：pathology,pathogenetic and clinical aspects.Alcohol Clin Exp Res.15(1)：45-66(1991)，該等文獻之全文併於此處以供參考)。

1-2. 小鼠之採食量、臟器重量與脂肪重量

將[製備實施例]C-1所紀錄之各組小鼠每日採食量平均值顯示於表3。此外，分別對[製備實施例]C-4各組所獲得之小鼠臟器重量與脂肪重量取平均值，再將各該平均重量(克)除以各 對應組之小鼠於第4週的平均體重，以獲得相對臟器重量(relative weight of organs)及相對脂肪重量(relative weight of fat)，結果亦示於表3。

註：各欄中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示，例如「控制組」之肝臟相對重量為3.38±0.04^b(克/100克小鼠體重)與「酒精處理組」之肝臟相對重量為4.55±0.04^a(克/100克小 鼠體重)，顯示該二組之肝臟相對重量具顯著差異(P value小於0.05)。

表3顯示，相較於「控制組」，「酒精處理組」、「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠的採食量均較低(p<0.05)。在相對臟器(例如肝臟、心臟、腎臟、及脾臟)重量方面，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠的肝臟、心臟、腎臟、及脾臟重量皆明顯提升(p<0.05)。

在相對脂肪重量方面，表3顯示，「控制組」與「酒精處理組」小鼠的腹部脂肪墊相對重量無明顯差異(p>0.05)；相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠的腹部及副睪脂肪墊相對重量皆明顯較低(p<0.05)。

上述結果顯示，「酒精處理組」小鼠之採食量雖低於「控制組」，但肝臟、心臟、腎臟、及脾臟的相對重量卻高於「控制組」，且於腹部累積了相同含量的脂肪，其原因可能是酒精攝取所造成的內臟脂肪累積，故內臟(例如肝臟、心臟、腎臟、及脾臟)的相對重量增加。上述結果亦顯示，麥角固醇可減緩或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積，具有調節體內脂質恆定的功效。

實施例2：分析小鼠體內之脂質恆定

為了解酒精攝取以及服用麥角固醇對小鼠體內脂質恆定(lipid homeostasis)的影響，比較小鼠血清、肝臟中三酸甘油酯(triacylglycerol，TAG)及總膽固醇(total cholesterol，TC)的含量、小鼠糞便中三酸甘油酯、總膽固醇及膽酸(bile acid)的 排出量、以及小鼠肝臟中脂質合成相關基因及促脂肪酸β氧化基因的表現，並觀察小鼠肝臟之外觀及染色結果。

2-1. 血清中三酸甘油酯與總膽固醇的含量

取[製備實施例]C-2所提供之各組小鼠血清，以商業套組(套組型號：TR210，購自英國Randox Laboratories公司)分析其中三酸甘油酯與總膽固醇的含量，結果示於第2A圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示，例如「a」與「b」係分別顯示於「控制組」與「酒精處理組」小鼠血清三酸甘油酯含量的結果中，顯示該二組血清中的三酸甘油酯含量具顯著差異(P value小於0.05)。由第2A圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠血清中的三酸甘油酯與總膽固醇含量皆明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠血清中的三酸甘油酯與總膽固醇含量皆明顯降低(p<0.05)，甚至與「控制組」相當。前述結果顯示，酒精攝取會造成血清中的脂肪(即，三酸甘油酯與總膽固醇)累積，而麥角固醇可有效減緩或抑制前述情形。此顯示，麥角固醇可有效減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積。

2-2. 肝臟中三酸甘油酯與總膽固醇的含量

取[製備實施例]D-1所提供之各組小鼠肝臟脂質萃取液，以商業套組(套組型號：TR210，購自英國Randox Laboratories公司)分析其中三酸甘油酯與總膽固醇的含量，結果示於第2B圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。由第2B圖可知，相較於「控制組」，「酒精處 理組」小鼠肝臟中的三酸甘油酯與總膽固醇含量皆明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中的三酸甘油酯與總膽固醇含量皆明顯降低(p<0.05)，甚至與「控制組」相當。前述結果顯示，酒精攝取會造成肝臟中的脂肪(即，三酸甘油酯與總膽固醇)累積，而麥角固醇可有效減緩或抑制前述情形。此顯示，麥角固醇可有效減緩及/或抑制酒精攝取所造成的肝臟脂肪累積。

2-3. 糞便中三酸甘油酯、總膽固醇及膽酸的含量

取[製備實施例]D-1所提供之各組小鼠糞便脂質萃取液，以商業套組(套組型號：TR210，購自英國Randox Laboratories公司)分析其中三酸甘油酯、總膽固醇及膽酸的含量，結果示於第2C圖及第3圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。由第2C圖及第3圖可知，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠糞便中三酸甘油酯、總膽固醇及膽酸的含量皆明顯提升(p<0.05)。前述結果顯示，麥角固醇可透過促進脂質及膽固醇的代謝及排出、減少脂質或膽固醇的吸收，而減緩或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積(例如肝臟脂肪累積)。

2-4. 肝臟中脂質合成相關基因的表現

已知LXR-α、SREBP-1c、ACC、FAS、及ME等基因係脂質合成相關基因，故以[製備實施例]D-2中的分析方法比較前述該等基因在各組小鼠肝臟中的表現，結果示於第4圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母 表示。由第4圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟中脂質合成相關基因的表現量皆明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中脂質合成相關基因的表現皆明顯降低(p<0.05)，甚至與「控制組」相當或低於「控制組」。前述結果顯示，酒精攝取會促進肝臟中脂質合成相關的基因表現，增加脂質合成，故造成肝臟脂肪累積，而麥角固醇可有效抑制該等基因的表現，減少脂質合成，故可有效減緩及/或抑制酒精攝取所造成的肝臟脂肪累積，有助於調節肝臟脂質恆定。

2-5. 肝臟中促脂肪酸β氧化基因的表現

已知脂肪酸β氧化與脂肪酸的代謝密切相關，且PPAR-α、RXR-α、CPT1、及UCP2等基因皆屬於促脂肪酸β氧化基因，故以[製備實施例]D-2中的分析方法比較前述該等基因在各組小鼠肝臟中的表現，結果示於第5圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。由第5圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟中促脂肪酸β氧化基因的表現量皆有降低的趨勢，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中促脂肪酸β氧化基因的表現則明顯提升(p<0.05)。前述結果顯示，酒精攝取會降低肝臟中促脂肪酸β氧化基因的表現，減少肝臟脂肪酸的代謝，故造成肝臟脂肪累積，而麥角固醇可有效提升促脂肪酸β氧化基因的表現，促進肝臟脂肪酸的代謝，故可有效減緩及/或抑制酒精攝取所造成的肝臟脂肪累積，有助於調節肝臟脂質恆定。

2-6. 觀察小鼠肝臟之外觀及染色結果

將[製備實施例]C-4所記錄之各組小鼠的肝臟外觀照片示於第6A至6E圖。由第6A至6E圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟的顏色較白，顯示「酒精處理組」小鼠已形成脂肪肝，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟顏色變白的現象則趨於減緩，此顯示麥角固醇可有效減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的脂肪肝。

另一方面，將[製備實施例]D-4所記錄之各組小鼠的肝臟染色照片示於第7A至7E圖，其中，「CV」係指「中央靜脈(central vein)」。由第7A至7E圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟組織中的脂肪空泡明顯較多，且該脂肪空泡係脂肪累積在肝細胞中的痕跡，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟組織中脂肪空泡則明顯減少。前述結果再次顯示，酒精攝取會促進肝臟脂肪累積，造成脂肪肝，而麥角固醇可有效減緩及/或抑制酒精攝取所造成的肝臟脂肪累積，故可減緩、抑制及/或治療造成酒精攝取所造成的脂肪肝。

實施例3：偵測小鼠臟器受損情形

已知丙胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase，AST)及天門冬胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase，ALT)均為胺基酸代謝酵素，廣泛地存在心臟、肝臟、骨骼肌、腎臟及腦中，當臟器中的細胞受到損傷，AST及ALT會釋放至血液中。因此，AST及ALT的活性可作為前述該等臟器的損傷指標，用以偵測內臟損 傷的情形，活性越高表示內臟受損越嚴重。其中，ALT在肝臟中含量較多，活性越高表示肝臟受損越嚴重。

為了解酒精攝取以及服用麥角固醇對小鼠臟器損傷情形的影響，分別取[製備實施例]C-2所提供之各組小鼠血清(每組取200微升)，與AST/ALT專業分析試紙(日本Arkray株式會社，Spotechem^TM Ⅱ)一同置入全自動乾式生化分析儀(日本Arkray株式會社，Spotechem^TM EZ,SP-4430)中，以偵測AST及ALT的活性，結果示於第8圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。

由第8圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠血清的AST及ALT活性皆明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠血清的AST活性以及「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠的ALT活性皆則明顯降低(p<0.05)，甚至與「控制組」相當。前述結果顯示，酒精攝取會造成內臟(尤其是肝臟)受損，而麥角固醇可有效改善酒精攝取所造成的內臟受損情形。

實施例4：評估小鼠肝臟氧化壓力及抗氧化能力

已知硫巴比妥酸反應物質(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)是脂質過氧化的指標，其氧化後會產生丙二醛(malondialdehyde，MDA)，TBARS值(即，丙二醛含量)越高表示脂質過氧化程度越高；TEAC值則代表總抗氧化能力(trolox equivalent antioxidant capacity)，TEAC值越高表示清除自由基之能力越強，抗氧化能力也越強；穀胱甘肽(glutathione， GSH)是抵禦自由基攻擊的第一道防線，若是GSH含量減少則會使氧化壓力升高；超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化酶(catalase，CAT)及穀胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)皆為相當重要的抗氧化酵素，超氧歧化酶(SOD)可將活性含氧物(Reactive oxygen species，ROS)轉變成反應性較低的H₂O₂，再由過氧化酶(CAT)及穀胱甘肽過氧化酶(GPx)轉變為氧氣及水。

為了解酒精攝取以及服用麥角固醇對小鼠肝臟脂質過氧化、氧化壓力、及抗氧化能力的影響，比較小鼠肝臟中的TBARS值、TEAC值、穀胱甘肽(GSH)含量、超氧歧化酶(SOD)活性、過氧化酶(CAT)活性、及穀胱甘肽過氧化酶(GPx)活性。

4-1. TBARS值

分別取1毫升之[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，加入8.5毫升之三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA，購自美國J.T.Barker公司)溶液，使多餘的蛋白質沉澱後，再加入1.5毫升之TBA(2-thiobarbituric acid，TBA，購自美國Sigma Co公司)並混和均勻，於95℃水浴槽中靜置30分鐘後離心(4℃、10000rpm、5分鐘)，取上清液並使用分光光度計分析其在535奈米波長下的吸光值，再以如下式1計算TBARS值(即，丙二醛含量)。結果示於表4。

表4顯示，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟之TBARS值明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟之TBARS值則明顯下降(p<0.05)，甚至與「控制組」相當。此顯示，酒精攝取會引起肝臟脂質過氧化的情形，而麥角固醇可有效改善此一情形。

4-2. TEAC值

取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，分析其中之TEAC值(檢測方法可參見例如A critical appraisal of the use of the antioxidant capacity(TEAC)assay in defining optimal antioxidant structures.Food Chemistry.80：409-414(2003)，該文獻全文併於此處以供參考)，結果示於表5。

表5顯示，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟之TEAC值明顯下降(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」 小鼠肝臟之TEAC值則明顯(p<0.05)提升，甚至與「控制組」相當。此顯示，酒精攝取會降低肝臟的抗氧化能力，而麥角固醇可有效改善此一情形。

4-3. 穀胱甘肽(GSH)含量

取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，分析其中之GSH含量(檢測方法可參見例如Du-Zhong(Eucommia ulmoides Oliv.)leaves inhibits CCl4-induced hepatic damage in rats.Food Chem Toxicol.44：1424-1431(2006)，該文獻全文併於此處以供參考)，結果示於表6。

表6顯示，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟之GSH含量明顯下降(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟之GSH含量則明顯(p<0.05)提升，甚至與「控制組」相當或遠高於「控制組」。此顯示，酒精攝取會使肝臟的氧化壓力升高，而麥角固醇可有效改善此一情形。

4-4. 小鼠肝臟之抗氧化酵素活性

取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，分析其中超氧歧化酶(SOD)、過氧化酶(CAT)及穀胱甘肽過 氧化酶(GPx)的活性(分析方法可參見例如：Regulation of the insulin antagonistic protein tyrosine phosphatase 1B by dietary Se studied in growing rats.J Nutr Biochem.20：235-247(2009)、Effects of Artemisia capillaris ethyl acetate fraction on oxidative stress and antioxidant enzyme in high-fat diet induced obese mice.Chem Biol Interact.179：88-93(2009)、以及Du-Zhong(Eucommia ulmoides Oliv.)leaves inhibits CCl4-induced hepatic damage in rats.Food Chem Toxicol.44：1424-1431(2006)，該等文獻之全文併於此處以供參考)，結果示表7。

表7顯示，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟之超氧歧化酶(SOD)活性係明顯提升(p<0.05)。在過氧化酶(CAT)活性方面，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟之過氧化酶(CAT)活性皆明顯提升(p<0.05)。在穀胱甘肽過氧化酶(GPx)活性方面，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟之穀胱甘肽過氧化酶(GPx)活性明顯提升(p<0.05)。前述結果顯示，麥角固醇可有效改善肝臟之抗氧化能 力。

實施例5：觀察小鼠肝臟的發炎情形

為了解酒精攝取攝取以及服用麥角固醇對小鼠肝臟發炎反應的影響，比較小鼠肝臟中促發炎細胞激素的含量與發炎相關基因的表現、以及小鼠肝臟之肝炎組織學活性指數。

5-1. 促發炎細胞激素的含量

取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，以Calibrator Diluent RD 5-17稀釋三倍後，使用Quantikine^® Rat TNF-α或Quantikine^® Rat IL-1β商業套組(購自美國R&D Systems公司)進行酵素連結免疫吸附分析(Enzyme-linked immune-sorption assay，ELISA)，檢測其中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及介白素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的含量，該酵素連結免疫吸附分析的操作步驟如下：(i)使對TNF-α(或IL-1β)具專一性之單株抗體固著於96孔盤的各孔中；(ii)於該96孔盤各孔中分別加入50微升之Assay Diluent RD1-41；(iii)於該96孔盤的不同孔中分別加入50微升之不同濃度(0、12.5、25、50、100、200、400、及800微微克/毫升)的標準品(standard)、或該經稀釋之肝臟均質液後，靜置於室溫下反應2小時；(iv)分別以400微升之清洗溶液(wash buffer)清洗各孔，並重複五次；(v)將各孔中的清洗溶液完全移除後，再於不同孔中分別加入100微升之Rat TNF-α Conjugate(或Rat IL-1β Conjugate)，並靜置於室溫下反應2小時；(vi)分別以400微升之清洗溶液(wash buffer)清洗各孔，並重複五次；(vii)於各孔中分別加入100微升之受質溶液(substrate solution)，並靜置於室溫下避光反應30分鐘；(viii) 於各孔中分別加入100微升之終止溶液(stop solution)，以終止反應；(ix)使用酵素連結免疫吸附分析測讀儀(ELISA hybrid reader，型號：Gen 5，購自英國BioTek公司)，偵測各孔樣本於波長450奈米(nm)下之吸光值，以換算成TNF-α(或IL-1β)的濃度。結果示於第9A及9B圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。

由第9A及9B圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟中的TNF-α及IL-1β濃度皆明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中的TNF-α及IL-1β濃度皆明顯降低(p<0.05)，甚至與「控制組」相當。前述結果顯示，酒精攝取會引起肝臟發炎，而麥角固醇可有效改善前述發炎情形。

5-2. 促發炎基因的表現

已知TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2及α-SMA等皆屬於促發炎基因，故以[製備實施例]D-2中的分析方法比較該等前述基因在各組小鼠肝臟中的表現，結果示於第10圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。由第10圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟中促發炎基因(即，TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2及α-SMA)的表現量皆明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中促發炎基因則明顯下降(p<0.05)，甚至與「控制組」相當或低於「控制組」。前述結果再次顯示，酒精攝取會引起肝臟發炎，而麥角固醇可有效減緩、抑制及/或治療 酒精攝取所引起的肝臟發炎。

5-3.肝炎組織學活性指數

為進一步觀察小鼠肝臟之發炎情形，使用國際通用的肝炎組織學活性指數(histology activity index，HAI score)將肝炎活性分為門脈區、肝小葉區與門脈周邊，並給予0至10分進行評分(如表8所示)，結果示於第11圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。前述評分方式可參見例如Liver biopsy interpretation in chronic hepatitis.J Insur Med.33：110-113(2001)，該文獻之全文併於此處以供參考。

由第11圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟的之門脈發炎、肝小葉發炎、及門脈周邊壞死分數明顯升高(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟的門脈發炎及門脈周邊壞死分數則明顯降低(p<0.05)。前述結果再次顯示，酒精攝取會引起肝臟發炎，而麥角固醇可有效減緩、抑制及/或治療酒精攝取所引起的肝臟發炎。

實施例6：分析小鼠肝臟之酒精代謝能力

已知酒精去氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、乙醛去氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)、過氧化酶(catalase，CAT)、及細胞色素(CYP2E1)為肝臟中代謝酒精的主要酵素，其中，細胞色素(Cytochrome P450 2E1，CYP2E1)在代謝過程中會產生大量的ROS，為酒精性肝臟疾病惡化的原因之一。為了解麥角固醇是否可提升肝臟之代謝酒精能力，係分析小鼠肝臟中過氧化酶(CAT)與細胞色素(CYP2E1)之基因表現與蛋白質表現量、酒精去氫酶(ADH)與乙醛去氫酶(ALDH)之基因表現與活性、以及血清中的酒精濃度。

6-1. 酒精代謝相關酵素之基因表現

以[製備實施例]D-2中的分析方法比較酒精代謝相關酵素基因(即，ADH、ALDH、CYP2E1、及CAT)在各組小鼠肝臟中的表現，結果示於第12圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。由第12圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟中CYP2E1的基因表現係明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角 固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中CYP2E1的基因表現則明顯下降(p<0.05)，甚至與「控制組」相當。另一方面，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中ADH、ALDH、及CAT的基因表現皆明顯提升(p<0.05)。前述結果顯示，酒精攝取會降低肝臟代謝酒精能力，而麥角固醇可有效提升肝臟代謝酒精能力。

6-2.酒精代謝相關酵素之蛋白質表現量

取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，以西方墨點法(western blot)比較酒精代謝相關酵素(例如CYP2E1)之蛋白質在各組小鼠肝臟中的表現量，操作步驟如下：(i)將肝臟均質液與4倍染劑混合；(ii)於95℃下加熱5分鐘後，注入下層膠(running gel)濃度為12%且上層膠(stacking gel)濃度為5%之聚丙烯醯胺膠體(sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel，SDS-PAGE)中；(iii)以70伏特進行電泳，待各泳道之樣品皆達到下層膠的頂端後，以100伏特繼續進行電泳；(iv)電泳結束後，使用半濕式轉印法(semi-dry)將SDS-PAGE上之蛋白質轉印至PVDF膜上(10伏特、10分鐘)；(v)轉印完成後，於該PVDF膜上加入2.5%胎牛血清(bovine serum albumin，BSA)，並於4℃下反應隔夜；(vi)於該PVDF膜上加入經適當比例稀釋之一級抗體，於4℃下反應隔夜；(vii)以清洗緩衝液(washing buffer)清洗該PVDF膜5分鐘，重複4次；(viii)於該PVDF膜上加入二級抗體，並於室溫下反應2小時；(ix)以清洗緩衝液清洗該PVDF膜5分鐘，重複4次；(x)利用ECL呈色法(enhanced chemiluminescence)偵測 CYP2E1蛋白質之表現量，拍照並進行定量。其中，拍照結果示於第13A圖，而定量結果示於第13B圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。

由第13A、13B圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白質表現量係明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白質表現量則明顯下降(p<0.05)。前述結果再次顯示，酒精攝取會降低肝臟代謝酒精能力，而麥角固醇可有效提升肝臟代謝酒精能力。

6-3. 酒精代謝相關酵素之活性

取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，分析其中ADH的活性，操作步驟如下：(i)將50微升之肝臟均質液、50微升之磷酸緩衝鹽溶液(Phosphate buffered saline，PBS)、及1毫升之0.1莫耳濃度甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液(glycine-NaOH buffer；pH 10.8、10毫莫耳濃度NAD⁺)混合均勻，於室溫下避光靜置4分鐘後，針測其在340奈米波長下之吸光值(A)；(ii)另取50微升之肝臟均質液、50微升之磷酸緩衝鹽溶液(PBS)、1毫升之0.1莫耳濃度甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液(glycine-NaOH buffer；pH 10.8、10毫莫耳濃度NAD⁺、0.016莫耳濃度之乙醇)混合均勻，於室溫下避光靜置4分鐘後，針測其在340奈米波長下之吸光值(B)；(iii)將吸光值(A)與吸光值(B)帶入式1，以計算ADH之活性(微莫耳/分鐘/毫克蛋白質，μmol/min/mg protein)。結果示於第14A圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於 0.05)，係以不同字母表示。

此外，取[製備實施例]D-3所提供之各組小鼠肝臟均質液，分析其中ALDH的活性，操作步驟如下：(i)將100微升之肝臟均質液與1毫升之焦磷酸鈉緩衝溶液(sodium pyrophosphate buffer；pH 8.8、1毫莫耳濃度NAD⁺、0.2毫莫耳濃度4-甲基吡唑(4-methylpyrazole)、1毫莫耳濃度氯化鎂、2微莫耳濃度魚藤酮、1%Ttriton X-100)混合均勻，於室溫下避光靜置20分鐘後，針測其在340奈米波長下之吸光值(A)；(ii)另取100微升之肝臟均質液與1毫升之焦磷酸鈉緩衝溶液(pH 8.8、1毫莫耳濃度NAD⁺、0.2毫莫耳濃度4-甲基吡唑(4-methylpyrazole)、1毫莫耳濃度氯化鎂、2微莫耳濃度魚藤酮、1%Ttriton X-100、5毫莫耳濃度乙醛)，於室溫下避光靜置20分鐘後，針測其在340奈米波長下之吸光值(B)；(iii)將吸光值(A)與吸光值(B)帶入式2，以計算ALDH之活性(微莫耳/分鐘/毫克蛋白質，μmol/min/mg protein)。結果示於第14B圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。

由第14A、14B圖可知，不論相較於「控制組」或「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠肝臟中ADH及ALDH的活性皆明顯提升(p<0.05)。前述結果再次顯示，麥角固醇可有效提升肝臟代謝酒精能力。

6-4. 血清中的酒精濃度

取[製備實施例]C-2所提供之各組小鼠血清樣本，與商業套組(英國Dade-Berhring公司，Emit ^® Ⅱ Plus Ethyl alcohol assay)中的ADH及NAD⁺的試劑混合均勻後，使用全自動生化分析儀(日本Olympus公司，AU2700)於340奈米波長下檢測前述血清樣本中的酒精濃度，結果示於第15圖，其中，不同組別間之數據若具顯著差異(P value小於0.05)，係以不同字母表示。

由第15圖可知，相較於「控制組」，「酒精處理組」小鼠血清中的酒精濃度明顯提升(p<0.05)，然而，相較於「酒精處理組」，「麥角固醇一倍組」、「麥角固醇五倍組」及「麥角固醇十倍組」小鼠血清中的酒精濃度則明顯下降(p<0.05)。前述結果再次顯示，酒精攝取會降低肝臟代謝酒精能力，而麥角固醇可有效提升肝臟代謝酒精能力。

由以上實驗結果可知，麥角固醇可有效提升肝臟代謝酒精能力。對於酒精攝取所導致之體脂肪累積或肝臟損傷之個體，麥角固醇可有效減緩及/或抑制體脂肪累積(例如肝臟脂肪累積)，或減緩、抑制及/或治療該肝臟損傷。

<110> 中國醫藥大學

<110> 國立台灣大學

<120> 麥角固醇之應用

<130> 無

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH引子-順向序列

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH引子-反向序列

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LXR-α引子-順向序列

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LXR-α引子-反向序列

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SREBP-1c引子-順向序列

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SREBP-1c引子-反向序列

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACC引子-順向序列

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACC引子-反向序列

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAS引子-順向序列

<400> 9

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAS引子-反向序列

<400> 10

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ME引子-順向序列

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ME引子-反向序列

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPAR-α引子-順向序列

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPAR-α引子-反向序列

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RXR-α引子-順向序列

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RXR-α引子-反向序列

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPT1引子-順向序列

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPT1引子-反向序列

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UCP2引子-順向序列

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UCP2引子-反向序列

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TLR4引子-順向序列

<400> 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TLR4引子-反向序列

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MyD88引子-順向序列

<400> 23

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MyD88引子-反向序列

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NF-κB引子-順向序列

<400> 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NF-κB引子-反向序列

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iNOS引子-順向序列

<400> 27

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iNOS引子-反向序列

<400> 28

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COX-2引子-順向序列

<400> 29

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COX-2引子-反向序列

<400> 30

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α-SMA引子-順向序列

<400> 31

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α-SMA引子-反向序列

<400> 32

<210> 33

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADH引子-順向序列

<400> 33

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADH引子-反向序列

<400> 34

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH引子-順向序列

<400> 35

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALDH引子-反向序列

<400> 36

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP2E1引子-順向序列

<400> 37

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP2E1引子-反向序列

<400> 38

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAT引子-順向序列

<400> 39

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAT引子-反向序列

<400> 40

Claims (10)

1. 一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該活性成分係麥角固醇(ergostatrien-3β-ol)，且該藥劑係用於提升肝臟代謝酒精能力，以減緩、抑制及/或治療酒精攝取所造成的脂肪肝及/或肝炎。
2. 一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該活性成分係麥角固醇(ergostatrien-3β-ol)，且該藥劑係用於提升肝臟代謝酒精能力，以減緩及/或抑制酒精攝取所造成的體脂肪累積。
3. 如請求項1或2之用途，其中該酒精攝取係慢性酒精攝取。
4. 如請求項1或2之用途，其中該藥劑之用量，以麥角固醇計，為每天約1毫克/公斤體重至100毫克/公斤體重。
5. 如請求項1或2之用途，其中該藥劑之用量，以麥角固醇計，為每天約10毫克/公斤體重。
6. 一種使用一活性成分於製造一製劑的用途，其中該活性成分係麥角固醇(ergostatrien-3β-ol)，且該製劑係一用以提升肝臟代謝酒精能力之食品或食品添加劑。
7. 如請求項6之用途，其中該製劑係一保健食品。
8. 如請求項6之用途，其中該製劑之用量，以麥角固醇計，為每天約1毫克/公斤體重至100毫克/公斤體重。
9. 如請求項6之用途，其中該製劑之用量，以麥角固醇計，為每天約10毫克/公斤體重。
10. 如請求項1、2、或6中任一項之用途，其中該麥角固醇係萃取 自牛樟芝(Antrodia camphorata)。