TWI580779B

TWI580779B - 一種牛樟菌固態培養基及牛樟菌之培養方法

Info

Publication number: TWI580779B
Application number: TW101143497A
Authority: TW
Inventors: 王伯綸; 謝榮基; 賴鼎元; 鄭瑞隆
Original assignee: 領先奈米製藥生技股份有限公司
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2017-05-01
Also published as: TW201420756A

Description

一種牛樟菌固態培養基及牛樟菌之培養方法

本發明係關於一種牛樟菌固態培養基及牛樟菌之培養方法，特別是一種用於提高牛樟菌生產三萜類含量之固態培養基及以該固態培養基培養牛樟菌之方法。

牛樟芝為台灣特有的珍貴藥材，其生長於台灣保育類之牛樟樹上，由於牛樟芝量少且不易取得，故無法直接採集以獲得其所含的生理活性成分，如具有防癌、保肝、降血壓等效果的三萜類化合物，或者具有提升免疫力之多醣體等成分。

由於牛樟芝取得不易，故許多業者已改由以牛樟菌進行人工栽培，並將人工栽培而獲得的牛樟菌菌絲體或牛樟芝進一步萃取其生理活性成分。目前，習用牛樟菌人工栽培方法，包括(1)椴木栽培法、(2)固體栽培法及(3)液體醱酵法：椴木栽培法係利用枯死的牛樟樹椴木，將牛樟芝菌體植入椴木中，使牛樟芝菌體在椴木中生長，藉此採取子實體。然而，習用椴木栽培法須經過較長的培養時間，且培養過程必須維持適當的環境溫度，故習用椴木栽培法的栽培成本高且栽培時間長，具有不利量產且成本較高的問題。

固體栽培法係以含有營養物質的太空包，將牛樟芝菌體植入太空包的基質(通常為木屑、腐植質等有機成分所組成)中，使牛樟芝菌體在基質上生長，並獲得與野生牛樟芝相似的牛樟芝子實體。然而，習用固體栽培法的醱酵效果不佳，導致該牛樟芝子實體的三萜類化合物含量偏低，且以習用固體栽培法所得牛樟芝子實體的主要生理活性成份與野生牛樟芝並不相同。

液體醱酵法則係將牛樟芝菌體以液態培養基進行醱酵，雖然習用液體醱酵法可在短時間內獲得牛樟芝液體發酵產品，然而，由於液態醱酵法的醱酵時間短且其醱酵條件僅能促進牛樟芝菌體進入一次代謝的生理狀態，故經習用液態醱酵法所獲得的醱酵液中，其主要生理活性成分通常為多醣體，該醱酵液中幾乎不會產生二次代謝產物的三萜類化合物，故習用液態醱酵法仍無法獲得較高含量的三萜類化合物。

由此可知，該等習用栽培法皆無法獲得較高含量的三萜類化合物，且該等習用栽培法還具有時間、人力及培養基成本高的問題，實需加以改善。

本發明之主要目的係提供一種牛樟菌固態培養基，係以成本較低且容易獲得的穀類作為培養基質者。

本發明之次一目的係提供一種牛樟菌之培養方法，係能夠提高牛樟菌所含之三萜類化合物含量。

本發明之又一目的係提供一種牛樟菌之培養方法，係能夠縮短培養牛樟菌菌絲之培養時間。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種牛樟菌固態培養基，係由顆粒狀大豆、顆粒狀薏仁及顆粒狀高粱所組成，其中，以重量百分比計，大豆佔20~50%，薏仁佔30~50%，及高粱佔20~50%。

本發明牛樟菌固態培養基中，大豆較佳係佔50%，薏仁較佳係佔30%，及高粱較佳係佔20%。

本發明牛樟菌固態培養基中，大豆、薏仁及高粱係以水浸泡過的大豆、薏仁及高粱。

一種牛樟菌之培養方法，包含有：提供一固態基質，該固態基質係由顆粒狀大豆、顆粒狀薏仁及顆粒狀高粱所組成；提供一牛樟菌菌液，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質，使每100公克之固態基質含有1×10³~1×10⁶cfu之牛樟菌菌數，進行靜置培養，待牛樟菌長出菌絲並附著於該固態基質上；及經靜置培養後，再進行間歇搖晃培養，係於該間歇搖晃培養中每間隔5至7天即搖晃該固態基質5至10分鐘，該間歇搖晃培養40天以上；其中，於提供該固態基質時，以重量百分比計，大豆佔該固態基質之20~50%，薏仁佔該固態基質之30~50%，及高粱佔該固態基質之20~50%。

本發明牛樟菌之培養方法中，於提供該固態基質時，以重量百分比計，大豆較佳係佔該固態基質之20~50%，薏仁佔該固態基質之30~50%，及高粱佔該固態基質之20~50%；更佳係大豆佔該固態基質之50%，薏仁佔該固態基質之30%，及高粱佔該固態基質之20%。

本發明牛樟菌之培養方法中，於提供該固態基質時，該固態基質之大豆、薏仁及高粱較佳係分別以水浸泡 20~80分鐘，再混合成該固態基質。

本發明牛樟菌之培養方法中，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質表面時，該牛樟菌菌液之菌數較佳為1×10⁵~1×10⁶cfu/ml。

本發明牛樟菌之培養方法中，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質表面後，較佳係先進行靜置培養4至5天，使該牛樟菌附著於該固態基質上生長。

本發明牛樟菌之培養方法中，該間歇搖晃培養之培養時間較佳為40至90天。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，作詳細說明如下：本發明牛樟菌之培養方法，包含有下列步驟：提供一固態基質，該固態基質係由大豆、薏仁及高粱所組成。更詳言之，本發明較佳實施例中，以重量百分比計，大豆佔該固態基質之20~50%，薏仁佔30~50%，及高粱佔20~50%。此外，本發明較佳實施例係以顆粒狀的大豆、薏仁及高粱作為支持牛樟菌菌絲生長的固態基質時，藉由該大豆、薏仁及高粱等顆粒之間存在有縫隙，使空氣與水氣容易滲入其中，有助於牛樟菌菌絲的生長。本實施例較佳係另進行一浸泡步驟，將大豆、薏仁及高粱分別以水浸泡20~80分鐘，特別係浸泡30分鐘，使大豆、薏仁及高粱的外表皮變軟，使牛樟菌菌絲更能夠容易穿過大豆、薏仁及高粱等外表皮而伸入其中；此外，為避免其他微生物的競爭，較佳係將該固態基質及盛裝該固態基質之培養容器進行滅菌後，再進行後續步驟。

於提供該固態基質後，再提供一牛樟菌菌液，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質，使每100公克之固態基質含有1×10³~1×10⁶cfu之牛樟菌菌數，進行靜置培養，待牛樟菌長出菌絲並附著於該固態基質上。舉例而言，本發明牛樟菌之培養方法之牛樟菌菌株可以選擇為購自中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心的牛樟菌菌株，如該牛樟菌菌株編號為BCRC 35396T、BCRC 35398、BCRC 35716、BCRC 36401、BCRC 36711、BCRC 36795、BCRC 37848、BCRC 37849或BCRC 37850等，但本發明牛樟菌之培養方法所選用之牛樟菌菌種並不以此為限；選定一牛樟菌菌株後，較佳係以馬鈴薯葡萄糖培養液(Potato dextrose broth，簡稱PDB培養基)培養該牛樟菌菌株，並培養該牛樟菌至該菌液中的菌數達到1×10⁵~1×10⁶cfu/ml，以確保該牛樟菌菌液中的牛樟菌係屬於較活躍的生理狀態。更詳言之，為使該牛樟菌能夠自整體固態基質中獲得足夠的生長空間及養分，較佳係於接種時，使每100公克之固態基質中含有1×10³~1×10⁴cfu/ml之牛樟菌菌數；此外，本實施例之接種方式可以選擇為直接添加後，再將該固態基質均勻搖晃使牛樟芝菌液沾附到固態基質表面，或者係以噴灑方式均勻地灑在該固態基質表面。本實施例之靜置培養時間較佳為4至5天，以確保該牛樟菌確實產生菌絲。

經靜置培養後，再進行間歇搖晃培養，係於該間歇搖晃培養中每間隔5至7天即搖晃該固態基質5至10分鐘，該間歇搖晃培養40天以上。更詳言之，由於牛樟菌在經過靜置培養後，該牛樟菌會在該固態基質表面之原接種處長出牛樟芝菌絲，本發明較佳實施例係藉由搖晃方式使該固態基質產生滾動，而使該固態基質表面的牛樟菌菌絲分散至其他固態基質表面，使牛樟菌菌絲分布均勻，可確保該牛樟菌菌絲能夠自整體固態基質中獲得足夠營養；此外，本實施例係將該牛樟菌培養至少40天以上，係為確保該牛樟菌菌絲進入二次代謝狀態，如此可提高該牛樟芝菌絲中的三萜類化合物含量；本實施例較佳係將牛樟菌培養至40~90天，即可獲得較高含量的三萜類化合物。本發明較佳實施例可以選擇藉由手動搖晃的方式將該固態基質進行搖晃，如此，使該牛樟芝菌絲可以均勻地分布於該固態基質之表面。

為證實本發明確實能夠有效提高該牛樟菌的生理活性成分含量，本實施例係選擇以菌株編號為BCRC 35398之牛樟菌菌株進行培養，其中，將該牛樟菌菌株以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato dextrose agar，簡稱PDA培養基)培養於溫度為26±2℃條件下，待該牛樟菌菌絲完全佈滿該PDA培養基(約略為2~3天後)，獲得一牛樟菌菌絲塊，取0.5~1.0克之牛樟芝菌絲塊，並置於30毫升的PDB培養基中，靜置培養2天，即可獲得一備用的牛樟菌菌液，其菌數約為2×10⁵cfu/ml。

本實施例之固態基質中，將大豆、薏仁及高粱以如第1表所示之三種重量比例進行混合，使各組別的固態基質重量為600公克，較佳係將各組別固態基質置於一容積為1公升之三角錐瓶中，並以軟木塞或透氣性棉塞封口後，進行滅菌作業，再分別對各組別進行牛樟菌之接種。

本實施例係將10毫升的牛樟菌菌液加入該600公克的固態基質上，並於溫度為26±2℃之條件下進行靜置培養4至5天，此係為了確保固態基質呈現靜置狀態，避免顆粒狀的大豆、薏仁及高粱發生滾動，造成牛樟菌菌絲無法貼附於該固態基質之表面生長。

待靜置培養4至5天後，以手動搖晃方式將各組別之三角錐瓶上下搖晃，使各組之固態基質於該三角錐瓶之容室中翻動，該牛樟菌菌絲能夠均勻地沾附到固態基質表面，使各組的固態基質呈現均勻的代謝條件，供各組別之牛樟菌菌絲進入二次代謝反應，而能夠生成大量的生理活性成分，如三萜類化合物或水溶性多醣體；本實施例係於淨置培養5天後，將各組別於每5至7天進行搖晃5至10分鐘，並持續培養至第90天後，收集各組別之含有牛樟菌菌絲之固態基質，並將之乾燥後研磨成粉末，分析各組別之三萜類化合物及水溶性多醣體的含量。

由第1表及附件所示，本實施例之各組別中，又以第 A1組之混合條件，可所獲得較高含量的水溶性多醣體及三萜類化合物。

綜上所述，本發明牛樟菌之培養方法係藉由提供較易取得且成本較低的顆粒狀固態基質，作為牛樟菌菌絲的支持物，並且使生長於該顆粒狀固態基質的牛樟菌菌絲能夠獲得足夠的空氣、水氣及營養；並且，利用該靜置培養及搖晃培養的條件，確保該牛樟菌菌絲能夠均勻地分布於該固體基質之表面，確保該牛樟菌菌絲進入二次代謝期，使該牛樟菌菌絲所含的三萜類化合物及水溶性多醣體含量增加。

藉此，本發明牛樟菌固態培養基，係相較於習用的牛樟椴木的培養基質，係以容易取得的穀類作為培養基質，能夠達到節省培養牛樟菌菌絲之培養成本之功效。

本發明牛樟菌之培養方法，係藉由靜置培養及搖晃培養，確保牛樟菌菌絲的代謝條件均勻，具有提高牛樟菌菌絲中所含之三萜類化合物含量的功效。

本發明牛樟菌之培養方法，係相較於以牛樟椴木作為培養基質的習用栽培法，能夠於一較短培養時間內，獲得含有三萜類化合物等有效成分之牛樟菌菌絲。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種牛樟菌固態培養基，係由顆粒狀大豆、顆粒狀薏仁及顆粒狀高粱所組成，其中，以重量百分比計，大豆佔20~50%，薏仁佔30~50%，及高粱佔20~50%。
如申請專利範圍第1項所述之牛樟菌固態培養基，其中，大豆佔50%，薏仁佔30%，及高粱佔20%。
如申請專利範圍第1項所述之牛樟菌固態培養基，其中，大豆、薏仁及高粱係以水浸泡過的大豆、薏仁及高粱。
一種牛樟菌之培養方法，包含有：提供一固態基質，該固態基質係由顆粒狀大豆、顆粒狀薏仁及顆粒狀高粱所組成；提供一牛樟菌菌液，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質，使每100公克之固態基質含有1×10³~1×10⁶cfu之牛樟菌菌數，進行靜置培養，待牛樟菌長出菌絲並附著於該固態基質上；及經靜置培養後，再進行間歇搖晃培養，係於該間歇搖晃培養中每間隔5至7天即搖晃該固態基質5至10分鐘，該間歇搖晃培養係維持40天以上；其中，於提供該固態基質時，以重量百分比計，大豆佔該固態基質之20~50%，薏仁佔該固態基質之30~50%，及高粱佔該固態基質之20~50%。
如申請專利範圍第4項所述之牛樟菌之培養方法，其中，大豆佔該固態基質之50%，薏仁佔該固態基質之 30%，及高粱佔該固態基質之20%。
如申請專利範圍第4項所述之牛樟菌之培養方法，其中，將牛樟菌菌液接種於該固態基質時，於提供該固態基質時，該固態基質之大豆、薏仁及高粱係分別以水浸泡20~80分鐘，再混合成該固態基質。
如申請專利範圍第4項所述之牛樟菌之培養方法，其中，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質表面時，該牛樟菌菌液之菌數為1×10⁵~1×10⁶cfu/ml。
如申請專利範圍第4項所述之牛樟菌之培養方法，其中，將該牛樟菌菌液接種於該固態基質表面後，先進行靜置培養4至5天，使該牛樟菌附著於該固態基質上生長。
如申請專利範圍第4項所述之牛樟菌之培養方法，其中，該間歇搖晃培養之培養時間為40至90天。