TWI595088B - 樟芝菌絲體培養基 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種樟芝菌絲體培養基，特別係關於一種提升樟芝胞外多醣含量及增進樟芝脂肪酶活性的樟芝菌絲體培養基。
樟芝，學名Antrodia cinnamomea，亦稱為牛樟菇、紅樟菰、樟內菇或紅樟，屬於台灣特有的真菌，僅生長於台灣特有野生牛樟樹(Cinnamomum kanehirae)內。
樟芝含有許多生理活性成分，如豐富的多醣體(polysaccharides)、三萜類(triterpenes)及固醇類(sterols)等，樟芝多醣體係可強化免疫細胞間的訊息傳遞、刺激體內巨噬細胞進行吞食作用、引起補體活化反應，並增強間白素(interleukin)與干擾素(IFN-γ)的產生，進而抑制腫瘤細胞的增值或將腫瘤細胞排除；三萜類可抑制癌症細胞增生，特別對肝癌細胞之效果最佳，三萜類亦可以降低GOT、GPT等肝功能指數，降低血管緊張素轉化酶(Angiotensin Converting Enzyme，簡稱ACE)活性，進而降低血壓，更能防止高血壓患者罹患中風之機率。
此外，由於樟芝內含豐富的脂肪酶，食用樟芝也可以降低血液中之膽固醇、血脂肪及三酸甘油脂含量，而自樟芝中生產之脂肪酶可耐熱至80℃，因而適合進行後續之修飾加工，以製成具有高附加價值之特用化學品。
然而，由於樟芝子實體只生長於野生牛樟樹之中空內
壁中，野生牛樟樹生長緩慢，又遭受嚴重的盜伐而瀕臨滅絕，導致樟芝的價格水長船高，因而目前大多改採對樟芝進行固液態人工醱酵培養，其中，固態人工醱酵培養之醱酵效果不佳，而液態人工醱酵培養則由於醱酵時間短且其醱酵條件僅能促進牛樟芝菌體進入一次代謝的生理狀態，以致胞外多醣、脂肪酶等營養成分含量較低，而使樟芝子實體或菌絲體的營養品質不佳。
據此，改善樟芝培養基質，提升人工培養樟芝之營養品質的確有其必要性。
本發明之主要目的係提供一種樟芝菌絲體培養基，其係能夠提升樟芝胞外多醣的含量。
本發明之次一目的係提供一種樟芝菌絲體培養基，其係能夠增進樟芝脂肪酶的活性。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種樟芝菌絲體培養基，係包含重量百分比為2.5-5%之香蕉果實，0-2.5%之碳源，1.1%之氮源，0.1%之磷源，0.025%之硫源，0.1%之鎂離子源，及一調配溶劑補充至100%；其中，該樟芝菌絲體培養基中所包含之香蕉果實係連皮進行熱風乾燥後再粉碎成粒徑5~7公厘而得。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該香蕉果實較佳為北蕉或南華蕉。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該香蕉果實較佳係為
經乙炔催熟之香蕉果實。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該碳源較佳為葡萄糖。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該氮源係可選自酵母萃取物、麥芽萃取物或蛋白腖。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該磷源較佳為磷酸二氫鉀，該鎂離子源較佳為硫酸鎂。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該調配溶劑較佳為水。
本發明之樟芝菌絲體培養基中，該培養基另包含重量百分比3至7%之瓊脂。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：請參照第1表所示，本發明較佳實施例之樟芝菌絲體培養基之配方，係包含重量百分比為2.5-5%之香蕉果實，0-2.5%之碳源，1.1%之氮源，0.1%之磷源，0.1%之鎂離子源，及一調配溶劑補充至100%。
本發明較佳實施例之香蕉果實較佳係選自北蕉或南華蕉。北蕉屬華蕉亞群(Cavendish subgroup)，為台灣最主要之內外銷品種，生長發育迅速，新植後約十二個月可採收；南華蕉，一般被稱為芭蕉，普遍種植於台灣埔里、集集地區，適應力強，極易栽培；本實施例所使用之香蕉
果實係選擇為台灣屏東內埔地區所產之北蕉或屏東縣九如鄉財團法人台灣香蕉研究所生產之南華蕉，但不以此為限。
本發明較佳實施例之香蕉果實較佳係經乙炔催熟之香蕉果實；本實施例係選擇但不限定以如下之方式進行催熟：將該香蕉果實(香蕉果皮呈青綠色)置於含濃度1000ppm之乙烯之19℃催熟庫中，進行一天之催熟，降溫至18℃保存一天後，再升溫至20℃以完成後熟，此時香蕉果皮色澤將由綠轉黃。
本發明較佳實施例之香蕉果實較佳係呈粒徑5至7公厘之粉粒，有助於樟芝進一步分解利用，並以該香蕉果實做為生長用的支持基質。本實施例係將香蕉果實連果皮放置於溫度65℃、溼度20%之環境下，進行熱風乾燥10小時，之後以高速粉碎機進行粉碎成適當大小後，並將其保存於溼度20%之室溫環境，以供後續實驗使用。
本實施例之碳源可以選擇為葡萄糖；該氮源可以為酵母萃取物、麥芽萃取物或蛋白腖，以提供該樟芝菌絲體在
生長過程中所需的營養；該磷源係選擇為磷酸二氫鉀(KH2PO4)，該鎂離子源係選擇為硫酸鎂(MgSO4)，該等無機鹽物質係提供樟芝菌絲體之生長過程所必須的磷、硫、鎂等鹽類，以構成細胞組織或酵素的組成、維持酵素的活性作用或調節新陳代謝，而該調配溶劑可以選擇為水，以溶解該碳源、氮源及無機鹽物質，並使該香蕉果實均勻分布於本發明樟芝菌絲體培養基中。
本發明樟芝菌絲體培養基較佳係形成一液態形式的樟芝菌絲體培養基，係有助於該樟芝菌絲體養分的獲取，其中，該香蕉果實係懸浮於該培養基中，使該樟芝菌絲體能夠藉由不同粒徑之香蕉果實，作為該樟芝菌絲體生長的支持基質，以提高該樟芝菌絲體的生長效能。
本發明樟芝菌絲體培養基可另包含重量百分比3至7%之瓊脂，形成一固態或半固態形式的樟芝菌絲體培養基，以作為固態醱酵時，該樟芝菌絲體生長的支持基質，以提高該樟芝菌絲體之生長效能，並提升該樟芝菌絲體之營養成分。
為證實本發明樟芝菌絲體培養基確實能夠用於培養樟芝菌絲體，並增加該樟芝菌絲體所產生之胞外多醣及提升該樟芝菌絲體所產生之脂肪酶活性，係如第2表所示，製備含有不同比例香蕉果實的樟芝菌絲體培養基，培養一樟芝菌株，並測量於培養過程中所產生之胞外多醣含量及脂肪酶的活性。
第2表：本試驗各組樟芝菌絲體培養基配方(單位：g/L)
本試驗係選擇但不限定以購自中華民國新竹食品工業發展研究所，編號BCRC 35396之樟芝菌株，作為生產胞外多醣及脂肪酶的菌株。
前述之樟芝菌株係選擇但不限定以麥芽抽出物培養基(Malt extract agar，簡稱MEA)，於27℃溫度下進行10天之平板培養，以獲得一樟芝菌絲塊，選取8mm大小之牛樟芝邊緣菌絲體菌落，置於滅菌後的水或礦物油中，於-20℃恆溫培養箱中進行保存，每1~3個月進行一次活化更新培養。
本試驗先取該保存的樟芝菌絲體，以無菌水震盪清洗三次後，接種於MEA平板培養基中，於27℃溫度下培養一週，使菌絲長滿培養基，再取培養基最外緣之菌絲持續接種於MEA平板培養基，於27℃進行繼代培養，每14天繼代培養一次，共進行三次，以獲得一活化的樟芝菌絲體，並可用於後續試驗。
請參照第3表所示，本試驗第A1至A4組中，該香蕉
果實係選自催熟或未催熟之北蕉或南華蕉果實，並將前述果實連皮進行熱風乾燥，再粉碎成粒徑5公厘之粉粒，再分別用以製備如第2表所示之第A1至A4組，舉例而言，第A1組又可分成第A1-1、A1-2、A1-3、A1-4組，其中所使用之香蕉果實分別為催熟之北蕉果實(第A1-1組)、未催熟之北蕉果實(第A1-2組)、催熟之南華蕉果實(第A1-3組)及未催熟之南華蕉果實(第A1-4組)，其他比例之組別亦以此類推，並以上述各組培養基，進行連續28天之醱酵培養，再分別量測：(A)胞外多醣含量，及(B)脂肪酶活性。
(A)胞外多醣含量
為證實本發明樟芝菌絲體培養基配方，能夠增加該樟芝菌絲體之胞外多醣含量，本試驗係以上述各組培養基，進行搖瓶培養(培養溫度27℃，搖床轉速120 rpm，於100 mL液態培養基中種入直徑約為0.5公分大小之樟芝菌絲體)，並分別於第7、14、21及28天取樣並過濾，將該培養液與菌絲分離(本試驗係以抽氣過濾法，濾紙為Whatman No.1)而得到一過濾液。
本試驗係取該過濾液，以醇析法分離胞外多醣，並以酚-硫酸法(phenol-sulfuric acid method)測定該胞外多醣的含量，該酚-硫酸法係測量醣類與強酸接觸時呈現之橘黃色(於490 nm處有最大吸光值)，再以比色法檢測該胞外多醣的濃度。
舉例而言，本試驗係取5 mL過濾液與20 mL 95%乙醇混合，於4℃下靜置萃取24小時，待該胞外多醣沉澱後，以12000 rpm離心6分鐘，去除上清液後得到一多醣沉澱物，再以75%乙醇震盪清洗該多醣沉澱物至少三次後，再將該多醣沉澱物至於60℃烘箱中去除多餘酒精，而得到多醣乾燥物。
將上述多醣乾燥物溶於5 mL去離子水中，以12000 rpm離心10分鐘，取1 mL上清液加入1 mL 5%苯酚溶液混合後，加入5 mL濃硫酸，均勻搖晃後靜置20分鐘，將試管置於水浴冷卻，10分鐘後，以分光光度計量測490 nm處的吸光值，並以標準曲線計算各組之胞外多醣含量。
請參照第4至7表所示，分別係以上述各組樟之菌絲體培養基培養樟芝菌絲體，於第7、14、21及28天時所測得之胞外多醣含量。
請參照第4表所示，第A0組係以葡萄糖作為碳源之組別，第A0組之胞外多醣含量並未高於1 g/L，於樟芝菌絲體培養基中添加催熟北蕉果實之第A1-1至A4-1組之胞外多醣含量，相較第A0組均有顯著差異，表示於樟芝菌絲體培養基中添加催熟北蕉果實的確有助於增加該樟芝菌絲體分泌胞外多醣之能力。
請參照第5表所示，於樟芝菌絲體培養基中添加未催熟北蕉果實之第A1-2至A4-2組之胞外多醣含量，自培養天數第7天起即遠高於第A0組，表示本發明含有未催熟北蕉果實之樟芝菌絲培養基的確可有效促進樟芝菌絲體生成胞外多醣。
請參照第6表所示，係以添加不同比例之催熟南華蕉果實的樟芝菌絲體培養基培養樟芝菌絲體，該樟芝菌絲體所分泌之胞外多醣含量，其中，第1-3至4-3組之胞外多醣含量均明顯高於未添加催熟南華蕉果實之第A0組，表示於樟芝菌絲體培養基中添加催熟南華蕉果實的確有助於增加該樟芝菌絲體分泌胞外多醣之能力。
請參照第7表所示，於樟芝菌絲體培養基中添加未催熟南華蕉果實之第A1-4至A4-4組之胞外多醣含量，自培養天數第7天起即遠高於第A0組，表示本發明含有未催熟南華蕉果實之樟芝菌絲培養基的確可有效促進樟芝菌絲體生成胞外多醣。
據此，本發明樟芝菌絲體培養基中，係以香蕉果實取代部分或全部碳源，的確可有效促進樟芝菌絲體生成胞外
多醣，且被香蕉果實取代之碳源含量越高，該樟芝菌絲體則可生成越多量之胞外多醣。
(B)脂肪酶活性
為證實本發明樟芝菌絲體培養基配方，也能夠提升該樟芝菌絲體產生之脂肪酶活性，係將分別培養7、14、21及28天之各組培養液過濾以獲得一過濾液。
將上述過濾液於4℃下進行水透析，由於脂肪酶可專一地分解基質硝基苯棕櫚酸酯(ρ-nitrophenyl palmitate，簡稱pNPP)，以生成棕櫚酸(palmitic acid)及硝基酚(ρ-nitrophenol，簡稱pNP)，而pNP於波長410 nm有最大吸光值，據此，即可以測量波長410 nm之吸光值以計算脂肪酶之活性。
以pNPP配置為一反應溶液(將pNPP溶於50 mM pH 8.0之Tris-HCl緩衝液，再混合含有10 mM氯化鈣的2-丙醇溶液，以獲得該反應溶液)，取0.2 mL過濾液與0.8 mL上述反應溶液，於45℃下反應5分鐘，再以分光光度計測量410 nm之吸光值，並依據其吸光值推得該過濾液中脂肪酶的活性。
請參照第8至11表所示，分別係以含有不同種類及不同濃度之香蕉果實的樟之菌絲體培養基培養樟芝菌絲體，於第7、14、21及28天時所測得之脂肪酶活性。
請參照第8表所示，第A0組係以葡萄糖作為碳源之組別，其脂肪酶活性雖會隨著培養時間上升，但是並不顯著；反之，於樟芝菌絲體培養基中添加催熟北蕉果實之第A1-1至A4-1組之脂肪酶活性，則相較第A0組均有顯著差異，且該脂肪酶活性隨著培養時間而有顯著地上升，表示於樟芝菌絲體培養基中添加催熟北蕉果實的確有助於提升該樟芝菌絲體所生成之脂肪酶活性的能力。
請參照第9表所示，於樟芝菌絲體培養基中添加未催熟北蕉果實之第A1-2至A4-2組之脂肪酶活性，自培養天數第7天起即遠高於第A0組，表示本發明含有未催熟北蕉果實之樟芝菌絲培養基的確可有效提升樟芝菌絲體生成之脂肪酶的活性。
第10表：以含不同濃度之催熟南華蕉果實的樟芝菌絲體培
請參照第10表所示，係以添加不同比例之催熟南華蕉果實的樟芝菌絲體培養基培養樟芝菌絲體，該樟芝菌絲體所分泌之脂肪酶活性，其中，第1-3至4-3組之胞外多醣含量均明顯高於未添加催熟南華蕉果實之第A0組，表示於樟芝菌絲體培養基中添加催熟南華蕉果實的確有助於提升該樟芝菌絲體分泌脂肪酶活性之能力。
請參照第11表所示，於樟芝菌絲體培養基中添加未催熟南華蕉果實之第A1-4至A4-4組之脂肪酶活性，自培養天數第7天起即遠高於第A0組，表示本發明含有未催熟南華蕉果實之樟芝菌絲培養基的確可有效促進樟芝菌絲體生成之脂肪酶活性。
據此，本發明樟芝菌絲體培養基中，係以香蕉果實取代部分或全部碳源，可有效提升樟芝菌絲體所生成脂肪酶的活性，且被香蕉果實取代之碳源含量越高，該樟芝菌絲體產生之脂肪酶活性則越高。
綜合上述，本發明樟芝菌絲體培養基係以香蕉果實中富含之醣類及澱粉作為碳源，能提高樟芝菌絲體之胞外多醣的產量，達到提升人工培養樟芝之營養價值的功效。
本發明樟芝菌絲體培養基係以香蕉果實提供樟芝菌絲體生長所需之碳源，並作為促進脂肪酶活性之有效成分，使樟芝菌絲體能於培養過程中快速生成高活性的脂肪酶，以達到提升樟芝於工業上之應用價值的功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (10)
- 一種樟芝菌絲體培養基，係包含重量百分比為2.5-5%之香蕉果實，0-2.5%之碳源，1.1%之氮源，0.1%之磷源，0.1%之鎂離子源，及一調配溶劑補充至100%；其中，該樟芝菌絲體培養基中所包含之香蕉果實係連皮進行熱風乾燥後再粉碎成粒徑5~7公厘而得。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述香蕉果實為北蕉。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述香蕉果實為南華蕉。
- 如申請專利範圍第1至3項任一項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述香蕉果實係為經乙炔催熟之香蕉果實。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述碳源為葡萄糖。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述氮源為酵母萃取物、麥芽萃取物或蛋白腖。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述磷源為磷酸二氫鉀。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述鎂離子源為硫酸鎂。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述調配溶劑為水。
- 如申請專利範圍第1項所述之樟芝菌絲體培養基，其中，上述培養基另包含重量百分比3至7%之瓊脂。
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