TWI591177B - 一種胰高血糖素胜肽－２（ｇｌｐ－２）類似物的製備方法 - Google Patents

一種胰高血糖素胜肽－２（ｇｌｐ－２）類似物的製備方法 Download PDF

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Description

一種胰高血糖素胜肽-2(GLP-2)類似物的製備方法
本發明係關於基因工程領域製備胜肽，特別是關於基因重組以製備胰高血糖素胜肽-2(Glucagon-like peptide-2,GLP-2)類似物的方法。
GLP-2是胰高血糖素原基因(proglucagon gene,PG)表達的產物之一，為胰高血糖素原被激素原轉化酶(prohormone convertase,PC)降解的產物之一，由33個胺基酸組成之胜肽，分子量為3900道爾頓，其胺基酸序列在哺乳動物具有高度保守性。GLP-2能促進腸黏膜生長，亦能加速腸黏膜損傷後的再生修復，具有腸道保護性藥物的研究與研發價值，且不影響其他組織器官的細胞增殖及組織型態變化。GLP-2在人體血液循環的生物半衰期約7分鐘，代謝主要是通過腎臟***及腸道刷狀緣上的雙基胜肽酶-4(dipeptidyl peptidase 4,DPP-4)水解GLP-2之胺基末端兩個殘基而形成無活性的GLP-2(3-33)。
Teduglutide(替度魯肽)為有DPP-4抗性的GLP-2胜肽類似物，僅有第二個丙胺酸被甘胺酸(A2G)取代，有效減少DPP-4降解，在人體血循環中的生物半衰期延長為約2小時。美國NPS藥廠(NPS Pharmaceuticals)開發該產品用在胃腸疾病適應症，並申請得到美國專利公告號第5,789,379號、第7,056,886號及第7,847,061號，於2012年分別在歐盟及美國上市，商 品名為Revestive及Gattex，主要適應症為短腸症後群(short bowel syndrome,SBS)。另外，替度魯肽對癌症化療所引起的腸黏膜和潰瘍性結腸修復也具有顯著的治療效果。
然而，替度魯肽價格偏高，一般病患並無法負擔。為此，原廠藥廠因而開發出不同生產的製程，以提高產量。例如美國專利公告號第7,781,567號、第7,829,307號及歐洲專利公告號第1,704,234號係利用基因重組技術以增加GLP-2胜肽類似物產量，強化產品競爭力。其中，美國專利公告號第7,781,567號已揭示clostripain(梭菌蛋白酶)切割能產生天然的GLP-2類似物胜肽。然而，該酵素卻因價格昂貴，並不符合成本效益，商業化困難。
臨床用的蛋白質藥或胜肽的基本要求之一，就是其胺基酸序列與組成必須與天然蛋白質完全相同，否則必須要證明多出來的胺基酸或核酸序列不完全係對人體無害的，不會發生免疫排斥等問題，因此非常費時費力。而若使用合成方法生產胜肽，則需有相當的設備及技術，因此價格昂貴。而若使用基因重組表達胜肽，則會有分子量較小，純化不易之問題。
因此，現今通常係以融合蛋白製造天然標的胜肽，以宿主細胞內表現的標的蛋白與搭檔蛋白融合，除了可增進標的蛋白的表現量，又具有使標的蛋白可受保護而不被降解、不會產生錯誤的折疊、易於純化與偵測及增加溶解度等優勢。然而，融合蛋白中的搭檔蛋白需要透過化學或酵素方法切除，產生自由態的標的胜肽，而傳統融合蛋白技術之一主要缺點就是經常發生不精確的切除搭檔蛋白，導致無法成功得到有活性或結構 完整的標的胜肽，進而產生前述會有多出來的胺基酸或核酸序列不全等缺點。此外，由於切割的酵素的種類有限，且酵素價格昂貴而水解效率偏低，因此也不利於放大融合蛋白技術製程。含小泛素(SUMO)之融合蛋白技術，係一種能增加融合蛋白溶解度之技術，且小泛素蛋白酶能辨認的胜肽序列為小泛素蛋白質的四級結構，其可精確的被小泛素蛋白酶做切除，產生天然的標的蛋白。然而，小泛素蛋白酶之酵素價格昂貴，不同基質間的水解效率差異甚大，因此仍限制製程的放大。
[非專利文獻]Petrassi et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15：3162-3166(2005)
本案發明者參考美國專利公告號第7,829,307號及歐洲專利公告號第1,704,234號揭示之製程發現，含七個串聯的GLP-2類似物胜肽聚合體，在使用酸處理該GLP-2類似物胜肽聚合體之時，雖然可產生有分子量大約4000道爾頓(4K)大小GLP-2類似物胜肽片段出現，但卻仍有較大分子量聚合體產生。而隨著酸處理時間增加，4K大小胜肽片段會減少，致使批次間變異大。另外，使用凝血酶(thrombin)酵素處理聚合體之時，該聚合體切割後雖有固定類型胜肽片段出現，但產生4K大小胜肽片段仍有限。此等結果顯示該等專利之製程仍有滯礙難行之虞，因此使用核酸序列重組製備GLP-2類似物胜肽之製程仍為待開發。
本發明者經參見專利文獻(Petrassi et al.2005)及美國專利公告號第7,629,437號揭露內容，發現新發展之含小泛素(SUMO)及連結子(Linker)的融合蛋白技術可彌補上述先前技術之缺點。因此，本發明提供一 種改良式的小泛素(SUMO)及連結子(linker)的融合蛋白系統，其可使任何標的基因有方向性的轉殖，進而快速純化天然標的蛋白或胜肽。
此外，通常在使用凝血酶(thrombin)切割時，標的胜肽的N端會殘留多餘的兩個胺基酸(Gly-Ser)，因此有無法產生與天然胜肽完全相同的胜肽之問題。本發明係利用聚合酶連鎖反應(PCR)及限制酶切割特定核酸序列製備表現載體，該表現載體之融合蛋白具有特異性高的連結子胜肽之核酸序列，使切割酵素能精確地辨識該連結子胜肽核酸序列為切點做切割，以獲得與天然蛋白或胜肽相同之蛋白或胜肽。
即，本發明之主要目的在於提供一個表現載體，其依序包含有：(a)一編碼標籤蛋白之核酸序列；(b)一編碼SEQ ID NO：1之Smt3蛋白之核酸序列；(c)一編碼SEQ ID NO：2連結子胜肽之核酸序列及一編碼標的蛋白之核酸序列；其中該表現載體可送入宿主細胞中表現出融合蛋白，該融合蛋白由N端到C端分別為標籤蛋白、Smt3、連結子胜肽及標的蛋白，其中經由凝血酶切割該連結子胜肽之C端，產生天然標的蛋白。
本發明之另一目的在於提供一種製備天然GLP-2類似物胜肽的方法，其步驟包含(i)製備上述之本發明之表現載體，其中該編碼標的蛋白之核酸序列為編碼GLP-2類似物胜肽之核酸序列；(ii)將構築好之該表現載體送入宿主細胞中表現融合蛋白，由N端到C端分別是標籤蛋白、Smt3蛋白、連結子胜肽及GLP-2類似物胜肽；及(iv)以切割融合蛋白用之蛋白酶切割此融合蛋白連結子C端，即產生天然的標的GLP-2類似物胜肽。
圖1為凝血酶切割三種胜肽PLTPRHGDGSF、 PVSGPRHGDGSF及ITDPLVPRHGDGS，以RP-HPLC C18管柱分析切割之產物分析結果圖譜(圖上方為原合成胜肽，圖下方為切割後的產物)。
圖2為本發明之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物表現載體之製備方法。
圖3為實施例2之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白經十二烷基硫酸鈉的聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳後之分析結果。
圖4為實施例3之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白、及以凝血酶切割後之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白之產物，經純化後由SDS-PAGE電泳後之分析結果。
圖5為實施例3之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白、實施例3之以凝血酶切割後之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白之產物、比較例之His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白、及比較例之以U1p1蛋白酶切割His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白之產物，四者經純化後由SDS-PAGE電泳後之分析結果。
圖6為實施例3之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白、實施例3之以凝血酶切割後之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白之產物、比較例之His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白、及比較例之以U1p1蛋白酶切割His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白之產物，四者經純化後使用RP-HPLC C18管柱分析之分析結果圖譜(圖上方為未經切割融合蛋白，圖下方為經切割融合蛋白之產物)。
圖7為實施例3之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白之產物GLP-2類似物，使用質譜儀分析結果圖譜。
本發明所提供之表現載體、製備天然標的蛋白之方法及製備天然GLP-2類似物胜肽的方法，如上發明內容所述。以下針對本案可實施之方式進一步說明。
本發明之「小泛素(SUMO；Small Ubiquitin-related Modifer)蛋白」係包含但不限於酵母菌中的Smt3蛋白，如SEQ ID NO：1所做出的蛋白；Smt3蛋白，也可以是前述之酵母菌Smt3蛋白有功能的變形體，其係與Smt3蛋白有高度核酸序列相似性的多胜肽(如核酸序列相似性至少有85%，90%，95%，98%，或99%的多胜肽)。當該酵母菌Smt3蛋白有功能的變形體接有標籤蛋白(如六個聚組胺酸標籤蛋白)，其做出的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，並與連結子胜肽及標的蛋白形成表現載體之時，該表現載體植入勝任細胞在宿主體內表現出融合蛋白後，會經凝血酶切割該融合蛋白連結子C端，以移除接有標籤蛋白酵母菌Smt3蛋白有功能的變形體及連結子胜肽之融合蛋白後，即能產生天然(native)標的胜肽。
本發明中之「標籤蛋白」係指一蛋白，其用於融合蛋白系統中。融合蛋白純化時，得選擇能與標籤蛋白之分子形成可逆結合的親和性管柱，使只有含標籤蛋白的融合蛋白吸附於親和性管柱上，並洗出其他不被吸附的蛋白質及雜質，隨後利用適當的緩衝液，將融合蛋白純化出來。本發明中的標籤蛋白係包含但不限於六聚組胺酸(His6)、麥芽糖結合蛋白(Maltose binding protein)、N-利用物質A(N-utilizing substance A)、硫氧化還原蛋白(Thioredoxin)、鈣調素結合蛋白(Calmodulin-binding protein)、麩胺基硫轉移酶(Glutathione S-transferase)或α因子(α-factor)，且以六聚組胺酸(His6) 為較佳。
本發明之「連結子」是一小段胜肽之核酸序列，透過化學或酵素方法可特異性地切割其在融合蛋白上之位點，當該位點越易受攻擊，表示切割效率越佳，切割後能產生較多量自由態的標的胜肽。本發明中的編碼SEQ ID NO：2為連結子胜肽之胺基酸序列。
本發明之「標的蛋白」係指製造出自由態或融合態的標的蛋白或胜肽。本發明中較佳之標的蛋白係天然的標的GLP-2類似物胜肽(SEQ ID NO：9)。此外，於本發明之實施例中，編碼SEQ ID NO：2連結子胜肽與編碼標的蛋白(SEQ ID NO：9)之核酸序列((SEQ ID NO：10)係製備為同一條核酸序列，且係透過聚合酶連鎖反應(PCR)製備而得。於一更佳實施例中，該PCR係使用如SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5分別作為前置及反置引子。
本發明中的切割融合蛋白用的蛋白酶較佳為「凝血酶」，其係是一種絲氨酸蛋白酶，可催化許多與凝血相關的反應。基因工程表現系統中融合蛋白，以凝血酶處理可將融合蛋白中搭檔蛋白(或本案中之連接子胜肽)與標的蛋白的肽段分離，其最適切割位點是：P4-P3-P2-Arg↓-P1'-P2'，式中P4和P3為疏水胺基酸，P1'和P2'為非酸胺基酸，↓為切割位點，即切割後標的蛋白N端有多餘兩個殘基出現，本發明透過特殊設計的連接子，可改善其切割後有多餘殘基的缺點。
本發明之「表現載體」為一含有高效能啟動子，以及在啟動子下游，有一個或多個選殖位置的質體。此質體被送入宿主細胞並在其內表現透過選殖位置所***質體中的標的蛋白核酸序列。將標的蛋白核酸序 列選殖入表現載體產生表現構築載體。
實施例
本發明以下敘述為此技術領域中通常知識者可輕易明瞭此發明之必要技術，且只要不違反其中的精神及範圍，就可以多樣的改變及修飾這個發明來適應不同的用途及狀況。如此，其他的實施例亦包含於申請專利範圍中。
測試例-凝血酶切割連結子胜肽之核酸序列
分別合成PLTPRHGDGSF(SEQ ID NO：6)、PVSGPRHGDGSF(SEQ ID NO：7)及ITDPLVPRHGDGS(SEQ ID NO：8)三種胜肽，雙底線之胺基酸序列為設計作為連結子胜肽之序列，後端之胜肽則為替度魯肽(Teduglutide)GLP-2胜肽類似物胺基酸序列(SEQ ID NO：9)的起始胺基酸。使用凝血酶切割該三種胜肽後，利用RP-HPLC C18管柱分析切割後的產物。三種胜肽經凝血酶切割前後之管柱分析結果如圖1所示(圖譜上方為未經凝血酶切割之原胜肽，圖譜下方為凝血酶切割後之產物，標箭頭處為HGDGSF或HGDGS胜肽片段)，圖1明顯可見PLTPRHGDGSF之切割最完全，代表凝血酶切割時，選用LTPR序列作為連結子胜肽之切割效率最佳。
實施例1. His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物表現載體
請參考圖2。
(a)使用聚合酶連鎖反應(PCR)製備含有六聚組胺酸(His6)標籤蛋白之核酸序列及釀酒酵母的Smt3蛋白之核酸序列，藉純化複製的去 氧核醣核酸用之NdeI及BamHI限制酶酵素處理，轉殖到pET30表現載體(Novagen,USA)，形成一His6-Smt3表現載體，如圖2之(a)所示。
(b)使用聚合酶連鎖反應(PCR)來製備含LTPR連結子胜肽(LTPR)之核酸序列及GLP-2類似物核酸序列，其中模板序列如SEQ ID NO：10，且引子使用SEQ ID NO：4及5，如圖2之(b)所示。
(c)將(a)所述的His6-Smt3表現載體及(b)所述的含LTPR之核酸序列及GLP-2類似物之核酸序列，分別以BamHI及EcoRI限制酶酵素處理，使含LTPR之核酸序列及GLP-2類似物之核酸序列轉殖到His6-Smt3表現載體，形成一His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物表現載體，如圖2之(c)所示。
實施例2. His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白
將實施例1之His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物表現載體經DNA定序確認為核酸序列正確的His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物表現載體，轉染到BL21(DE3)-勝任細胞(大腸桿菌)中，在含有50毫克/升卡那黴素之LB(Luria-Bertani)洋菜培養基中篩選含GLP-2類似物轉型株，命名為ST16於LB培養液培養後，添加10%油分裝保存於-70℃冰箱。取一管ST16轉型株，37℃隔夜培養；隔天取少量加入100毫升新鮮的LB培養液，37℃培養，待其吸光值OD600達到約0.7-0.8時，加入異丙基-β-D乳糖苷(IPTG)(1mM)至作為勝任細胞之大腸桿菌培養液中誘導His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物表現載體表現，以產生His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白。
．His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白之定性
將被誘導產生His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白的大腸桿菌在37℃下培養0到6小時，並經離心收集不同階段菌體。大腸桿菌細 胞團塊經收集後，以B-PER細菌蛋白提取試劑(Thermo Scientific,USA)將細胞溶解，離心後，分為可溶性部分(以S表示該部分)主要包括可溶性His-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白分為可溶性及不溶性部分，不溶性部分(以P表示該部分)主要包括菌體碎片，His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白聚集形成不溶性的包涵體(Inclusion body,IB)；利用十二烷基硫酸鈉的聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析，考馬斯亮藍(Coomassie-blue)染色偵測，如圖3所示，有多個條帶被偵測到，位於可溶性部分之His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白為主要條帶。
．His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白之純化
利用鎳離子Ni2+親和性層析管柱純化His6-Smt3-LTPR GLP-2類似物融合蛋白。使用液相色譜儀AKTA purifier 100(GE Healthcare,Sweden)機台搭配6ml Profinity IMAC樹脂管柱(Bio-Rad,USA)；配製吸附蛋白及清洗雜蛋白用緩衝液：20mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)，300mM NaCl(pH8.0)；另，配製沖離標的融合蛋白用緩衝液：20mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑(pH 8.0)，以梯度沖離將附於其上的His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物之融合蛋白洗出，得到純化之His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白。
實施例3. 凝血酶切割His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白，製造GLP-2類似物胜肽
(a)將實施例2中，由大腸桿菌中粗略萃取出的His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白加到一含有鎳離子Ni2+樹脂的管柱中，以實施例2中的清洗緩衝液清洗。首先，不洗出結合在Ni2+樹脂的 His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白，當為16-30%梯度沖離時，His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白就可由Ni2+樹脂中洗出，經SDS-PAGE電泳分析後以考馬斯亮藍(Coomassie-blue)染色偵測，可發現His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白有相當純度，主要為含有單一的條帶(如圖4所示)；最後的產率約為每100毫升的細胞培養液中有9毫克的融合蛋白。
(b)另外，將鎳離子Ni2+親和性層析管柱純化的His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白，以凝血酶切割，使用SDS-PAGE電泳分析及考馬斯亮藍(Coomassie-blue)染色偵測，主要偵測到兩個條帶，分別為分子量較大的His6-Smt3-Linker及分子量較小的GLP-2類似物(如圖4所示)，意味著凝血酶在His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白上只有一個切位。
．GLP-2類似物胜肽與替度魯肽之比對
實施例3純化的GLP-2類似物胜肽，其N端以Edman切割法切割來確認凝血酶的切位是否準確。結果顯示GLP-2類似物胜肽的N端序列和其基因對應出來的完全一樣。而以質譜儀檢測純化出的GLP-2類似物胜肽的分子量約3,752.12Da(如圖7所示)，與替度魯肽3,752.08Da非常的相近。
比較例. U1p1蛋白酶切割His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白，製造GLP-類似物胜肽
(a)比較例中，使用U1p1蛋白酶作為切割蛋白酶，U1p1蛋白酶為一種SUMO蛋白酶(SUMO protease)，而被切割的融合蛋白為 His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白，其並不具有連結子胜肽之核酸序列。
(b)使用鎳離子Ni2+親和性層析管柱純化以U1p1蛋白酶做切割之六聚組胺酸His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白之產物，並以SDS-PAGE電泳分析及考馬斯亮藍(Coomassie-blue)染色偵測。主要有三個條帶被偵測到(如圖5所示之樣本T3)，分別為分子量較大的His6-Smt3-GLP-2，其次為分子量次大的His6-Smt3及分子量較小的GLP-2類似物。此結果顯示，U1p1蛋白酶在六聚組胺酸His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白上只有一個切位，但其切割效率遠低於以凝血酶切割之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白，而使用R-HPLC做質譜分析顯示出一致結果，如圖7所示。
一併參照圖6，圖6(a)上圖為實施例3之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白、圖6(a)下圖為實施例3之以凝血酶切割後之His6-Smt3-Linker-GLP-2類似物融合蛋白之產物、圖6(b)上圖為比較例之His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白、及圖6(b)下圖為比較例之以U1p1蛋白酶切割His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白之產物，四者經純化後使用RP-HPLC C18管柱分析之分析結果圖譜(圖上方為未經切割融合蛋白，圖下方為經切割融合蛋白之產物)，由實施例3及比較例結果顯示：實施例3中，本發明之表現載體所表現之融合蛋白His6-Smt3-LTPR-GLP-2類似物融合蛋白，由於具有特異性高之連結子胜肽(即LTPR連結子胜肽)，經凝血酶切割所產生的切割產物完整，不會產生切割不完全的片段，因此切割效率佳，使GLP-2產率佳。然而，比較例中，由於His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋白不含有連結子胜肽，因此使用U1p1蛋白酶切割所產生的切割產物，會產生切割不完全的情形，產物中會有未切割的His6-Smt3-GLP-2類似物融合蛋 白，即切割效率不佳，所得到的GLP-2產率也低。
亦即，本發明之表現載體，因為具有特異性連結子胜肽之核酸序列，可有較佳的標的蛋白或胜肽產率；相較於先前技術之含小泛素(SUMO)及連結子(Linker)的融合蛋白及使用其製備天然標的蛋白之製備方法，相較於先前技術中通常之基因重組製備標的蛋白之方法，具有較佳的產率，適於作為生產天然蛋白或胜肽之製程，以大量製造天然蛋白或胜肽。
<110> 中化合成生技股份有限公司
<120> 一種胰高血糖素胜肽-2(GLP-2)類似物的製備方法
<130> P161223TW
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> Smt3胺基酸序列
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(98)
<400> 1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> 未知
<222> (1)..(4)
<400> 2
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 標籤蛋白與Smt3融合
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(111)
<400> 3
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> Ted-前置引子
<220>
<221> 引子_連接
<222> (1)..(36)
<400> 4
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> Ted-反置引子
<220>
<221> 引子_連接
<222> (1)..(29)
<400> 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 測試胜肽1
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(11)
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> DRT
<213> 未知
<220>
<223> 測試胜肽2
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(12)
<400> 7
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 測試胜肽3
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(13)
<400> 8
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 替度魯肽
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(33)
<400> 9
<210> 10
<211> 99
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 替度魯肽
<220>
<221> 未知特徵
<222> (1)..(99)
<400> 10

Claims (8)

  1. 一種表現載體，其依序包含：(a)一編碼標籤蛋白之核酸序列；(b)一編碼SEQ ID NO：1之Smt3蛋白之核酸序列；(c)一編碼SEQ ID NO：2連結子胜肽之核酸序列及一編碼標的蛋白之核酸序列；其中該編碼標的蛋白之核酸序列係天然GLP-2類似物胜肽(SEQ ID NO：9)之核酸序列(SEQ ID NO：10)。
  2. 如請求項1之表現載體，其中該標籤蛋白可選自六聚組胺酸(His6)、麥芽糖結合蛋白(Maltose binding protein)、N-利用物質A(N-utilizing substance A)、硫氧化還原蛋白(Thioredoxin)、鈣調素結合蛋白(Calmodulin-binding protein)、麩胺基硫轉移酶(Glutathione S-transferase)或α因子(α-factor)。
  3. 如請求項2之表現載體，其中該標籤蛋白為六聚組胺酸(His6)。
  4. 如請求項1至3任一項之表現載體，其中該表現載體可送入宿主細胞中表現出融合蛋白，該融合蛋白由N端到C端分別為標籤蛋白、Smt3、連結子胜肽及標的蛋白，其中經由凝血酶切割該連結子胜肽之C端，產生天然標的蛋白。
  5. 如請求項4之表現載體，其中該編碼SEQ ID NO：2連結子胜肽之核酸序列及該編碼標的蛋白之核酸序列係以聚合酶連鎖反應(PCR)製備。
  6. 一種製備天然GLP-2類似物胜肽的方法，其步驟包含(i)製備如請求項1至6任一項之表現載體，其中該編碼標的蛋白之核酸序列為編碼GLP-2類似物胜肽之核酸序列(SEQ ID NO：10)； (ii)將構築好之該表現載體送入宿主細胞中表現融合蛋白，由N端到C端分別是標籤蛋白、Smt3蛋白、連結子胜肽及GLP-2類似物胜肽；及(iii)以切割融合蛋白用之蛋白酶切割此融合蛋白連結子C端，即產生天然的標的GLP-2類似物胜肽；其中該切割融合蛋白用之蛋白酶為凝血酶。
  7. 如請求項6所述之製備天然GLP-2類似物胜肽的方法，其中該編碼SEQ ID NO：2連結子胜肽之核酸序列及該編碼SEQ ID NO：10之GLP-2類似物胜肽之核酸序列係以聚合酶連鎖反應(PCR)製備。
  8. 如請求項6所述之製備天然GLP-2類似物胜肽的方法，其中該PCR係使用如SEQ ID NO：4、5所示之引子進行。
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