TWI569012B - 評估一個體罹患肝癌之風險以及罹患肝癌預後的方法 - Google Patents

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Description

評估一個體罹患肝癌之風險以及罹患肝癌預後的 方法
本發明係關於評估一個體罹患肝癌之風險及罹患肝癌預後的方法。
一般而言，於所有的癌症中都可以觀察到DNA不正常的甲基化現象。DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶所催化，在胞嘧啶的第5個碳上增加一個甲基，此作用若發生在基因的5’端或是啟動子區域的CpG島，經常會抑制該基因的轉錄作用而造成非活化。在腫瘤發生的過程中，不正常的DNA甲基化現象經常參與抑制DNA修復基因以及腫瘤抑制基因的作用。
一般認為不正常的DNA甲基化通常發生在癌症早期，因此，這些不正常的基因甲基化非常適合作為各種不同的癌症標記，例如：癌症分類、診斷、預後、風險評估、化療反應等。相較於其他的生物標記，DNA甲基化有其獨特的優點，其中最重要的優點之一就是具有組織與不同癌症間的專一性。此外，甲基化標記是一種DNA標記，相較於RNA與蛋白質，其穩定性相對較高。特別的是，DNA甲基化不僅能在組織檢體中偵測，更能在各 種不同的體液中偵測，例如：唾液、痰、***、腸胃道消化液、呼吸道灌洗液、血漿、血清、尿液及糞便檢體等。
目前之肝癌篩檢，除了檢驗胎兒蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)指數外，還必須合併腹部超音波檢查，然而，胎兒蛋白(AFP)指數和腹部超音波檢查兩者都有其限制。在統計上，整體來說有百分之七十至百分之八十肝癌病人的胎兒蛋白指數會升高，但仍有百分之二十左右的病人即使到肝癌末期胎兒蛋白指數仍然不會升高。對於早期肝癌的診斷，胎兒蛋白的準確度更低，有三分之一小型肝癌(小於三公分)病人的胎兒蛋白指數不會升高。而且還有一些其他因素會導致胎兒蛋白升高，影響肝癌診斷的正確性，例如：肝炎、肝硬化、懷孕、生殖細胞腫瘤等。而，僅管超音波檢查沒有痛苦，也沒有副作用，但，超音波檢查需要訓練精良的醫師操作，因此檢出率與醫師的訓練、經驗有關，除此之外，超音波本身也有其限制，例如，有些腫瘤長在超音波監測的死角、無法分辨腫瘤性質、可能遺漏浸潤型的腫瘤或是腫瘤太小等無法檢測出來。
於現階段，手術切除是肝癌唯一根治性的治療。然而，由於肝癌早期不易發現，且大多數病人在肝癌發現時因為肝功能不佳(75%以上的病人有潛在的慢性肝病)、兩側肝葉疾病、或肝外轉移而導致無法進行切除。因此，肝癌的整體可切除率只有10~25%。如果肝癌無法切除，預後很差，中位存活期只有幾個月。
因此，目前亟需發展新的肝癌檢測方法，以提高肝癌初期的檢出率。
本發明提供一種評估一個體罹患肝癌之風險的方法，包括：(a)分別測定一個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數A；以及(c)根據該預測分數A評估該個體罹患肝癌之風險程度。
本發明也提供一種評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法，包括：(a)分別測定該感染B型肝炎病毒之個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數B；以及(c)根據該預測分數B評估該感染B型肝炎病毒之個體罹患罹患B型肝炎相關肝癌的風險程度。
本發明還提供一種APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因於製備一套組中的用途，其中所述套組可用於評估一個體罹患肝癌之風險的方法。
本發明提供另一種APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因於製備一套組中的用途，該套組用於預測一感染B型肝炎病毒之個體是否罹患B型肝炎相關肝癌的方法。
本發明也提供一種評估一已罹患肝癌之個體之預後 的方法，包括：(a)分別測定一已罹患肝癌個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度計算一預測分數A；以及(c)根據該預測分數A評估該已罹患肝癌個體之五年存活機率。
本發明還提供一種評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，包括：(a)分別測定一已罹患肝癌個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度，以及依據年齡、性別、AFP值、血管侵犯程度、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否，計算出一預後分數；以及(c)根據該預後分數評估該已罹患肝癌個體之五年存活機率。
本發明更提供一種偵測微小RNA-203的甲基化之套組，包括：一引子對，係由一順向引子與一逆向引子所構成；以及一第一探針及/或一第二探針，其中該順向引子之序列包括與序列辨識號：2之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而該逆向引子之序列包括與序列辨識號：3之序列具有至少85%序列相似度的一序列，又其中，該第一探針之序列包括與序列辨識號：4之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而該第二探針之序列包括與序列辨識號：5之序列具有至少85%序列相似度的一序列。
本發明又提供一種用於評估一個體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個體之預後的套組，包括：用於偵測微小 RNA-203的甲基化之引子對與探針；用於偵測APC之基因的甲基化之引子對與探針；用於偵測COX2之基因的甲基化之引子對與探針；以及用於偵測RASSF1A之基因的甲基化之引子對與探針。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
第1圖顯示，APC基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
第2圖顯示，COX基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
第3圖顯示，微小RNA-203基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
第4圖顯示，RASSF1A基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
第5圖顯示，在肝癌族群中，將ln(APC)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第6圖顯示，在肝癌族群中，將ln(COX2)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第7圖顯示，在肝癌族群中，將ln(miR-203)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第8圖顯示，在肝癌族群中，將ln(RASSF1A)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第9圖顯示，在肝癌族群中，將ln(APC)、ln(COX2)、ln (miR-203)與ln(RASSF1A)四個變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第10圖顯示，在肝癌族群中，將ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)與ln(RASSF1A)四個變數以交互驗證法分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第11圖顯示，在肝癌族群中，將AFP單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第12圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將ln(APC)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第13圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將ln(COX2)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第14圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將ln(miR-203)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第15圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將ln(RASSF1A)單變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第16圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)與ln(RASSF1A)四個變數以邏輯迴歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第17圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)與ln(RASSF1A)四個變數以交互驗證法分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第18圖顯示，在B肝相關肝癌族群中，將AFP單變數以邏輯迴 歸分析後進行接受者操作特徵曲線分析之結果。
第19圖顯示，對於肝癌預測分數A小於等於0.45及大於0.45之5年存活單變量分析的結果。
第20圖顯示，使用Cox比例風險模式(Cox proportional hazards model)計算預後分數，以Breslow方式計算基本存活函數，並以肝癌預測分數A是否大於0.45為分群，調整預後分數中位數，評估5年內存活函數。
第21圖顯示，使用Cox比例風險模式計算預後分數，以Breslow方式計算基本存活函數，並以肝癌預測分數A(是否大於0.45)與AFP指數(是否大於20)為分群，調整預後分數中位數，評估不同次群組之5年內存活函數。
在本發明一實施態樣中，提供一種評估一個體罹患肝癌之風險的方法。適合以本發明之評估一個體罹患肝癌之風險的方法來評估的肝癌，並無特別限制。而在一實施例中，適合以本發明之評估一個體罹患肝癌之風險的方法來評估的肝癌可包括B型肝炎相關肝癌。
而上述本發明之評估一個體罹患肝癌之風險的方法，可包括下列步驟，但不限於此。
首先，分別測定一個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
上述個體，可包括，一哺乳動物，例如，人類、猩猩、猴子、貓、狗、兔子、天竺鼠、大鼠或小鼠，但不限於此。 在一實施例中，上述個體可為人類。
又，上述樣本的例子，可包括，但不限於，血液、血漿、血清、肝組織、唾液、痰、***、腸道消化液、呼吸道灌洗液、糞便等。在一實施例中，上述樣本可為血漿或血清。
所偵測之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化位點，並無特別限制。在一實施例中，微小RNA-203之基因的甲基化，可藉由偵測在染色體14之第104,522,452鹼基對位置至第104,522,886鹼基對位置的序列(根據NCBI Homo sapiens Annotation Release 107)(序列辨識號：1)中，第104,522,554鹼基對位置與第104,522,557鹼基對位置之間的CpG二核苷酸甲基化及/或第104,522,570鹼基對位置與第104,522,571鹼基對位置之間的CpG二核苷酸甲基化及/或第104,522,579鹼基對位置與104,522,582鹼基對位置之間的CpG二核苷酸甲基化等來確認。
此外，適用於偵測APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化的方法，可包括，定量甲基化特異聚合酶鏈反應(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)、重亞硫酸限制組合分析法(combined bisulfite restriction analyse,COBRA)、重亞硫酸定序法(Bisulfite Sequencing)、焦磷酸定序法(Pyrosequencing)、次世代定序(Next Generation Sequencing,NGS)、DNA甲基化陣列晶片分析法(DNA Methylation Array Chip Analysis)等，但不限於此。在一實施例中，甲基化程度係由定量甲基化特異聚合酶鏈反應所偵測。
又，於一特定實施例中，甲基化程度係由定量甲基化特異聚合酶鏈反應所偵測，而由定量甲基化特異聚合酶鏈反應所偵測之微小RNA-203之基因的甲基化位點，可如前方實施例中所述之甲基化位點，於此不再進行贅述。
於上述之特定實施例中，微小RNA-203之基因的甲基化可藉由一引子對與一第一探針及/或一第二探針之組合來偵測。上述引子對可包括一順向引子與一逆向引子，且順向引子之序列可包括與序列辨識號：2之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而逆向引子之序列可包括與序列辨識號：3之序列具有至少85%序列相似度的一序列。又，第一探針之序列可包括與序列辨識號：4之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而第二探針之序列可包括與序列辨識號：5之序列具有至少85%序列相似度的一序列。在一實施例中，微小RNA-203之基因的甲基化可藉由一引子對與一第一探針及/或一第二探針之組合來偵測，其中引子對包括一順向引子與一逆向引子，且順向引子之序列可為序列辨識號：2之序列，而逆向引子之序列可為序列辨識號：3之序列，又，第一探針之序列可為序列辨識號：4之序列，而第二探針之序列可為序列辨識號：5之序列。
依據APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數A。
預測分數A可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度進行例如邏輯迴歸分析(logistic regression analysis)、判別函數分析(discriminant function analysis)、山脊迴歸分析(ridge regression analysis)等來獲得，但不限於此。在一實施例中，預測分數A可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度進行邏輯迴歸分析來獲得。
在一實施例中，預測分數A可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1可為1.6148至2.8618，X2可為0.0237至0.1559，X3可為0.1169至0.2581，Y4可為0.0058至0.1344，而X5可為0.0436至0.1758。
且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000。
在一特定實施例中，於上方所示之公式中，X1為2.238，X2為0.0898，X3為0.1875，X4為0.0701，而X5為0.1097。
在依據APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出預測分數A之後，根據此預測分數A來評估一個體罹患肝癌之風險程度。
若預測分數A高於一預先確認的參考值，則此個體被評估為具有罹患肝癌之風險。
在一實施例中，預先確認的參考值為比較一群已知非肝癌個體以及已知具有肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式並進一步作出接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值。在一特定實施例中，預先確認的參考值可為0.45，而若預測分數A高於0.45，則該個體被評估為具有罹患肝癌之風險。
在本發明另一實施態樣中，提供一種APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因於製備一套組中的用途，其中所述套組可用於前述任一本發明之評估一個體罹患肝癌之風險的方法。
在本發明另一實施態樣中，提供一種評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法。
而上述本發明之評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法，可包括下列步驟，但不限於此。
首先，分別測定一感染B型肝炎病毒之個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
有關個體、樣本、所偵測微小RNA-203之基因的甲基 化位點、適用於偵測基因甲基化的方法、以及所用以偵測微小RNA-203之基因的甲基化的引子對與探針等的例子，如前方相對應段落中之記載所述，故於此不再進行贅述。
依據APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數B。
預測分數B可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度進行例如邏輯迴歸分析、判別函數分析、山脊迴歸分析等來獲得，但不限於此。在一實施例中，預測分數B可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度進行邏輯迴歸分析來獲得。
在一實施例中，預測分數B可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，以下列公式進行計算所獲得：預測分數B=exp(預測值)/(1+exp(預測值))，其中預測值B=Y1+Y2×ln(APC)+Y3×ln(COX2)+Y4×ln(miR-203)+Y5×ln(RASSF1A)，又，其中Y1為1.7至3.34，Y2為0.045至0.213，Y3為0.142至0.32，Y4為0.028至0.193，而Y5為0.038至0.224，且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000； 其中ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000。
在一特定實施例中，於上方所示之公式中，Y1為2.447，Y2為0.127，Y3為0.226，Y4為0.1091，而Y5為0.1288。
在依據APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出預測分數B之後，根據此預測分數B來評估一B肝患者個體罹患肝癌之風險程度。
若預測分數B高於一預先確認的參考值，則此一B肝患者個體被評估為具有罹患肝癌之風險。
在一實施例中，預先確認的參考值為比較一群已知非B肝相關肝癌個體以及已知具有B肝相關肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度代入前方所示公式，並進一步作出接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值。在一特定實施例中，預先確認的參考值可為0.4，而若預測分數B高於0.4，則此一B肝患者個體可被評估為具有罹患肝癌之風險。
在本發明另一實施態樣中，提供一種APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因於製備一套組中的用途，其中所述套組可用於前述任一本發明之評估一B肝患者個體罹患肝癌之風險的方法。
在本發明另一實施態樣中，提供評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法。以上述本發明之評估已罹患肝癌之個體之預後的方法來評估之肝癌病患，並無特別限制。在一實施例中，以前述本發明之評估已罹患肝癌之個體之預後的方法來評估之肝癌病患可包括B型肝炎相關肝癌之病患以及C型肝炎相關肝癌之病患。
而上述本發明之評估已罹患肝癌之個體之預後的方法，可包括，但不限於，下列步驟。
首先，分別測定一已罹患肝癌個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
有關個體、樣本、所偵測微小RNA-203之基因的甲基化位點、適用於偵測基因甲基化的方法、以及所用以偵測微小RNA-203之基因的甲基化的引子對與探針等的例子，如前方相對應段落中之記載所述，故於此不再進行贅述。
然後，依據前述測得之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度，計算一預測分數A，並根據預測分數A評估該已罹患肝癌個體之五年存活機率。
預測分數A藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值 A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1為1.6148至2.8618，X2為0.0237至0.1559，X3為0.1169至0.2581，X4為0.0058至0.1344，而X5為0.0436至0.1758，且其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000。
在一實施例中，若預測分數A大於一預先確認的參考值，則5年存活率為約20-30%，而預測分數A小於等於一預先確認的參考值，則5年存活率為約60-70%。
上述預先確認的參考值為比較一群已知非肝癌個體以及已知具有肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式並進一步作出接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值。上述預先確認的參考值可為在約0.4-0.5之間的一數值，但不限於此。在一實施例中，上述預先確認的參考值可為0.45，而預測分數A大於0.45，則5年存活率為約26.93%，而預測分數A小於等於0.45，則5年存活率為約69.63%。
在本發明又另一實施態樣中，提供評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法。適合以上述本發明之評估已罹患肝癌之個體之預後的方法來評估之肝癌病患，並無特別限制。在一實施例中，適合以前述本發明之評估已罹患肝癌之個體之預後的方法來評估之該癌病患可包括B型肝炎以及C型肝癌相關肝癌之病患。
而上述本發明之評估已罹患肝癌之個體之預後的方法，可包括，但不限於，下列步驟。
首先，分別測定一已罹患肝癌個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
有關個體、樣本、所偵測微小RNA-203之基因的甲基化位點、適用於偵測基因甲基化的方法、以及所用以偵測微小RNA-203之基因的甲基化的引子對與探針等的例子，如前方相對應段落中之記載所述，故於此不再進行贅述。
依據前述測得之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度，並依據年齡、性別、AFP值、血管侵犯程度、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否，進行多變量存活分析，計算出一預後分數。
在一實施例中，計算預後分數以及存活機率之步驟可進一步包括下列所述步驟，但不限於此：(i)依據APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度以計算出一預測分數A；與(ii)將預測分數A，結合年齡、性別、AFP值、血管侵犯與否、 腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否與罹患肝硬化與否，計算出預後分數。
於上方所述之步驟(i)中，預測分數A可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度進行，例如邏輯迴歸分析、判別函數分析、山脊迴歸分析等來獲得，但不限於此。在一實施例中，預測分數A可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度進行邏輯迴歸分析來獲得。
在一實施例中，於上方所述之步驟(i)中，預測分數A可藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1可為1.6148至2.8618，X2可為0.0237至0.1559，X3可為0.1169至0.2581，X4可為0.0058至0.1344，而X5可為0.0436至0.1758。
又，其中ln(APC)表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；其中ln(COX2)表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；其中ln(miR-203)表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；其中ln(RASSF1A)表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數 值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000。
又，在一特定實施例中，於上方所示之公式中，X1為2.238，X2為0.0898，X3為0.1875，X4為0.0701，而X5為0.1097。
又於上方所述之步驟(ii)中，預後分數可藉由將年齡、性別、AFP值、血管侵犯、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及前述計算之預測分數A大於一預先確認的參考值與否進行多變量存活分析來獲得。
在一實施例中，於上方所述之步驟(ii)中，預後分數可藉由將年齡、性別、AFP值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及前述計算所獲得之預測分數A大於一預先確認的參考值與否，以下列公式進行計算所獲得：預後分數=B1×(年齡)+B2×(性別)+B3×(α-胎兒蛋白指數是否大於20)+B4×(血管侵犯與否)+B5×(腫瘤大小是否大於5cm)+B6×(臨床分期)+B7×(是否為肝硬化)+B8×(預測分數A是否大於一預先確認的參考值)，B1為-0.0224至0.0426，B2為-0.8233至0.7836，B3為0.1798至1.3902，B4為-0.1089至1.0898，B5為-0.9560至0.4118，B6為0.8525至2.2027，B7為-1.9221至-0.2812，而B8為0.3534至2.2217。
其中，年齡直接代入實際歲數(年)；性別：男性代入1，女性則代入0；血管侵犯與否：是，代入1，否代入0；腫瘤大小是否大於5cm：是，代入1；否，代入0；臨床階段：III/IV代入1， I/II代入0；是否有肝硬化：是，代入1，否，代入0；預測分數A是否大於一預先確認的參考值：是，代入1；否，代入0。
上述預先確認的參考值為比較一群已知非肝癌個體以及已知具有肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式並進一步作出接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值。上述預先確認的參考值可為在約0.4-0.5之間的一數值，但不限於此。在一實施例中，上述預先確認的參考值可為0.45。
在計算出前述預後分數之後，根據預後分數來評估已罹患肝癌個體在一預估存活時間(年)t的存活機率。在一實施例中，預估存活時間(年)t之存活機率=(S0(t))exp(預後分數)，其中S0(t)為基礎t年存活機率。
又，在一特定實施例中，若預後分數小於0.45之罹癌患者，則5年存活機率約為69.48%，而若預後分數大於等於0.45之罹癌患者，則5年存活機率約為34.19%。
以預測分數A和AFP指數為準，以其他變數複合值中位數調整後，經由Breslow方法來估計調整共變數存活函數，以說明肝癌預測分數A與AFP指數分群之四種組合之存活函數差異，AFP<=20(ng/ml)和預測分數A<=0.45之罹癌患者五年存活機率為69.48%。AFP>20(ng/ml)和預測分數A<=0.45之罹癌患者，五年存活機率為48.61%。AFP<=20(ng/ml)和預測分數>0.45之罹癌患者，五年存活機率約34.19%，AFP>20(ng/ml)和預測分數>0.45之罹癌患者，五年活機率僅剩11.64%。
本發明又另一實施態樣，則提供一種偵測微小 RNA-203之甲基化的套組。
上述偵測微小RNA-203之甲基化的套組，則可包括，一引子對，係由一順向引子與一逆向引子所構成，與一第一探針及/或一第二探針，但不限於此。
在一實施例中，順向引子之序列可包括與序列辨識號：2之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而逆向引子之序列可包括與序列辨識號：3之序列具有至少85%序列相似度的一序列。又第一探針之序列可包括與序列辨識號：4之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而第二探針之序列則可包括與序列辨識號：5之序列具有至少85%序列相似度的一序列。
在一特定實施例中，上述本發明之偵測微小RNA-203之甲基化的套組，可包括，一引子對，係由一順向引子與一逆向引子所構成，與一第一探針及/或一第二探針。於此特定實施例中，順向引子之序列為序列辨識號：2之序列，逆向引子之序列為序列辨識號：3之序列，第一探針之序列為序列辨識號：4之序列，而第二探針之序列為序列辨識號：5之序列。
本發明又另一實施態樣，則提供一種用於評估一個體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個體之預後的套組。
上述用於評估一個體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個體之預後的套組，可包括，用於偵測微小RNA-203的甲基化之引子對與探針、用於偵測APC之基因的甲基化之引子對與探針、用於偵測COX2之基因的甲基化之引子對與探針，與用於偵測RASSF1A之基因的甲基化之引子對與探針，但不限於此。
在一實施例中，在用於偵測微小RNA-203的甲基化之 引子對與探針中，引子對可包括一順向引子與一逆向引子，而探針可包括一第一探針及/或一第二探針。順向引子之序列可包括與序列辨識號：2之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而逆向引子之序列可包括與序列辨識號：3之序列具有至少85%序列相似度的一序列。又第一探針之序列可包括與序列辨識號：4之序列具有至少85%序列相似度的一序列，而第二探針之序列則可包括與序列辨識號：5之序列具有至少85%序列相似度的一序列。
在一實施例中，上述套組適用於定量甲基化特異聚合酶鏈反應，但不限於此。
【實施例】
A.基因甲基化之偵測
(1)臨床血漿檢體
臨床血漿檢體來自國立成功大學醫學院附設醫院，計有健康人50例；肝炎47例(包含B型肝炎21例、C型肝炎26例)；肝炎合併肝硬化57例(包含B型肝炎32例、C型肝炎25例)；肝癌203例(包含B型肝炎81例、C型肝炎30例、B型肝炎合併肝硬化42例、C型肝炎合併肝硬化50例)，總計357例血漿檢體。此臨床研究經國立成功大學醫學院附設醫院人體試驗委員會審查通過。
(2)血漿游離DNA萃取
800μl血漿以QIAGEN QIAamp DNA Blood Mini Kit萃取血漿游離DNA，萃取方法根據供應商建議步驟進行。以即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase.Chain Reaction,Q-PCR)來測定血漿游離DNA的濃度。
(3)亞硫酸氫鈉處理
使用EZ DNA甲基化套組(Zymo Research)來處理臨床樣本DNA，且執行亞硫酸氫鈉處理，處理方法根據供應商建議步驟進行。
(4)即時定量甲基化分析(Real-Time Quantitative Methylation Analysis)
將如上所述經亞硫酸氫鈉轉化之DNA，以探針基礎之即時定量甲基化特異性PCR(qMSP)來進行檢測。
各個反應係由1x KAPA PROBE FAST Master Mix(KAPA)、0.5μM順向引子與0.5μM逆向引子以及0.25μM探針所構成，總體積為20μl。擴增反應(amplification)在StepOnePlus即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific Inc.)中進行，根據下列的熱循環條件：95℃、3分鐘；之後95℃、3秒，60-68℃、20秒及72℃、10秒的55個循環。根據上述記載，以下列公式計算β-肌動蛋白(β-actin)與目標基因之間的Ct值差，獲得甲基化程度：對於血漿樣本：2[Ct(β-肌動蛋白)-Ct(目標基因)]x1000
偵測微小RNA-203、APC、COX2、RASSF1A之甲基化所使用之引子對與探針，分別如下所示：
B.基本統計& ANOVA
於以下顯示APC、COX2、RASSF1A以及微小RNA-203四個基因基本敘述統計，並呈現九個組別之個體間差異性。上述九組組別包含，健康成人組、B型肝炎病毒(HBV)感染組、C型肝炎病毒感染組(HCV)、B型肝炎病毒感染+肝硬化組(HBV+Cirrhosis)、C型肝炎病毒感染+肝硬化組(HCV+Cirrhosis)、肝癌-B型肝炎組(HCC-HBV)、肝癌-C型肝炎組(HCC-HCV)、肝癌-B型肝炎+肝硬化組(HCC-HBV+Cirrhosis)以及肝癌-C型肝炎組+肝硬化組(HCC-HCV+Cirrhosis)。
(1)APC基因之甲基化的基本敘述統計
APC基因之甲基化的基本敘述統計結果如表2與第1圖所示。
又，上方九組個體之ln(APC)均值，經由ANOVA分析顯示其在統計上呈現顯著不同。相較於非肝癌群組(包括健康成人組、B型肝炎病毒感染組、C型肝炎病毒感染組、B型肝炎病毒感染+肝硬化組以及C型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-B型肝炎組、肝癌-C型肝炎組、肝癌-B型肝炎+肝硬化組以及肝癌-C型肝炎組+肝硬化組)之APC基因甲基化程度明顯升高。
(2)COX基因之甲基化的基本敘述統計
COX基因之甲基化的基本敘述統計結果如表3與第2圖所示。
又，上方九組個體之ln(COX2)均值，經由ANOVA分析顯示其在統計上呈現顯著不同。相較於非肝癌群組(包括健康成人組、B型肝炎病毒感染組、C型肝炎病毒感染組、B型肝炎病毒感染+肝硬化組以及C型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-B型肝炎組、肝癌-C型肝炎組、肝癌-B型肝炎+肝硬化組以及肝癌-C型肝炎組+肝硬化組)之COX2基因甲基化程度明顯升高。
(3)微小RNA-203基因之甲基化的基本敘述統計
微小RNA-203基因之甲基化的基本敘述統計結果如表4與第3圖所示。
又，上方九組個體之ln(miR-203)均值，經由ANOVA分析顯示其在統計上呈現顯著不同。相較於非肝癌群組(包括健康成人組、B型肝炎病毒感染組、C型肝炎病毒感染組、B型肝炎病毒感染+肝硬化組以及C型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-B型肝炎組、肝癌-C型肝炎組、肝癌-B型肝炎+肝硬化組以及肝癌-C型肝炎組+肝硬化組)之微小RNA-203基因甲基化程度明顯升高。
(4)RASSF1A基因之甲基化的基本敘述統計
RASSF1A基因之甲基化的基本敘述統計結果如表5與第4圖所示。
又，上方九組個體ln(RASSF1A)均值，經由ANOVA分析顯示其在統計上呈現顯著不同。相較於非肝癌群組(包括健康成人組、B型肝炎病毒感染組、C型肝炎病毒感染組、B型肝炎病毒感染+肝硬化組以及C型肝炎病毒感染+肝硬化組)，肝癌群組(包括：肝癌-B型肝炎組、肝癌-C型肝炎組、肝癌-B型肝炎+肝硬化組以及肝癌-C型肝炎組+肝硬化組)之RASSF1A基因甲基化程度明顯升高。
C.邏輯迴歸與接受者操作特徵曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC Curve)
罹患肝癌風險預測
以下將利用基因與肝癌之關連性部份，以邏輯迴歸進行模式預測，並找到敏感度與精確度較佳之肝癌預測機率為最佳切點。之後透過收方特徵操作曲線與其面積估計，評論該預測模式對肝癌有無區分之能力。
九個群組分別如下：非肝癌群組包括：健康群組、B型肝炎病毒(HBV)感染組、C型肝炎病毒感染組(HCV)、B型肝炎病毒感染+肝硬化組(HBV+Cirrhosis)與C型肝炎病毒感染+肝硬化組(HCV+Cirrhosis)(共154位，N=154)；肝癌群組包括：B型肝炎病毒感染-肝硬化-肝癌組(HCC-HBV+Cirrhosis)與B型肝炎病毒感染+肝癌組(HBV-HCC)(共203位，N=203)
1.單一甲基化標記對肝癌之預測
(1)APC
將前述九個群組之ln(APC)建立模式。
預測模式：Ln(P/(1-P))=0.9753+0.1683*ln(APC)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第5圖所示。根據第5圖可知，於APC之預測模式中，ROC Curve面積為0.6063，而若以0.48為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為56.2%，專一性為57.1%，整體正確率為56.6%。
(2)COX2
將前述九個群組之ln(COX2)建立模式。
預測模式：Ln(P/(1-P))=1.2778+0.2479*ln(COX2)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第6圖所示。根據第6圖可知，於COX2之預測模式中，ROC Curve面積為0.683，而若以0.45為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為61.1%，專一性為66.2%，整體正確率為63.3%。
(3)miR-203
將前述九個群組之ln(miR-203)建立模式。
預測模式：Ln(P/(1-P))=0.6845+0.0942*ln(miR-203)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第7圖所示。根據第7圖可知，於miR-203之預測模式中，ROC Curve面積為0.518，而若以0.52為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為49.3%，專一性為43.5%，整體正確率為46.8%。
(4)RASSF1A
將前述九個群組之ln(RASSF1A)建立模式。
預測模式：Ln(P/(1-P))=0.9818+0.1787*ln(RASSF1A)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第8圖所示。根據第8圖可知，於RASSF1A之預測模式中，ROC Curve面積為0.6332，而若以0.46為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為59.8%，專一性為48.6%，整體正確率為55.0%。
2.多重甲基化標記對肝癌之預測
(1)逐步選取法(Stepwise selection)
將以上九個群組之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF1A)與ln(miR-203)進行逐步選取法分析，上述四種因子進入模式順序為ln(COX2)、ln(RASSF1A)、ln(APC)以及ln(miR-203)，無移除因子。
(2)最大似然率估計(Maximum Likelihood Estimates)
將以上九個群組之ln(COX2)、ln(RASSF1A)、ln(APC)與ln(APC)進行最大似然率估計分析、參數評估與Wald信賴區間分析，結果如表6所示。
(3)風險勝算比評估與95%信賴區間(Odds Ratio Estimates and Profile-Likelihood Confidence Intervals)
將以上九個群組之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF1A)與ln(miR-203)進行風險勝算比評估與95%信賴區間分析，結果如表7所示。
由表7可以得知，ln(APC)每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比(Odd ratio)增加9.4%；ln(COX2)每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比則會增加20.6%；ln(miRNA-203)每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比則會增加7.3%；ln(RASSF1A每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比則會增加 11.6%。四種基因之甲基化程度以COX2基因為最具影響程度。
於前述各分析後，以逐步迴歸分析，選出ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)與ln(RASSF1A)四個變數建立模式。
預測模式A：Ln(P/(1-P))=2.238+0.0898*ln(APC)+0.1875*ln(COX2)+0.0701*ln(miRNA-203)+0.1097*ln(RASSF1A)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如表8以及第9圖所示。
根據表8與第9圖可知，接受者操作特徵曲線面積為0.793，表示以預測模式A對非肝癌及肝癌族群作有無罹患肝癌分類，可得到較佳的分類結果。若以0.45為模式最佳截斷值(cutoff value)，可得到靈敏度為73.4%，專一性為73.0%，偽陽性21.5%，偽陰性32.9%，整體正確率為73.2%。
另外以交互驗證法(Cross-validation)(Leave-one-out)作模式驗證，亦可印證本模式之分類能力，結果如表9以及第10圖所示。
根據表9，以及第10圖可知，以交互驗證法Cross-validation(Leave-one-out)作模式驗證，接受者操作特徵曲線面積為0.7818。若以0.47為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為72.9%、專一性為73%、偽陽性為21.6%以及偽陰性33.3%，整體正確率為72.9%。證明預測模式之準確度。
3.AFP標記對肝癌之預測
將前述九個群組之ln(AFP)建立模式。
預測模式：ln(P/(1-P))=0.7865+0.1198*ln(AFP)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如表10以及第11圖所示。最佳切點為0.75時，靈敏度是55.7%，專一性是56.9%，偽陽性是18.8%，偽陰性是72.3%，整體正確率為56.0%。
罹患B型肝炎相關肝癌風險預測
五個群組分別如下：非肝癌群組包括：健康群組、B型肝炎病毒(HBV)感染組與B型肝炎病毒感染+肝硬化組(HBV+Cirrhosis)(共100位，N=100)；肝癌群組包括：B型肝炎病毒感染-肝硬化-肝癌組(HCC-HBV+Cirrhosis)與B型肝炎病毒感染+肝癌組(HBV-HCC)(共120位，N=120)
1.單一甲基化標記對B型肝炎相關肝癌預測
(1)APC
將前述五個群組之ln(APC)建立模式。
預測模式：ln(P/(1-P))=0.9165+0.1922*ln(APC)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第12圖所示。
根據第12圖可知，於APC之預測模式中，ROC Curve面積為0.644，而若以0.547為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為62.5%，專一性為92%，整體正確率為75.9%。
(2)COX2
將前述五個群組之ln(COX2)建立模式。
預測模式：ln(P/(1-P))=1.20072+0.29966*ln(COX2)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第13圖所示。
根據第13圖可知，於COX2之預測模式中，ROC Curve面積為0.758，而若以0.454為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為74.16%，專一性為92%，整體正確率為82.27%。
(3)miR-203
將前述五個群組之ln(miR-203)建立模式。
預測模式：ln(P/(1-P))=0.5909+0.1096 *ln(miR-203)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第14圖所示。
根據第14圖可知，於miR-203之預測模式中，ROC Curve面積為0.55，而若以0.565為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為55%，專一性為83%，整體正確率為67.73%。
(4)RASSF1A
將前述五個群組之ln(RASSF1A)建立模式。
預測模式：ln(P/(1-P))=0.99403+0.21392*ln(RASSFIA)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如第15圖所示。
根據第15圖可知，於RASSF1A之預測模式中，ROC Curve面積為0.67，而若以0.582為模式最佳截斷值，可得到靈敏度為62.5%，專一性為83%，整體正確率為76.36%。
2.多重甲基化標記對B型肝炎相關肝癌預測
(1)逐步選取法(Stepwise selection)
將以上五個群組之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF1A)與ln(miR-203)進行逐步選取法分析，上述四種因子進入模式順序為ln(COX2)、ln(APC)、ln(RASSF1A)以及ln(miR-203)，無移除因子。
(2)最大似然率估計(Maximum Likelihood Estimates)
將以上五個群組之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF1A)與ln(微小RNA-203)進行最大似然率估計分析、參數評估與Wald信賴區間分析，結果如表11所示。
(3)風險勝算比評估與95%信賴區間(Odds Ratio Estimates and Profile-Likelihood Confidence Intervals)
將以上五個群組之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF1A)與ln(miR-203)進行風險勝算比估計與95%信賴區間分析，結果如表12所示。
由表12可以得知，ln(APC)每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比(Odd ratio)增加13.6%；ln(COX2)每上升一單 位，罹患HCC之風險勝算比則會增加25.4%；ln(微小RNA-203)每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比則會增加11.5%；ln(RASSF1A)每上升一單位，罹患HCC之風險勝算比則會增加13.7%。四種基因之甲基化程度以COX2基因為最具影響程度。
於前述各分析後，以逐步迴歸分析，選出ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)與ln(RASSF1A)四個變數建立模式。
預測模式B：ln(P/(1-P))=2.447+0.127×ln(APC)+0.226×ln(COX2)+0.1091×ln(miR-203)+0.1288×ln(RASSFIA)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如表13，以及第16圖所示。
根據表13以及第16圖可知，接受者操作特徵曲線面積為0.865，而此表示以預測模式B對非B肝相關肝癌族群及B肝相關肝癌族群作有無罹患肝癌分類，可得到很好的分類結果。若以 0.4為模式最佳截斷值(cutoff value)，可得到靈敏度為84.2%，專一性為83.0%，偽陽性14.4%，偽陰性18.6%，整體正確率為83.6%。
另外以交互驗證法(Cross-validation)(Leave-one-out)作模式驗證，亦可印證本模式之分類能力，結果如表14，以及第17圖所示。
根據表13與表14，以及第17圖可知，以交互驗證法Cross-validation(Leave-one-out)作模式驗證，接受者操作特徵曲線面積為0.8548。若以0.4為模式最佳截斷值，可得到與原先模式相同之靈敏度、專一性、偽陽性以及偽陰性，證明預測模式之準確度。
3.AFP標記對B型肝炎相關肝癌預測
將前述五個群組之ln(AFP)建立模式。
預測模式：ln(P/(l-P))=0.8159+0.1685*ln(AFP)
之後進行接受者操作特徵曲線分析，結果如表15，以及第18圖所示。最佳切點為0.775時，相對應之AFP(ng/ml)值為12.1545，靈敏度是50.9%，專一性是62.1%，偽陽性是15.7%，偽陰性是76%，整體正確率為53.1%。
根據上方個結果可知，ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF1A)與ln(miR-203)之組合的預測模型具有最高的正確率。
D.存活分析
(1)單變量存活分析
將已罹患肝癌之病患，依據年齡、性別、AFP值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及肝癌預測分數A是否大於0.45進行分類，並進行5年 死亡之單變量分析，結果如表16所示。
註：肝癌預測分數A可由以下公式可獲得預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))預測值A=2.238+0.0898×ln(APC)+0.1875×ln(COX2)+0.0701×ln(miR-203)+0.1097×ln(RASSFIA)
表16列出各變數分類群組之五年死亡率，並以對數等級檢定(Log-rank Test)進行存活函數檢定，結果顯示，肝硬化、組織分級、AFP(ng/ml)、病理階段、臨床階段、血管侵犯、預測分數A等七個變數，各單變數在其分類群組之存活函數有顯著不同。
而對於肝癌預測分數A之5年存活單變量分析的結果如第19圖所示。預測分數A≦0.45，5年存活機率為75.2%；預測分數A>0.45，5年存活機率為48.3%，P=0.0052，具顯著差異。
(2)多變量存活分析
將已罹患肝癌之病患，依據年齡、性別、AFP值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及預測分數A是否大於0.45進行分類，並進行多變量存活分析。
多變量Cox比例風險迴歸分析
將已罹患肝癌之病患，依照上述分類進行多變量Cox比例風險迴歸分析，結果如表17所示。
以Cox比例風險迴歸分析進行多變量存活函數分析，其中AFP、臨床分期肝硬化、預測分數A等變數，在其他變數同時調整下仍具統計顯著。若受檢者AFP>20，5年內死亡之風險比增加1.0倍；若受檢者之臨床病理分類為第三期以上，5年內死亡之風險比增加約3.4倍；若受檢者預測分數A大於0.45，5年內死亡之風險比增加約1.9倍。
多變量Cox比例風險迴歸分析所獲得之公式如下：預後分數=B1×(年齡)+B2×(性別)+B3×(α-胎兒蛋白指數是否大於20)+B4×(血管侵犯與否)+B5×(腫瘤大小是否大於5cm)+B6×(臨床分期)+B7×(是否為肝硬化)+B8×(預測分數A是否大於0.45)。
其中，B1為0.01398，B2為-0.04761，B3為0.69494，B4為0.50467，B5為-0.18205，B6為1.47360，B7為0.69139，B8為1.08088。
又，年齡直接代入實際歲數(年)；性別：男性代入1，女性則代入0；血管侵犯與否：是，代入1，否代入0；腫瘤大小是否大於5cm：是代入1；否代入0；臨床階段：III/IV代入1，I/II代入0；是否有肝硬化：是代入1，否代入0；預測分數A是否大於0.45：是代入1；否代入0。
以Breslow方法預估存活t年之存活機率=(S0(t))exp(預後分數)，S0(t)為基礎t年存活機率。基礎t年存活機率S0(t)函數如表18所示(依據文獻Breslow,N.(1974)Covariance Analysis of Survival Data under the Proportional Hazards Model.International Statistical Review,43,43-54.與Elisa,T.Lee and John Wenyu Wang.(2003)Statistical Methods for Survival Data Analysis.P.321.3rd ed.Wiley,New York.所記載之計算方式獲得)。
(a)以肝癌預測分數A估計存活機率
以肝癌預測分數A為準，以其他變數複合值中位數調整後，經由Breslow方法來估計調整共變數存活函數(Covariate-Adjusted Survival Function)，以說明肝癌預測分數A分群之兩種組合之存活函數差異，結果如第20圖所示。
第20圖顯示，預測分數A<=0.45之罹癌患者，五年存活之機率約為69.48%，而預測分數>0.45之罹癌患者，五年存活之機率約為34.19%。
(b)以預測分數A及AFP指數評估存活機率
以預測分數A和AFP指數為準，以其他變數複合值中位數調整後，經由Breslow方法來估計調整共變數存活函數，以說明肝癌預測分數A與AFP指數分群之四種組合之存活函數差異，結果如第21圖所示。
第21圖顯示，AFP<=20(ng/ml)和預測分數A<=0.45之罹癌患者五年存活機率為69.48%。AFP>20(ng/ml)和預測分數<=0.45之罹癌患者，五年存活機率為48.61%。AFP<=20(ng/ml)和預測分數>0.45之罹癌患者，五年存活機率約34.19%，AFP>20(ng/ml)和預測分數>0.45之罹癌患者，五年活機率僅剩11.64%。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 評估一個體罹患肝癌之風險以及罹患肝癌預後的方法
<130> 0965-A24887-TW
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 413
<212> DNA
<213> 人類
<400> 1
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一探針
<400> 4
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二探針
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 6
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 7
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 8
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 10
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 11
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 順向引子
<400> 15
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向引子
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針
<400> 17

Claims (16)

  1. 一種評估一個體罹患肝癌之風險的方法，包括：(a)分別測定一個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數A，其中該預測分數A藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1可為1.6148至2.8618，X2可為0.0237至0.1559，X3可為0.1169至0.2581，X4可為0.0058至0.1344，而X5可為0.0436至0.1758，且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^ (Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000；以及(c)根據該預測分數A評估該個體罹患肝癌之風險程度，若該預測分數A高於一預先確認的參考值，則該個體被評估為具有罹患肝癌之風險。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之評估一個體罹患肝癌之風險的方法，其中該預先確認的參考值係藉由比較一群已知非肝癌個體以及已知具有肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，並根據接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值所決定。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之評估一個體罹患肝癌之風險的方法，其中該微小RNA-203之基因的甲基化係藉由一引子對與一第一探針及/或一第二探針之組合來偵測，其中該引子對包括一順向引子與一逆向引子，且該順向引子之序列包括序列辨識號：2之序列，而該逆向引子之序列包括序列辨識號：3之序列，又其中，該第一探針之序列包括序列辨識號：4之序列，而該第二探針之序列包括序列辨識號：5之序列。
  4. 一種APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因於製備一套組中的用途，該套組用於評估 一個體罹患肝癌之風險的方法，該方法包括：(a)分別測定一個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數A，其中該預測分數A藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1可為1.6148至2.8618，X2可為0.0237至0.1559，X3可為0.1169至0.2581，X4可為0.0058至0.1344，而X5可為0.0436至0.1758，且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203)) *1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000；以及(c)根據該預測分數A評估該個體罹患肝癌之風險程度，若該預測分數A高於一預先確認的參考值，則該個體被評估為具有罹患肝癌之風險。
  5. 一種評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法，包括：(a)分別測定該感染B型肝炎病毒之個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數B，其中該預測分數B藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數B=exp(預測值B)/(1+exp(預測值B))，其中預測值B=Y1+Y2×ln(APC)+Y3×ln(COX2)+Y4×ln(miR-203)+Y5×ln(RASSF1A)，又，其中Y1為1.7至3.34，Y2為0.045至0.213，Y3為0.142至0.32，Y4為0.028至0.193，而Y5為0.038至0.224，且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對 數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；其中ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000；以及(c)根據該預測分數B評估該感染B型肝炎病毒之個體罹患罹患B型肝炎相關肝癌的風險程度，若該預測分數B高於一預先確認的參考值，則該感染B型肝炎病毒之個體被評估為具有罹患B型肝炎相關肝癌之風險。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法，其中該預先確認的參考值係藉由比較一群已知非B肝相關肝癌個體以及已知B肝相關肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，並根據接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值所決定。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法，其中該微小RNA-203之基因的甲基化係藉由一引子對與一第一探針及/或 一第二探針之組合來偵測，其中該引子對包括一順向引子與一逆向引子，且該順向引子之序列包括序列辨識號：2之序列，而該逆向引子之序列包括序列辨識號：3之序列，又其中，該第一探針之序列包括序列辨識號：4之序列，而該第二探針之序列包括序列辨識號：5之序列。
  8. 一種APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因於製備一套組中的用途，該套組用於評估一感染B型肝炎病毒之個體罹患B型肝炎相關肝癌之風險的方法，該方法包括：(a)分別測定該感染B型肝炎病毒之個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度計算出一預測分數B，其中該預測分數B藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數B=exp(預測值B)/(1+exp(預測值B))，其中預測值B=Y1+Y2×ln(APC)+Y3×ln(COX2)+Y4×ln(miR-203)+Y5×ln(RASSF1A)，又，其中Y1為1.7至3.34，Y2為0.045至0.213，Y3為 0.142至0.32，Y4為0.028至0.193，而Y5為0.038至0.224，且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；其中ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000；以及(c)根據該預測分數B評估該感染B型肝炎病毒之個體罹患罹患B型肝炎相關肝癌的風險程度，若該預測分數B高於一預先確認的參考值，則該感染B型肝炎病毒之個體被評估為具有罹患B型肝炎相關肝癌之風險。
  9. 一種評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，包括：(a)分別測定一已罹患肝癌個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度計算一預測分數A，其中該預測分數A藉由將APC之基因、COX2之基因、 RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1為1.6148至2.8618，X2為0.0237至0.1559，X3為0.1169至0.2581，X4為0.0058至0.1344，而X5為0.0436至0.1758，且其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000；以及(c)根據該預測分數A評估該已罹患肝癌個體之五年存活機率。
  10. 一種評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，包括： (a)分別測定一已罹患肝癌個體之一樣本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度，以及依據年齡、性別、AFP值、血管侵犯程度、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否以及罹患肝硬化與否，計算出一預後分數；以及(c)根據該預後分數評估該已罹患肝癌個體在一預估存活時間(年)t的存活機率，其中該預估存活時間(年)t的存活機率係由下列公式所獲得：預估存活時間(年)t之存活機率=(S0(t))exp(預後分數)，其中S0(t)為基礎t年存活機率。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，其中步驟(b)中包括：(i)依據該APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因與微小RNA-203之基因的甲基化程度以計算出一預測分數A；以及(ii)依據該預測分數A，結合年齡、性別、AFP值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否與罹患肝硬化與否，計算出該預後分數。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，其中該預測分數A藉由將APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式進行計算所獲得：預測分數A=exp(預測值A)/(1+exp(預測值A))，其中預測值A=X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，又，其中X1為1.6148至2.8618，X2為0.0237至0.1559，X3為0.1169至0.2581，X4為0.0058至0.1344，而X5為0.0436至0.1758，且其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然對數值，APC甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然對數值，COX2甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然對數值，miR-203甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然對數值，RASSF1A甲基化程度由下列公式獲得：2^(Ct(β-actin)-Ct(RASSF1A))*1000。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，其中該預後分數藉由將年齡、性別、AFP 值、血管侵犯與否、腫瘤大小、臨床分期、罹患肝炎病毒與否、罹患肝硬化與否以及該預測分數A大於一預先確認的參考值與否，以下列公式進行計算所獲得：預後分數=B1×(年齡)+B2×(性別)+B3×(α-胎兒蛋白指數是否大於20)+B4×(血管侵犯與否)+B5×(腫瘤大小是否大於5cm)+B6×(臨床分期)+B7×(是否為肝硬化)+B8×(預測分數A是否大於一預先確認的參考值)，B1為-0.0224至0.0426，B2為-0.8233至0.7836，B3為0.1798至1.3902，B4為-0.1089至1.0898，B5為-0.9560至0.4118，B6為0.8525至2.2027，B7為-1.9221至-0.2812，而B8為0.3534至2.2217，其中，年齡直接代入實際歲數(年)；性別：男性代入1，女性則代入0；血管侵犯與否：是，代入1，否代入0；腫瘤大小是否大於5cm：是代入1；否代入0；臨床階段：III/IV代入1，I/II代入0；是否有肝硬化：是代入1，否代入0；預測分數A是否大於0.45：是代入1；否代入0。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之評估一已罹患肝癌之個體之預後的方法，其中該預先確認的參考值係藉由比較一群已知非肝癌個體以及已知具有肝癌個體中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，並根據接受者操作特徵曲線所獲得的一截斷值所決定。
  15. 一種偵測微小RNA-203之基因之甲基化的套組，包括：一引子對，係由一順向引子與一逆向引子所構成；以及一第一探針及/或一第二探針，其中該順向引子之序列包括序列辨識號：2之序列，而該逆向引子之序列包括序列辨識號：3之序列，又其中，該第一探針之序列包括序列辨識號：4之序列，而該第二探針之序列包括序列辨識號：5之序列。
  16. 一種用於評估一個體是否罹患肝癌及/或評估罹患肝癌之個體之預後的套組，包括：用於偵測微小RNA-203的甲基化之引子對與一第一探針及/或一第二探針，其中該引子對係由一順向引子與一逆向引子所構成，該順向引子之序列包括序列辨識號：2之序列，而該逆向引子之序列包括序列辨識號：3之序列，又其中，該第一探針之序列包括序列辨識號：4之序列，而該第二探針之序列包括序列辨識號：5之序列；用於偵測APC之基因的甲基化之引子對與探針；用於偵測COX2之基因的甲基化之引子對與探針；以及用於偵測RASSF1A之基因的甲基化之引子對與探針。
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