CN111647657B - 一种肺癌检测试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因检测领域，特别涉及一种肺癌检测试剂及试剂盒，所述的试剂或试剂盒包括针对特定核酸片段甲基化的检测试剂，用于检测特定核酸片段经修饰后的序列。本发明的试剂经试验证实，可以高灵敏、高特异地检测和诊断肺癌，有极高的临床应用价值。

Description

一种肺癌检测试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测领域，更具体地，本发明涉及一种肺癌检测试剂及试剂盒。
背景技术
肺癌是起源于支气管粘膜、腺体或肺泡上皮的肺部恶性肿瘤。按照病理类型可以分为：1)小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)：一种特殊病理学类型的肺癌，有明显的远处转移倾向，预后较差，但多数病人对放化疗敏感；2)非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)：除小细胞肺癌以外其他病理学类型的肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。在生物学行为和临床病程方面具有一定差异。按照发生位置又可以分为：1)中心型肺癌(central lung cancer)：生长在肺段支气管开口及以上的肺癌；2)周围型肺癌(peripheral lung cancer)：生长在肺段支气管开口以远的肺癌。
近年来，人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使中国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，根据国家癌症中心发布的《2017中国肿瘤登记年报》显示，全国每分钟约7人确诊患癌，其中肺癌发病率与死亡率均为第一位。中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测到2025年中国肺癌的人数将达到100万。而根据流行病学研究显示：吸烟是引起肺癌的重要因素。世界上约80％-90％的肺癌可归因于吸烟。与非吸烟者相比，45-64岁每日吸香烟1-19支和20支以上者患肺癌的相对危险度分别为4.27和8.61，与从不吸烟者比较，长期每日吸烟1-19支和20支以上者死于肺癌的相对危险度分别为6.14和10.73。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4％仅上升至12％左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月，但对于Ⅰ期肺癌患者，手术后5年生存率高达约60％～70％。因此肺癌的早期诊断与早期手术是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。
肺癌目前的临床辅助诊断主要有以下几种，但是他们都不能完全做到早发现，早诊断：
(1)血液生化检查：对于原发性肺癌，目前无特异性血液生化检查。肺癌病人血液碱性磷酸酶或血钙升高考虑骨转移的可能，血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高考虑肝转移的可能。
(2)肿瘤标志物检查：1)CEA：30％～70％肺癌患者血清中有异常高水平的CEA，但主要见于较晚期肺癌患者。目前血清中CEA的检查主要用于估计肺癌预后以及对治疗过程的监控。2)NSE：是小细胞肺癌首选标志物，用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3)CYFRA21-1：是非小细胞肺癌的首选标记物，对肺鳞癌诊断的敏感性可达60％，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。
(3)影像学检查：1)胸部X线检查：应包括胸部正位和侧位片。在基层医院，胸部正侧位片仍是肺癌初诊时最基本和首选的影像诊断方法。一旦诊断或疑诊肺癌，即行胸部CT检查。2)CT检查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的检查方法，用于肺癌的诊断与鉴别诊断、分期及治疗后随诊。CT引导下肺穿刺活检是肺癌的重要诊断技术，有条件的医院可将其用于难以定性的肺内病变的诊断，以及临床诊断肺癌需经细胞学、组织学证实而其它方法又难以取材的病例。近年来，多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。低剂量螺旋CT被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。3)超声检查：主要用于发现腹部重要器官及腹腔、腹膜后***有无转移，也用于颈部***的检查。对于贴邻胸壁的肺内病变或胸壁病变，可鉴别其囊实性及进行超声引导下穿刺活检；超声还常用于胸水抽取定位。4)骨扫描：对肺癌骨转移检出的敏感性较高，但有一定的假阳性率。可用于以下情况：肺癌的术前检查；伴有局部症状的病人。
(4)其它检查：1)痰细胞学检查：目前肺癌简单方便的无创诊断方法，连续涂片检查可提高阳性率约达60％，是可疑肺癌病例的常规诊断方法。2)纤维支气管镜检查：肺癌诊断中最重要的手段之一，对于肺癌的定性定位诊断和手术方案的选择有重要的作用。对拟行手术治疗的患者为必需的常规检查项目。而经支气管镜穿刺活检检查(TBNA)，虽利于治疗前分期，但因技术难度和风险较大，有需要者应转上级医院进一步检查。3)其他：如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等，在有适应证的情况下，可根据现有条件分别采用以协助诊断。
影像学检查中的多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。在临床实践工作中证明，任何肺癌筛查项目的成败取决于高危人群的识别，融合多重高危因素的风险预测模型已被世界公认是识别肺癌高危人群的方法之一。风险模型通过协助临床医生改进干预措施或治疗手段，从而进一步改善肺癌患者的疗效。虽然世界已经认同针对高危人群的筛查能够降低肺癌目前较高的死亡率，但高危人群界定仍然是难以解决的问题。为了使肺癌筛查的效益-伤害比达到最大化，关键的问题第一是如何界定高危患病风险的人群；第二是用什么方法对该人群进行筛查，包括高危因素的界定，总体风险的量化汇总以及筛查效益界值的选择。
随着技术的飞速发展，肿瘤标志物检测成为继影像学诊断，病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断，检测，治疗产生重大的影响。肿瘤标志物可以在体液或者是组织中检测到，能够反映肿瘤的存在，分化程度，预后估计和个性化用药以及治疗效果等。早期肺癌患者没有明显的症状，难以被医生和患者察觉，再加之其在血液或生化项目上没有明显的特异性的标识物，因此难以通过常规的诊断方法进行早期发现和早期诊断，因此对肺癌早期诊断，尤其是大规模应用人群筛查上较为困难。
越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过DNA核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖DNA序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成。基因的异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，并且在肿瘤逐步发展的过程中，基因异常甲基化的程度增加。对常见的98种人类原发肿瘤的基因组进行分析，发现每种肿瘤至少有600个异常甲基化的CpG岛。
许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。这些生物样品比较容易获得，并且通过PCR技术将其中的DNA进行大量的扩增后能够很灵敏的检测到，因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。与其它类型的肿瘤分子标记物相比，检测启动子异常甲基化有更多的优点。某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便；另外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。Esteller等检测了22例非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤组织和血清中p16、DAPK、GSTP1及MGM T等基因的启动子区异常甲基化状态，发现68％(15/22)的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化；而在15例组织阳性病例中，有11例同时在血清中也检测到了启动子异常甲基化的存在。另有许多研究者也分别从肝癌、头颈部癌、食管癌及结肠癌患者的肿瘤组织和血清中同时检测出了某些肿瘤相关基因的启动子甲基化。
现有的肺癌检测技术中主要存在灵敏度低、假阳性高，有创，并且，目前常规检测技术难以检出早期肺癌。
而肺癌的无创检测，例如，痰液检测，难度则更大。尽管也有研究者研究肺癌患者痰液中的肿瘤标志物，然而，对比起其他肿瘤患者血液样本的肿瘤标志物检测及评估，痰液样本的成功率却很低。这主要由于以下原因：①痰液的成分比较复杂，不同的人群在不同的疾病或者环境下痰液的成分和粘度等差异比较大；②痰液中含有较多的气管上皮细胞和细菌，口腔黏膜细胞等非肺癌细胞的成分，一般的样本处理方法无法有效的富集到数目充足的肺癌来源的DNA；③有很多的吸烟患者并不表现出咳痰。A J Hubers等人在《Molecularsputum analysis for the diagnosis of lung cancer》中对过去10篇文献研究显示，肺癌组织中标志物的中位数的甲基化程度为48％，而痰液的中位数的甲基化程度为38％，结果显示甲基化标志物在组织中的检出率明显高于痰液。同时，Rosalia Cirincione(Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancerpatientsdetected by spiral computed tomography:A nested case–contro)报道了RARbeta2、P16、RASSF1A在肺癌组织中检出率分别达到65.5％、41.4％、51.7％，而在痰液中分别只有44.4％、5％、5％。
目前肺癌的漏检率较高。特别是，对于腺癌这种类型，痰液无创检测更加是难上加难，检出率极其低。这是因为，多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌，肺深部的脱落细胞更加难以通过痰液咳出。因此，目前腺癌的痰液检测手段几乎为零。
降低漏检率在肿瘤早期筛查中是尤其重要的。如果一个肿瘤早期筛查产品无法将所有或绝大部分的病患筛查出来的话，那么漏检的那些将无法得到足够的风险提示，从而延误的治疗时机，这对患者来说是一个巨大的损失。
尽管现有技术中已经发现了一些肺癌相关的肿瘤标志物，但是，受限于针对这些肿瘤标志物的检测试剂或者检测手段，导致这些肿瘤标志物的灵敏度和特异性不能满足需求，因此，目前本领域中仍然需要进一步研究能够切实地应用于肺癌的筛查手段。然而，虽然无创式的筛查具有取样方面独到的优势，然而，其也具有其他方面的一些局限，例如，肺癌中的腺癌这种类型，由于其肺深部的脱落细胞难以通过痰液咳出，通常说来，本领域技术人员会认为该种类型的肺癌不适宜采用无创筛查。另一方面，即使是其他类型的肺癌，目前已报道的无创筛查方法也很难达到临床使用的要求。尽管相关研究已进展多年，但至今仍未有可以推向临床的肺癌无创筛查方法。
发明内容
一方面，本发明提供了如SEQ ID NO：4所示的核酸片段(下称“核酸片段”)在制备肺癌检测试剂或试剂盒中的应用。该“应用”包括了对SEQ ID NO：4所示的核酸片段中的任意一部分的应用，也就是说，SEQ ID NO：4所示的核酸片段中的任意一部分(例如，一段更小的片段)在制备肺癌检测试剂或试剂盒中的应用，均落入本申请的保护范围中。
一方面，本发明还提供了一种引物，所述的引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5所示序列，和它们互补序列中的至少任意一条。
在一些实施方案中，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：2所示的至少一对引物对。
在一些实施方案中，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。
一方面，本发明还提供了一种探针，所述的探针选自SEQ ID NO：3所示序列或其互补序列中的至少任意一条。
在一些实施方案中，所述探针选自SEQ ID NO：3所示的序列。
一方面，本发明还提供了上述的引物和/或者探针在制备肺癌检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明中的“检测”同诊断，除了肺癌的早期诊断，还包括结肺癌中期和晚期的诊断，且也包括肺癌筛选、风险评估、预后、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。
作为病症阶段可选的实施方式，可通过在肺癌在不同阶段或时期的进展可通过从样品中获取的所述核酸片段的甲基化程度的测量进行诊断。通过比较从肺癌的每个阶段的样品中分离出的所述核酸片段甲基化程度与从没有细胞增殖性异常的样品中分离出的一个或多个核酸中的所述核酸片段的甲基化程度，可检测样品中肺癌的具体阶段。
另一方面，本发明提供了一种肺癌检测试剂，该试剂含有SEQ ID NO：4所示的核酸片段的甲基化检测试剂。
“核酸片段的甲基化检测试剂”，包括以下内容：针对所述核酸片段序列或该核酸片段中的更小/短的任意序列进行检测的试剂。也就是说，任意针对所述核酸片段中的任意位点(例如，一段更小的片段)进行的检测及检测试剂，均落入本申请的保护范围中。
甲基化的发生是胞嘧啶上多了一个甲基，经过经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理后，胞嘧啶会变成脲嘧啶，因为在进行PCR扩增时尿嘧啶与胸腺嘧啶相似而会被识别为胸腺嘧啶，体现在PCR扩增序列上就是没有发生甲基化的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶(C变成T)，甲基化的胞嘧啶(C)则不会发生变化。PCR检测甲基化基因的技术通常为MSP，针对处理后的甲基化片段(即片段中未改变的C)设计引物，进行PCR扩增，如果有扩增则说明发生了甲基化，无扩增则没有甲基化。
在一些实施方案中，所述的甲基化检测试剂检测的是所述核酸片段经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。
在一些实施方案中，检测的是所述核酸片段经重亚硫酸氢盐修饰后的序列。
在一些实施方案中，所述甲基化检测试剂包括针对SEQ ID NO：4所示的核酸片段的甲基化检测的引物和/或探针。
在一些实施方案中，所述引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
I、具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及
II、如I所示序列的互补序列。
在一些实施方案中，所述引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
III、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；及
IV、如III所示序列的互补序列。
所述的引物用于扩增所述核酸片段。本领域公知，引物的成功设计对于PCR是至关重要。相对于一般的PCR，在甲基化检测中，引物的设计影响更为关键，这是由于甲硫化反应促使DNA链中的“C”转化为“U”，导致GC含量降低，使PCR反应后在序列中出现长的连续“T”，容易引起DNA链的断裂，导致很难选择具有合适的Tm值及稳定的引物；另一方面，为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的DNA，需要引物有足够数量的“C”，这些都增加了选择稳定引物的困难。因此，DNA甲基化检测中，引物所针对的扩增片段的选择，如扩增片段长短和位置，以及引物的选择等等都对检测的灵敏度和特异性产生影响。发明人经实验也发现，不同的扩增目的片段和引物对检测效果有所区别。很多时候，发现了某些基因或核酸片段在肿瘤和非肿瘤中具有表达差异，然而其距离转化为肿瘤的标志物，应用到临床中，仍存在很长的距离。其中最主要的原因是因为检测试剂的限制，导致该潜在肿瘤标志物的检测灵敏度和特异性难以满足检测需求，或者检测方法操作复杂、成本高，难以在临床中大规模应用。
在一些实施方案中，所述探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
V、具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；及
VI、如V所示序列的互补序列。
在一些实施方案中，所述的试剂含包括内参基因的检测试剂。
在一些实施方案中，所述的内参基因为β-actin。
在一些实施方案中，所述的内参基因的检测试剂为针对内参基因的引物和探针。
在一些实施方案中，所述的内参基因的检测试剂为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物对和SEQ ID NO：8所示的探针。
在一些实施方案中，所述的试剂还包括亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐中的至少一种，以对所述核酸片段进行修饰，当然可以不包括。
在一些实施方案中，所述的试剂含包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子、缓冲液中的一种或几种，优选包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液的PCR反应体系，用于对经修饰后的核酸片段的扩增。
本发明的检测/诊断试剂所检测的样品可以选自肺泡灌洗液、组织、胸水、痰液、血液、血清、血浆、尿液、***液或粪便中的至少一种。
在一些实施方案中，所述的样品选自肺泡灌洗液、组织、痰液中的至少一种。
在一些实施方案中，所述样品选自肺泡灌洗液或痰液中的至少一种。
一方面，本发明还提供了包含上述引物、或探针、或肺癌检测试剂的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物对；第二容器，其包含探针。
本发明的检测试剂针对的组织选自肺癌组织和癌旁正常组织(或者良性肺部疾病组织)。
在一些实施方案中，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。
一方面，本发明还提供了一种检测所述核酸片段甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；
(2)利用上述试剂或试剂盒对步骤(1)的经修饰的待测样品进行所述核酸片段甲基化情况检测；
作为优选的实施方式，步骤(2)中，采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行检测。
另一方面，本发明还提供了一种肺癌的检测***。所述的***含有：
(1)SEQ ID NO：4所示的核酸片段甲基化检测构件，以及，
(2)结果判断***；
在一些实施方案中，所述的甲基化检测构件含有上述检测试剂或试剂盒。
在一些实施方案中，所述的结果判断构件用于根据检测***检测的SEQ ID NO：4所示的核酸片段的甲基化结果，输出肺癌的患病风险和/或肺癌类型。
在一些实施方案中，所述的患病风险是根据通过结果判断比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。
在一些实施方案中，若所述核酸片段甲基化阳性，则表明待测样品的提供者为肺癌高危或肺癌患者。作为一种优选的实施方式，所述的阳性是指将所获得检测结果与正常样本的检测结果比较，当待测样本与正常样本的扩增结果具有显著或极显著的差异时，所述待测样本的供体呈阳性。
在一些实施方案中，所述判断***的判断标准包括：根据界值判断肺癌标本和正常标本。
在一些实施方案中，根据目标基因即核酸片段的Cp值和/或ΔCp值(ΔCp值＝Cp靶向基因-Cp内参基因)来判断标本的甲基化水平。
在一些实施方案中，标本中的Cp值的界值取值范围为35～39，ΔCp值的界值取值范围为4～12。
在一些实施方案中，组织标本中的ΔCp值的界值为6.5，痰液标本中的Cp值的界值为37.6，灌洗液标本中的ΔCp值的界值为10。
在一些实施方案中，所述组织和灌洗液标本的ΔCp值小于所述ΔCp值的界值则判断为肺癌标本，所述组织和灌洗液标本的ΔCp值大于等于所述ΔCp值的界值则判断为正常标本。所述痰液标本的Cp值小于所述Cp值的界值则判断为肺癌标本，所述痰液标本的Cp值大于等于所述Cp值的界值则判断为正常标本。
本发明的有益效果：
虽然，现有技术中，已经报道了一些基因标志物的甲基化可以作为肺癌的肿瘤标志物之一。然而，有关肺癌的肿瘤标志物的报道，不计其数，真正能够用于临床中，作为肺癌检测的标志物的却少之又少。本发明针对特定核酸片段的检测试剂对肺癌具有很高的灵敏度和特异性，十分有希望作为肺癌临床诊断的肿瘤标志物。
基于本发明的核酸片段以及检测试剂，才能使得肺癌在组织标本中能够达到特异性为97.8％，灵敏度71.8％的检出率。在最难检出的腺癌中，其特异性达到了97.8％，灵敏度达到了89.5％。
此外，本发明的核酸片段针对不同类型的肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌中的鳞癌、腺癌均具有很高的特异性和灵敏度，其适用范围广，基本上能作为所有肺癌的肿瘤标志物。而现有的用于临床的肺癌标志物，其一般仅能适用于一类肺癌的检测，如NSE用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，而CYFRA21-1是非小细胞肺癌的首选标记物。
本发明提供的针对特定核酸片段的检测试剂和方法能非常方便、准确地判断出肺癌和肺部良性疾病患者，该基因的检测方法有望转化为基因检测试剂盒，并服务于肺癌的筛查、临床检测和预后监测。
附图说明
图1为实施例1中核酸片段在组织标本中检测的ROC曲线；
图2为实施例2中核酸片段在痰液标本中检测的ROC曲线；
图3为实施例3中核酸片段灌洗液样本中检测的ROC曲线；
图4为实施例3中核酸片段的扩增曲线。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本申请中，“正常”样本指分离自已知无所述癌症或肿瘤的个体的相同类型的样本。
本申请甲基化检测的样本包括但不限于DNA，或RNA，或含mRNA的DNA和RNA样品、或DNA-RNA杂交体。其中DNA或者RNA可为单链或双链。
本申请中，“甲基化水平”同“甲基化程度”，通常可以表示为甲基化胞嘧啶的百分比，其为甲基化的胞嘧啶数量除以甲基化胞嘧啶的数量与未甲基化胞嘧啶数量的总和；以及目前普遍采用甲基化靶向基因数量除以内参基因数量的方法来表示甲基化水平；以及其他现有技术中甲基化水平表示方法。
本申请中“样本”同“标本”。
实施例1：
发明人筛选了数百个基因标志物及核酸片段，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应(real-timefluorescent quantitative methylation-specific PCR,qMSP)检测。在组织样本中进行筛选，以β-actin基因作为内参基因，最终经过筛选获得SEQ ID NO：4所示的核酸片段对肺癌的检测结果更好。将SEQ ID NO：4片段与常用的肺癌检测基因标志物(PCDHGA12、HOXD8)的检测效果进行比较，各基因检测引物探针如下：
核酸片段的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：1引物F：TCGTGTGTCGTCGTTCAGAC
SEQ ID NO：2引物R：GAAATACCCGCGAAAATACTG
SEQ ID NO：3探针P：FAM-AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG-BQ1
PCDHGA12的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：9PCDHGA12引物F：TTGGTTTTTACGGTTTTCGAC
SEQ ID NO：10PCDHGA12引物R：AAATTCTCCGAAACGCTCG
SEQ ID NO：11PCDHGA12探针P：FAM-ATTCGGTGCGTATAGGTATCGCGC-BQ1
HOXD8的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：12HOXD8引物F：TTAGTTTCGGCGCGTAGC
SEQ ID NO：13HOXD8引物R：CCTAAAACCGACGCGATCTA
SEQ ID NO：14HOXD8探针P：FAM-AAAACTTACGATCGTCTACCCTCCG-BQ1
β-actin的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：6β-actin引物F：GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT
SEQ ID NO：7β-actin引物R：CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA
SEQ ID NO：8β-actin探针P：FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1
实验过程：
1)提取DNA
收集确诊肺癌患者的标本和非肺癌患者的标本，分别包括石蜡组织标本、痰液标本、灌洗液标本。样品经过预处理及分离细胞后，按美基生物公司试剂盒HiPure FFPE DNAKit(D3126-03)说明书进行DNA提取。
2)DNA修饰
以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA MethylationTM KIT(D5002)说明进行重亚硫酸氢盐修饰。
3)扩增与检测
表1配液体系
Figure BDA0002522448990000091
扩增体系：扩增体系参见表2。
表2核酸片段和β-actin的扩增体系
Figure BDA0002522448990000092
Figure BDA0002522448990000101
表3 PCDHGA12和HOXD8的扩增体系
Figure BDA0002522448990000102
4)检测结果
样本信息：肺组织样本共计169例，其中正常组织样本91例，癌组织样本78例，78例癌症组样本中有鳞癌27例，腺癌38例，小细胞癌3例，大细胞癌4例，复合型癌1例，未明确分类的肺癌5例，其中癌和癌旁对照样本77对。
计算方法：
核酸片段：以ACTB作为内参基因，根据靶向基因即核酸片段的ΔCp值(ΔCp值＝Cp核酸片段-CpACTB)来判断标本的甲基化水平，核酸片段的阈值线为：ΔCp值＝6.5。当检测结果ΔCp值<6.5，则可判定为阳性，若检测结果ΔCp值≥6.5，则可判定为阴性。
PCDHGA12、HOXD8：PCDHGA12的阈值线为Cp值＝25.9，HOXD8的阈值线为Cp值＝27.4，当各标志物检测结果大于或等于对应的阈值线时则可判定为阴性；若标志物检测结果小于对应的阈值线则可判定为阳性。
根据此标准，核酸片段在所有组织标本中检测的ROC曲线图1所示。各基因在组织中检测的统计结果表3所示。
表3组织中的检测结果
Figure BDA0002522448990000103
从以上结果可以看出，在组织样本中，所述核酸片段在特异性为97.8％的情况下，灵敏度71.8％。本申请的核酸片段在组织样本中，在高特异性下，仍然具有较高的灵敏度。
痰液作为无创性的检测样本，在肺癌诊断上更具重要意义，为此，发明人对核酸片段在痰液中进行检测。
实施例2：在痰液样本中的检测
样本信息：测试痰液样本共计107例，其中正常对照组样本51例，癌症组对照样本56例，56例癌症组样本中有鳞癌20例，小细胞癌8例，腺癌20例，大细胞癌1例，巨细胞癌1例，未明确分类的肺癌6例。
试验过程：
本实施例中核酸片段的引物探针序列、β-actin的引物探针序列、DNA修饰与实施例1相同。
a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的痰液标本，使用NaOH解稠后，离心取沉淀分离细胞，使用PBS洗涤2遍，然后使用美基生物(Magen)公司的DNA提取试剂盒(HiPureFFPE DNA Kit，D3126-03)提取DNA。
b.配液体系如下：
表4配液体系
Figure BDA0002522448990000111
c.扩增体系如下：
表5核酸片段和β-actin的扩增体系
Figure BDA0002522448990000112
表6 PCDHGA12和HOXD8的扩增体系
Figure BDA0002522448990000113
Figure BDA0002522448990000121
d.检测结果如下：
核酸片段：以ACTB作为内参基因，根据靶向基因即核酸片段的Cp值来判断标本的甲基化水平，核酸片段的阈值线为：Cp值＝37.6。当检测结果Cp值<37.6，则可判定为阳性，若检测结果Cp值≥37.6，则可判定为阴性。
PCDHGA12、HOXD8：PCDHGA12的阈值线为Cp值＝23.48，HOXD8的阈值线为Cp值＝26.4，当各标志物检测结果大于或等于对应的阈值线时则可判定为阴性；若标志物检测结果小于对应的阈值线则可判定为阳性。
表7痰液中的检测结果
Figure BDA0002522448990000122
核酸片段在痰液标本中检测的ROC曲线见图2，统计结果见表7，从以上结果可以看出，在痰液样本中，在特异性达到94.1％的情况下，所述核酸片段对全部肺癌的检出率可达到60.7％。尤其是对于小细胞癌，在特异性94.1％的情况，灵敏度高达100％。
实施例3：在灌洗液中的检测
样本信息：测试肺泡灌洗液样本共计176例，其中正常对照组样本94例，癌症组对照样本82例，82例癌症组样本中有鳞癌20例，腺癌40例，小细胞癌9例，未明确肺癌类型13例。各基因检测引物探针如下：
核酸片段的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：1引物F：TCGTGTGTCGTCGTTCAGAC
SEQ ID NO：2引物R：GAAATACCCGCGAAAATACTG
SEQ ID NO：3探针P：FAM-AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG-BQ1
β-actin的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：6β-actin引物F：GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT
SEQ ID NO：7β-actin引物R：CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA
SEQ ID NO：8β-actin探针P：Texas Red-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ2
试验过程：
a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的肺泡灌洗液标本，离心分离细胞，然后使用美基生物公司的DNA提取试剂盒(HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03)提取DNA。
b.使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation Kit，D5002)进行DNA的重亚硫酸氢盐修饰。
c.扩增检测体系如下：
表8扩增体系
Figure BDA0002522448990000131
d.检测体系如下：
表9扩增体系
Figure BDA0002522448990000132
e.检测结果如下：
以ACTB作为内参基因，根据靶向基因即核酸片段的ΔCp值(ΔCp值＝Cp核酸片段-CpACTB)来判断标本的甲基化水平，核酸片段的阈值线为：ΔCp值＝10。当检测结果ΔCp值<10，则可判定为阳性，若检测结果ΔCp值≥10，则可判定为阴性。176例灌洗液标本的检测结果如下：
表10检测结果
Figure BDA0002522448990000133
核酸片段在灌洗液样本中检测的ROC曲线见图3，扩增曲线见图4，统计结果见表10。从以上结果可以看出，核酸片段检测在95.7％的高特异性下，灵敏度达到64.6％；特别是对腺癌的检测效果，核酸片段的检测灵敏性高达到72.5％。这一突破对腺癌的检测具有重大的意义，因为腺癌一般为周围型，由于支气管的树状生理结构，肺泡灌洗液不容易接触到肺深部的肺泡或者癌组织。
实施例4引物探针对检测效果的影响
引物和探针也对肿瘤标志物的检测效果有极大的影响，发明人在研究过程中，设计了多对引物及其对应的探针，以寻找到尽可能提高检测灵敏度和特异性的探针和引物，以使本发明的检测试剂能够实际应用到临床检测中。部分引物和探针如下表11所示，检测结果如表11所示。
表11引物和探针
Figure BDA0002522448990000141
各配液体系均一致，配液体系同表4；各扩增程序均一致，扩增程序同表5。
在40例痰液样本对不同引物探针组合进行检测，其中正常对照组样本15例，癌症组对照样本25例，各组引物探针检测结果如下：
表12在痰液样本中的检测结果(正常组vs.全部癌症组)
组别 特异性 灵敏性
F1，R1，P1 93.3％ 56.0％
F2，R1，P1 93.3％ 52.0％
结果表明针对同一区域的不同引物对，对检测结果会产生影响。在特异性一致的情况下，F1，R1，P1的引物和探针组合有更高的灵敏性。
序列表
<110> 广州市康立明生物科技有限责任公司
<120> 一种肺癌检测试剂及试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtgtgtcg tcgttcagac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaatacccg cgaaaatact g 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttttacgt tggagaagcg tcgg 24
<210> 4
<211> 851
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ccccgtcaca cgctctcgat ttccggactg caggcagagg tctgggggcc aagcccccac 60
ccccttcctc cccaggctcc agaaaaggcc aaccagagcc actgccctgg agggacaact 120
ccccaactcc tccccttctt ccctctctgc tccagatgcc tcccagagtt ggaatgagcc 180
tggggacacg gagcacgggg tcagacctcc tcccctgccc gctggccgcg gccgcagccg 240
cagccgcagc cgggagccca ctcacctgct ctcgcatcct gtcctgctgg cctcgcaggg 300
ccagggcgtg ctgtgggtac ttgctcttca ggtggtccat gaaggcatca cgcttgcggt 360
cggcgtccgc cttctggagc ccgctgagcg cctccagact ctgggccgcg atcaccgtgt 420
gccgccgctc ggacgtgtgc accagcccca cgttggagaa gcgccggccc ccgctgcccc 480
cgccgccccc gccccccagg gtccggtact cccgcgggta ctccgcatcg tccgcagaca 540
gcatgggggg gctgctccgc tccggatctg cgagaggtga gaggggcacg gctgggtcac 600
ggcgcgcccg gcctggggct gcccatcccc caagggggtc cctgcgggaa ggggcggggc 660
ctgggcctaa ggagagtgga gaggcgcccg gggagaggca ggggctgccc agcaccccac 720
tagggactga agggggaagt gcgtggatgg cgtggaaagc gcgcctacgg cccctaggga 780
ggggtgagga acaagggctg gatactccct gttcctccgt gggtttggag cgataatgac 840
cgcgggggtg c 851
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatcgtgtat cgtcgttcgg ac 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaggtttag taagtttttt ggatt 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caataaaacc tactcctccc tta 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgtgtgttg ggtggtggtt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggttttta cggttttcga c 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaattctccg aaacgctcg 19
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attcggtgcg tataggtatc gcgc 24
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttagtttcgg cgcgtagc 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctaaaaccg acgcgatcta 20
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaacttacg atcgtctacc ctccg 25

Claims (21)

1.一种引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：2所示的至少一对引物对。
2.如权利要求1所述的引物，所述引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。
3.如权利要求1-2任一所述的引物在制备肺癌检测试剂或试剂盒中的应用。
4.如SEQ ID NO：4所示的核酸片段的甲基化检测试剂在制备肺癌检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述甲基化检测试剂含有引物对，所述引物对选自SEQ ID NO：1和SEQID NO：2，及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：2所示的至少一对引物对。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述甲基化检测试剂还含有探针。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述探针为选自SEQ ID NO：3，和其互补序列中的至少任意一条。
7.如权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
8.如权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述的肺癌选自非小细胞肺癌，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。
9.一种肺癌检测试剂，其特征在于，所述的试剂含有SEQ ID NO：4所示的核酸片段的甲基化检测试剂，所述甲基化检测试剂含有引物对，所述引物对选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：2所示的至少一对引物对。
10.如权利要求9所述的肺癌检测试剂，其特征在于，所述的甲基化的检测试剂还包括针对SEQ ID NO：4所示的核酸片段的甲基化检测的探针；
所述探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；及其互补序列。
11.如权利要求9所述的肺癌检测试剂，其特征在于，所述的试剂的检测样品选自肺泡灌洗液、痰液、组织中的至少一种。
12.如权利要求9所述的肺癌检测试剂，其特征在于，所述的试剂的检测样品选自肺泡灌洗液或痰液中的至少一种。
13.如权利要求9所述的肺癌检测试剂，其特征在于，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
14.如权利要求9所述的肺癌检测试剂，其特征在于，所述的肺癌选自非小细胞肺癌，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。
15.一种包含权利要求1或2所述的引物、或权利要求9-12任一所述肺癌检测试剂的试剂盒。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物；第二容器，其包含探针。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
18.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述的肺癌选自非小细胞肺癌，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。
19.一种肺癌的检测***，其特征在于，所述的***含有：
a. SEQ ID NO：4所示的核酸片段甲基化检测构件，以及，
b.结果判断***；
所述的甲基化检测构件含有权利要求9-12任一所述的检测试剂或权利要求15所述的试剂盒。
20.如权利要求19所述的检测***，其特征在于，所述的结果判断构件用于根据检测***检测的SEQ ID NO：4所示的核酸片段甲基化结果，输出肺癌的患病风险和/或肺癌类型。
21.如权利要求20所述的检测***，其特征在于，所述的患病风险是根据通过结果比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。
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Estrogen and xenoestrogens in breast cancer;Fernandez SV等;《Toxicol Pathol》;20100121;第38卷(第1期);全文 *
MicroRNA-510 Plays Oncogenic Roles in Non-Small Cell Lung Cancer by Directly Targeting SRC Kinase Signaling Inhibitor 1;Wei Wu等;《Oncol Res》;20190808;第27卷(第8期);全文 *
miR-150 promotes the proliferation and migration of lung cancer cells by targeting SRC kinase signalling inhibitor 1;Cao M等;《Eur J Cancer》;20140330;第50卷(第5期);第884页右栏最后1段，第885页左栏第1段 *
Sandra V Fernandez等.DNA methylation changes in a human cell model of breast cancer progression.《Mutat Res》.2010,第688卷(第1-2期),第28-35页. *

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Applicant after: Guangzhou kangliming Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 510530 6th floor, building A2, No. 11, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant before: CREATIVE BIOSCIENCES (GUANGZHOU) Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
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