TWI548649B - 中和性催乳激素受體抗體Ｍａｔ３及其治療用途 - Google Patents

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Description

中和性催乳激素受體抗體Mat3及其治療用途
本發明係關於催乳激素受體抗體Mat3且提供抗體Mat3之特異性結合並中和催乳激素受體之重組抗原結合區及含有此等抗原結合區之功能片段、編碼上述抗體之核酸序列、含有其之載體、含有其之醫藥組合物及其在治療或預防子宮內膜異位症及自催乳激素受體介導之信號傳導之抑制受益之其他疾病中的用途。
催乳激素(PRL)係由199個胺基酸構成之多肽激素。PRL屬於多肽激素之胎盤催乳激素(PL)家族生長激素(GH)且係在垂體之催乳激素細胞中及在若干垂體外組織(例如淋巴球、乳腺上皮細胞、子宮肌層及***)中合成。兩種不同啟動子調控垂體及垂體外PRL合成(BioEssays 28：1051-1055,2006)。
PRL結合至PRL受體(PRLR)，即屬於1類細胞介素受體超家族之單一跨膜受體(Endocrine Reviews 19：225-268,1998)。PRLR以3種不同亞型存在，即可藉由細胞質尾之長度區別之短型、長型及中間型。在配體結合後，依序過程導致PRLR活化。PRL經由其結合位點1與一個PRLR分子相互作用且隨後經由其結合位點2與第二受體分子相互作用，從而產生PRLR之活性二聚物。PRLR二聚化主要使JAK/STAT(Janus激酶/轉錄信號轉導子及活化子)途徑活化。在受體二聚化後，與受體締合之JAK(主要為JAK2)彼 此轉磷酸化並活化。另外，PRLR亦經磷酸化且可結合至含有SH2-結構域之蛋白質，例如STAT。結合受體之STAT隨後經磷酸化，自該受體解離並轉移至細胞核，其中其刺激靶基因之轉錄。另外，已闡述PRLR對Ras-Raf-MAPK途徑之活化及對細胞質src激酶之活化(評論見Endocrine Reviews 19：225-268,1998)。
由PRLR介導之信號傳導在諸如以下等多種過程中發揮作用：乳腺發育、泌乳、繁殖、乳腺及***腫瘤生長、自體免疫疾病、一般生長及代謝及免疫調節(Endocrine Reviews 19：225-268,1998；Annu.Rev.Physiol.64：47-67,2002)。
當前，除藉由使用溴隱亭(bromocriptine)及其他多巴胺受體2激動劑抑制垂體PRL分泌外，沒有可用藥劑能夠完全干擾由PRLR介導之信號傳導(Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism2(10)：571-581,2006)。然而，該等藥劑不會抑制可順利地補償對垂體PRL合成之抑制的垂體外PRL合成，從而幾乎不損害由PRLR介導之信號傳導(Endocrine Reviews 19：225-268,1998)。因此，儘管催乳激素與乳癌或自體免疫疾病(例如全身性狼瘡或類風濕性關節炎)有關，但多巴胺型2受體激動劑無益於罹患該等疾病之患者不足為奇(Breast Cancer Res.Treat.14：289-29,1989；Lupus 7：414-419,1998)。多巴胺受體激動劑不會阻斷乳癌細胞或淋巴球中分別在乳癌或自體免疫疾病中發揮關鍵作用之局部催乳激素合成。
結合至PRLR之乳癌診斷用抗體首先闡述於WO 2003/004989(Millenium Pharmaceuticals)中。在該WO03/004989中，將在若干***腫瘤組織中過表現之眾多基因及對應蛋白質(包括PRLR)視為早期檢測惡性腫瘤之適宜標記物。在WO03/008583中，集中針對淋巴瘤及白血病闡述癌相關基因及蛋白質(包括PRLR)。
此外，在WO 2006/110585(Novartis)中，闡述作為癌標記物之PRLR過表現及PRLR特異性抗體用於診斷及治療乳癌及其他癌症類型(肺癌、***癌及皮膚癌)之用途。此時，基於兩個實驗證據主張具有拮抗活性之單株抗體：a)PRLR特異性siRNA阻斷乳癌MCF7細胞中之PRLR表現會抑制該等細胞之增殖且b)催乳激素誘導諸如T47D等乳癌細胞中之STAT5及MAPK磷酸化。然而，既未提供單株抗體實際上抑制乳癌細胞系增殖之任何證據，亦未揭示任何具體抗體。
PRLR拮抗劑順利地干擾乳癌發育之第一活體內概念證明已公開於1988年。在DMBA小鼠***腫瘤模型中，單株PRLR抗體可降低***腫瘤之發生率(Am J Pathol 133：589-595,1988)。
主張用於預防及治療乳癌之第一PRLR抗體闡述於US 2007/0269438(Biogen)中。5個雜交瘤細胞系之表現產物(抗體)係藉由其緊密結合乳癌細胞系T47D及MCF7及阻斷由PRL介導之信號傳導(STAT5-、MAPK-、AKT-磷酸化)之能力來闡述。然而，尚未揭示活體內概念證明。此外，除 最先知識外尚未對以下聲明提供任何證據：尤其在患者之癌症變得具有抗***獨立性後，可向該患者投與抗PRLR抗體。
第二組單株PRLR特異性抗體與所揭示一級序列一起闡述於WO 2008/022295(Novartis)中。儘管該等抗體主張為用於乳癌、肺癌及***之治療劑，但使用淋巴瘤模型來顯示該等藥劑之活體內抗增殖效應。
另一方面，源自催乳激素且帶有N末端缺失及點突變之肽能PRLR拮抗劑(例如δ1-9G129R催乳激素)亦表現為PRLR拮抗劑，然而，其與催乳激素相比半衰期(15-20 min)縮短且效能較低(Pituitary 6：89-95,2003)。因此，中和性PRLR抗體尤其在抑制在乳癌及***癌症中發揮作用之自分泌催乳激素信號傳導增強方面極佳。
亦研究由PRLR介導之信號傳導在良性疾病子宮內膜異位症之情形下之作用。在一個研究中，在月經週期之中後期增殖階段期間分析PRLR在子宮內膜異位症患者之子宮內膜異位試樣及正位性子宮內膜中之表現模式(Acta Obstet Gynecol Scand 81：5-10,2002)。據顯示，79%所分析子宮內膜異位症患者之正位性子宮內膜中存在PRLR mRNA，而86%子宮內膜異位症患者之子宮內膜異位病灶中不存在PRLR mRNA。該等數據表明，在正常組織與子宮內膜異位組織之間可能存在PRLR表現之差別調控。然而，自該等表現數據不能推斷，PRLR之抑制可能代表適宜子宮內膜異位症療法，尤其由於未發現PRLR在子宮內 膜異位病灶中表現(Acta Obstet Gynecol Scand 81：5-10,2002)。
總之，儘管由PRLR介導之信號傳導在多種過程中發揮作用，但已揭示極少且部分矛盾之結果顯示PRLR拮抗作用對於包括子宮內膜異位症在內之多數良性疾病之治療價值。
已公開許多數據指示PRLR可在乳癌中發揮決定性作用。且在概念上，有效PRLR拮抗劑可係顯示PRLR抑制對於乳癌之治療價值的適當藥劑。然而，迄今為止對於以下情形尚未提供任何活體內概念證明：PRLR阻斷實際上抑制腫瘤生長(不包括淋巴瘤治療及乳癌發育之抑制)且此外拮抗性PRLR抗體可用於治療自PRLR信號傳導阻斷受益之良性疾病。因此，當前可用抗體不能用於允許臨床前概念證明研究之預測模型。
需要以下抗體：以高親和力結合至人類、猴及小鼠中之PRLR而不會競爭性地結合至PRL且此方式中和所有3種物種中由PRLR介導之信號傳導，且允許在小鼠中以及亦在猴中以合理劑量實施臨床前概念證明研究。
因此，本發明之潛在問題在於提供以下新穎PRLR抗體：可用於允許臨床前概念證明研究之預測模型且可用於治療自催乳激素受體信號傳導阻斷受益之疾病。
該問題可藉由提供新穎抗體Mat3來解決。
現已發現，與彼等如WO 2008/022295中所揭示非競爭性地結合至諸如HE06642等PRL之抗體相比，該抗體在生物 化學以及細胞結合研究中對人類、猴及小鼠中之PRLR具有令人驚奇之特異性且具有高親和力而不會競爭性地結合至PRL，且此方式中和所有3種物種中由PRLR介導之信號傳導。以此方法，該抗體使得能夠在小鼠中以及亦在猴中以合理劑量實施臨床前概念證明研究。此外，現已發現，與彼等如WO 2008/022295中所揭示非競爭性地結合至諸如HE06642等PRL之抗體相比，該抗體可因有效性更高且與人類種系序列關係更密切而向個體遞送治療益處且因此提供改良副效應剖面之機會，即，因劑量減少及與人類種系序列之相似性增加而降低免疫原性之風險。
新穎Mat3抗體較佳與來自不同物種之PRLR交叉反應，該等物種係(例如)恒河猴(Macaca mulatta,rhesus monkey)及食蟹獼猴(Macaca fascicularis,cynomolgus)、家鼷鼠(Mus musculus)(小鼠)及智人(人類)。本文之交叉反應性意指該抗體與人類、猴及小鼠PRLR之親和力(KD值)及細胞結合EC50值低於10×10-9 M(參見表1，實例9、10、13及14)且增殖抑制IC50值低於20×10-9 M(參見實例1至3)。本發明係基於對可向個體遞送治療益處之新穎抗體Mat3之發現(新穎抗體之序列係如SEQ ID NO：1-10中所示)。本發明抗體最佳可為與人類種系序列具有極密切關係之完全人類抗體或可為其帶有完全人類形式之CDR之人類化或嵌合或人類改造變體，其可用於較全面地闡述於本文中之許多情形中。
為顯示該抗體相對於WO 2008/022295之經最深刻表徵的 非競爭性地結合至PRL之已知抗體在效能及人類-猴-小鼠交叉反應性上的優越性，已在活體外增殖研究中比較該抗體與WO 2008/022295之HE06642(實例1-3)。本文提及之HE06642或HE06.642或06.642含有可變結構域SEQ ID NO：14及15，其與WO 2008/022295中之he06.642-2之序列一致。
在若干細胞系統中表徵抗體Mat3，以確定其在涉及PRLR介導之信號傳導之失活及增殖之不同讀出範式中之物種特異性及其效能以及功效。在經人類PRLR(實例1)、鼠類PRLR(實例2)或恒河猴PRLR(實例3)穩定轉染之Ba/F細胞系中實施增殖分析。抗體Mat3完全抑制攜帶有人類、鼠類及恒河猴PRLR之細胞之增殖(實例1-3)。與Mat3相比，抗體HE06642(WO 2008/022295)對攜帶有鼠類PRLR之細胞無活性且顯示對恒河猴PRLR-細胞之活性顯著降低。抗體Mat3亦比抗體HE06.642對人類PRLR更有效。亦有證據表明，Mat3以高於HE06422之效能抑制大鼠NB2淋巴瘤細胞增殖。除細胞增殖分析外，亦使用經人類或鼠類PRLR(實例12)穩定轉染且經在LHRE(催乳激素反應元件)控制下之螢光素酶報告子基因瞬時轉染之HEK293細胞系實施螢光素酶報告子分析。使用該等系統可證實，依賴於由PRLR介導之信號傳導之啟動子係在Mat3存在下關閉。抗體HE06.642不能有效地阻斷由鼠類PRLR介導之信號傳導再次變得顯而易見。
總之，因此，抗體Mat3適於在鼠類及猴模型中測試對由 PRLR介導之信號傳導之抑制。
該抗體比HE06642含有與經轉譯人類種系V-基因更相似之可變結構域。圖6顯示，VH結構域及VL結構域各自與經轉譯人類種系重鏈V及λ輕鏈V基因90%一致[VBASE2數據庫；Retter I,Althaus HH,Münch R,Müller W：VBASE2,an integrative V gene database.Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(數據庫專刊)：D671-4]。HE06642展現與VBASE2中發現之最相似轉譯VH種系序列具有89%一致性且與最相似轉譯種系輕鏈V序列僅具有80%一致性。當用Mat3治療患者時，此發現提供具有較低免疫原性風險之機會。
Mat3及HE06642與人類、猴及小鼠PRLR之細胞外結構域之結合研究指示，兩種抗體均與該等經純化結構域相互作用(參見下文，實例10及表1)。然而，當使該等結構域暴露於細胞表面上時，可觀察到Mat3與HE06642之間之較顯著差異。最突出地，當Ba/F細胞表現鼠類PRLR時，HE06642不結合此受體，而Mat3結合此受體(表2及圖5及實例9)。此發現與以下觀察一致：與HE06642相比，Mat3阻斷由鼠類PRLR介導之信號傳導及增殖。當將人類PRLR之細胞外結構域純化且暴露於細胞表面上時，對結合Mat3及HE06642之細胞外結構域進行肽掃描，顯示Mat3結合至子結構域S2(實例11)，例如如先前針對HE06642所報導(WO 2008/022295)。此掃描另外顯示，Mat3與HE06642之間在與S2結構域之結合上存在差異(圖8)。最近已公開，藉由此一肽掃描所觀察抗體之不同結合使得能夠解釋抗體性質 之差異(Niederfellner等人，Blood.2011年3月28日.doi：10.1182/blood-2010-09-305847)。總之，肽掃描結果指示，抗體Mat3顯示與HE06642相比具有不同物種特異性及效能之原因。
本發明提供表5之人類單株抗體Mat3(SEQ ID NO.1-10)或其抗原結合片段，其拮抗由催乳激素受體介導之信號傳導。該抗體特異性地結合至PRLR之細胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO：12)或SEQ ID No：12之人類多型變體，例如闡述於PNAS 105(38),14533,2008及J.Clin.Endocrinol.Metab.95(1),271,2010中之I146L及I76V變體。此外，該抗體特異性地結合至恒河猴及食蟹獼猴PRLR之細胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO：11)以及鼠類PRLR之細胞外結構域(ECD)(SEQ ID NO：13)。
在一個實施例中揭示拮抗由催乳激素受體介導之信號傳導之人類抗體Mat3或其人類化、人類改造或嵌合抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含對應於核酸序列SEQ ID NO：3及胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈可變區以及對應於核酸序列SEQ ID NO：4及胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含如上文所述抗體之CDRs，其中可變重鏈含有對應於SEQ ID NO：5、6及7之CDR序列 且可變輕鏈含有對應於SEQ ID NO：8、9及10之CDR序列。
在本發明之另一實施例中，抗體Mat3係由抗原結合區組成，該抗原結合區特異性地結合至人類、猴及小鼠之PRLR之細胞外結構域的一或多個區，且其中人類PRLR之胺基酸序列係藉由以下來繪示：SEQ ID NO：12之1至210位及SEQ ID NO：12之人類多型變體的胺基酸序列、猴PRLR SEQ ID NO：11及小鼠PRLR SEQ ID NO：13之1至210位的胺基酸序列。
在本發明之另一實施例中，Mat3係由抗原結合區組成，其中與人類、猴及小鼠之PRLR之細胞外結構域的親和力係至少100 nM、較佳小於約100 nM、更佳小於約30 nM、甚至更佳小於約10 nM。
在另一實施例中，抗體Mat3係由抗原結合區組成，該抗原結合區特異性地結合至人類PRLR之細胞外結構域之一或多個區且其中親和力係至少10 nM、更佳小於約1 nM。
此外，本發明目標係上述Mat3，其中重鏈恆定結構域確定經修飾或未經修飾IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
表1提供本發明抗體Mat3之解離常數(親和力)及解離速率之匯總，如藉由表面電漿共振(Biacore)在直接固定抗體上利用人類PRLR之單體細胞外結構域(胺基酸1至210)(SEQ ID NO：12)、恒河猴及食蟹獼猴PRLR之單體細胞外結構域(胺基酸1至210)(SEQ ID NO：11，其中已藉由蛋白水解因子Xa消化去除Fc-His融合物)及鼠類PRLR之單 體細胞外結構域(胺基酸1至210)(SEQ ID NO：13)所測定(實例10)。
針對WO 2008/022295中之HE06642所揭示之親和力係2.6×10-9 M(在人類PRLR之細胞外結構域上)、38.9×10-9 M(在食蟹獼猴PRLR之對應結構域上)及2.7×10-9 M(在鼠類PRLR之對應結構域上)。
抗體Mat3之基於細胞之親和力係藉由螢光活化細胞分選(FACS)組合Scatchard分析來測定(實例9)。
表2表示呈人類IgG2分子之Mat3對分別經人類及恒河猴PRLR穩定轉染之HEK293細胞系之結合強度。
抗體產生
為分離一組能夠在功能上阻斷人類及鼠類PRLR之抗體，平行研究稱為n-CoDeR®(來自Bioinvent)之合成人類抗體噬菌體展示文庫之分別表現scFv及Fab片段的兩種模式(Söderlind等人2000,Nature BioTechnology.18,852-856)。用於scFv或Fab選擇之靶係人類PRLR之可溶性ECD(SEQ ID NO.12之胺基酸位置1至210)及小鼠PRLR之可溶性ECD(SEQ ID NO：13之胺基酸位置1至210)，其係以生物素化(NHS-LC生物素，Pierce)及非生物素化變體以及表現PRLR人類乳癌細胞系T47D形式應用。
使用噬菌體展示技術(PDT)中各種方法之組合藉由蛋白質與全細胞淘選之組合且經由研發特定工具來分離高親和力、PRLR特異性、人類單株抗體。淘選工具及篩選方法包括人類及小鼠PRLR與Fc結構域融合重組表現之ECD(R&D Systems，目錄編號分別為1167-PR及1309-PR；SEQ ID NO：12及13之分別1-216位，各自融合至人類IgG1 Fc結構域，即人類IgG1之100至330位)、人類PRLR與6-組胺酸標籤融合重組表現之細胞外結構域(SEQ ID NO：12)、各自分別經人類及鼠類PRLR穩定轉染之HEK293及鼠類淋巴瘤細胞系Ba/F、及各自天然表現PRLR之乳癌細胞系T47D及大鼠淋巴瘤細胞Nb2以及研發能夠鑑別中和性抗體之淘選程序及篩選分析，該等中和性抗體優先結合至展示於細胞表面上之PRLR且與小鼠之PRLR交叉反應。
藉由在ELISA測試中使用重組表現抗原首先鑑別與人類PRLR之結合物且最終鑑別與小鼠PRLR之結合物來實施篩 選。該等具體方法之組合允許尤其分離抗體「005-C04」。
藉由「005-C04」在人類PRLR及鼠類PRLR之細胞外結構域上之親和力成熟，根據實例8中所述程序鑑別有益取代。最後，評估有益於改良親和力之個別取代對抗體之熱穩定性的影響。尤其應確保在成熟抗體變性(例如藉由溫度升高)期間協作展開Fab結構域(關於協作展開之參考文獻：Roethlisberger,D.等人，J.Mol.Biol.2005：347,773-789)。抗體Mat3源自上述抗體發現及成熟方法。
肽變體
本發明抗體不限於本文提供的具體肽序列。而是，本發明亦涵蓋該等多肽之變體。參考本發明及以習用方式獲得之技術及參考文獻，熟習此項技術者應能夠製備、測試並利用本文所揭示抗體之功能變體，同時瞭解能夠結合並在功能上阻斷PRLR之變體屬於本發明範圍。
變體可包括(例如)與本文所揭示之肽序列相比具有至少一個經改變互補決定區(CDR)(超變)及/或框架(FR)(可變)結構域/位置之抗體。為較佳地闡釋此概念，以下簡要說明抗體結構。
抗體係由兩條肽鏈構成，每條含有一個(輕鏈)或3個(重鏈)恆定結構域及可變區(VL、VH)，其中後者在每一情況下均由4個FR區(VH：HFR1、HFR2、HFR3、HFR4；VL：LFR1、LFR2、LFR3、LFR4)及3個間隔開之CDR(VL：LCDR1、LCDR2、LCDR3；VH：HCDR1、HCDR2、HCDR3)構成。抗原結合位點係由一或多個CDR形成，而 FR區為CDR提供結構框架且在抗原結合中發揮重要作用。藉由改變CDR或FR區中之一或多個胺基酸殘基，熟習此項技術者可以常規方式產生經突變或多樣化之抗體序列，例如，可就新性質或改良性質針對抗原來篩選該等抗體序列。
圖4提供對可變結構域VL及VH中每一胺基酸位置進行編號之方案。表3(VH)及表4(VL)描繪本發明抗體Mat3之CDR區並比較給定位置處之胺基酸與對應共有或「主控基因」序列，其中用「X」標記CDR區。表5及6有助於將SEQ ID編號分配至本發明中提供之抗體、抗體片段及PRLR變體。
熟習此項技術者可使用表3、4及5中之數據來設計在本發明範圍內之肽變體。較佳地，藉由改變一或多個CDR區內之胺基酸來構築變體；變體亦可具有一或多個經改變框架區(FR)。例如，可在與種系序列相比存在殘基偏差之處對肽FR結構域實施改變。
此外，可藉由以下方式獲得變體：成熟，即使用一種抗體作為起始點用以藉由使該抗體中之一或多個胺基酸殘基(較佳為一或多個CDR中之胺基酸殘基)多樣化來進行最佳化並從所得抗體變體收集物中篩選出具有改良性質之變體。尤佳係使VL之LCDR3、VH之HCDR3、VL之LCDR1及/或VH之HCDR2中之一或多個胺基酸殘基多樣化。可藉由使用三核苷酸誘變(TRIM)技術合成DNA分子收集物來進行多樣化[Virnekäs,B.,Ge,L.,Plückthun,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.及Moroney S.E.(1994)Trinucleotide phosphoramidites：ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.Nucl.Acids Res.22,5600；亦參見實例8]。
保守胺基酸變體
可製備保留本文所述抗體肽序列整個分子結構之多肽變體。鑒於個別胺基酸之性質，熟習此項技術者會認可一些合理取代。例如，胺基酸取代(即「保守取代」)可基於所涉及殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性性質方面之相似性實施。
例如，(a)非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺 酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、***酸、色胺酸及甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；(c)帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；及(d)帶負電(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。取代通常可在(a)至(d)群組內進行。另外，甘胺酸及脯胺酸可根據其破壞α螺旋之能力彼此取代。同樣，某些胺基酸(例如丙胺酸、半胱胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸及離胺酸)更常見於α螺旋中，而纈胺酸、異白胺酸、***酸、酪胺酸、色胺酸及蘇胺酸更常見於β摺疊片中。甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺及脯胺酸常見於轉角中。一些較佳取代可在以下基團中進行：(i)S與T；(ii)P與G；及(iii)A、V、L與I。若已知遺傳密碼及重組及合成DNA技術，則可容易地構築編碼保守胺基酸變體之DNA。
本文所用兩個多肽序列間之「序列一致性」指示該等序列間一致胺基酸之百分比。「序列同源性」指示一致或代表保守胺基酸取代之胺基酸之百分比。本發明之較佳多肽序列含有胺基酸序列，其中a. HCDR1之胺基酸序列與SEQ ID NO：5至少在8個胺基酸中有7個一致，且b. HCDR2之胺基酸序列與SEQ ID NO：6至少在19個胺基酸中有14個、更佳19個胺基酸中有15個、更佳19個胺基酸中有16個、更佳19個胺基酸中有17個或甚 至更佳19個胺基酸中有18個一致，且c. HCDR3之胺基酸序列與SEQ ID NO：7至少在11個胺基酸中有8個、更佳11個胺基酸中有9個或甚至更佳11個胺基酸中有10個一致，且d. LCDR1之胺基酸序列與SEQ ID NO：8至少在14個胺基酸中有12個或更佳14個胺基酸中有13個一致，且e. LCDR2之胺基酸序列與SEQ ID NO：9至少在7個胺基酸中有4個、更佳7個胺基酸中有5個或甚至更佳7個胺基酸中有6個一致，且f. LCR3之胺基酸序列與SEQ ID NO：10至少在12個胺基酸中有11個一致。
本發明DNA分子
本發明亦係關於編碼本發明抗體之DNA分子。該等序列包括(但不限於)彼等在SEQ ID NO 3及4中所述之DNA分子。
本發明DNA分子並不限於本文所揭示之序列，且亦包括其變體。屬於本發明內之DNA變體可參考其在雜交方面之物理性質加以闡述。熟習此項技術者應認識到，可使用核酸雜交技術利用DNA鑑別其補體及其等效物或同系物(因DNA為雙鏈)。亦應認識到，可在互補性低於100%時發生雜交。然而，鑒於適當選擇之條件，可利用雜交技術根據DNA序列與特定探針之結構相關性來區分DNA序列。有關此等條件之指南參見Sambrook等人，1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)]及Ausubel等人，1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.及Struhl,K.編輯(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons]。
兩個多核苷酸序列之間之結構相似性可表示成兩個序列可彼此雜交之條件之「嚴格性」的函數。本文所用術語「嚴格性」係指條件不利於雜交之程度。嚴格條件極不利於雜交，且僅結構上最密切之分子會在此等條件下彼此雜交。相反，非嚴格條件有利於展示較低程度結構相關性之分子進行雜交。因此，雜交嚴格性與兩個核酸序列之結構關係直接相關。以下關係可用於使雜交與相關性相關聯(其中Tm係核酸雙鏈體之解鏈溫度)：
a. Tm=69.3+0.41(G+C)%
b.不匹配鹼基對之數目每增加1%，雙鏈體DNA之Tm降低1℃。
c.(Tm)μ2-(Tm)μ1=18.5 log10μ2/μ1
其中μ1及μ2係兩種溶液之離子強度。
雜交嚴格性隨多種因素而變化，包括總體DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小及破壞氫鍵之試劑之存在。促進雜交之因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長探針大小及不存在破壞氫鍵之試劑。雜交通常分兩個階段實施：「結合」階段及「洗滌」階段。
首先，在結合階段探針在有利雜交之條件下與靶結合。 在此階段通常通過改變溫度來控制嚴格性。對於高嚴格性而言，除非使用短(<20 nt)寡核苷酸探針，否則溫度通常介於65℃與70℃之間。代表性雜交溶液包含6×SSC、0.5% SDS、5×Denhardt's溶液及100 μg非特異性載體DNA[參見Ausubel等人，第2.9部分，增刊27(1994)]。當然，已知許多不同但在功能上等效之緩衝條件。倘若相關性程度較低，則可選擇較低溫度。低嚴格性結合溫度介於約25℃與40℃之間。培養基嚴格性介於至少約40℃與小於約65℃之間。高嚴格性係至少約65℃。
其次，藉由洗滌去除過量探針。在此階段通常應用更為嚴格之條件。因此，此「洗滌」階段在經由雜交確定相關性過程中最為重要。洗滌溶液通常含有較低鹽濃度。一種實例性中等嚴格性之溶液含有2×SSC及0.1% SDS。高嚴格性洗滌溶液含有小於約0.2×SSC之等效物(在離子強度方面)，其中較佳嚴格性溶液含有約0.1×SSC。與各種嚴格性相關之溫度與上文針對「結合」所討論者相同。洗滌溶液通常亦會在洗滌期間更換多次。例如，典型高嚴格性洗滌條件包括在55℃下洗滌兩次(每次30分鐘)及在60℃下洗滌三次(每次15分鐘)。
因此，本發明標的係編碼本發明抗體及抗原結合片段之經分離核酸序列。
本發明之另一實施例係編碼本發明抗體之上述經分離核酸序列，其中該等核酸序列係如表5所給出。
因此，本發明包括可與表5中所述分子在高嚴格性結合 及洗滌條件下雜交之核酸分子，其中此等核酸分子編碼具有本文所述性質之抗體或其功能片段。較佳分子(就mRNA而言)係彼等與本文所述DNA分子中之一者具有至少75%或80%(較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%)序列一致性的分子。該等分子阻斷由催乳激素受體介導之信號傳導。
功能等效變體
屬於本發明範圍內之又一類別之DNA變體可參考其所編碼之產物來闡述。該等功能等效基因之特徵在於以下事實，其因遺傳密碼之簡併性而編碼見於SEQ ID No：1及2中之相同肽序列。
應認識到，本文所提供DNA之分子變體可以若干不同方式構築。例如，其可作為完全合成之DNA加以構築。有效合成在20個至約150個核苷酸範圍內之寡核苷酸的方法普遍適用。參見Ausubel等人，第2.11部分，增刊21(1993)。可以首先以Khorana等人，J.Mol.Biol.72：209-217(1971)報導之方式合成並組裝重疊寡核苷酸；亦參見Ausubel等人，見上文，第8.2部分。較佳地，藉助在基因5'及3'端改造之便利限制位點對合成DNA加以設計以促進選殖至適當載體中。
如所指示，產生變體之方法係以本文所揭示DNA中之一者開始且隨後實施定點誘變。參見Ausubel等人，見上文，第8章，增刊37(1997)。在一個典型方法中，將靶DNA選殖至單鏈DNA噬菌體載體中。分離單鏈DNA並與含 有期望核苷酸改變之寡核苷酸雜交。合成互補鏈並將雙鏈噬菌體引入宿主中。所得子代中之一些將含有期望突變體，其可使用DNA定序加以證實。另外，各種能夠使子代噬菌體成為期望突變體之可能性增加的方法均適用。該等方法為彼等熟習此項技術者所熟知且用於產生此等突變體之套組可自市面購得。
重組DNA構築體及表現
本發明進一步提供包含本發明一或多個核苷酸序列之重組DNA構築體。本發明重組構築體可與載體(例如質粒、噬粒、噬菌體或病毒載體)聯合使用，可將編碼本發明抗體之DNA分子***該載體中。
經編碼基因可藉由Sambrook等人，1989及Ausubel等人，1989中所述技術產生。或者，DNA序列可使用(例如)合成器以化學方式合成。例如，參見OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(1984，Gait編輯，IRL Press，Oxford)中所述之技術，其全文以引用方式併入本文中。熟習此項技術者能夠將編碼可變結構域之DNA與編碼各種人類IgG同種型或其突變或非突變衍生物之恆定區的基因片段融合。其能夠應用重組DNA技術以單鏈模式使用連接體(例如含有3×甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸-絲胺酸之15-胺基酸延伸部分)將兩個可變結構域融合。本發明重組構築體包含在能夠表現編碼DNA之RNA及/或蛋白質產物之表現載體中。該載體可進一步包含調控序列，包括以可操作方式與開放閱讀框(ORF)相連之啟動子。載體可進一步包含可選標記 物序列。亦可需要特異性起始信號及細菌分泌信號以有效轉譯***之靶基因編碼序列。
本發明進一步提供含有本發明DNA中至少一者之宿主細胞。宿主細胞實際上可為可用於表現載體之任何細胞。其可為(例如)高等真核生物宿主細胞(例如哺乳動物細胞)、低等真核生物宿主細胞(例如酵母細胞)且可為原核細胞(例如細菌細胞)。重組構築體向宿主細胞中之導入可藉由磷酸鈣轉染、DEAE、右旋糖酐介導之轉染、電穿孔或噬菌體感染來實現。
細菌表現
用於細菌用途之有用表現載體可藉由***編碼期望蛋白質之結構DNA序列連同處於可操作閱讀期之適宜轉譯起始信號及終止信號以及功能啟動子來構築。載體將包含一或多個表型可選標記物及複製起始點以確保載體之維持且(若需要)提供在宿主內之擴增。用於轉化之適宜原核宿主包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏鼠傷寒菌(Salmonella typhimurium)及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)各屬中之各物種。
細菌載體可基於(例如)噬菌體、質粒或噬粒。該等載體可含有源自通常含有習知選殖載體pBR322(ATCC 37017)元件之市售質粒的可選標記物及細菌複製起始子。在轉化適宜宿主菌株且使宿主菌株生長至適當細胞密度後，藉由適當手段(例如，溫度變動或化學誘導)來使所選啟動子解 除抑制/受到誘導並將細胞培養額外一段時間。通常藉由離心收穫細胞，藉由物理或化學手段使其破裂，並保留所得粗製提取物以用於進一步純化。
在細菌系統中，可有利地根據欲用於所表現蛋白質之用途選擇多種表現載體。例如，當欲產生大量此一蛋白質時，對於產生抗體或篩選肽文庫而言，可能期望(例如)可引導易於純化之融合蛋白質產物高程度表現之載體。
因此，本發明之目標係包含編碼本發明新穎抗體之核酸序列的表現載體。
哺乳動物表現及純化
用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括在哺乳動物細胞中引導高程度之蛋白質表現之病毒元件，例如源自以下之啟動子及/或增強子：巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤。關於病毒調控元件及其序列之進一步說明，參見(例如)頒予Stinski之美國5,168,062、頒予Bell等人之美國4,510,245及頒予Schaffner等人之美國4,968,615。重組表現載體亦可包括複製起點及可選標記物(例如，參見頒予Axel等人之美國4,399,216、4,634,665及美國5,179,017)。適宜可選標記物包括賦予已引入載體之宿主細胞對諸如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲蝶呤(methotrexate)等藥物之抗性的基因。例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予對胺甲蝶呤之抗性且neo基因賦予對 G418之抗性。
表現載體至宿主細胞中之轉染可使用諸如電穿孔、磷酸鈣沈澱及DEAE-右旋糖酐轉染等標準技術來實施。
本文所提供用於表現抗體、其抗原結合部分或衍生物之適宜哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)[包括dhfr-CHO細胞(闡述於Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中)，其與DHFR可選標記物(例如，如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)一起使用]、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。在一些實施例中，表現載體經設計以使得經表現蛋白質分泌至生長宿主細胞之培養基中。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體、其抗原結合部分或衍生物。
可藉由已知方法自重組細胞培養物回收並純化本發明抗體或其抗原結合片段，該等方法包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沈澱、酸提取、蛋白質A層析、蛋白質G層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸-纖維素層析、疏水相互作用層析、親和力層析、氫氧磷灰石層析及凝集素層析。亦可採用高效液相層析(「HPLC」)來純化。例如，參見Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，每一者以引用方式完全併入本文中。
本發明抗體或其抗原結合片段包括天然純化產物、化學 合成程序產物及藉由重組技術自真核生物宿主產生之產物，該真核生物宿主包括(例如)酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞。端視重組產生程序中所用宿主而定，本發明抗體可經糖基化或可不經糖基化。此等方法闡述於許多標準實驗室手冊中，例如Sambrook，見上文，第17.37-17.42部分；Ausubel，見上文，第10、12、13、16、18及20章。
因此，本發明之一目標亦係包含載體或核酸分子之宿主細胞，其中宿主細胞可係高等真核生物宿主細胞(例如哺乳動物細胞)、低等真核生物宿主細胞(例如酵母細胞)，且可係原核生物細胞，例如細菌細胞。
本發明之另一目標係使用宿主細胞產生抗體及抗原結合片段之方法，其包含在適宜條件下培養宿主細胞並回收該抗體。
因此，本發明之另一目標係如本發明中所述之抗體，其係利用本發明宿主細胞產生且經純化至以重量計至少95%均質性。
子宮內膜異位症及子宮肌腺症(子宮內子宮內膜異位症)
子宮內膜異位症係良性***依賴性婦科病症，其特徵在於在子宮腔外存在子宮內膜組織(腺體及間質)。子宮內膜異位病灶主要發現於骨盤腹膜上、卵巢及直腸***隔中(Obstet.Gynecol.Clin.North.Am.24：235-238,1997)。子宮內膜異位症經常與***及疼痛症狀(諸如痛經)相關。另外，許多患者罹患自體免疫疾病(Hum.Reprod.17(19)： 2715-2724,2002)。子宮肌腺症亦稱為子宮內子宮內膜異位症，闡述限於子宮之子宮內膜異位症之亞型。在子宮肌腺症之情形下，子宮內膜腺體侵入子宮肌層及子宮壁。
根據移植理論，子宮內膜片段係由逆行月經流入患者與健康女性二者之腹腔中(Obstet.Gynecol.64：151-154,1984)。4個主要因素似乎關鍵地涉及在患者骨盆腔中順利建立子宮內膜異位病灶：
a)在月經週期之晚期分泌期中，健康女性之子宮內膜細胞凋亡。在患者中，子宮內膜細胞之凋亡程度顯著降低(Fertil.Steril.69：1042-1047,1998)。因此，患者發生以下情形之可能性高於健康女性：已由逆行月經流入腹腔中之子宮內膜片段不死亡並順利地植入。
b)對於順利植入腹膜中且長期存活之異位性子宮內膜片段而言，必須形成新血管(British Journal of Pharmacology,149：133-135,2006)。
c)許多患者罹患自體免疫疾病且因此具有受損免疫系統(Hum.Reprod.17(19)：2002,2715-2724,2002)。此可推斷完整免疫反應(因其存在於健康女性中)可能在防止建立子宮內膜異位病灶方面發揮作用。
d)病灶必須生長，且因此有賴於有絲***刺激及生長因子之存在。
對於子宮內膜異位症之治療而言，當前存在以下方法：
a)***釋放激素(GnRH)類似物：抑制卵巢雌二 醇合成並誘導異位性子宮內膜異位植入物萎縮，該等植入物關鍵有賴於生長用***之存在。
b)芳香酶抑制劑：抑制子宮內膜異位植入物局部產生***，誘導凋亡並抑制異位性子宮內膜異位片段之增殖。
c)選擇性***受體調節劑：在正常子宮內膜及異位性植入物中具有***受體拮抗活性且因此導致所植入異位性子宮內膜異位組織之萎縮。
d)孕酮受體激動劑：抑制正常及異位性子宮內膜細胞之增殖，誘導分化及凋亡。
e)組合口服避孕藥：維持現狀，預防疾病之進展並誘導異位性及正位性子宮內膜之萎縮。
f)手術切除病灶。
GnRH類似物、SERM及芳香酶抑制劑具有嚴重副效應並在罹患子宮內膜異位症之年輕女性中導致熱潮紅及骨損失。用孕酮受體激動劑治療導致***抑制、不規則月經出血、之後閉經、體重增加及抑鬱。因靜脈血栓栓塞風險增加，因此年齡大於35歲之女性、吸菸者及罹患超重之個體不適於組合口服避孕藥。手術切除病灶易於具有高復發率。
本發明抗體藉由垂體及局部產生之催乳激素或因活化PRLR突變干擾PRLR介導之信號傳導刺激且因此比僅干擾垂體催乳激素分泌之多巴胺-2-受體激動劑更有效。
因此，本發明之目標係本發明中所述之抗體或抗原結合 片段，其作為藥劑。
PRL及PRLR係在子宮中表現且在正常子宮生理機能中發揮作用；PRL可用作有效有絲***促進劑且具有免疫調節作用。在本發明中顯示，PRL/PRLR系統中之改變在人類子宮內膜異位症中發揮作用。藉由量化Taqman PCR對PRL及PRLR在健康女性之子宮內膜中及在患者之子宮內膜及病灶中之表現的分析(參見實例4)顯示於圖1及2中。
如圖1(PRL表現)及圖2(PRLR表現)中所顯示，兩種PRL及其受體在子宮內膜異位病灶中顯著上調。該等發現令人驚奇且與先前公開之研究明顯不同(Acta Obstet Gynecol Scand 81：5-10,2002)，該研究闡述在人類子宮內膜異位病灶中幾乎完全不存在PRLR表現。
本發明之發現首次獲得自分泌PRL信號傳導在子宮內膜異位病灶之建立、生長及維持中發揮基礎性作用的實驗證據。
在子宮內子宮內膜異位症之動物模型(即小鼠之子宮肌腺症)中順利地測試PRLR抗體Mat3(參見實例5)。子宮肌腺症之特徵在於子宮內膜腺體在子宮內膜之子宮肌層中浸潤性生長。其類似於限定於子宮之子宮內膜異位症形式，即可產生子宮內膜異位症非月經物質之唯一形式。
可在臨床上有效治療罹患子宮內膜異位症之患者之達那唑(Danazol)亦可有效治療子宮肌腺症(Life Sciences 51：1119-1125,1992)。然而，達那唑係雄激素黃體素且在年輕女性中導致嚴重雄激素副效應，此會限制其使用。
本發明抗體解決向子宮內膜異位症提供新穎治療或預防之問題並展現低於現行標準療法之副效應。
本發明之另一態樣係本發明中所述抗體Mat3及抗原結合片段之用途，其用於治療或預防子宮內膜異位症及子宮肌腺症(子宮內子宮內膜異位症)。
良性***疾病及***痛
良性***疾病涵蓋多種症狀，例如纖維囊性***疾病、纖維腺瘤、***痛及巨囊。30-50%停經前女性罹患纖維囊性***疾病(Epidemiol Rev 19：310-327,1997)。端視女性年齡而定，良性***疾病可以獨特表型存在(J Mammary Gland Biol Neoplasia 10：325-335,2005)：在早期生殖期(15-25歲)期間，當正常***發生小葉發育時，良性***疾病會導致纖維腺瘤。觀察到單巨纖維腺瘤以及多發性腺瘤。該等纖維腺瘤係由間質細胞以及上皮細胞構成且係由小葉引起。在成熟生殖期(25-40歲)，***在每一月經週期期間經受週期性變化。患病女性呈現週期性***痛且其房乳中具有若干結節。隨後(35-55歲年齡)，正常***退化，而在患病***中可觀察到巨囊及具有及不具有異型性之上皮增生。良性***疾病之彼等伴隨上皮細胞增殖增強之形式具有產生乳癌之較高風險。若增殖細胞部分中存在細胞異型性，則此風險可高達11%(Zentralbl Gynäkol 119：54-58,1997)。25%年齡為60-80歲之女性亦罹患良性***疾病，經常***替代療法或肥胖係在停經後持續性良性***疾病之原因(Am J Obstet Gynecol 154：161-179,1986)。
纖維囊性***疾病之病理生理學係確定導致結締組織過度增殖(纖維化)、之後兼性上皮細胞增殖之***優勢及孕酮缺乏來確定。如已提及，在纖維囊性病灶內展現上皮細胞增殖增強之患者之乳癌風險升高。在臨床上，纖維囊性***疾病呈現乳痛及***觸痛。70%纖維囊性***疾病患者罹患黃體不足或無***(Am J Obstet 154：161-179,1986)。黃體不足導致孕酮含量降低及***優勢。
***痛(乳痛)在約70%女性生殖壽命中之某時對其造成影響。乳痛可或可不與其他月經前症候群標準相關。已顯示，在刺激下丘腦垂體軸後，罹患***痛之女性會以釋放過量催乳激素作為反應(Clin Endocrinol 23：699-704,1985)。
良性***疾病及***痛之標準療法係：
1)溴隱亭
作為多巴胺激動劑之溴隱亭僅阻斷垂體催乳激素合成，而不阻斷乳腺上皮細胞中催乳激素之局部合成。因此，其僅在彼等依賴於全身性催乳激素含量升高之***痛及良性***疾病之形式中有效。溴隱亭之主要副效應係：噁心、嘔吐、水腫、低血壓、眩暈、脫髮、頭痛及幻覺
2)達那唑
達那唑係經由其抗***活性抵消在良性***疾病中觀察到之***優勢的雄激素黃體素。主要副效應係：月經不規則、抑鬱、痤瘡、多毛症、聲音變低沉(voice deepening)及熱潮紅以及體重增加。
3)他莫昔芬(Tamoxifen)
他莫昔芬係在***中具有抗***活性且在子宮中具有***活性的選擇性***受體調節劑。主要副效應係：停經後症狀(例如骨損失及熱潮紅)、卵巢囊腫及子宮內膜癌。
4)黃體素
黃體素經由垂體性腺軸抑制、***抑制及***消耗來抑制良性***疾病。***消耗導致停經症狀，例如骨損失及熱潮紅。
5)低劑量組合口服避孕藥
年齡大於35歲、吸菸以及糖尿病及超重女性患者不適於此治療。
一般而言，已發現，1/3患有良性***疾病之女性之催乳激素含量有所增加。由於***增強垂體催乳激素分泌，因此認為血清催乳激素含量增加係此疾病中之***優勢之結果。已報導，活化PRLR突變經常存在於罹患多發性***腺瘤之女性中，該等腺瘤類似於纖維囊性***疾病之亞型(Paul Kelly,Breast Congress Turin,2007及Proc Natl Acad Sci 105：14533-14538；2008)。
良性***疾病、***痛及月經前***緊張依賴於一個常見病理生理機制：催乳激素信號傳導增強。催乳激素信號傳導升高可係以下之結果：
￭全身性高催乳激素血症(因垂體腺瘤所致)
￭局部高催乳激素血症(因增殖性乳腺上皮細胞中之催 乳激素合成所致)。局部高催乳激素血症不會轉變成血液中之催乳激素含量升高。
￭在正常催乳激素含量存在下之組成性活性PRLR信號傳導(因活化PRLR突變所致)。
假定良性***疾病之某些形式可產生乳癌，則對於此疾病之治療存在醫療需要。
為顯示中和性PRLR抗體Mat3在良性***疾病之臨床前模型中之功效，採用基於全身性高催乳激素血症之小鼠模型。在腎囊膜下用垂體同源移植物移植成人Balb/c小鼠，如實例6中所述(In：Methods in Mammary gland Biology and Breast Cancer Research,101-107,2000)。在本發明良性***疾病小鼠模型中，未使用諸如DMBA等致癌劑；僅用垂體腺體移植小鼠以研究Mat3抗體應用對良性上皮細胞增殖增強之結果。在前一研究中，另外用致癌劑DMBA處理垂體-同源移植動物且分析不同單株PRLR抗體對乳癌發生之效應(Am J Pathol 133：589-595,1988)。該等抗體可有效治療乳癌，然而，未分析對良性***疾病之效應(Am J Pathol 133：589-595,1988)。
在本發明模型中，與未治療原始對照小鼠相比，全身性高催乳激素血症引起乳腺中之上皮細胞增殖增強並刺激側向分支(sidebranching)及小葉肺泡發育。如實例6中所述，在此Balb/c小鼠模型中測試中和性PRLR抗體Mat3與非特異性抗體相比在以下方面之能力：
￭阻斷側向分支及小葉肺泡發育
￭抑制乳腺上皮細胞增殖
￭抑制催乳激素靶基因elf 5之表現
中和性PRLR抗體Mat3抑制側向分支(圖3A)及催乳激素靶基因elf 5之表現(圖3B)。
本發明之另一態樣係本發明中所述抗體Mat3及抗原結合片段之用途，其用於治療停經前及停經後女性之良性***疾病及***痛。
自藉由抗體Mat3阻斷由PRLR介導之信號傳導受益的其他適應症：
非激素女性避孕：
現行女性避孕方法如下：
a)含有***及黃體素之組合口服避孕藥。
促黃體素組份經由對下丘腦-垂體-性腺軸之負反饋介導避孕效應。***組份保證良好出血控制並經由誘導靶細胞中之孕酮受體來增強促孕作用。
b)子宮內避孕器僅含有黃體素。
局部釋放黃體素使子宮內膜處於抗植入狀態。另外，宮頸黏膜變得使精細胞幾乎不可滲透。
c)僅黃體素之丸劑及植入物。
黃體素經由對下丘腦-垂體-性腺軸之負反饋來抑制***。另外，降低宮頸黏膜對精細胞之滲透性。
d)含有炔雌醇加黃體素之***環。
組合口服避孕藥之主要副效應係靜脈血栓栓塞(VTE)之風險升高。此外，超重或吸菸女性以及罹患自體免疫疾病 (例如狼瘡)之女性及大於35歲之女性不能使用口服組合避孕藥。
含有黃體素之子宮內避孕器及植入物僅會導致功能失調性子宮出血。
僅黃體素之丸劑可引起不規則出血模式、點滴出血、閉經。異位性妊娠風險增加。重量增加及骨質密度降低係其他副效應。
***環可導致***炎、白帶或娩出。
已於數年前產生PRLR缺乏小鼠(Genes Dev 11：167-178,1997)。有趣的是，PRLR缺乏女性而非雄性小鼠完全***。PRLR-/-女性動物在受精後立即展現卵發育受阻，即，其顯示植入前發育受阻而***正常。僅極少卵母細胞達到囊胚階段且不能植入突變女性動物中，但在移植後於野生型***母體中發育成正常胚胎。可藉由孕酮補充來挽救PRLR缺乏小鼠之***表型直至中期妊娠。顯然，由PRLR介導之信號傳導在允許並維持妊娠所必需之產生孕酮之黃體的維持及功能中發揮重要作用。另外，PRLR缺乏女性動物而非雄性動物展現與異常腹部脂肪質量及瘦素含量降低相關之體重降低。
迄今為止，人們不瞭解不活化性人類PRLR突變，因此仍未知由PRLR介導之信號傳導在人類生育力中之準確作用。然而，有愈來愈多之證據表明，亦在人類中，需要最低催乳激素含量來允許順利妊娠。用溴隱亭治療罹患因高催乳激素血症性黃體不足所致之原發性***之患者。在一 些情況下，催乳激素含量受到過度抑制且再次再出現縮短之黃體期(Bohnet HG等人in Lisuride and other dopamine agonists，由D.B.Calne等人編輯，Raven Press,New York,1983)。自該等數據推斷，高催乳激素血症性及低催乳激素血症性狀態消極地干擾女性生育力。此可藉由PRL與其受體之相互作用來解釋。在低催乳激素含量之情況下，沒有足夠受體活化，而在高催乳激素血症之情況下，亦沒有足夠受體活化，此乃因所有受體均被一種催乳激素分子阻斷且不能再二聚化。換言之，催乳激素之劑量反應係鐘形且最佳受體活化僅係在某一濃度範圍內達成。自第二研究之證據表明，患者缺乏子宮內膜催乳激素表現會導致早期植入失敗(Human Reprod.19：1911-1916,2004)。此外，已顯示，離體催乳激素可防止經培養人類顆粒層細胞凋亡且因此維持早期黃體功能，如其已在PRLR缺乏小鼠中所顯示(Human Reprod.18：2672-2677,2003)。
與上述標準方法相比，利用中和性PRLR抗體進行女性避孕具有若干優點：
￭可在吸菸、超重及老年女性以及在罹患紅斑狼瘡之女性中使用該等抗體(PRLR抗體甚至可有益於治療狼瘡及減少腹部脂肪，即PRLR缺乏小鼠具有較少腹部脂肪)。
￭PRLR抗體不會升高VTE(靜脈血栓栓塞性)風險。
￭與用於組合口服避孕中之***及黃體素相比，中和由PRLR介導之信號傳導可抑制***上皮增殖且與生 育力控制之激素方法不同，其甚至可保護使用者免患乳癌。
本發明之另一目標係抗體Mat3用於女性避孕之用途，其與標準治療相比具有降低之副效應。
泌乳抑制
催乳激素係參與分娩後泌乳之主要激素。此係藉由PRLR缺乏小鼠之表型來證明。甚至異型接合小鼠具有嚴重泌乳問題且完全不能哺育其後代(Frontiers in Neuroendocrinology 22：140-145,2001)。
出於許多原因，女性必須終止母乳餵養，即母體攝入對嬰兒潛在有害之藥物、嚴重感染(乳腺炎、腎炎)、產後大出血及嚴重母體疾病(例如糖尿病、癌及衰弱)或新生兒疾病。當前，使用諸如溴隱亭及利舒脲(lisuride)等多巴胺受體激動劑來抑制分娩後泌乳。然而，該等化合物可引起嚴重副效應，例如噁心、嘔吐、水腫、低血壓、眩暈、脫髮、頭痛及幻覺。另外，多巴胺受體激動劑不適於罹患心血管疾病及高血壓之女性。溴隱亭之又一缺點係其短半衰期，從而需要在14天時段內每天攝入4-6次藥物。
因此，預計中和性PRLR抗體適於泌乳抑制。在前一出版物中，將針對部分純化PRLR產生之抗血清給予泌乳大鼠。據推測，抗血清導致泌乳抑制，此乃因窩重有輕微減少(Endocrinology 102：1657-1661,1978)。然而，作者不能排除甚至其他機制可導致窩重微減少。另外，其觀察到抗血清引起經治療大鼠之黃體增加((Endocrinology 102：1657- 1661,1978)。此觀察與PRLR缺乏小鼠之表型明顯不同((Genes Dev 11：167-178,1997)，其中***未受損害且其中未觀察到黃體增加。最可能地，所用抗血清阻斷一些額外未知分子。
本發明之另一目標係抗體Mat3用於抑制泌乳之用途。
良性***增生
良性***增生(BPH)係老年男性之第4大流行健康護理病況。***肥大係影響超過50%年齡為50歲之男性的年齡依賴性進行性病況。BPH之特徵在於***間質細胞及上皮細胞增生，從而導致***之尿道周邊區域中形成大離散結節，此會壓迫尿道。因此，尿流障礙係BPH之一個主要結果。
標準BPH療法涵蓋：
a)α1-腎上腺素受體拮抗劑(例如坦洛新(tamsulosin)、阿夫唑嗪(alfuzosin)、特拉唑嗪(terazosin)、多沙唑嗪(doxazosin))緩解下泌尿道中之BPH症狀。其藉由阻斷由α受體介導之對***平滑肌之刺激來減少膀胱出口阻塞。主要副效應係血管舒張性不良事件、眩暈及***失敗。
b)5α-還原酶抑制劑(例如非那雄胺(finasteride))5α-還原酶抑制劑防止***中形成造成***肥大之睪酮之活性形式二氫睪固酮。主要副效應係性功能障礙，例如***障礙及***降低。
c)經尿道***切除術(TURP)
此手術治療與高發病率相關。副效應係出血、失禁、狹窄形成、***喪失及膀胱穿孔。
d)***支架
將支架***尿道之***部分以保證適當尿液。主要副效應係結殼、泌尿道感染及支架偏移。此外，必須在任何經尿道操作前去除支架。
如針對乳腺所述，PRL及PRLR在***內以自分泌/旁分泌方式作用(J.Clin.Invest.99：第618頁，1997)。
臨床研究指示，高催乳激素血症(及肢端肥大症)與***肥大及發炎細胞之間質累積相關。人類生長激素可在鋅存在下結合至人類PRLR，此可解釋肢端肥大症可導致良性***增生之原因。BPH患者之PRL血清含量經常升高。
普遍過表現PRL基因之轉基因動物產生嚴重間質***增生，從而指示PRL為產生***增生之重要病理生理因子(Endocrinology 138：第4410頁，1997)。此外，轉基因小鼠在***特異性***鹼性蛋白(probasin)啟動子下局部過表現PRL會導致間質膨大、發炎細胞累積及病灶上皮發育不良，此係人類BPH之基本特性(Endocrinology 144：第2269頁，2003)。
本發明之另一態樣係本發明中所述抗體Mat3或抗原結合片段用於治療良性***增生之用途。
組合激素療法
對於仍具有子宮之停經後女性之熱潮紅之治療而言，使 用***(***或馬偶聯***=CEE)與黃體素(例如乙酸甲羥孕酮(MPA)、孕酮、屈螺酮(drospirenone)、左炔諾孕酮(levonorgestrel))之組合。必須添加黃體素以抑制***活化之子宮上皮細胞增殖。然而，添加黃體素會增加乳腺上皮細胞增殖。由於正常以及癌性乳腺上皮細胞二者均以增殖對經組合***加黃體素治療作出反應，因此發現在CEE與MPA治療後乳癌之相對風險增加(JAMA 233：321-333；2002)。
本發明抗體解決治療在組合激素療法下觀察到之***上皮細胞增殖增強的問題。
本發明之另一目標係中和性PRLR抗體Mat3或抗原結合片段在組合激素療法(即***+黃體素療法)中用以抑制乳腺上皮細胞增殖之用途。
脫髮
業內仍未滿足對脫髮治療之需要。週期性頭皮毛髮生長：生長期階段之特徵在於活躍頭髮生長；退化期階段顯示退化且隨後為終期階段(靜止期)。脫落期階段(exogen phase)(釋放死毛髮)與終期階段之末端一致。脫髮可係擾亂任一階段中毛髮生長之結果。
終期脫髮可具有許多觸發物(生理學及情緒應激、醫療條件、鐵及鋅之缺乏)，重要地，其早期階段中之雄激素禿發顯示終期毛髮部落(Cleveland clinic journal of medicine 2009；76：361-367)。生長期脫髮經常係輻射或化學療法之結果。
使用米諾地爾(Minoxidil)及非那雄胺來治療雄激素性脫髮，而使用糖皮質激素來治療班禿。一般而言，所有該等治療均具有副效應(非那雄胺：男性之***減退及陽痿；糖皮質激素：糖尿病、重量增加、骨質疏鬆症)，且尚未完全解決治療脫髮之問題。
在齧齒類動物中，使用成年動物之剃毛實驗來分析化合物對脫髮之效應，其係藉由使用剃毛區中之毛髮再生長作為讀出范式來達成(British Journal of dermatology 2008；159：300-305)。對成年動物剃毛(主要在終期階段之毛髮)誘導特徵在於毛髮生長之生長期階段。
已發現催乳激素及PRLR在毛囊中表現。自表現數據表明，干擾由PRLR介導之信號傳導可針對脫髮有效，但沒有功能數據顯示，證明此假說(Aktuelle Dermatologie 31：109-116,2005)。
本發明抗體解決向女性及男性之高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性脫髮提供新治療之問題。
因此，本發明又一態樣係採用抗體Mat3或抗原結合片段來治療或預防高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性脫髮。
抗***抗性乳癌之治療及預防
已表明，PRLR在人類乳癌中過表現(J Clin Endocrinol Metab 83：667-674,1998)且負面干擾PRL-PRLR相互作用可對乳癌治療具有正面影響(Int.J.Cancer：55(5)：712-721,1993)。有證據表明，血漿催乳激素含量與乳癌風險相關 聯(Cancer Lett 243：160-169,2006)。在抗他莫昔芬乳癌患者中，進行性疾病之產生與催乳激素血漿含量相關聯(Eur J Surg Oncol 20：118-121,1994)。過表現催乳激素之轉基因小鼠較易於產生乳癌(J Clin Invest 100：2744-2751,1997)。
本發明之另一態樣係本發明中所述抗體Mat3或抗原結合片段對於治療或預防抗***抗性乳癌之用途。
定義
本文所用靶抗原人類「PRLR」係指細胞外結構域中之胺基酸序列與SEQ ID NO.12之胺基酸位置1至210實質上相同的人類多肽及其天然等位基因及/或剪接變體。本文所用「PRLR之ECD」係指PRLR之由上述胺基酸代表之細胞外部分。另外，靶人類PRLR亦涵蓋受體之突變形式，例如由Paul Kelly闡述之活化突變I146L(Proc Natl Acad Sci U S A.105(38)：14533-14538,2008；及oral communication，Turin,2007)。
本文所用靶抗原猴「PRLR」係指細胞外結構域中之胺基酸序列與SEQ ID NO.11之胺基酸位置1至210實質上相同的恒河猴以及食蟹獼猴多肽及其天然等位基因及/或剪接變體。本文所用「PRLR之ECD」係指PRLR之由上述胺基酸代表之細胞外部分。
本文所用靶抗原鼠類或小鼠「PRLR」係指細胞外結構域中之胺基酸序列與SEQ ID NO.13之胺基酸位置1至210實質上相同的鼠類多肽及其天然等位基因及/或剪接變體。本文所用「PRLR之ECD」係指PRLR之由上述胺基酸 代表之細胞外部分。
本文所用片語「治療有效量」意指治療性或預防性抗體當根據期望治療方案投與時將適於誘發期望治療性或預防性效應或反應之量，該效應或反應包括減輕疾病之此等症狀之一些或所有或降低患該疾病之傾向性。
若抗體能夠辨別抗原與一或多種參考抗原，則認為本文所用抗體「特異性結合」抗原(本文為PRLR)、對抗原「具有特異性」或「特異性識別」抗原，此乃因結合特異性並非絕對性質而為相對性質。在其最通用形式中(且當未提及經定義參考物時)，「特異性結合」係指抗體辨別所關注抗原與無關抗原之能力，如(例如)根據以下方法中之一者所確定。此等方法包含(但不限於)西方墨點(Western blot)、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試及肽掃描。例如，可實施標準ELISA分析。可藉由標準顯色(例如二級抗體與辣根過氧化物及四甲基聯苯胺與過氧化氫)實施評分。在某些孔中之反應係藉由光密度(例如，在450 nm下)實施評分。典型背景(=陰性反應)可為0.1 OD；典型陽性反應可為1 OD。此意味著陽性/陰性差可超過10倍。通常，結合特異性之測定並非藉由使用單一參考抗原實施而是藉由使用一組約3至5個無關抗原(例如乳粉、BSA、轉鐵蛋白或諸如此類)實施。然而，「特異性結合」亦可指抗體辨別靶抗原與一或多種用作參考點之密切有關之抗原之能力。另外，「特異性結合」可係指抗體辨別其靶抗原之不同部分之能力，該等不同部分係(例如)PRLR之不同結 構域、子結構域或區，例如PRLR之ECD之N末端或C末端區中之表位、或PRLR之ECD之一或多個關鍵胺基酸殘基或胺基酸殘基延伸部分。
「親和力」或「結合親和力」KD經常係藉由量測平衡締合常數(ka)及平衡解離常數(kd)並計算kd與ka之商(KD=kd/ka)來測定。術語「免疫特異性」或「特異性地結合」意指抗體以低於或等於10-6 M之親和力KD(單價親和力)結合至PRLR或其ECD。術語「高親和力」意指抗體以低於或等於10-7 M之親和力(KD)(單價親和力)結合至PRLR或其ECD。抗體與靶抗原之親和力可實質上大於與其他無關分子之親和力。抗體與靶抗原之親和力亦可實質上大於與同系物之親和力，例如與靶抗原之相對親和力為至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍或更大。此等親和力可使用習用技術來容易地測定，例如藉由平衡透析；藉由使用BIAcore 2000儀器，使用由製造商概述之一般程序；藉由使用經放射標記之靶抗原進行放射免疫分析；或藉由熟習此項技術者已知之另一方法。親和力數據可藉由(例如)Scatchard等人，Ann N.Y.Acad.ScL,51：660(1949)之方法來分析。
本文所用片語「抗體拮抗由催乳激素介導之信號傳導」意指藉由本發明抗體阻斷催乳激素受體活化，此可完全抑制由催乳激素受體介導之信號傳導。
本文所用片語「抗體競爭結合」意指一種抗體與第二配體之間對於與催乳激素受體結合之競爭。
術語「抗體」以最廣泛意義使用且包括完全組裝抗體、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、可結合抗原之抗體片段(例如，Fab'、F'(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙鏈抗體)、駱駝抗體(camel body)及包含抗體之重組肽，只要其展現期望生物學活性即可。抗體可在其重鏈上帶有較佳源自IgG1、IgG2或IgG4同種型之不同恆定結構域(Fc結構域)(參見下文)。可引入修改效應子功能之突變。已鑑別出Fc結構域中在與補體蛋白質C1q及Fc受體之相互作用中起主導作用之胺基酸殘基且已闡述影響效應子功能之突變(關於綜述，參見Labrijn等人，Current opinion in Immunology 20：479-485,2008)。特定而言，IgG1之糖基化可藉由於胺基酸位置297處將天冬醯胺突變成丙胺酸或將天冬醯胺突變成麩醯胺酸來達成，已報導其消除源自抗體之細胞介導之細胞毒性(ADCC)(Sazinsky等人，Proc.Nat.Acad.Sci.105(51)：20169,2008；Simmons等人，J.of Immunological Methods 263：133-147,2002)。於322位處由丙胺酸替代離胺酸可降低ADCC並去除源自補體之細胞毒性(CDC)，而同時於234位及235位處由丙胺酸替代兩個白胺酸可避免ADCC及CDC[Hezareh等人，J.of Virology,75(24)：12161-12168,2001]。為應用IgG4同種型作為在活體內保留親合力之二價治療劑，可引入諸如「核心鉸鏈區」中之絲胺酸至脯胺酸交換等修改(Schuurman,J.等人Immunology 97：693-698,1999)。人類IgG2分子形成異質共價二聚物之傾向性可藉由將127位、 232位及233位處之半胱胺酸中之一者交換成絲胺酸來避開(Allen等人，Biochemistry,2009,48(17)，第3755-3766頁)。具有降低之效應子功能之替代模式可係源自帶有4個IgG4-特異性胺基酸殘基變化之IgG2的IgG2m4模式(An等人，mAbs 1(6),2009)。抗體片段可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整抗體來產生且進一步闡述於下文中。單株抗體之非限制性實例包括鼠類、嵌合、人類化、人類及Human EngineeredTM之免疫球蛋白、抗體、具有源自免疫球蛋白或其突變蛋白質或衍生物之序列之嵌合融合蛋白質，各自進一步闡述於下文中。涵蓋完整分子及/或片段之多聚物或聚集體，包括經化學衍生化抗體。
本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，即，除可少量存在之可能天然突變外，構成該群體之個別抗體均相同。單株抗體具有高度特異性，針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之習用(多株)抗體製劑相比，每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。除其特異性外，單株抗體亦有利之原因在於其係藉由未受具有不同特異性及特性之其他免疫球蛋白污染之同源培養來合成。
修飾語「單株」指示抗體之特性為自實質上同源之抗體群體獲得，且認為不需要藉由任何特定方法來產生抗體。例如，所欲使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature,256：495[1975闡述之雜交瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法製得(例如，參見美國專利第4,816,567號)。
「單株抗體」亦可係(例如)重組、嵌合、人類化、人類、Human EngineeredTM或抗體片段。
「免疫球蛋白」或「天然抗體」係四聚物糖蛋白。在天然免疫球蛋白中，每一四聚物係由2個相同多肽鏈對構成，每對具有一條「輕」鏈(約25 kDa)及一條「重」鏈(約50-70 kDa)。每一鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100至110或更多個胺基酸之「可變區」。每一鏈之羧基末端部分界定主要負責效應子功能之恆定區。可將免疫球蛋白指定為不同類別，此端視其重鏈之恆定結構域之胺基酸序列而定。將重鏈歸類為繆(mu,μ)、德耳塔(delta,△)、伽瑪(gamma,γ)、阿爾法(alpha,α)及伊普西龍(epsilon,ε)，且將抗體之同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。可將該等中之若干進一步劃分成亞類或同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。不同同種型具有不同效應子功能；例如，IgG1及IgG3同種型經常具有ADCC活性。將人類輕鏈歸類為卡帕(kappa,K)及蘭布達(lambda,λ)輕鏈。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區係由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個或更多個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.編輯，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))。
本文將抗體/免疫球蛋白之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」定義為保留抗原結合區之抗體/免疫球蛋白片段(例如，IgG可變區)。吾人發現抗體之「抗原結合區」 通常位於抗體之一或多個超變區(即，CDR-1區、CDR-2區及/或CDR-3區)中；然而，可變「框架」區亦可在抗原結合中發揮重要作用，例如為CDR提供支架。較佳地，「抗原結合區」至少包含可變輕(VL)鏈之4至103位胺基酸殘基及可變重(VH)鏈之5至109位胺基酸殘基，更佳地包含VL之3至107位胺基酸殘基及VH之4至111位胺基酸殘基，且尤佳為完整的VL鏈及VH鏈[VL之1至109位胺基酸及VH之1至113位胺基酸，同時根據Kabat數據庫對胺基酸進行編碼(Johnson及Wu,Nucleic Acids Res.,2000,28,214-218)]。用於本發明中之較佳免疫球蛋白類別係IgG。
術語「超變」區係指抗體或功能片段之負責抗原結合之可變結構域VH及VL的胺基酸殘基。超變區包含「互補決定區」或CDR之胺基酸殘基[即，輕鏈可變結構域中之殘基24-34(LCDR1)、殘基50-56(LCDR2)及殘基88-97(LCDR3)以及重鏈可變結構域中之殘基29-36(HCDR1)、殘基48-66(HCDR2)及殘基93-102(HCDR3)，如圖12中所述]及/或彼等來自超變環之殘基[即，輕鏈可變結構域中之殘基26-32(在LCDR1內)、殘基50-52(在LCDR2內)及殘基91-96(在LCDR3內)以及重鏈可變結構域中之殘基26-32(在HCDR1內)、殘基53-55(在HCDR2內)及殘基96-101(在HCDR3內)，如由等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)所闡述]。
抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、結構域抗體(dAb)、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體 (scFv)、單鏈抗體片段、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微小抗體、線性抗體(Zapata等人，Protein Eng.,8(10)：1057-1062(1995))；螯合重組抗體、三體(tribody)或二體(bibody)、細胞內抗體(intrabody)、奈米抗體(nanobody)、小模組免疫醫藥(SMIP)、抗原-結合-結構域免疫球蛋白融合蛋白質、駱駝化抗體、含有VHH之抗體或其突變蛋白或衍生物及含有免疫球蛋白之至少一部分之多肽(該部分足以賦予該多肽特定性抗原結合，例如CDR序列)，只要該抗體保留期望生物學活性即可；及自抗體片段形成之多特異性抗體(C.A.K Borrebaeck編輯(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann及S.Duebel編輯(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。除「雙特異性」或「雙功能」抗體以外之抗體應理解為其結合位點中之每一者相同。F(ab')2或Fab可經改造以最小化或完全去除CH1結構域與CL結構域之間發生之分子間二硫化物相互作用。抗體之木瓜酶消化產生兩個相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有單一抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個「Fv」片段之F(ab')2片段。「Fv」片段係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此區係由一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域以緊密非共價締合之二聚物組成。每一可變結構域之3個CDR以此組態相互作用以界定VH-VL二聚物 之表面上之抗原結合位點。6個CDR共同賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單一可變結構域(或Fv之一半，其僅包含3個對抗原具有特異性之CDR)具有識別並結合抗原之能力。
「單鏈Fv」或「sFv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中該等結構域係以單一多肽鏈存在。
較佳地，Fv多肽進一步包含VH結構域與VL結構域之間之多肽連接體，其使Fv能夠形成對於抗原結合所期望之結構。關於sFv之綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab片段與Fab'片段之不同之處在於在重鏈CH1結構域之羧基末端添加幾個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH係本文針對恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'之命名。F(ab')2抗體片段最初係作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生。
「框架」或FR殘基係彼等除超變區殘基以外之可變結構域殘基。
片語「恆定區」係指抗體分子之賦予效應子功能之部分。
術語「突變蛋白」或「變體」可互換使用且係指抗體之在可變區或等效於可變區之部分中含有至少一個胺基酸取 代、缺失或***的多肽序列，前提為突變蛋白或變體保留期望結合親和力或生物學活性。
突變蛋白可與親代抗體實質性上同源或實質上一致。
術語「衍生物」係指藉由非天然胺基酸之化學合成藉由諸如以下等技術共價修飾之抗體：泛素化、偶聯至治療劑或診斷劑、標記(例如，用放射性核素或各種酶)、共價聚合物附接(例如聚乙二醇化，用聚乙二醇衍生化)及***或取代。
本文將「人類」抗體或人類功能抗體片段定義為並非嵌合或「人類化」且並非(完全或部分地)來自非人類物種者。人類抗體或功能抗體片段可源自人類或可為合成人類抗體。本文將「合成人類抗體」定義為具有完全或部分來自基於在電腦上對已知人類抗體序列分析之合成序列之序列的抗體。人類抗體序列或其片段之電腦上之設計可藉由(例如)以下方式達成：分析人類抗體或抗體片段序列數據庫並利用自其中獲得之數據設計多肽序列。人類抗體或功能抗體片段之另一個實例係由自人類來源之抗體序列文庫(即，此文庫係基於自人類天然源獲取之抗體)分離出之核酸編碼者。人類抗體之實例包括基於n-CoDeR之抗體，如由以下文獻中所述：Carlsson及Söderlind Exp.Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001)；Soderlin等人Nat.Biotech.18,852-856(2000)及美國專利第6,989,250號。
本文將「人類化抗體」或人類化功能抗體片段定義為經以下處理者：(i)源自非人類源(例如，帶有異源免疫系統 之轉基因小鼠)，其抗體係基於人類種系序列；或(ii)經CDR移植，其中可變結構域之CDR係來自非人類來源，而可變結構域之一或多個框架具有人類來源且恆定結構域(若有)具有人類來源。
本文所用片語「嵌合抗體」係指含有源自兩個通常源自不同物種之不同抗體之序列的抗體(例如，參見美國專利第4,816,567號)。最通常地，嵌合抗體包含人類及鼠類抗體片段，通常為人類恆定區及小鼠可變區。
「Human EngineeredTM」抗體係藉由根據Studnicka等人，美國專利第5,766,886號中所述之方法改變親代序列產生，例如由SEQ ID NO 14及15代表且闡述於專利申請案WO 08/022295中之抗體。
本發明抗體可源自重組抗體基因文庫。研發用於製備重組人類抗體基因譜及在絲狀噬菌體之表面上展示經編碼抗體片段之技術已向直接製備並選擇人類抗體提供重組手段，其亦可適用於人類化抗體、嵌合抗體、鼠類抗體或突變蛋白抗體。藉由噬菌體技術產生之抗體係在細菌中以抗原結合片段(通常為Fv或Fab片段)產生且因此缺乏效應子功能。效應子功能可藉由兩種策略中之一者引入：可將片段改造成完全抗體用於在哺乳動物細胞中表現或改造成具有能夠觸發效應子功能之第二結合位點的雙特異性抗體片段。通常，抗體之Fd片段(VH-CH1)及輕鏈(VL-CL)係藉由PCR單獨選殖且在組合噬菌體展示文庫中隨機重組，其隨後可經選擇用於結合至特定抗原。Fab片段係在噬菌體表 面上表現，即，物理連接至編碼其之基因。因此，藉由抗原結合選擇Fab共選擇隨後可擴增之Fab編碼序列。藉由若干輪抗原結合及再擴增，即稱為淘選之程序，富集並最終分離對抗原具有特異性之Fab。
已闡述自噬菌體展示文庫獲得人類抗體之多種程序。此等文庫可在單一主框架上構建，其中使多種活體內形成(即源自人類)之CDR重組，如由以下文獻中所述：Carlsson及Söderlind Exp.Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001)；Söderlin等人Nat.Biotech.18,852-856(2000)及美國專利第6,989,250號。或者，此一抗體文庫可係基於已在電腦上設計且藉由以合成方式產生之核酸編碼的胺基酸序列。抗體序列之電腦上設計可藉由(例如)以下方式達成：分析人類序列數據庫並利用自其中獲得之數據設計多肽序列。用於設計並獲取電腦上產生之序列之方法闡述於(例如)Knappik等人，J.Mol.Biol.(2000)296：57；Krebs等人，J.Immunol.Methods.(2001)254：67；及美國專利第6,300,064號中。關於噬菌體展示技術，參見WO08/022295(Novartis)。
或者，本發明抗體可來自動物。此一抗體可係經人類化或人類改造，其匯總於WO08/022295(Novartis)中；此一抗體可來自轉基因動物[亦參見WO08/022295(Novartis)]。
本文將本文所用抗原之不同「形式」(例如PRLR)定義為自不同轉譯及轉譯後修飾產生之不同蛋白質分子，該等修飾係例如(但不限於)一級催乳激素受體轉錄物之剪接差 異、糖基化差異及轉譯後蛋白水解裂解差異。
本文所用術語「表位」包括能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體之任何蛋白質決定簇。表位決定簇通常係由分子之化學活性表面基團(例如，胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。若藉由彼等熟習此項技術者所熟知之方法中之任一者顯示一種抗體在競爭性結合分析中與第二抗體競爭，則認為兩種抗體「結合相同表位」，且該表位之所有胺基酸由該兩種抗體結合。
術語「成熟抗體」或「成熟抗原結合片段」(例如成熟Fab變體)包括抗體或抗體片段之衍生物，其展現與給定抗原(例如PRLR之細胞外結構域)之較強結合，即以增加之親和力結合。成熟係在抗體或抗體片段之6個CDR內鑑別出少量使此親和力增加之突變之過程。成熟方法係組合將突變引入抗體中並篩選鑑別經改良結合物之分子生物學方法。
治療方法
治療方法涉及向需要治療之個體投與治療有效量之本發明所涵蓋之抗體。本文將「治療有效」量定義為量足以阻斷PRLR陽性細胞在個體之經治療區域中增殖之抗體的量，其以單次劑量或根據多劑量方案、單獨或與其他藥劑組合，此可減輕不利情況，但該量可在毒理學上耐受。個體可係人類或非人類動物(例如，兔、大鼠、小鼠、猴或其他低級靈長類動物)。
本發明抗體可與已知藥劑共投與，且在一些情況下該抗體本身可經修飾。例如，抗體可與免疫毒素或放射性同位素偶聯，從而潛在地進一步增加功效。
本發明抗體可在多種情形(其中不期望PRLR高度表現)下用作治療或診斷工具。尤其適於用本發明抗體治療之病症及病況係子宮內膜異位症、子宮肌腺症、非激素女性生育避孕、良性***疾病及***痛、泌乳抑制、良性***增生、類纖維瘤、高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性脫髮，及在組合激素療法中用以抑制乳腺上皮細胞增殖之聯合治療。
為治療上述病症中之任一者，可以習用方式使用一或多種生理上可接受之載劑或賦形劑調配用於本發明之醫藥組合物。本發明抗體可以任何適宜手段投與，投與手段可端視欲治療病症之類型而變化。可能投與途徑包括非經腸(例如，肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下)、肺內及鼻內投與及(若需要局部免疫抑制治療)病灶內投與。另外，本發明抗體可以(例如)抗體之遞減劑量藉由脈衝輸注投與。較佳地，製藥部分地端視投與期之長短而藉由注射(最佳為靜脈內或皮下注射)投與。欲投與之量將端視多種因素(例如臨床症狀、個體重量、是否投與其他藥物)而定。熟習此項技術者將認識到，投與途徑將端視欲治療病症或病況而變化。
根據本發明測定新穎多肽之治療有效量將主要取決於特定患者特性、投與途徑及欲治療疾病之性質。通用指南可 參見(例如)International Conference on Harmonisation之出版物及REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第27及28章，第484-528頁(第18版，Alfonso R.Gennaro編輯，Easton,Pa.：Mack Pub.公司，1990)。更具體而言，測定治療有效量將取決於諸如藥劑毒性及功效等因素。毒性可利用業內熟知且見於上述參考文獻中之方法測定。功效可利用相同指南結合下文實例中所述之方法測定。
醫藥組合物及投與
本發明亦係關於醫藥組合物，其可包含單獨或與至少一種其他藥劑(例如穩定化合物)組合之PRLR抗體，其可以任何無菌、生物相容醫藥載劑(包括(但不限於)鹽水、緩衝鹽水、右旋糖及水)形式投與。該等分子中之任一者可單獨或與醫藥組合物中之其他藥劑、藥物或激素組合投與患者，其中將該分子與賦形劑或醫藥上可接受之載劑混合。在本發明之一個實施例中，醫藥上可接受之載劑具有醫藥惰性。
本發明亦係關於醫藥組合物之投與。此投與係非經腸達成。非經腸遞送方法包括局部、動脈內(直接至腫瘤)、肌內、皮下、髓內、鞘內、室內、靜脈內、腹膜腔內、子宮內或鼻內投與。除活性成份外，該等醫藥組合物可含有適宜的醫藥上可接受之載劑，其包含有助於將活性化合物處理成可在醫藥上使用之製劑的賦形劑及助劑。有關調配及投與技術其他細節可參見Remington's Pharmaceutical Sciences之最新版本(編輯Maack Publishing公司，Easton, Pa.)。
用於非經腸投與之醫藥調配物包括活性化合物之水溶液。對於注射而言，本發明醫藥組合物可以水溶液、較佳以生理上相容之緩衝液(例如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理緩衝鹽水)調配。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。另外，活性化合物之懸浮液可以適當油狀注射懸浮液形式製備。適宜親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯)或脂質體。視情況，懸浮液亦可含有增加化合物之溶解性之適宜穩定劑或藥劑以允許製備高濃縮溶液。
對於局部或經鼻投與而言，在調配中使用適於透過特定障壁之滲透劑。此等滲透劑為業內眾所周知。
非經腸投與亦包含非經腸遞送方法，其亦包括動脈內、肌內、皮下、髓內、鞘內及室內、靜脈內、腹膜腔內、子宮內、***或鼻內投與。
套組
本發明進一步係關於醫藥包裝及套組，其包含經本發明上述組合物之一或多種成份填充的一或多個容器。此等容器可附有呈由調控醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構規定之形式的公告，從而反映獲得供人類投與用產品之製造、使用或銷售之機構批準。
在另一實施例中，套組可含有編碼本發明抗體之DNA序 列。較佳地，編碼該等抗體之DNA序列係以適於轉染至宿主中並由宿主細胞表現之質粒形式提供。質粒可含有啟動子(經常為誘導型啟動子)以調控DNA在宿主細胞中之表現。質粒亦可含有適當限制位點以有助於其他DNA序列***質粒中，從而產生各種抗體。質粒亦可含有諸多其他元件以有助於選殖及表現經編碼蛋白質。此等元件為彼等熟習此項技術者所熟知且包括(例如)可選標記物、起始密碼子、終止密碼子及諸如此類。
製造及儲存
本發明醫藥組合物可以業內已知方式製造，例如，藉助習用混合、溶解、造粒、製糖衣丸、研磨、乳化、囊封、覆埋或凍乾製程。
醫藥組合物可在1 mM-50 mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇中在4.5至5.5之pH範圍下以凍乾粉末形式提供，該粉末在使用前與緩衝液組合。
在製備以可接受之載劑調配之包含本發明化合物之醫藥組合物後，可將其置於適當容器中且標記用於治療所指示病況。對於PRLR抗體之投與而言，此標記可包括投與之量、頻率及方法。
治療有效劑量
適用於本發明中之醫藥組合物包括含有有效量之活性成份之組合物以達成期望目的，即治療特徵在於表現PRLR之特定疾病狀態。有效劑量之測定一定在彼等熟習此項技術者之能力範圍內。
對於任何化合物而言，可最初在(例如)淋巴瘤細胞之細胞培養分析中或在動物模型(通常為小鼠、大鼠、兔、狗、豬或猴)中估計治療有效劑量。亦使用動物模型來達成合意投與濃度範圍及途徑。隨後可使用此等資訊來確定人類中之可用投與劑量及途徑。
治療有效劑量係指蛋白質或其抗體、拮抗劑或抑制劑改善症狀或病況之量。可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中確定治療功效及毒性，例如，ED50(於50%群體中治療有效之劑量)及LD50(致死50%群體之劑量)。治療效果與毒性效果之間之劑量比率係治療指數，且其可表示為比率ED50/LD50。展現大治療指數之醫藥組合物較佳。在調配供人類使用之劑量範圍中使用自細胞培養分析及動物研究獲得之數據。此等化合物之劑量較佳在循環濃度範圍內，其包括具有較少毒性或不具有毒性之ED50。劑量可端視所用劑型、患者敏感度及投與途徑在此範圍內變化。
正確劑量係由個別醫師根據欲治療患者選擇。調節劑量及投與以提供足量活性部分或維持期望效應。可考慮之其他因素包括疾病狀態之嚴重程度，例如子宮內膜異位病灶之大小及位置；患者之年齡、重量及性別；飲食、投與時間及頻率、藥物組合、反應敏感度，及對療法之耐受性/反應。可每3至4天、每週一次，或每兩週一次，或每月一次投與長效醫藥組合物，視特定調配物之半衰期及清除率而定。
正常劑量可自0.1微克至100,000微克，多達約2 g之總劑 量變化，視投與途徑而定。關於特定遞送劑量及方法之指導提供於文獻中。參見US.4,657,760、US 5,206,344或US 5,225,212。熟習此項技術者將採用與蛋白質或其抑制劑不同之聚核苷酸之調配物。相似地，多核苷酸或多肽之遞送將針對特定細胞、條件、位置等。經放射標記抗體之較佳比活性可在0.1至10 mCi/mg蛋白質範圍內(Riva等人，Clin.Cancer Res.5：3275s-3280s,1999；Wong等人，Clin.Cancer Res.6：3855-3863,2000；Wagner等人，J.Nuclear Med.43：267-272,2002)。
本發明進一步由以下實例闡述。僅提供實例以藉由參考特定實施例來闡釋本發明。該等例示闡釋本發明之某些特定態樣，並未描述限制或限定所揭示發明之範圍。
除非另有詳細闡述，否則所有實例係使用標準技術實施，該等技術為熟習此項技術者所熟知且係常規。以下實例之常規分子生物學技術可如標準實驗室手冊，諸如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989中所述實施。
實例 實例1 藉由中和性催乳激素受體抗體及非特異性對照抗體抑制由催乳激素誘導之BaF3細胞(經人類催乳激素受體穩定轉染之單株細胞)之增殖
為分析中和性PRLR抗體之活體外功效，使用對催乳激 素活化之BaF3細胞之細胞增殖之抑制。該等細胞經人類PRLR穩定轉染且在含有2 mM麩醯胺酸之RPMI中在10% FCS及10 ng/ml人類催乳激素存在下常規地培養。在含有1% FCS之無催乳激素之培養基中饑餓6個小時後，將細胞以25000個細胞/孔之密度接種至96孔板中。用35 ng/ml催乳激素刺激細胞且將其與增加劑量之中和性PRLR抗體一起共培育兩天。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)分析細胞增殖。產生抑制催乳激素刺激之細胞生長之劑量-反應曲線且計算IC50值。作為陰性對照，使用利用非特異性對照抗體之刺激。比較測試抗體Mat3與抗體HE 06.642(二者均呈IgG1模式)(圖9)。
實例2 藉由中和性催乳激素受體抗體及非特異性對照抗體抑制催乳激素誘導之BaF3細胞(經鼠類催乳激素受體穩定轉染之單株細胞)之增殖
為分析中和性PRLR抗體之活體外功效，使用對催乳激素活化之Ba/F3細胞之細胞增殖之抑制。該等細胞經鼠類PRLR穩定轉染且在含有2 mM麩醯胺酸之RPMI中在10% FCS及10 ng/ml鼠類催乳激素存在下常規地培養。在含有1% FCS之無催乳激素之培養基中饑餓6個小時後，將細胞以20000個細胞/孔之密度接種至96孔板中。用50 ng/ml催乳激素刺激細胞且將其與增加劑量之中和性PRLR抗體一起共培育三天。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)分析細胞增殖。產生抑制催乳激 素刺激之細胞生長之劑量-反應曲線且計算IC50值。作為陰性對照，使用利用非特異性對照抗體之刺激。比較測試抗體Mat3與抗體HE 06.642(二者均呈IgG1模式)(圖10)。
實例3 藉由中和性催乳激素受體抗體及非特異性對照抗體抑制催乳激素誘導之BaF3細胞(經恒河猴催乳激素受體穩定轉染之單株細胞)之增殖
為分析中和性PRLR抗體之活體外功效，使用對催乳激素活化之Ba/F3細胞之細胞增殖之抑制。該等細胞經恒河猴PRLR穩定轉染且在含有2 mM麩醯胺酸之RPMI中在10% FCS及10 ng/ml人類催乳激素存在下常規地培養。在含有1% FCS之無催乳激素之培養基中饑餓6個小時後，將細胞以25000個細胞/孔之密度接種至96孔板中。用100 ng/ml催乳激素刺激細胞且將其與增加劑量之中和性PRLR抗體一起共培育兩天。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)分析細胞增殖。產生抑制催乳激素刺激之細胞生長之劑量-反應曲線且計算IC50值。作為陰性對照，使用利用非特異性對照抗體之刺激。比較測試抗體Mat3與抗體HE 06.642(二者均呈IgG1模式)(圖11)。
實例4 在患者及健康對照之正位性及異位性子宮內膜及子宮內膜異位病灶中藉由即時TaqMan PCR分析來定量分析催乳激素及催乳激素受體基因表現
根據製造商說明書使用ABI Prism 7700 Sequence Detector System(PE Applied Biosystems)實施即時Taqman PCR分析且該分析如Endocrinolgy 2008,149(8)：3952-3959)所述且為熟習此項技術者已知。將PRL及PRLR之相對表現程度正規化成親環素之表現。藉由使用定量即時Taqman PCR分析來分析PRL及PRLR在健康女性之子宮內膜中及在患者之子宮內膜及子宮內膜異位病灶中之表現。與健康子宮內膜或源自患者之子宮內膜相比，子宮內膜異位病灶中催乳激素及其受體之表現明顯上調。
結果顯示於圖1及2中。
該等發現暗示，自分泌催乳激素信號傳導在子宮內膜異位症及子宮肌腺症(子宮內子宮內膜異位症，即限於子宮之子宮內膜異位症之形式)之產生及維持中發揮作用。
實例5 利用中和性PRLR抗體Mat3治療SHN小鼠之子宮肌腺症子宮(=子宮內子宮內膜異位症)
為測試中和性PRLR抗體在子宮內膜異位症中之功效，採用依賴於全身性高催乳激素血症之SHN小鼠之子宮肌腺症模型(Acta anat.116：46-54,1983)。藉由在腎囊膜下垂體同源移植7週齡女性小鼠來誘導SHN小鼠之高催乳激素血症(Acta anat.116：46-54,1983)。在垂體同源移植後兩週開始經皮下投與中和性PRLR抗體Mat3(30 mg/kg、10 mg/kg、3 mg/kg、1 mg/kg)或非特異性抗體(30 mg/kg)。用抗體治療動物，每週1次，持續7週。評價腺體組織對子宮肌層之浸潤，如先前所述(Laboratory Animal Science 1998, 48：64-68)。進行屍體剖檢(垂體移植後66天)，將子宮於4%緩衝福馬林(formalin)中固定過夜且包埋於石蠟中。子宮肌腺症(=子宮內子宮內膜異位症)之程度評價如下：0級=無子宮肌腺症
1級=子宮肌層之內層失去其同心定向
2級=子宮內膜腺體侵入子宮肌層之內層
3級=子宮內膜腺體在子宮肌層之內層與外層之間
4級=子宮內膜腺體侵入子宮肌層之外層
5級=子宮內膜腺體在子宮肌層之外層外部
該實驗包含以下實驗組：
1.無垂體移植之動物，即正常催乳激素血症性小鼠
2.具有垂體移植之動物，即高催乳激素血症性小鼠
3.具有垂體移植之動物，其用非特異性對照抗體每週1次以30 mg/kg之劑量治療
4.具有垂體移植之動物，其用呈鼠類IgG2a模式之中和性催乳激素受體抗體Mat3每週1次以30 mg/kg之劑量治療
5.具有垂體移植之動物，其用呈鼠類IgG2a模式之中和性催乳激素受體抗體Mat3每週1次以10 mg/kg之劑量治療
6.具有垂體移植之動物，其用呈鼠類IgG2a模式之中和性催乳激素受體抗體Mat3每週1次以3 mg/kg之劑量治療
7.具有垂體移植之動物，其用呈鼠類IgG2a模式之中和 性催乳激素受體抗體Mat3每週1次以1 mg/kg之劑量治療
中和性PRLR抗體Mat3抑制子宮內子宮內膜異位症(=子宮肌腺症)(圖12)。因此，中和性PRLR抗體Mat3適於治療女性之子宮內子宮內膜異位症(=子宮肌腺症)及子宮外子宮內膜異位症。
實例6 中和性PRLR抗體Mat3適於治療良性***疾病
活化PRLR突變或局部或全身性高催乳激素血症可引起良性***疾病。因此，採用乳腺中具有增強增殖(良性***疾病之最嚴重形式之標誌)之高催乳激素血症性小鼠模型。12週齡女性Balb/c小鼠在腎囊膜下接受垂體同源移植物或保持未經操作。垂體同源移植小鼠保持未經治療或在垂體移植後第15天、第22天、第29天及第36天經皮下每週1次用呈IgG2模式之中和性PRLR抗體Mat3(=IgG2 Mat3)或用呈IgG2模式之非特異性對照抗體治療。抗體劑量係30 mg/kg。實驗組大小係8隻動物。
該實驗包含以下實驗組：
1.無垂體移植之動物，即正常催乳激素血症性小鼠
2.具有垂體移植之動物，即高催乳激素血症性小鼠
3.具有垂體移植之動物，其用非特異性對照抗體每週1次以30 mg/kg之劑量治療
4.具有垂體移植之動物，其用中和性催乳激素受體抗體Mat3每週1次以30 mg/kg之劑量治療
在垂體移植後第38天處死小鼠。在死亡前2小時，動物接受BrdU之腹膜腔內注射以監測上皮細胞增殖。將左腹腔溝乳腺固定於卡諾依溶液(Carnoy's solution)中並製備乳腺全形封閉物(whole mount)且用明礬洋紅(Carmine alaune)染色。評估乳腺全形封閉物中之側向分支。結果繪示於圖3A中。抗體Mat3抑制乳腺中之側向分支，非特異性對照抗體沒有效應(圖3A)。
此後，將乳腺全形封閉物包埋於石蠟中並實施BrdU免疫染色，如先前所述(Endocrinology 149(8)：3952-3959；2009)。分析每隻動物4個組織學乳腺切片中之上皮細胞增殖。
將右腹股溝乳腺之1/3無淋巴結側面在液氮中冷凍並處理以供製備RNA。在反轉錄後，根據製造商說明書使用ABI Prism 7700 Sequence Detector System(PE Applied Biosystems)實施即時Taqman PCR分析。評價催乳激素靶基因elf 5之表現且將其正規化成細胞角蛋白18表現。藉由比較△CT-方法來計算相對mRNA程度。垂體同源移植，即高催乳激素血症增強催乳激素靶基因elf 5之表現(圖3B)。特異性抗體Mat3，而非非特異性對照抗體抑制elf 5基因表現，從而指示催乳激素受體之順利阻斷(圖3B)。
因此，抗體Mat3適於治療良性***疾病。
實例7 自人類抗體噬菌體展示文庫分離靶特異性抗體
為分離一組能夠中和人類PRLR之活性之抗體，平行研 究3個表現Fab及scFv片段之人類抗體噬菌體展示文庫。用於文庫淘選之靶係人類及小鼠催乳激素受體之可溶性細胞外結構域(ECD)，其分別由SEQ ID NO.12及13之胺基酸1-210代表。替代靶係PRLR之ECD，其C末端經由具有胺基酸序列「異白胺酸-麩胺酸-甘胺酸-精胺酸-甲硫胺酸-天冬胺酸」之連接體連接至6個組胺酸或人類IgG1-Fc結構域。
自噬菌體展示選擇靶特異性抗體係根據由Marks等人(Methods MoI Biol.248：161-76,2004)所述之方法實施。將噬菌體展示文庫與50 pmol生物素化ECD在室溫下一起培育1 hr且然後使用100 μl抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)珠粒懸浮液(Dynabeads ® M-280抗生蛋白鏈菌素，Invitrogen)捕獲所形成複合物。藉由用洗滌緩衝液(PBS+5%牛乳)洗滌珠粒去除非特異性噬菌體。用0.5 ml 100 nM三乙胺(TEA)溶析經結合噬菌體，且立即藉由添加等體積IM TRIS-Cl pH 7.4來中和。使用經溶析噬菌體彙集物來感染於對數期生長之TG1大腸桿菌(E coli)細胞，且如所述挽救噬菌粒(Methods MoI Biol.248：161-76,2004)。重複總共3輪選擇。在ELISA分析中針對結合活性篩選自來自第三輪淘選之經溶析噬菌體感染之TG1細胞獲得的單菌落。簡言之，使用自經溶析噬菌體感染之TG1細胞獲得之單菌落來接種96孔板中之培養基。
在振盪培育器中在30℃下過夜培養後使微量培養物生長至OD600=0.6，此時藉由添加1 mM IPTG誘導可溶性抗體片段之表現。旋轉沈澱細菌且製備周質提取物並使用其依照 由微量板製造商提供之標準ELISA方案來檢測與固定於96孔微量板(96孔平底Immunosorb板，Nunc)上之ECD的抗體結合活性。
使用Biacore® 2000來估計抗催乳激素受體(PRLR)抗體與重組細胞外結構域(ECD)之結合親和力且使用該親和力對抗體親和力分級。
實例8 抗體變體之成熟：
抗體親和力成熟係兩步驟過程，其中組合飽和誘變與基於孔之高通量篩選以鑑別少量導致親和力增加之突變。在每一輪親和力成熟中，根據BMC Biotechnology 7：65,2007使用NNK-三核苷酸匣(cassette)(其中N代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤與胞嘧啶核苷酸之混合物，其中每一者各佔25%；且K代表胸腺嘧啶與鳥嘌呤核苷酸之混合物，其中每一者各佔50%)藉由定位誘變引入野生型抗體之位置多樣化。此方式於個別胺基酸位置處引入所有20個胺基酸。此位置隨機化限於6個互補決定區(CDR)。在第二輪親和力成熟中，組合有益取代且針對進一步改良進行篩選。
藉由ELISA測試篩選成熟「005-C04」Fab變體：
用1 μg/毫升人類PRLR塗佈96孔微量滴定板。將板在4℃下培育過夜。在用含有3%牛血清白蛋白之PBS緩衝液阻斷後，添加含有Fab變體之源自大腸桿菌之正規化上清液。經由添加經辣根過氧化物酶標記之抗flag抗體(Sigma,A8592)來檢測所形成複合物。
添加Amplex Red作為辣根過氧化物酶之螢光受質且在室溫下將其培育30分鐘。使用Tecan Infinite F500讀數器量測570 nm下之吸光度及585 nm下之消光度。篩選命中物(hit)「005-C04-20-2」之所得結果顯示於圖7中。評估篩選命中物「005-C04-20-2」(圖7)中有益於親和力改良之個別取代對熱抗體穩定性之影響，以確保在藉由溫度升高變性期間協作展開Fab結構域。抗體Mat3係「005-C04-20-2」之衍生物，其中已將熱去穩定取代逆轉成親代抗體「005-C04」。
實例9 抗體對細胞表面上表現之小鼠及人類PRLR之交叉反應性
a)為理解抗體HE06642對帶有鼠類PRLR之細胞之缺失性抗增殖活性，在分別穩定表現人類及鼠類PRLR之HEK293細胞上藉由流式細胞術測定HE06642對細胞上表現之小鼠及人類PRLR之結合特性。收穫無PRLR之細胞以及親代HEK293細胞系，離心且以約5×106個細胞/ml再懸浮於含有2% FBS及0.1%疊氮化鈉之1×PBS(FACS緩衝液)中。將抗體HE06642於FACS緩衝液中稀釋至2倍最終濃度且添加至適當試樣孔(50 μl/孔)中。對於二級抗體及自發螢光對照而言，將50 μl FACS緩衝液添加至適當孔中。將50 μl細胞懸浮液添加至每一試樣孔中。在4℃下將試樣培育1小時，用冷FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於以1：100稀釋之含有PE-偶聯山羊抗人類IgG之FACS緩衝液中。在4℃下培育30 min後，用冷FACS緩衝液將細胞洗滌兩次，再懸浮於 含有1 mg/ml碘化丙錠(Invitrogen,San Diego,CA)之FACS緩衝液中且藉由流式細胞術分析。如圖5A中所示，抗體HE06.642僅結合至人類PRLR且不結合至鼠類PRLR。此觀察與實例2及12中關於HE06.642在鼠類PRLR依賴性增殖及螢光素酶報告子基因分析中之缺失性活性所報告之發現一致。
b)為顯示抗體Mat3對帶有人類及恒河猴PRLR(其細胞外結構域之胺基酸序列與食蟹獼猴一致)之細胞之細胞結合，在分別穩定表現人類及猴PRLR之HEK293細胞上藉由流式細胞術測定Mat3對細胞上表現之人類及猴PRLR之結合特性。收穫細胞，離心且以約2×106細胞/ml再懸浮於含有3% FBS及0.05%疊氮化鈉之1×PBS(FACS緩衝液)中。將抗體Mat3於FACS緩衝液中稀釋至2倍最終濃度且添加至適當試樣孔(50 μl/孔)中。對於二級抗體及自發螢光對照而言，將50 μl FACS緩衝液添加至適當孔中。將50 μl細胞懸浮液添加至每一試樣孔中。在4℃下將試樣培育1小時，用冷FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於以1：100稀釋之含有PE-偶聯山羊抗人類IgG之FACS緩衝液中。在4℃下培育30 min後，用冷FACS緩衝液將細胞洗滌兩次，再懸浮於含有1 mg/ml碘化丙錠(Invitrogen,San Diego,CA)之FACS緩衝液中且藉由流式細胞術分析。如圖5B中所示，抗體Mat3結合至人類PRLR以及猴PRLR。最高抗體濃度下之最大信號強度取決於細胞表面上所表現PRLR之數目，即HEK293及Ba/F細胞在其表面上不帶有相同數目之PRLR。基於圖5B 中闡釋之劑量反應曲線計算EC50值，以獲得Mat3對細胞之結合強度之量測值(表2)。Mat3之基於細胞之結合效能係0.53 nM(在具有人類PRLR之HEK293細胞上)及2.94 nM(在具有猴PRLR之Ba/F細胞上)。該等數據支持以下發現，Mat3不僅係極有效之人類特異性藥劑，且亦在低毫微莫耳範圍內以合理劑量對猴PRLR具有活性。
實例10 利用經純化細胞外PRLR結構域使用表面電漿共振分析進行結合研究
藉由在Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore公司)上進行表面電漿共振分析來測定抗體Mat3之結合親和力。經由間接捕獲試劑抗人類IgG Fc將抗體固定至CM5感測器晶片上。使用來自「Human Antibody Capture Kit」(BR-1008-39，GE Healthcare Biacore公司)之試劑，如由製造商所述。每個細胞固定約5000 RU單株小鼠抗人類IgG(Fc)抗體。將抗體Mat3以5 μg/ml之濃度以10 μl/min注射10 sec以達到約200 RU至600 RU之捕獲量。將不同濃度(400 nM、200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM及3.12 nM)之存於HEPES-EP緩衝液(GE Healthcare Biacore公司)中之人類、猴或鼠類PRLR的ECD以60 μl/min之流速注射於經固定Mat3抗體上，且持續3分鐘並解離10分鐘。人類PRLR之ECD(SEQ ID NO：12)、猴PRLR之ECD(SEQ ID NO：11，在經由因子Xa消化蛋白水解去除Fc-His-標籤後)及鼠類PRLR之ECD(SEQ ID NO：13)代表單價分析物。在 依次進行在線參考細胞校正、緩衝液試樣扣除後產生感測圖。基於締合速率常數(kon)與解離速率常數(koff=kd)之比率來計算解離平衡常數(KD)，該等常數係藉由利用一階1：1結合模型擬合感測圖使用BiaEvaluation軟體獲得。單價解離常數(KD，親和力)及解離速率(kd=koff)值顯示於表1中。
實例11 肽掃描 a)肽合成：
為自人類PRLR之ECD胺基酸位置1至210重新構築靶分子SEQ ID NO.12之不連續表位，合成經結構化肽文庫。此係使用Pepscan之專有化學連接之支架上之肽(Pepscan's proprietary Chemically Linked Peptides)(CLIPS)技術進行(Timmerman等人，2007,J.Mol.Recognit.20：283-99；Pepscan Therapeutics,Lelystad,Netherlands)。CLIPS技術允許將肽結構化成單環、雙環、三環、片樣摺疊、螺旋樣摺疊及其組合。CLIPS模板偶合至半胱胺酸殘基。肽中多個半胱胺酸之側鏈偶合至一或兩個CLIPS模板。例如，將T2 CLIPS模板1,3-雙(溴甲基)苯之0.5 mM溶液溶解於碳酸氫銨(20 mM,pH 7.9)/乙腈(1：1(v/v))中。將此溶液添加至肽陣列上。CLIPS模板結合至肽陣列(具有3 μl孔之455孔板)之固相結合肽中所存在之兩個半胱胺酸之側鏈。將肽陣列在溶液中輕輕振盪30分鐘至60分鐘，同時完全覆蓋於溶液中。最後，用過量H2O充分洗滌肽陣列且在70℃下在含有存於PBS中之1% SDS/0.1% β-巰基乙醇之破裂緩衝液 (pH 7.2)中音波處理30分鐘，之後在H2O中再音波處理45分鐘。以相似方式製備帶有肽之T3 CLIPS，但現在具有3個半胱胺酸。
b)Pepscan ELISA：
在基於PEPSCAN之ELISA中測試抗體Mat3及抗體HE06642與每一肽之結合(Slootstra等人，1996,Molecular Diversity 1：87-96)。預培育肽陣列與5%至100%-結合緩衝液(1 hr,20℃)。結合緩衝液係由1% Tween-80、4%馬血清、5%卵白蛋白(w/v)構成且用PBS稀釋。在洗滌後，將肽陣列與存於含有1% Tween-80之PBS中之一級抗體溶液(1 μg/ml至5 μg/ml)一起培育(在4℃下過夜)。在洗滌後，在25℃下將肽陣列與抗體過氧化物酶偶聯物(抗人類，humpo)存於100%結合緩衝液中之1/1000稀釋液一起培育1小時。在洗滌後，添加過氧化物酶受質2,2'-次偶氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽(ABTS)及2微升/毫升3% H2O2。1小時後，量測顯色。用電荷耦合器件(CCD)-相機及影像處理系統量化顯色。
c)數據處理：
原始數據係藉由CCD-相機獲得之光學值。該等值在0 mAU至3000 mAU範圍內，此與標準96孔板ELISA-讀數器相似。量化結果且將其儲存至Peplab數據庫中。提取結合值以供分析。孔偶爾含有氣泡，從而導致偽陽性值，手動檢測卡片且將由氣泡引起之任何值評為0分。
d)數據分析及表示：
級圖(heat map)係數據圖示，其中來自實驗數據之經驗值係以二維圖組織，且隨後以色彩表示(Brinton,1914,Graphic Methods for Presenting Facts,New York：The Engineering Magazine公司；Gower及Digby，1981，「Expressing complex relationships in two dimensions」，Interpreting Multivariate Data，Barnett,V.,Chichester編輯，UK：John Wiley & Sons，第83-118頁)。對於雙環CLIPS肽而言，此二維圖可源自第一環及第二環之獨立性序列。
對於靶蛋白質(人類PRLR之ECD)而言，2916 CLIPS肽具有54個獨特子序列以兩個依序CLIPS環有效組合排列之序列。因此，所觀察Pepscan ELISA數據可以54×54矩陣標繪，其中每一X座標係第一環之胺基酸序列，且每一Y座標係第二環之胺基酸序列。對於矩陣中之每一XY座標而言，放置源自具有序列X+Y之肽的Pepscan ELISA值。為進一步促進可視化，用來自連續梯度之色彩替代Pepscan ELISA值。在此情況下，將極低值標為綠色，將極高值標為紅色，且將平均值標為黑色。當將此色彩圖應用於所述數據矩陣時，產生色彩級圖。基於該等級圖表示選擇抗體Mat3與HE06642之間在ELISA結果上顯示最顯著差異之肽。對於該等肽而言，處理每一ELISA信號值以供表示於長條圖(圖8A及8B)中。每一標繪值代表針對54個肽獲得之平均值與S.E.M(平均值之標準誤差)。將數據正規化成整個2916肽數據集之平均值且針對背景信號進行校正。
圖8A顯示在胺基酸103-PDPPLELAVEVKQPE-117(指示 為X軸上之「117」)至127-WSPPTLIDLKTGWFT-141(指示為「141」)之範圍內之肽子集的ELISA結果。即該等沿ECD胺基酸序列位移3個胺基酸之肽覆蓋人類PRLR之ECD之胺基酸位置103至141的區。此數據集內觀察到之最強差異係針對肽109-LAVEVKQPEDRKPYL-123(指示為「123」)，其中顯著性p值為4×10-12；及針對肽121-PYLWIKWSPPTLIDL-135(指示為「135」)，其中顯著性p值為7×10-40。
圖8B顯示在139-WFTLLYEIRLKPEKA-153(指示為X軸上之「153」)至163-QQTEFKILSLHPGQK-177(指示為「177」)之範圍內之肽子集的ELISA結果。即該等沿ECD胺基酸序列位移3個胺基酸之肽覆蓋人類PRLR之ECD之胺基酸位置139至177的區。此數據集內觀察到之最強差異係針對肽148-LKPEKAAEWEIHFAG-162(指示為「162」)，其中顯著性p值為6×10-26；及針對肽160-FAGQQTEFKILSLHP-174(指示為「174」)，其中顯著性p值為8×10-8。
該等數據顯示，兩種抗體均結合至人類PRLR之ECD之S2子結構域(胺基酸101至210)且因此不會與主要結合至S1結構域之天然配體PRL競爭。然而，此肽掃描顯示，Mat3與HE06642之間在結合至S2結構域上存在差異。此發現指示抗體Mat3與HE06642相比顯示不同物種特異性及效能之原因。
實例12 在經人類及鼠類PRLR穩定轉染之HEK293細胞中之螢光素 酶報告子基因活性之抑制
為進一步分析中和性PRLR抗體Mat3對人類及鼠類PRLR之活體外活性，使用報告子基因分析。經鼠類PRLR穩定轉染之HEK293細胞經在LHRE(催乳激素反應元件)控制下之螢光素酶報告子基因瞬時轉染。此後，將細胞以20000個細胞/孔(80 μl)之密度接種於96孔板上之具有4.5 g/L葡萄糖、2 mM Glutamax、0.5% FCS及1%青黴素(Penicillin)/鏈黴素(Streptomycin)之DMEM高葡萄糖培養基中。在下一天添加200 ng/ml具有及不具有增加劑量之測試抗體(10 μl)之人類催乳激素(10 μl)。24小時後，測定螢光素酶活性。對於比較而言，亦測試抗體HE06642及靶向稱為CTX之霍亂毒素之非特異性抗體。所有抗體均作為IgG1分子測試(圖13A及13B)。
實例13 利用經純化細胞外PRLR結構域使用表面電漿共振分析進行結合研究
藉由在Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore公司)上進行表面電漿共振分析來平行測定抗體Mat3及HE06642之結合親和力。經由間接捕獲試劑抗人類IgG Fc將抗體固定至CM5感測器晶片上。使用來自「Human Antibody Capture Kit」(BR-1008-39，GE Healthcare Biacore公司)之試劑，如由製造商所述。每個細胞固定約5000 RU單株小鼠抗人類IgG(Fc)抗體。將每一測試抗體以5 μg/ml之濃度以10 μl/min注射10 sec以達到約200 RU至600 RU之捕獲量。將 不同濃度(400 nM、200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM及3.12 nM)之存於HEPES-EP緩衝液(GE Healthcare Biacore公司)中之人類、猴或鼠類PRLR的ECD以60 μl/min之流速注射於經固定測試抗體上，且持續3分鐘並解離10分鐘。人類PRLR之ECD(SEQ ID NO：12)、猴PRLR之ECD(SEQ ID NO：11，在蛋白經由因子Xa消化水解去除Fc-His-標籤後)及鼠類PRLR之ECD(SEQ ID NO：13)代表單價分析物。在依次進行在線參考細胞校正、緩衝液試樣扣除後產生感測圖。基於締合速率常數(kon)與解離速率常數(koff=kd)之比率計算解離平衡常數(KD)，該等常數係藉由利用一階1：1結合模型擬合感測圖使用BiaEvaluation軟體獲得(參見表7)。
如表7中所示，Mat3與HE06.642相比展現與猴及鼠類PRLR之經改良親和力。與HE06.642相比與hPRLR之經改良親和力並不反映Mat3對人類PRLR之經改良細胞結合及 抗增殖活性。儘管結合至鼠類PRLR之經純化ECD，但HE06.642不結合細胞或抑制表現鼠類PRLR之細胞之增殖(圖10及14，表8)。相比之下，在所有三種物種中，Mat3以毫微莫耳至亞毫微莫耳級阻斷細胞增殖。
另外，經由經固定測試抗體Mat3及HE06642將可溶性ECD-PRLR(SEQ ID NO：12)捕獲於表面上，因此，對於所有經結合ECD-PRLR分子而言，阻斷捕獲抗體之表位。將人類PRL立即傳送至表面上以結合至經固定ECD-PRLR。以此方式，可量測PRL是否結合ECD-PRLR，但測試抗體捕獲ECD。
可觀察到，PRL結合ECD-PRLR，此獨立於結合至Mat3及HE06.642。因此，兩種抗體均不會與ECD-PRLR上之天然配體PRL競爭。
實例14 抗體對表現人類、小鼠及猴PRLR之各種細胞系之細胞結合研究
利用抗體Mat3及HE06642以及霍亂毒素特異性同種型對照實施細胞結合研究，所有抗體及對照均呈IgG1模式。測試細胞系係分別穩定表現人類及小鼠PRLR之HEK293細胞、人類乳癌細胞系T47D以及表現人類、小鼠及恒河猴PRLR之Ba/F細胞系。細胞結合係在上述細胞上藉由流式細胞術來測定。收穫細胞，離心且以約2×106細胞/ml再懸浮於含有3% FBS及0.05%疊氮化鈉之1×PBS(FACS緩衝液)中。將每一測試抗體於FACS緩衝液中稀釋至2倍最終濃度 且添加至適當試樣孔(50 μl/孔)中。對於二級抗體及自發螢光對照而言，將50 μl FACS緩衝液添加至適當孔中。將50 μl細胞懸浮液添加至每一試樣孔中。在4℃下將試樣培育1小時，用冷FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於以1：100稀釋之含有PE-偶聯山羊抗人類IgG之FACS緩衝液中。在4℃下培育30 min後，用冷FACS緩衝液將細胞洗滌兩次，再懸浮於含有1 mg/ml碘化丙錠(Invitrogen,San Diego,CA)之FACS緩衝液中且藉由流式細胞術分析。
所得數據作為劑量-反應曲線顯示於圖14中。自該等曲線推導EC50值，從而指示細胞結合效能(表8)。總之，數據指示Mat3與HE06.642相比在不同的PRLR-表現細胞系間之極佳細胞結合特性。
圖1：催乳激素-mRNA(PRL-mRNA)(藉由即時TaqMan PCR分析來分析)在健康女性及罹患子宮內膜異位症之女性之人類子宮內膜及病灶(異位性組織)中之表現。
圖2：催乳激素受體-mRNA(PRLR-mRNA)(藉由即時TaqMan PCR分析來分析)在健康女性及罹患子宮內膜異位症之女性之人類子宮內膜及病灶(異位性組織)中之表現。
圖3A：中和性催乳激素受體抗體Mat3抑制已用於良性***疾病之高催乳激素血症性代用模型中之小鼠之乳腺中的側向分支。非特異性抗體不具有效應。健康正常催乳激素血症性小鼠(無垂體)顯示側向分支減少，而垂體移植(高催乳激素血症)增強側向分支及小葉肺泡發育。特異性抗體Mat3拮抗高催乳激素血症之效應。
圖3B：中和性催乳激素受體抗體Mat3抑制在良性***疾病之高催乳激素血症性代用模型中在小鼠之乳腺中誘導催乳激素靶基因elf 5。非特異性抗體不具有效應。健康正常催乳激素血症性小鼠(無垂體)顯示乳腺中elf 5之表現減少，而垂體移植(高催乳激素血症)顯著刺激elf 5基因表現。特異性抗體Mat3而非非特異性對照抗體拮抗高催乳激素血症之效應。
圖4：根據Johnson及Wu(Nucleic Acids Res.2000,28,214-218)對框架胺基酸位置進行Kabat編號。
圖5A：對抗PRLR抗體HE06642之FACS分析結果。以固定濃度測定抗體對表現人類及小鼠PRLR之HEK293細胞與 不表現PRLR之親代細胞系相比之結合。Y軸：#，中值螢光強度，以0.37 μg/ml呈IgG1分子之HE06642。*，1=具有人類PRLR之HEK293；2=具有鼠類PRLR之HEK293；3=不具有PRLR之HEK293。
圖5B：對抗PRLR抗體Mat3之FACS分析結果。以一系列不同濃度測定抗體對表現人類PRLR之HEK293細胞及表現恒河猴PRLR之Ba/F細胞與不表現PRLR之細胞系(HEK293)相比之結合。最高抗體濃度下之最大信號強度取決於細胞表面上所表現PRLR之數目，即HEK293及Ba/F細胞在其表面上不帶有相同數目之PRLR。Y軸：#，中值螢光強度；X軸：∘，呈IgG2分子之抗體Mat3之不同濃度(μg/ml)；*，1(圓形)=具有人類PRLR之HEK293；2(三角形)=具有恆河猴PRLR之Ba/F；3(正方形)=不具有PRLR之HEK293。
圖6A：Mat3-VL結構域之序列區與VBASE2中鑑別之最相似人類V區段之比對(Mat3-VL與種系序列humIGLV056 90%一致)。
圖6B：Mat3-VH結構域之序列區與VBASE2中鑑別之最相似人類V區段之比對(Mat3-VH與種系序列humIGHV313 90%一致)。
圖6C：HE06642-VL結構域之序列區與VBASE2中鑑別之最相似人類V區段之比對(HE06642-VL與種系序列humIGKV083 80%一致)。
圖6D：HE06642-VH結構域之序列區與VBASE2中鑑別之最相似人類V區段之比對(HE06642-VH與種系序列 humIGHV313 89%一致)。
圖7：對成熟Fab變體之基於ELISA之結合測試：針對與人類PRLR之經固定細胞外結構域之結合測試含有Fab之大腸桿菌上清液。該圖以長條圖形式闡釋Fab變體之結合。信號強度(消光度)(#)在y軸上給出，Fab變體之名稱(*)在x軸上給出。成熟Fab變體005-C04-20-2與親代抗體005-C04之非成熟Fab相比信號強度升高顯示005-C04-20-2與005-C04相比之較佳PRLR-結合。「變體」pET28代表帶有不表現任何Fab之Fab-表現質粒pET28a(Novagen,EMD Chemicals Group,Merck,Darmstadt,Germany)之大腸桿菌菌株的上清液。
圖8：Pepscan ELISA結果之Barplot表示。
每一標繪值代表針對54個肽獲得之平均值與S.E.M(平均值之標準誤差)。黑色條形代表抗體HE06642之相對結合強度。白色條形代表抗體Mat3之相對結合強度。將數據正規化成整個2916肽數據集之平均值且針對背景信號進行校正。
圖8A顯示在胺基酸103-PDPPLELAVEVKQPE-117(指示為X軸上之「117」)至127-WSPPTLIDLKTGWFT-141(指示為「141」)之範圍內之肽子集的ELISA結果。即該等沿ECD胺基酸序列位移3個胺基酸之肽覆蓋人類PRLR之ECD之胺基酸位置103至141的區。此數據集內觀察到之最強差異係針對肽109-LAVEVKQPEDRKPYL-123(指示為「123」)，其中顯著性p值為4×10-12；及針對肽121- PYLWIKWSPPTLIDL-135(指示為「135」)，其中顯著性p值為7×10-40。
圖8B顯示在139-WFTLLYEIRLKPEKA-153(指示為X軸上之「153」)至163-QQTEFKILSLHPGQK-177(指示為「177」)之範圍內之肽子集的ELISA結果。即該等沿ECD胺基酸序列位移3個胺基酸之肽覆蓋人類PRLR之ECD之胺基酸位置139至177的區。此數據集內觀察到之最強差異係針對肽148-LKPEKAAEWEIHFAG-162(指示為「162」)，其中顯著性p值為6×10-26；及針對肽160-FAGQQTEFKILSLHP-174(指示為「174」)，其中顯著性p值為8×10-8。
該等數據顯示，兩種抗體均結合至人類PRLR之ECD之S2子結構域(胺基酸101至210)且因此不會與主要結合至S1結構域之天然配體PRL競爭。然而，此肽掃描顯示，Mat3與HE06642之間在結合至S2結構域上存在差異。此發現指示抗體Mat3與HE06642相比顯示不同物種特異性及效能之原因。
圖9：藉由中和性催乳激素受體抗體及非特異性對照抗體抑制催乳激素誘導之BaF3細胞(經人類催乳激素受體穩定轉染之單株細胞)之增殖。測定呈IgG1模式之以下抗體之IC50值：Mat3(實心圓形)，IC50=0.7 nM[100%抑制，以1 μg/ml(=6.7 nM)]；HE06.642(空心正方形)，IC50=4.2 nM[81%抑制，以1 μg/ml(=6.7 nM)]；非特異性對照抗體(空心三角形)：無抑制效應。
圖10：藉由中和性催乳激素受體抗體及非特異性對照抗 體抑制催乳激素誘導之BaF3細胞(經鼠類催乳激素受體穩定轉染之單株細胞)之增殖。測定呈IgG1模式之以下抗體之IC50值：Mat3(實心圓形)，IC50=3.0 nM[97.4%抑制，以1 μg/ml(=6.7 nM)]；HE06.642(空心正方形)，無抑制效應；非特異性對照抗體(空心三角形)：無抑制效應。
圖11A及11B：藉由中和性催乳激素受體抗體及非特異性對照抗體抑制催乳激素誘導之BaF3細胞(經恒河猴催乳激素受體穩定轉染之單株細胞)之增殖。測定呈IgG1模式之以下抗體之IC50值：Mat3(實心圓形)，IC50=4.6 nM[99.1%抑制，以1 μg/ml(=6.7 nM)](參見圖11A)；HE06.642(空心正方形)，IC50=206 nM[92.4%抑制，以240 μg/ml(=1600 nM)](參見圖11A及11B)；非特異性對照抗體(空心三角形)：無抑制效應(參見圖11A及11B)。
圖12：利用中和性PRLR抗體Mat3治療SHN小鼠之子宮肌腺症子宮(=子宮內子宮內膜異位症)。結果以疾病評分(子宮肌腺症評分)繪示於y軸上，如實例5中所述。每一實驗組之中值疾病分數指示為水平條形。實驗組如下：1組，無垂體同源移植物(正常催乳激素血症性小鼠在一定程度上產生子宮內子宮內膜異位症，中值疾病評分=1)；2組，具有垂體同源移植物(因垂體同源移植所致之高催乳激素血症提高疾病評分，中值疾病評分=3)；3組，具有垂體同源移植物，其用非特異性鼠類IgG2a同種型對照抗體每週1次以30 mg/kg之劑量治療(中值疾病評分=3)；4組，具有垂體同源移植物，其用呈鼠類IgG2a模式之抗體Mat3 (Mat3-mIgG2a)每週1次以30 mg/kg之劑量治療(Mat3完全治癒該等動物)。每週1次給予30 mg/kg Mat3後之疾病評分(中值疾病評分=0)甚至低於正常催乳激素血症性小鼠之疾病評分(中值疾病評分=1)；5組，具有垂體同源移植物，其用抗體Mat3-mIgG2a每週1次以10 mg/kg之劑量治療(中值疾病評分=2)；6組，具有垂體同源移植物，其用抗體Mat3-mIgG2a每週1次以3 mg/kg之劑量治療(中值疾病評分=2.5)；7組，具有垂體同源移植物，其用抗體Mat3-mIgG2a每週1次以1 mg/kg之劑量治療(中值疾病評分=2.5)。經抗體Mat3治療顯示中值疾病評分之劑量依賴性降低。因此，Mat3適於治療女性之子宮內子宮內膜異位症(=子宮肌腺症)及子宮外子宮內膜異位症。
圖13A及13B：在經人類及鼠類PRLR穩定轉染之HEK293細胞中之螢光素酶報告子基因活性之抑制。在圖13A中相對於抗體濃度繪製人類PRLR依賴性活性，而圖13B顯示鼠類PRLR依賴性活性。螢光素酶活性係以不添加任何抗體獲得之最大螢光素酶活性之百分比給出。測定呈IgG1模式之以下抗體之IC50值：Mat3(實心圓形)，IC50=0.5 nM(圖13A，hPRLR)及1.3 nM(圖13B，mPRLR)；HE06.642(空心正方形)，IC50=4.6 nM(圖13A，hPRLR)及>>1333 nM(=20 μg/ml)(圖13B，mPRLR)；非特異性同種型對照抗體(空心三角形)：無抑制效應(參見圖13A及13B)。該等數據顯示Mat3與HE06.642相比對hPRLR之改良活性且顯示Mat3對mPRLR之活性，而HE06.642不抑制mPRLR依賴性螢光 素酶活性。
圖14：中和性PRLR抗體對表現人類、小鼠及猴之PRLR之細胞之細胞結合，其中使用流式細胞術。相對於抗體濃度繪製中值螢光信號強度。應用以下IgG1抗體：Mat3(實心圓形)、HE06.642(空心正方形)、非特異性同種型對照抗體(空心三角形)。測試不同細胞系：A)經人類PRLR穩定轉染之HEK293細胞系、B)經鼠類PRLR穩定轉染之HEK293細胞系、C)未經任何PRLR基因轉染之HEK293細胞系(陰性對照細胞系)、D)人類乳癌細胞系T47D、E)經恒河猴PRLR穩定轉染之BaF3細胞系、F)經人類PRLR穩定轉染之BaF3細胞系、G)經鼠類PRLR穩定轉染之BaF3細胞系。已自劑量-反應曲線以EC50值推導抗體對不同細胞系之細胞系結合效能(參見表8)。劑量-反應曲線指示Mat3與HE06.642相比之極佳細胞結合性質。
Seq ID NO：1代表Mat3之VH之胺基酸序列
Seq ID NO：2代表Mat3之VL之胺基酸序列
Seq ID NO：3代表Mat3之VH之核酸序列
Seq ID NO：4代表Mat3之VL之核酸序列
Seq ID NO：5代表Mat3之HCDR1之胺基酸序列
Seq ID NO：6代表Mat3之HCDR2之核酸序列
Seq ID NO：7代表Mat3之HCDR3之核酸序列
Seq ID NO：8代表Mat3之LCDR1之核酸序列
Seq ID NO：9代表Mat3之LCDR2之核酸序列
Seq ID NO：10代表Mat3之LCDR3之核酸序列
Seq ID NO：11代表食蟹獼猴及恒河猴PRLR之融合至Fc-His之細胞外結構域的胺基酸序列
Seq ID NO：12代表人類ECD_PRLR胺基酸位置1-210，S1結構域1-100(S1結構域構築體1-102)，S2結構域101-210
Seq ID NO：13代表鼠類ECD_PRLR胺基酸位置1-210
Seq ID NO：14代表Novartis(WO 2008/22295)之HE06642之VH的胺基酸序列
Seq ID NO：15代表Novartis(WO 2008/22295)之HE06642之VL的胺基酸序列
Seq ID NO：16代表Novartis(WO 2008/22295)之HE06642之VH的核酸序列
Seq ID NO：17代表Novartis(WO 2008/22295)之HE06642之VL的核酸序列
<110> 德商拜耳知識產權公司
<120> 中和性催乳激素受體抗體Mat3及其治療用途
<130> BHC113039
<140> 101119849
<141> 2012-06-01
<150> 11168644.0
<151> 2011-06-03
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 1
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<213> 家鼷鼠
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<213> 人工序列
<220>
<223> VH蛋白質
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH DNA
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<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL DNA
<400> 17

Claims (32)

  1. 一種抗體Mat3或其抗原結合片段，其拮抗由催乳激素受體介導之信號傳導，其中該抗體包含對應於核酸序列SEQ ID NO：3及胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈可變區以及對應於核酸序列SEQ ID NO：4及胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈可變區。
  2. 如請求項1之抗體Mat3或其抗原結合片段，其包含如請求項1之抗體之CDRs，其中該可變重鏈含有對應於SEQ ID NO：5、6及7之CDR序列及該可變輕鏈含有對應於SEQ ID NO：8、9及10之CDR序列。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係由抗原結合區組成，該抗原結合區特異性結合至人類、猴及小鼠之PRLR之細胞外域之一或多個區，且其中該人類PRLR之胺基酸序列係由SEQ ID NO：12之1至210位及SEQ ID NO：12之人類多型變體的胺基酸序列所示、猴PRLR之胺基酸序列係由SEQ ID NO：11之1至210位之胺基酸序列所示及小鼠PRLR之胺基酸序列係由SEQ ID NO：13之1至210位之胺基酸序列所示。
  4. 如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中與人類、猴及小鼠之PRLR之細胞外域的親和力係至少100nM。
  5. 如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中與人類、猴及小鼠之PRLR之細胞外域的親和力係小於約100nM。
  6. 如請求項5之抗體或其抗原結合片段，其中與人類、猴 及小鼠之PRLR之細胞外域的親和力係小於約30nM。
  7. 如請求項6之抗體或其抗原結合片段，其中與人類、猴及小鼠之PRLR之細胞外域的親和力係小於約10nM。
  8. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係由抗原結合區組成，該抗原結合區特異性結合至人類PRLR之細胞外域之一或多個區，且其中親和力係至少10nM。
  9. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係由抗原結合區組成，該抗原結合區特異性結合至人類PRLR之細胞外域之一或多個區，且其中親和力係小於約1nM。
  10. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該等重鏈恆定域決定經修飾或未經修飾之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  11. 一種經分離之核酸序列，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體或抗原結合片段。
  12. 如請求項11之經分離之核酸序列，其中該等核酸序列對應於Seq ID NO：3及4。
  13. 一種表現載體，其包含如請求項11或12之核酸序列。
  14. 一種宿主細胞，其包含如請求項13之載體或如請求項11或12之核酸分子，其中該宿主細胞可為高等真核生物宿主細胞、低等真核生物宿主細胞，或可為原核生物細胞。
  15. 如請求項14之宿主細胞，其中該高等真核生物宿主細胞 為哺乳動物細胞。
  16. 如請求項14之宿主細胞，其中該低等真核生物宿主細胞為酵母細胞。
  17. 如請求項14之宿主細胞，其中原核生物細胞為細菌細胞。
  18. 一種使用如請求項14至17中任一項之宿主細胞產生抗體或抗原結合片段之方法，其包含如請求項14至17中任一項之宿主細胞在適宜條件下培養並回收該抗體。
  19. 一種抗體或抗原結合片段，其係由如請求項18之方法產生。
  20. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其經純化至以重量計至少95%均質性。
  21. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其作為藥劑。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體或抗原結合片段，及包含賦形劑及助劑之醫藥上可接受之載劑。
  23. 一種套組，其用於治療子宮內膜異位症、子宮肌腺症、良性***疾病及***痛、泌乳抑制、高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性脫髮、良性***增生、類纖維瘤，或用於非激素女性避孕，或用於組合激素療法(即***加黃體素療法)治療女性以抑制乳腺上皮細胞增殖，或用於治療及預防抗***抗性乳癌，其包含包裝於容器中如請求項1至10中任一項之抗體，該套組視情況含有第二治療劑，且進一步包含貼附於或包裝於該容器之 標籤，該標籤描述該容器之內含物且提供有關該容器之內含物之用途的適應症及/或說明書。
  24. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其用於治療及/或預防子宮內膜異位症及子宮肌腺症(子宮內子宮內膜異位症)之方法。
  25. 一種如請求項1至10中任一項之抗體或抗原結合片段之用途，其用以製造用於女性避孕之藥劑。
  26. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其用於治療良性***疾病及***痛之方法中。
  27. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其用以製造用於泌乳抑制之藥劑。
  28. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其用於治療良性***增生之方法中。
  29. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其用於治療高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性脫髮之方法中。
  30. 一種如請求項1至10中任一項之抗體或抗原結合片段之用途，其用於製造用以治療接受***加黃體素療法之女性之藥劑。
  31. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其用於治療或預防抗***抗性乳癌之方法中。
  32. 如請求項22之醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之PRLR抗體或抗原結合片段與至少一種其他藥劑組合。
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