CN103764679B - 中和性促乳素受体抗体Mat3及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中和性促乳素受体抗体Mat3和抗原结合片段，含有其的药物组合物及其在治疗或预防由促乳素受体介导的良性失调和适应症如子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非激素女性避孕、良性乳腺疾病和乳腺痛、泌乳抑制、良性***增生、纤维样瘤、高促血促乳素性脱发和血促乳素性脱发中的应用以及在组合激素疗法抑制乳腺上皮细胞增殖共同治疗中的应用和治疗及预防抗***抗性乳腺癌中的应用。本发明的抗体阻断促乳素受体介导的信号传导。

Description

中和性促乳素受体抗体Mat3及其治疗用途
本发明涉及促乳素受体抗体Mat3并且提供了特异性结合并中和促乳素受体的抗体Mat3的重组抗原结合区及含有这种抗原结合区的功能性片段，编码前述抗体的核酸序列，含有其的载体，含有其的药物组合物及其在治疗或预防获益于抑制促乳素受体介导的信号传导的子宫内膜异位症及其它疾病的用途。
促乳素(PRL)是由199个氨基酸组成的多肽激素。PRL属于生长激素(GH)，多肽激素的胎盘促乳素(PL)家族，在垂体的泌乳素细胞和一些垂体外组织如淋巴细胞、乳腺上皮细胞、子宫平滑肌及***中合成。两种不同的启动子调节垂体和垂体外PRL合成(BioEssays28:1051-055,2006)。
PRL结合PRL受体(PRLR)，属于1类细胞因子受体超家族的单跨膜受体(EndocrineReviews19:225-268,1998)。PRLR以三种不同的同种型存在，可以通过其胞质尾部的长度区分的短、长和中等形式。在配体结合时，相继的过程导致PRLR激活。PRL通过其结合位点1与一个PRLR分子相互作用，然后通过其结合位点2吸引第二受体分子，产生活化的PRLR二聚体。PRLR二聚体化导致JAK/STAT(Janus激酶/转录的信号转导物和激活剂)通路的优势激活。在受体二聚体化时，与受体结合的JAK(主要是JAK2)彼此反式磷酸化(transphosphorylate)和激活。另外，PRLR也被磷酸化并可以结合含有SH2-结构域的蛋白如STAT。受体结合的STAT随后被磷酸化，从受体解离并移位至核，在此其刺激靶基因的转录。另外，通过PRLR的Ras-Raf-MAPK通路的激活和胞质src激酶的激活已被描述(见综述EndocrineReviews19:225-268,1998)。
PRLR-介导的信号传导在多种过程如乳腺发育、哺乳、生殖、乳腺和***肿瘤生长、自身免疫疾病、一般生长和代谢以及免疫调节中起作用(EndocrineReviews19:225-268,1998;Annu.Rev.Physiol.64:47-67,2002)。
目前，除了通过使用溴隐亭(bromocriptine)和其它多巴胺受体2激动剂(NatureClinicalPracticeEndocrinologyandMetabolism2(10):571-581,2006)抑制垂体PRL分泌之外，没有能够完全干扰PRLR-介导的信号传导的药物。然而，这些药物不阻抑能够成功代偿垂体PRL合成抑制的垂体外PRL合成，导致几乎没有损害的PRLR-介导的信号传导(EndocrineReviews19:225-268,1998)。因此，多巴胺2型受体激动剂无益于患有乳腺癌或自身免疫疾病如全身性狼疮或风湿性关节炎的患者并不令人惊讶(BreastCancerRes.Treat.14:289-29,1989;Lupus7:414-419,1998)，尽管在这些疾病中涉及促乳素。分别在乳腺癌或自身免疫疾病中起重要作用的乳腺癌细胞或淋巴细胞中的局部促乳素合成不被多巴胺受体激动剂阻断。
用于乳腺癌诊断的结合PRLR的抗体首次描述于WO2003/004989(MilleniumPharmaceuticals)。在WO03/004989中，在一些乳腺癌中过表达的众多基因及相应的蛋白质包括PRLR被认为是早期检测恶性病的合适标记。在WO03/008583中，关注淋巴瘤和白血病，描述了癌相关基因基因和蛋白质包括PRLR。
此外，在WO2006/110585(Novartis)中，描述了PRLR过表达作为癌症标记以及PRLR-特异性抗体用于诊断和治疗乳腺癌和其它类型癌症(肺癌、***癌和皮肤癌)的用途。这时，基于两个实验证据请求保护具有拮抗活性的单克隆抗体：a)在乳腺癌MCF7细胞中通过PRLR-特异性siRNA阻断PRLR表达导致抑制这些细胞增殖以及b)在乳腺癌细胞如T47D中促乳素诱导STAT5和MAPK磷酸化。然而，没有提供任何证据显示单克隆抗体确实抑制了乳腺癌细胞系的增殖，也没有公开任何具体抗体。
PRLR拮抗剂成功干扰乳腺癌发展的第一个体内概念验证(Proofofconcept)公开于1988年。在DMBA小鼠乳腺癌模型中，单克隆PRLR抗体导致乳腺癌发病率降低(AmJPathol133:589-595,1988)。
在US2007/0269438(Biogen)中描述了请求保护用于预防和治疗乳腺癌的首批PRLR抗体。来自5种杂交瘤细胞系的表达产物(抗体)通过其紧密结合乳腺癌细胞系T47D和MCF7及阻断PRL-介导的信号传导(STAT5-、MAPK-、AKT-磷酸化)的能力来描述。然而，还没有公开体内概念验证。而且，现有技术知识中没有提供证据说明特别是在患者的癌症成为抗***非依赖性之后，抗-PRLR抗体可以施用给患者。
第二组单克隆PRLR-特异性抗体以及公开的一级序列描述于WO2008/022295(Novartis)。尽管请求保护这些抗体作为用于乳腺癌、肺癌和***癌的治疗剂，淋巴瘤模型示出这些药物的体内抗增殖作用。
另一方面，衍生自促乳素并具有N-末端缺失和点突变(例如delta1-9G129R促乳素)的肽能(peptidergic)PRLR拮抗剂也作为PRLR的拮抗剂，然而如果与促乳素(Pituitary6:89-95,2003)相比，其具有降低的半衰期(15-20分钟)和低效力。因此，中和性PRLR抗体是优异的，特别是对于抑制增强的在乳腺癌和***癌中起作用的自分泌促乳素信号传导。
PRLR-介导的信号传导的作用也在良性疾病子宫内膜异位症中研究。在一个研究中，在***的中晚期增生期(mid-lateproliferativephaseofthemenstrualcycle)分析了来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜异位样品和在位内膜(eutopicendometrium)中的PRLR表达模式(ActaObstetGynecolScand81:5-10,2002)。证明了PRLRmRNA存在于79%的分析的子宫内膜异位症患者的在位内膜中，而在86%的子宫内膜异位症患者的子宫内膜异位损伤中缺失。这些数据提示在正常和子宫内膜异位组织中PRLR表达的可能的差异调节。然而，根据这些表达数据，不能推断抑制PRLR可能代表了适当的子宫内膜异位症治疗–特别是因为没有发现PRLR在子宫内膜异位损伤中表达(ActaObstetGynecolScand81:5-10,2002)。
总之，尽管PRLR-介导的信号传导在多种细胞过程中起作用，但是公开了极少和部分矛盾的结果证明PRLR拮抗机制对于大多数良性疾病包括子宫内膜异位症的治疗价值。
公开了许多数据，表明PRLR可能是乳腺癌的起因。而且从概念上来说，有效的PRLR拮抗剂可能是证明PRLR抑制对于乳腺癌的治疗价值的适当物质。然而，迄今为止没有提供体内概念验证证明PRLR阻断确实导致抑制肿瘤生长(除了淋巴瘤治疗和抑制乳腺癌发展)并且拮抗性PRLR抗体可以用于治疗得益于阻断PRLR信号传导的良性疾病。因此，目前可以获得的抗体不能用于可以允许临床前概念验证研究的预测模型中。
需要在人、猴和小鼠中以高亲和力结合PRLR而不竞争性结合PRL的抗体，并且这种方法在所有3个物种中中和PRLR-介导的信号传导，其允许以合理剂量在小鼠以及猴中进行临床前概念验证研究。
因此，本发明的根本问题在于提供可以用于预测模型中的新PRLR抗体，其可以进行临床前概念验证研究并且可以用于治疗得益于阻断泌乳受体信号传导的疾病。
所述问题通过提供新的抗体Mat3而解决。
现已发现所述抗体在生物化学以及细胞结合研究中对于人、猴和小鼠中的PRLR具有令人惊讶的特异性并具有高亲和力，而不竞争结合PRL，并且这种方式在所有3种物种中中和PRLR-介导的信号传导，与WO2008/022295中公开的那些抗体不同，其非竞争性结合PRL如HE06642。这种方式，所述抗体能够以合理剂量在小鼠以及猴中进行临床前概念验证研究。而且，已发现与WO2008/022295中公开的非竞争性结合PRL那些抗体如HE06642相比，所述抗体由于更有效并与人种系序列更密切而可以给对象提供治疗益处并因此提供了改良副作用谱的机会，即由于降低的剂量以及与人种系序列增加的相似性而降低的免疫原性危险。
所述新Mat3抗体优选与来自不同物种如猕猴(Macacamulatta)(恒河猴)和食蟹猴(Macacafascicularis)、小鼠(Musmusculus)和智人(Homosapiens)(人)的PRLR是交叉反应性的。本文交叉反应性是指所述抗体对人、猴和小鼠PRLR的亲和力(KD值)和细胞结合EC50值低于10x10-9M(见表1，实施例9、10、13和14)并且增殖抑制IC50值低于20x10-9M(见实施例1至3)。本发明基于这样的发现，即新抗体Mat3可以给对象提供治疗益处(所述新抗体的序列如SEQIDNO:1-10所示)。本发明的抗体（其最优选可以是与人种系序列具有非常密切关系的完全人抗体或者可以是其携带完全人形式的CDR的人源化或嵌合或人工程化变体）可以用于本文更完全描述的许多上下文中。
为了示出所述抗体在体外增殖研究中相对于WO2008/022295的非竞争性结合PRL的最深入鉴定的已知抗体在效力和人-猴-小鼠交叉反应性方面的优越性，所述抗体与WO2008/022295的HE06642进行了比较(实施例1-3)。本文提及的HE06642或HE06.642或06.642含有可变结构域SEQIDNO:14和15，其与WO2008/022295的he06.642-2的序列相同。
在一些细胞***中鉴定抗体Mat3以确定其物种特异性及其效力以及在不同读出范例中的功效，解决了PRLR-介导的信号传导和增殖的失活。在稳定转染了人PRLR(实施例1)、鼠PRLR(实施例2)或恒河猴PRLR(实施例3)的Ba/F细胞系中进行增殖测定。抗体Mat3完全抑制了携带人、鼠和恒河猴PRLR的细胞的增殖(实施例1-3)。抗体HE06642(WO2008/022295)在携带鼠PRLR的细胞中是无活性的，并与Mat3比较在恒河猴PRLR-细胞中示出强烈降低的活性。抗体Mat3在人PRLR中也比抗体HE06.642更有效力。也有证据表明Mat3比HE06422以更高的效力抑制大鼠NB2淋巴瘤细胞增殖。除了细胞增殖测定，使用稳定转染了人或鼠PRLR(实施例12)以及瞬时转染了在LHRE(催乳激素反应元件(lactogenichormoneresponseelements))控制下的荧光素酶报道基因的HEK293细胞系进行了荧光素酶报道基因测定。使用这些***，可以证实依赖于PRLR-介导的信号传导的启动子在存在Mat3时关闭。抗体HE06.642不能有效阻断鼠PRLR-介导的信号传导也是明显的。
总之，抗体Mat3因而适于在鼠和猴模型中测试PRLR-介导的信号传导的抑制。
所述抗体比HE06642含有更相似于翻译的人种系V基因的可变结构域。图6示出VH和VL结构域每个与翻译的人种系重链V和λ轻链V基因是90%相同的[VBASE2database;RetterI,AlthausHH,MünchR,MüllerW:VBASE2,anintegrativeVgenedatabase.NucleicAcidsRes.2005Jan1;33(Databaseissue):D671-4]。HE06642与VBASE2中发现的最相似的翻译的VH种系序列显示89%相同性并且与最相似的翻译的种系轻链V序列仅80%相同性。当用Mat3治疗患者时，这一发现提供了具有更低免疫原性风险的机会。
具有人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域的Mat3和HE06642的结合研究表明这两种抗体与这些纯化的结构域相互作用(见下文，实施例10和表1)。然而，当这些结构域在细胞表面暴露时，可以在Mat3和HE06642之间观测到更显著的差异。更显著地，当Ba/F细胞表达抗体HE06642时，HE06642不结合鼠PRLR，而Mat3则结合(表2，和图5，和实施例9)。这一发现Mat3阻断鼠PRLR-介导的信号传导和增殖（与HE06642不同）的观测一致。具有人PRLR的胞外结构域（当纯化时以及暴露在细胞表面时被Mat3和HE06642结合）的肽扫描揭示Mat3结合亚结构域S2(实施例11)如HE06642，如之前所报道(WO2008/022295)。这一扫描还示出在Mat3和HE06642之间在结合S2结构域中存在差异(图8)。近来，公开了通过这种肽扫描观测到的抗体的不同结合能够解释抗体性质的差异(Niederfellneretal.,Blood.2011,Mar28.doi:10.1182/blood-2010-09-305847)。总之，所述肽扫描结果表明为什么抗体Mat3与HE06642相比显示不同的物种-特异性和效力。
本发明提供了表5所示的人单克隆抗体Mat3(SEQIDNO.1-10)或其拮抗促乳素受体-介导的信号传导的抗原结合片段。所述抗体特异性结合PRLR(SEQIDNO:12)或SEQIDNO：12的人多态性变体如I146L和I76V变体的胞外结构域(ECD)，如PNAS105(38),14533,2008,和J.Clin.Endocrinol.Metab.95(1),271,2010所述。而且，所述抗体特异性结合恒河猴和食蟹猴PRLR(SEQIDNO:11)和鼠PRLR(SEQIDNO:13)的胞外结构域(ECD)。
在一个实施方案中，公开了人抗体Mat3或其人源化、人-工程化的或嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含相应于SEQIDNO:3的核酸序列和SEQIDNO:1的氨基酸序列的可变重链区，并且包含相应于SEQIDNO:4的核酸序列和SEQIDNO:2的氨基酸序列的可变轻链区，其拮抗促乳素受体-介导的信号传导。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含上述抗体CDR，其中
所述可变重链含有相应于SEQIDNO:5、6和7的CDR序列以及所述可变轻链含有相应于SEQIDNO:8、9和10的CDR序列。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体Mat3由特异性结合人、猴和小鼠的PRLR的胞外结构域的一或多个区域的抗原结合区组成，并且其中所述人PRLR的氨基酸序列如SEQIDNO:12和SEQIDNO:12的人多态性变体的1-210位的氨基酸序列、SEQIDNO:11的猴PRLR和SEQIDNO:13的小鼠PRLR的1-210位的氨基酸序列所示。
在本发明的另一个实施方案中，所述Mat3由抗原结合区组成，其中对于人、猴和小鼠PRLR胞外结构域的亲和力至少是100nM，优选小于大约100nM，更优选小于大约30nM，甚至更优选小于大约10nM。
在另一个实施方案中，所述抗体Mat3由特异性结合人PRLR胞外结构域的一或多个区域并且亲和力是至少10nM、更优选小于大约1nM的抗原结合区组成。
本发明的另一目的是前述的Mat3，其中所述重链恒定区确定修饰或未修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
表1提供了本发明抗体Mat3的解离常数(亲和力)和解离速率的总结，通过人PRLR(SEQIDNO:12)、恒河猴和食蟹猴PRLR(SEQIDNO:11，其中Fc-His融合体通过蛋白酶解因子Xa消化除去)和鼠PRLR(SEQIDNO:13)的单体胞外结构域(氨基酸1-210)对于直接固定的抗体的表面等离子共振确定(Biacore)(实施例10)。
表1:在HEK293细胞中表达的人、恒河猴/食蟹猴和小鼠PRLR的胞外结构域对于作为人IgG分子的Mat3通过表面等离子共振确定的单价解离常数和解离速率(见实施例10)
人PRLR 恒河猴/食蟹猴PRLR 小鼠PRLR
KD[M] 0.9x10-9 7.1x109 0.4x109
Kd[1/s] 4.4x10-4 1.1x10-3 2.1x10-4
WO2008/022295中公开HE06642对于人PRLR胞外结构域的亲和力是2.6x10-9M，对于食蟹猴PRLR的相应结构域是38.9x10-9M以及对于鼠PRLR的相应结构域是2.7x10-9M。
通过荧光激活细胞分选(FACS)组合Scatchard分析确定了抗体Mat3的基于细胞的亲和力(实施例9)。
表2表明了作为人IgG2分子的Mat3对于分别稳定转染了人和恒河猴PRLR的HEK293细胞系的结合强度。
表2:IgG2形式的抗-PRLR抗体Mat3对于分别稳定转染了人和恒河猴PRLR的HEK293细胞系的通过FACS确定的基于细胞的结合效力(见实施例9)
抗体产生
为分离功能性阻断人和鼠PRLR的一组抗体，平行研究了两种形式的分别表达scFv和Fab片段的来自Bioinvent的称为n-CoDeR的合成人抗体噬菌体展示文库(etal.2000,NatureBioTechnology.18,852-856.)。用于scFv或Fab选择的靶是人PRLR(SEQIDNO.12的氨基酸位置1至210)和小鼠PRLR(SEQIDNO:13的氨基酸位置1至210)的可溶ECD，以生物素化(NHS-LC生物素，Pierce)和非生物素化的变体以及表达PRLR的人乳腺癌细胞系T47D应用。
噬菌体展示技术(PDT)中不同方法的组合用于分离高亲和力、PRLR-特异性、人单克隆抗体，通过蛋白质和全细胞淘选组合并通过开发特异性工具进行。淘选工具和筛选方法包括与Fc结构域融合的重组表达的人和小鼠PRLR的ECD(分别是R&DSystems,catalogueno.1167-PR和1309-PR；分别是SEQIDNO:12和13的位置1-216，每个与人IgG1Fc结构域、人IgG1的位置100-330融合)，与六组氨酸标记融合的重组表达的人PRLR的胞外结构域(SEQIDNO:12)，每个分别稳定转染人和鼠PRLR的HEK293和鼠淋巴瘤细胞系Ba/F，和每个天然表达PRLR的乳腺癌细胞系T47D和大鼠淋巴瘤细胞Nb2以及开发能够鉴定优先结合在细胞表面展示的PRLR并与小鼠PRLR具有交叉反应性的中和抗体的淘选方法和筛选测定。
使用重组表达的抗原在ELISA测试中首先鉴定对于人PRLR以及最终小鼠PRLR的结合剂进行筛选。这些特异方法的组合允许分离–例如-抗体“005-C04”。
通过“005-C04”在人PRLR和鼠PRLR胞外结构域的亲和力成熟，根据实施例8所述的方法鉴定有益取代。最终，评价各个有益于改良亲和力的取代其对于抗体热稳定性的影响。特别地，在成熟抗体变性(例如通过温度升高)期间应保证Fab结构域的协同解折叠(cooperativeunfolding)(关于协同解折叠的参考文献:Roethlisberger,D.etal.,J.Mol.Biol.2005:347,773–789)。抗体Mat3得自上述抗体发现和成熟方法。
肽变体
本发明的抗体不限于本文提供的特异肽序列。而且，本发明还包含这些多肽的变体。参考本发明内容和常规可获得的技术和文献，本领域技术人员将能够制备、测试和使用本文公开抗体的功能性变体，同时具有结合并功能性阻断PRLR能力的变体在本发明的范围之内。
变体可以包括例如相对于本文公开的肽序列具有至少一个改变的互补决定区(CDR)(超变)和/或构架(FR)(可变)结构域/位置的抗体。为了更好地阐述这一概念，下文是抗体结构的简要描述。
抗体由两条肽链组成，每条含有一(轻链)或三个(重链)恒定结构域和可变区(VL，VH)，后者在每种情况中组成为4个FR区(VH：HFR1，HFR2，HFR3，HFR4；VL：LFR1，LFR2，LFR3，LFR4)和3个间隔的CDR(VL：LCDR1，LCDR2，LCDR3；VH：HCDR1，HCDR2，HCDR3)。抗原结合位点由一或多个CDR形成，而FR区提供了CDR结构构架，因此在抗原结合中起重要作用。例如，通过改变CDR或FR区中一或多个氨基酸残基，本领域技术人员能常规产生突变的或多样化的抗体序列，针对抗原其可以被筛选新或改良的性质。
图4提供了编号可变结构域VL和VH中每个氨基酸位置的示意图。表3(VH)和4(VL)划出了本发明抗体Mat3的CDR区并且在给定位置与相应共用或“MasterGene”序列比较氨基酸，其中CDR区标记为‘X’。表5和6给本发明提供的抗体、抗体片段和PRLR变体分配SEQID编号。
表3:抗体Mat3的VH序列包括CDR注释
表4:抗体Mat3的VL序列包括CDR注释
表5:抗体序列
表6:人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域序列
抗体 SEQ ID
人ECD PRLR(蛋白) 12
鼠ECD PRLR(蛋白) 13
恒河猴和食蟹猴ECD PRLR(蛋白) 11
本领域技术人员能够使用表3、4和5的数据来设计在本发明范围内的肽变体。优选通过改变一或多个CDR区中的氨基酸构建变体；变体也可以具有一或多个改变的构架区(FR)。例如，肽FR结构域可以被改变，其中与种系序列相比在残基中存在偏差。
而且，变体可以通过突变即通过使用一种抗体作为起点通过多样化所述抗体中一或多个氨基酸残基、优选一或多个CDR中氨基酸残基进行优化、并通过筛选获得的抗体变体集合中具有改良性质的变体而获得。特别优选的是VL的LCDR3、VH的HCDR3、VL的LCDR1和/或VH的HCDR2中一或多个氨基酸残基的多样化。可以通过使用三核苷酸诱变(TRIM)技术合成DNA分子集合进行多样化[Ge,L.,Plückthun,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.,andMoroneyS.E.(1994)Trinucleotidephosphoramidites:idealreagentsforthesynthesisofmixedoligonucleotidesforrandommutagenesis.Nucl.AcidsRes.22,5600;也见实施例8]。
保守氨基酸变体
可以制备保留本文所述抗体肽序列的全部分子结构的多肽变体。鉴于各个氨基酸的性质，本领域技术人员知道一些合理取代。例如，基于涉及残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性可以制备氨基酸取代即“保守性取代”。
例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)荷正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)荷负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。取代典型可以在(a)-(d)组内进行。另外，根据其破坏α-螺旋的能力，甘氨酸和脯氨酸可以互相取代。相似地，某些氨基酸如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更通常发现于α-螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更通常发现于β-折叠片(β-pleatedsheets)中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸更通常发现于转角中。一些优选的取代可以在下组中进行：(i)S和T；(ii)P和G；和(iii)A、V、L和I。鉴于已知的遗传密码和重组和合成DNA技术，本领域技术人员可以容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。
如本文所用，两个多肽序列的″序列相同性″表明所述序列之间相同的氨基酸的百分比。″序列同源性″表明相同或表示保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。本发明优选的多肽序列含有氨基酸序列，其中
a.HCDR1的氨基酸序列在至少8个氨基酸的7个中与SEQIDNO:5相同，并且
b.HCDR2的氨基酸序列在至少19个氨基酸的14个、更优选19个氨基酸的15个、更优选19个氨基酸的16个、更优选19个氨基酸的17个、或者甚至更优选19个氨基酸的18个中与SEQIDNO:6相同，并且
c.HCDR3的氨基酸序列在至少11个氨基酸的8个、更优选11个氨基酸的9个、或者甚至更优选11个氨基酸的10个中与SEQIDNO:7相同，并且
d.LCDR1的氨基酸序列在至少14个氨基酸的12个、或者更优选14个氨基酸的13个中与SEQIDNO:8相同，并且
e.LCDR2的氨基酸序列在至少7个氨基酸的4个、更优选7个氨基酸的5个、或者甚至更优选7个氨基酸的6个中与SEQIDNO:9相同，并且
f.LCR3的氨基酸序列在至少12个氨基酸的11个中与SEQIDNO:10相同。
本发明的DNA分子
本发明还涉及编码本发明抗体的DNA分子。这些序列包括但不限于SEQIDNO：3和4所示的那些DNA分子。
本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，也包括其变体。本发明的DNA变体可以参照其在杂交中的物理性质进行描述。本领域技术人员将知道使用核酸杂交技术，DNA能够用于鉴定其互补物并且因为DNA是双链，能够鉴定其等价物或同系物。也将知道杂交能够在小于100%互补性时发生。然而，根据适当的条件选择，可以使用杂交技术根据其与特定探针的结构相关性来区分DNA序列。关于这种条件的指导可见Sambrooketal.,1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,USA)]和Ausubeletal.,1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYork:JohnWileyandSons]。
两个多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为两个序列彼此杂交的条件的″严格性″的函数。如本文所用，术语″严格性″指条件不利杂交的程度。严格条件强烈不利杂交，并且只有最结构相关的分子将在这种条件下彼此杂交。相反地，非严格条件有利于显示较少程度结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两个核酸序列的结构相关性直接关联。如下相关性可用于将杂交和相关性关联(其中Tm是核酸双链体的解链温度):
a.Tm=69.3+0.41(G+C)%
b.双链DNA的Tm降低1℃伴随增加1%的错配碱基对数目。
c.(Tm)μ2-(Tm)μ1=18.5log10μ2/μ1
其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。
杂交严格性是许多因素包括整体DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键合的物质的存在的函数。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小和不存在破坏氢键合的物质。杂交典型在两个阶段进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
首先，在结合阶段，在有利于杂交的条件下探针结合靶。在这一阶段通常通过改变温度控制严格性。对于高严格性，温度通常在65℃和70℃之间，除非使用短(<20nt)寡核苷酸探针。代表性杂交溶液包含6xSSC、0.5%SDS、5xDenhardt′s溶液和100μg非特异性载体DNA[见Ausubeletal.,2.9节,supplement27(1994)]。当然，已知许多不同的、但是功能性等价的缓冲液条件。当相关性程度较低时，可以选择较低的温度。低严格性结合温度在大约25℃和40℃之间。中等严格性在至少大约40℃至低于大约65℃之间。高严格性是至少大约65℃。
其次，通过洗涤除去过量探针。在这一阶段通常应用更严格的条件。因此，这一″洗涤″阶段在通过杂交决定相关性中是最重要的。洗涤溶液典型含有较低的盐浓度。一种示例的中等严格性溶液含有2xSSC和0.1%SDS。高严格性洗涤溶液含有低于大约0.2xSSC的等价物(以离子强度)，优选的严格性溶液含有大约0.1xSSC。与不同严格性相关的温度与如上对于″结合″所述的相同。洗涤过程中洗涤溶液也典型被替换多次。例如，典型高严格性洗涤条件包含洗涤两次30分钟、55℃和3次15分钟、60℃。
因此，本发明的主题是编码本发明抗体和抗原结合片段的分离的核酸序列。
本发明的另一实施方案是前述编码本发明抗体的分离的核酸序列，其中所述核酸序列示于表5。
因此，本发明包括在高严格性结合和洗涤条件下与表5所示分子杂交的核酸分子，其中这种核酸分子编码具有本文所述性质的抗体或其功能性片段。优选的分子(从mRNA角度)是与本文所述的DNA分子之一具有至少75%或80%(优选至少85%、更优选至少90%和最优选至少95%)序列相同性的那些。所述分子阻断促乳素受体介导的信号传导。
功能性等价物变体
本发明范围内的另一类别DNA变体可以参照其编码的产物描述。这些功能性等价物基因特征在于其由于遗传密码的简并性而编码与SEQIDNO：1和2相同的肽序列。
可知本文提供的DNA分子的变体可以几种不同方式构建。例如，其可以被构建为完全合成的DNA。可以广泛获得有效合成范围为20至大约150个核苷酸的寡核苷酸。见Ausubeletal.,section2.11,Supplement21(1993)。可以如Khoranaetal.,J.Mol.Biol.72:209-217(1971);也见Ausubeletal.,如前,Section8.2所首次报道的方式合成和组装重叠寡核苷酸。优选设计具有在基因的5’和3’末端工程化以促进克隆至合适载体的方便的限制位点的合成DNA。
如所指出的，产生变体的方法是用本文公开的DNA之一开始，然后进行定点诱变。见Ausubeletal.,如前,第8章,Supplement37(1997)。在典型的方法中，将靶DNA克隆至单链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA并与含有所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，将双链噬菌体导入宿主中。所得子代的一些将含有所需突变体，其能够使用DNA测序证实。另外，可用增加子代噬菌体是所需突变体的可能性的不同方法。本领域技术人员熟知这些方法，可以商业获得产生这种突变体的试剂盒。
重组DNA构建体和表达
本发明还提供了包含一或多个本发明核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体与载体如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体（编码本发明抗体的DNA分子***其中）联合使用。
可以通过Sambrooketal.,1989和Ausubeletal.,1989所述技术产生所述编码的基因。或者，所述DNA序列可以使用例如合成仪化学合成。见例如OligonucleotideSynthesis(1984,Gait,ed.,IRLPress,Oxford)所述的技术，其全文援引加入本文。本领域技术人员能够将编码可变结构域的DNA与编码突变或非突变的不同人IgG同种型或其衍生物的恒定区的基因片段融合。他能够应用重组DNA技术以使用接头如含有3个甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸的15个氨基酸片段融合单链形式的两个可变结构域。本发明的重组构建体包含在能够表达所编码DNA的RNA和/或蛋白质产物的表达载体中。所述载体可进一步包含调控序列，包括与开放读框(ORF)可操纵连接的启动子。所述载体可进一步包含选择标记序列。特异性起始和细菌分泌信号对于***的靶基因编码序列的有效翻译可能也是需要的。
本发明还提供了含有至少一种本发明DNA的宿主细胞。所述宿主细胞实际上可以是可以用于表达载体的任何细胞。例如其可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞如酵母细胞，并可以是原核细胞如如细菌细胞。向所述宿主细胞导入重组构建体可以通过磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖(dextran)介导的转染、电穿孔或噬菌体感染进行。
细菌表达
通过将编码所需蛋白以及合适的翻译起始和终止信号的结构DNA序列***具有功能性启动子的可操纵阅读相(operablereadingphase)来构建用于细菌用途的有用表达载体。所述载体将包含一或多个表型选择标记和复制起点以维持载体，并且在需要时在宿主内进行扩增。用于转化的合适原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和内假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的不同物种。
细菌载体可以例如是基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可以含有来自可商业获得的典型含有熟知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的元件的质粒的选择标记和细菌复制起点。在转化合适的宿主菌株并且宿主菌株生长至适当细胞密度后，通过适当手段（例如温度变换或化学诱导）去阻抑/诱导所选择的启动子并培养细胞额外的时间。典型地，细胞通过离心收获，通过物理或化学手段破坏，所得粗提取物进一步纯化。
在细菌***中，可以根据所表达蛋白的用途来有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这种蛋白时，例如用于产生抗体或筛选肽文库，指导可被容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体可能是所需的。
因此，本发明的一个目的是包含编码本发明新抗体的核酸序列的表达载体。
哺乳动物表达&纯化
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件，如来自巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(如CMV启动子/增强子)、来自猿猴病毒40的启动子和/或增强子(SV40)(如SV40启动子/增强子)、来自腺病毒的启动子和/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和来自多瘤病毒的启动子和/或增强子。对于病毒调控元件及其序列的进一步说明见例如Stinski的U.S.5,168,062、Bell等的U.S.4,510,245和Schaffner等的U.S.4,968,615。重组表达载体还可包括复制起点和选择标记(见例如U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017，Axeletal.)。适当的选择标记包括赋予引入所述载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，neo基因赋予对G418的抗性。
将表达载体转染入宿主细胞可以使用标准技术如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE葡聚糖转染进行。
用于表达本文提供的所述抗体、抗原结合蛋白或其衍生物的适当哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-CHO细胞，描述于UrlaubandChasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,使用DHFR选择标记，例如R.J.KaufmanandP.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所述]]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计表达载体以便所表达的蛋白分泌进宿主细胞生长的培养基中。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基回收抗体、其抗原结合部分或衍生物。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过熟知方法从重组细胞培养物回收和纯化，包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A层析、蛋白G层析、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。见例如Colligan,CurrentProtocolsinImmunology,或CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),例如第1、4、6、8、9、10章,每一均全文援引加入本文。
本发明的抗体或其抗原结合片段包括天然纯化产物、化学合成方法产物和来自真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的通过重组技术产生的产物。根据重组生产方法使用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化或可以是非糖基化的。这种方法描述于许多标准实验室手册，如Sambrook,如前,17.37-17.42节;Ausubel,如前,第10、12、13、16、18和20章。
因此，本发明的一个目的也是包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞如酵母细胞，并且可以是原核细胞如细菌细胞。
本发明的另一个目的是使用所述宿主细胞生产抗体和抗原结合片段的方法，包括在适当条件下培养所述宿主细胞并回收所述抗体。
因此，本发明的另一个目的是本发明所述的抗体，用本发明宿主细胞生产并纯化至至少95%重量均一性(homogeneity)。
子宫内膜异位症(endometriosis)和子宫腺肌病(adenomyosis)(宫内子宫内膜异 位症(endometriosisinterna))
子宫内膜异位症是良性、***依赖性妇产科病症，其特征在于在子宫腔外存在子宫内膜组织(腺体和基质)。子宫内膜异位损害主要发现于***、卵巢和直肠***隔(Obstet.Gynecol.Clin.North.Am.24:235-238,1997)。子宫内膜异位症通常与不育和疼痛症状如痛经相关。另外，许多患者患有自身免疫疾病(Hum.Reprod.17(19):2715-2724,2002)。子宫腺肌病(adenomyosisuteri)，也称为宫内子宫内膜异位症描述了子宫内膜异位症的一种亚型，其限于子宫。在子宫腺肌病情况中，子宫内膜腺体侵袭子宫肌层和子宫壁。
根据移植理论，在患者和健康女性中子宫内膜片段被经血倒流冲进腹膜腔(Obstet.Gynecol.64:151-154,1984)。4个主要因素看来是主要涉及患者盆腔中子宫内膜异位损害的成功建立：
a)在月经循环的后期分泌阶段中，健康女性的子宫内膜细胞凋亡。患者中，子宫内膜细胞的凋亡程度明显降低(Fertil.Steril.69：1042-1047，1998)。因此，患者中比健康女性中存在更高的可能性，即被经血倒流冲进腹膜腔的子宫内膜片段不会死亡并成功移植。
b)为在腹膜中成功移植和异位子宫内膜片段的长期存活，不得不形成新血管(BritishJournalofPharmacology,149:133-135,2006)。
c)许多患者患有自身免疫疾病并因此具有受损的免疫***(Hum.Reprod.17(19):2002,2715-2724,2002)。这可能导致这样的结论，即完整免疫应答–如其在健康女性中存在的–可能在预防建立子宫内膜异位损害中起作用。
d)损害不得不生长并因此依赖于有丝***刺激和生长因子的存在。
对于治疗子宫内膜异位症，目前存在如下方法：
a)***释放激素(GnRH)类似物：导致卵巢***合成抑制并诱导主要依赖于存在***进行生长的异位子宫内膜异位移植物的萎缩。
b)芳香酶(aromatase)抑制剂：抑制子宫内膜异位移植物的***局部产生，诱导凋亡并抑制异位的子宫内膜异位片段的增殖。
c)选择性***受体调节物：在正常子宫内膜和异位移植物中具有***受体拮抗活性并因此导致移植的异位子宫内膜异位组织的萎缩。
d)孕酮受体激动剂：抑制正常和异位子宫内膜细胞的增殖，诱导分化和凋亡。
e)组合口服避孕药：维持现状，预防疾病进展并诱导异位和在位内膜的萎缩。
f)损害的手术切除。
GnRH类似物SERM和芳香酶抑制剂具有严重副作用并在患有子宫内膜异位症的年轻女性中导致潮热和骨丢失。用孕酮受体激动剂的治疗导致***抑制、月经出血紊乱随后闭经、体重增加和抑郁。由于静脉血栓栓塞风险增加，组合口服避孕药不用于35岁以上女性、吸烟者和超重个体。损害的手术切除倾向于高复发率。
本发明的抗体干扰由垂体-和局部产生的促乳素或由于激活PRLR突变刺激的PRLR-介导的信号传导并因此比仅干扰垂体促乳素分泌的多巴胺-2-受体激动剂更有效。
因此，本发明的一个目的是本发明所述的抗体或抗原结合片段作为药物。
PRL和PRLR在子宫中表达并在正常子宫生理学中起作用；PRL能够作为有效有丝***原并具有免疫调节作用。本发明示出在PRL/PRLR***中的改变在人子宫内膜异位症中起作用。通过定量TaqmanPCR对PRL和PRLR在健康女性内膜和患者内膜和损害中的表达分析(见实施例4)示于图1和2。
如图1(PRL表达)和图2(PRLR表达)所示，PRL及其受体在子宫内膜异位损害中明显上调。这些发现是令人惊讶的并且与先前公开的描述了在人子宫内膜异位损害中PRLR表达几乎完全不存在的研究尖锐对立(ActaObstetGynecolScand81:5-10,2002)。
本发明的发现首次提供了实验证据表明自分泌PRL信号传导在子宫内膜异位损害的建立、生长和维持中起重要作用。
PRLR抗体Mat3在宫内子宫内膜异位症动物模型即小鼠子宫腺肌病中成功测试(见实施例5)。子宫腺肌病特征在于内膜腺体在内膜肌层的侵润性生长。其类似限于子宫的子宫内膜异位症形式-非月经物种能够发生的唯一的子宫内膜异位症形式。
有效用于临床治疗患者子宫内膜异位症患者的达那唑(danazol)也可有效用于治疗子宫腺肌病(LifeSciences51:1119-1125,1992)。然而，达那唑是雄激素性孕酮(androgenicprogestin)并导致在年轻女性中严重的雄激素性副作用，限制了其应用。
本发明的抗体解决了问题，提供了对于子宫内膜异位症的新治疗和预防并且比目前标准疗法显示更少的副作用。
本发明的另一方面是本发明的抗体Mat3和抗原结合片段用于治疗或预防子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症)的应用。
良性乳腺疾病和乳腺痛
良性乳腺疾病涵盖多种症状，如纤维化囊性乳腺病(fibrocysticbreastdisease)、纤维腺瘤、乳腺痛和大囊胞(macrocysts)。30–50%的绝经前女性患有纤维化囊性乳腺疾病(EpidemiolRev19:310-327,1997)。根据女性年龄，良性乳腺疾病可以呈现独特表型(JMammaryGlandBiolNeoplasia10:325-335,2005)：在正常乳腺中发生小叶发育的早期生殖阶段(15-25岁)期间，良性乳腺疾病导致纤维腺瘤。观测到单个巨大纤维腺瘤(singlegiantfibroadenomas)以及多发腺瘤(multipleadenomas)。这些纤维腺瘤组成为基质以及上皮细胞并起自小叶。在成熟生殖阶段(25–40岁)，乳腺在每个***经历周期性变化。患病女性在其乳腺中呈现周期性乳腺痛和一些结节。晚期(35-55岁)，正常乳腺恢复原状，而在患病乳腺中可以观测到具有和不具有异型性的大囊肿和上皮增生。那些伴随有增强的上皮细胞增殖的良性乳腺疾病形式具有发育乳岩的更高风险。如果在增殖细胞部分中存在细胞异型性，这种风险可以直至11%(Zentralbl119:54-58,1997)。25%的年龄为60-80岁的女性也患有良性乳腺疾病，通常***替代疗法或肥胖症是停经后持续性良性乳腺疾病的原因(AmJObstetGynecol154:161-179,1986)。
纤维化囊性乳腺病的病理生理学取决于导致***增殖(纤维化)随之兼性上皮细胞增殖的***优势和孕酮缺陷。如已提及的，在纤维化囊性病灶中展现增强的上皮细胞增殖的患者中乳腺癌风险升高。临床纤维化囊性乳腺病呈现乳腺痛和***柔软。70%的患有纤维化囊性乳腺病的患者患有黄体功能不足(corpusluteuminsufficiency)或无***(AmJObstet154:161-179,1986)。黄体功能不足导致降低的孕酮水平和***优势。
乳腺痛(乳腺疼)在生殖期的某些时间影响大约70%的女性。乳腺痛可能与或可能不与经期前综合征的其它标准相关。已证明患有乳腺痛的女性响应在刺激下丘脑垂体轴后的过量促乳素释放(ClinEndocrinol23:699-704,1985)。
良性乳腺疾病和乳腺痛的标准疗法是：
1)溴隐亭(Bromocriptine)
溴隐亭作为多巴胺激动剂仅阻断垂体促乳素合成，但不阻断乳腺上皮细胞中促乳素的局部合成。因此，其在那些依赖于升高的全身促乳素水平的乳腺痛和良性乳腺疾病形式中是有效的。溴隐亭的主要副作用是：
恶心、呕吐、水肿、低血压、眩晕、脱发、头痛和幻觉
2)达那唑
达那唑是雄激素性孕酮，通过其抗***活性抵消在良性乳腺疾病中观测到的***优势。主要副作用是：
***、抑郁、痤疮、多毛症、声音低沉(voicedeepening)和潮热以及体重增加。
3)他莫昔芬(Tamoxifen)
他莫昔芬是选择性***受体调节剂，在***中具有抗***性活性(estrogenicactivity)并且在子宫具有***性活性。主要副作用是：
绝经后症状如骨丢失和潮热、***和子宫内膜癌。
4)孕激素类
孕激素类通过阻抑垂体性腺轴、***抑制和***耗竭而抑制良性乳腺疾病。***耗竭导致绝经症状如骨丢失和潮热。
5)低剂量组合口服避孕药
这种治疗不适用于35岁以上、吸烟以及糖尿病和超重患者的女性。
通常，发现促乳素水平在三分之一患有良性乳腺疾病的女性中增加。因为***增强垂体促乳素分泌，因此认为血清促乳素水平的增加是该疾病中***优势的结果。已报道激活PRLR突变通常存在于患有多发乳腺腺瘤(multiplebreastadenomas)的女性中–类似于纤维化囊性乳腺病的亚型(PaulKelly,BreastCongressTurin,2007和ProcNatlAcadSci105:14533-14538;2008)。
良性乳腺疾病、乳腺痛和经前乳腺胀痛(premenstrualbreasttension)依赖于一个共同的病理生理学机制：增强的促乳素信号传导。升高的促乳素信号传导可能是如下的结果：
■全身高血促乳素症(由于垂体腺瘤)
■局部高血促乳素症(由于增殖的乳腺上皮细胞中的促乳素合成)。局部高血促乳素症不翻译为血液中升高的促乳素水平。
■在存在正常促乳素水平时组成型活性PRLR信号传导(由于激活PRLR突变)。
鉴于某些良性乳腺疾病形式可以引起乳腺癌，因此存在治疗这种疾病的医疗需要。
为证明中和性PRLR抗体Mat3在良性乳腺疾病临床前模型中的效力，使用了基于全身高血促乳素症的小鼠模型。成年Balb/c小鼠在肾包膜(kidneycapsule)之下移植了垂体同型移植物(isograft)，如实施例6所述(In:MethodsinMammaryglandBiologyandBreastCancerResearch,101–107,2000)。在本发明良性乳腺疾病的小鼠模型中，未使用致癌物如DMBA；小鼠仅植入了垂体腺以研究Mat3抗体应用对于增强的良性上皮细胞增殖的作用。在先前研究中，垂体-同型移植的动物额外用致癌物DMBA处理并分析不同单克隆PRLR抗体对于乳腺癌发展的作用(AmJPathol133:589-595,1988)。这些抗体有效治疗乳腺癌，然而未分析对良性乳腺疾病的作用(AmJPathol133:589-595,1988)。
在本发明的模型中，全身高血促乳素症导致乳腺中增强的上皮细胞增殖，并与未处理的未使用的对照小鼠相比刺激旁侧分枝(sidebranching)和小叶肺泡发展。如实施例6所述，在这种Balb/c小鼠模型中，与非特异性抗体相比，对于其如下能力测试了中和性PRLR抗体Mat3：
■阻断旁侧分枝和小叶肺泡发展
■抑制乳腺上皮细胞增殖
■抑制促乳素靶基因elf5的表达
中和性PRLR抗体Mat3抑制旁侧分枝(图3A)和促乳素靶基因elf5的表达(图3B)。
本发明的另一方面是本发明所述的抗体Mat3和抗原结合片段用于治疗绝经前和绝经后女性中良性乳腺疾病和乳腺痛的应用。
得益于通过抗体Mat3阻断PRLR-介导的信号传导的其它适应症：
非激素女性避孕：
目前用于女性避孕的方法如下：
a)含有***和孕激素类的组合口服避孕药。
孕激素性(progestogenic)成分通过对于下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈介导避孕作用。***性(estrogenic)成分通过在靶细胞中诱导孕酮受体保证了良好的出血控制并强化了孕激素(gestagenic)作用。
b)仅含有孕激素的宫内装置。
局部释放的孕激素赋予移植抗性状态的子宫内膜。另外，***对于***细胞几乎成为不可渗透的(impermeable)。
c)仅孕激素丸剂和植入物。
孕激素通过对于下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈抑制***。另外，***对于***细胞的渗透性降低。
d)含有炔雌醇加孕激素的***环
组合口服避孕药的主要副作用是静脉血栓栓塞(VTE)的风险提高。而且，超重或吸烟女性以及患有自身免疫疾病如狼疮的女性和35岁以上女性不能使用口服组合避孕药。
仅含有孕激素的宫内装置和植入物能够导致功能失调性子宫出血。
仅孕激素丸剂能引起异常出血模式、点状出血(spotting)、闭经、***风险增加。体重增加和骨密度降低是进一步副作用。
***环能导致***炎、白带或脱落(expulsion)。
一些年前产生了PRLR-缺陷小鼠(GenesDev11:167-178,1997)。有趣的是，PRLR-缺陷雌性而不是雄性小鼠是完全不育的。PRLR-/-雌性在受精后立即显示卵发育的阻滞，即它们显示着床前发育的阻滞，而***是正常的。只有极少数的***达到囊胚阶段并且不能植入突变的雌性，但在移植后的野生型***母体(fostermother)中发育为正常胚胎。PRLR-缺陷小鼠的***表型可以直至在怀孕中期通过补充孕酮被拯救。明显地，PRLR-介导的信号传导在产生允许和维持怀孕所需的孕酮的黄体的维持和功能中起重要作用。另外，PRLR-缺陷雌性而不是雄性显示与腹部脂肪量和瘦素水平降低相关的体重降低。
迄今，未知失活人PRLR突变，因此仍未知PRLR-介导的信号传导在人类生育中的确切作用。然而，越来越多的证据表明，人类也如此；需要最低促乳素水平以允许成功怀孕。由于高血促乳素症性黄体功能不全而患有原发***的患者用溴隐亭治疗。在一些情况中，促乳素水平被过度抑制并且缩短的黄体期再次出现(BohnetHGetal.inLisurideandotherdopamineagonistseditedbyD.B.Calneetal,RavenPress,NewYork,1983)。从这些数据可以得出结论高血促乳素症和低促乳素血症状态负面干扰雌性生育能力。这可以通过PRL与其受体的相互作用而解释。在低促乳素水平的情况中，没有足够的受体激活，而在高血促乳素症的情况中，也没有足够的受体激活，因为所有受体被一个促乳素分子阻断，并且不能再二聚化。换言之，对于促乳素的剂量应答是钟形的并且仅在某些浓度范围获得最佳受体激活。从第二个研究的证据证明患者中子宫内膜促乳素表达的缺失导致早期植入失败(HumanReprod.19:1911-1916,2004)。而且，显示离体的促乳素能够防止培养的人颗粒细胞的凋亡并且因此维持早期黄体功能，如在PRLR-缺陷小鼠中所证明的(HumanReprod.18:2672-2677,2003)。
与前述标准方法比较，用中和性PRLR抗体的雌性避孕具有几种优点：
●所述抗体可以用于吸烟、超重和年老女性以及患有红斑狼疮的女性(PRLR抗体甚至可能有益于治疗狼疮和腹部脂肪减少，即PRLR-缺陷小鼠具有更少的腹部脂肪)。
●所述PRLR抗体不提高VTE(静脉血栓栓塞)风险
●与在组合口服避孕中使用的***和孕激素不同，PRLR-介导的信号传导的中和导致乳腺上皮增殖的抑制并与用于生育控制的激素方法不同，甚至可能保护使用者免于乳腺癌。
本发明的另一目的是所述抗体Mat3用于雌性避孕的应用，与标准治疗比较具有降低的副作用。
泌乳抑制
促乳素是在孩子出生后参与泌乳的主要激素。这通过PRLR-缺陷小鼠的表型证明。甚至杂合小鼠有严重的泌乳问题，完全无法养育其后代(FrontiersinNeuroendocrinology22:140-145,2001)。
由于许多原因，女性必须停止母乳喂养，即对婴儿有潜在危险的母体药物摄入、严重感染(乳腺炎，肾炎)、产后大出血和严重孕产妇疾病如糖尿病、癌症以及新生儿虚弱或疾病。目前，多巴胺受体激动剂如溴隐亭和麦角乙脲(lisuride)用于抑制孩子出生后的泌乳。然而，这些化合物可以引起严重的副作用如恶心、呕吐、水肿、低血压、头晕、脱发、头痛和幻觉。另外，多巴胺受体激动剂不指明用于患有心血管疾病和高血压的女性。溴隐亭的另一个缺点是它的半衰期短，在14天的时间需要每天服药4-6次。
因此，我们预计中和性PRLR抗体适于泌乳抑制。在之的出版物中，针对部分纯化的PRLR产生的抗血清给予哺乳中大鼠。因为窝重出现了小的降低，所以推测抗血清导致泌乳抑制(Endocrinology102:1657-1661,1978)。然而，作者没有能排除即使其他机制可能会导致轻微窝重下降。此外，他们还观测到抗血清引起处理的大鼠中黄体增加((Endocrinology102:1657-1661,1978)。这个观测与PRLR-缺陷小鼠的表型明显相反((GenesDev11:167-178,1997)，其中***未受损害并且其中没有观测到黄体增加。最有可能的是采用的抗血清阻断了一些其它的未知分子。
本发明的另一目的是抗体Mat3用于抑制泌乳的应用。
良性***增生
良性***增生（BPH）是老年男性中第四个最流行的医疗保健病症。***肿大是一种年龄依赖性渐进病症，其影响50％以上的年龄≥50岁的男性。BPH的特征是******和上皮细胞的增生，导致在***的尿道周围区域中形成大的离散结节，其压缩尿道管。因此，尿流损害是BPH的一个主要后果。
BPH的标准疗法包括：
a)1-肾上腺素能受体拮抗剂(如坦索罗辛(tamsulosin)，阿夫唑嗪(alfuzosin)，特拉唑嗪(terazosin)，多沙唑嗪(doxazosin))缓解下尿路的BPH症状。它们通过阻断α-受体介导的***平滑肌刺激降低膀胱出口梗阻。主要的副作用是血管扩张不良事件、头晕和***失败。
b)5-还原酶抑制剂(例如非那雄胺(finasteride))
5-还原酶抑制剂防止形成双氢睾酮，睾酮在***中的活性形式，其负责***肿大。主要副作用是性功能障碍，如***障碍和***下降。
c)经尿道***切除术(TURP)
这种手术治疗与高发病率有关。副作用是出血、失禁、狭窄形成(strictureformation)、丧失***和膀胱穿孔。
d)***支架
支架***尿道的***部以保证正常尿流。主要副作用是形成外层(encrustation)、***以及支架迁移。此外，支架需要在任何经尿道操作之前被移除。
如对于乳腺所述，PRL和PRLR在***内的自分泌/旁分泌途径(J.Clin.Invest.99:618pp,1997)中起作用。
临床研究表明高血促乳素症（以及肢端肥大症）与***增大和炎症细胞的基质积累有关。人生长激素在锌的存在下可以结合人PRLR，这或许可以解释为什么肢端肥大症可导致良性***增生。在BPH患者中血清PRL水平往往升高。
普遍过表达PRL基因的转基因动物出现严重的基质***增生，表明PRL为***增生发展的重要病理生理因素(Endocrinology138:4410pp,1997)。此外，PRL在转基因小鼠中***特异性***碱性蛋白(probasin)启动子下的局部过表达导致基质扩张、炎性细胞的积累和病灶上皮异常增生，这是人BPH的基本特征(Endocrinology144:2269pp,2003)。
本发明的另一个方面是本发明所述的抗体Mat3或抗原结合片段用于治疗良性***增生的应用。
组合激素疗法
为治疗仍具有子宫的绝经后妇女的潮热，使用***(***，或缀合马***=CEE)和孕激素(例如醋酸甲羟孕酮(MPA)，孕酮，屈螺酮(drospirenone)，左炔诺孕酮(levonorgestrel))的组合。必须添加孕激素以抑制***激活的子宫上皮细胞增殖。然而，添加孕激素增加了乳腺上皮细胞增殖。由于正常和癌乳腺上皮细胞两种对组合***加孕激素治疗增殖反应，发现乳腺癌的相对危险性在CEE加MPA治疗后增加(JAMA233:321-333;2002)。
本发明的抗体解决了用于治疗在组合激素治疗下观察到的增强的乳腺上皮细胞增殖的问题。
本发明的另一个目的是中和性PRLR抗体Mat3或抗原结合片段在组合激素疗法（即***+孕激素治疗）以抑制乳腺上皮细胞增殖的应用。
脱发
脱发的治疗仍是一个未满足的需要。头皮头发生长周期：生长期阶段的特点是活性毛发生长；退化阶段表示卷绕，随后是休止期（静止）。该脱毛期(exogen)阶段（死者头发释放）恰逢休止期的结束。脱发可能是任何阶段头发生长扰乱的结果。
休止期脱发可以有很多触发器（生理学和情绪应激，医学病症，铁和锌不足），重要的是雄激素性脱发在早期阶段显示休止期头发脱落(Clevelandclinicjournalofmedicine2009;76:361-367)。生长期脱发往往是放疗或化疗的结果。
米诺地尔(Minoxidil)和非那雄胺用于治疗雄激素性脱发，而糖皮质激素用于斑秃。通常，所有这些治疗都有副作用（非那雄胺：***丧失和男性阳痿，糖皮质激素：糖尿病，体重增加，骨质疏松），和治疗脱发的问题一直没有完全解决。
在啮齿动物中，在成年动物中使用剃毛实验通过使用在剃毛区域中的毛发再生作为读出模式来分析化合物对脱发的作用(BritishJournalofdermatology2008;159:300-305)。成年动物的剃毛（大多在休止期的毛发）引起特征为毛发生长的生长期。
促乳素和PRLR已被发现在毛囊表达。从表达数据有人提出干扰PRLR-介导的信号传导可能对脱发有用，但没有功能数据显示证明这个假说(AktuelleDermatologie31:109-116,2005)。
本发明的抗体解决了为女性和男性的高血促乳素性脱发(hyperprolactinemichairloss)和正常血促乳素性脱发(normoprolactinemichairloss)提供新治疗方法的问题。
因此，本发明的另一方面是使用抗体Mat3或抗原结合片段治疗或预防高血促乳素性脱发和正常血促乳素性脱发。
抗***抗性乳腺癌的治疗和预防
有提示PRLR在人乳腺癌中过表达(JClinEndocrinolMetab83:667-674,1998)并且负面干扰PRL-PRLR相互作用对于乳腺癌治疗具有正面影响(Int.J.Cancer:55(5):712-721,1993)。有证据表明通常血浆促乳素水平与乳腺癌风险相关(CancerLett243:160-169,2006)。在他莫昔芬抗性乳腺癌患者中，渐进性疾病的进展与促乳素血浆水平相关(EurJSurgOncol20:118-121,1994)。过表达促乳素的转基因小鼠更倾向于发展乳腺癌(JClinInvest100:2744-2751,1997)。
本发明的另一方面是本发明所述抗体Mat3或抗原结合片段用于治疗或预防抗***抗性乳腺癌的应用。
定义
本文所用的靶抗原人“PRLR”是指在其胞外结构域具有与SEQIDNO：12的氨基酸位置1-210基本上相同的氨基酸序列的人多肽及其天然发生的等位基因和/或剪接变体。本文所用的“PRLR的ECD”指PRLR由上述氨基酸表示的胞外部分。另外，靶人PRLR也包括所述受体的突变形式，如由PaulKelly所述的激活突变I146L(ProcNatlAcadSciUSA.105(38)：14533-14538，2008；和oralcommunicationTurin,2007)。
本文所用的靶抗原猴“PRLR”是指在其胞外结构域具有与SEQIDNO：11的氨基酸位置1-210基本上相同的氨基酸序列的恒河猴以及食蟹猴多肽和其天然发生的等位基因和/或剪接变体。本文所用的“PRLR的ECD”指PRLR由上述氨基酸表示的胞外部分。
本文所用的靶抗原鼠或小鼠“PRLR”是指在其胞外结构域具有与SEQIDNO：13的氨基酸位置1-210基本上相同的氨基酸序列的鼠多肽和其天然发生的等位基因和/或剪接变体。本文所用的“PRLR的ECD”指PRLR由上述氨基酸表示的胞外部分。
如本文所用，短语“治疗有效量”意指治疗或预防抗体的量，其当根据所需的治疗方案给药时将适当的引起期望的治疗或预防作用或应答，包括减轻一些或全部此类疾病的症状或降低疾病的易感性。
如本文所用，抗体“特异性结合”是“特异于”或“特异性识别”抗原(本文指PRLR)if这种抗体能够区分这种抗原和一或多种参考抗原，因为结合特异性不是绝对而是相对性质。其最通常的形式(及不提及限定的参考时)，“特异性结合”是指抗体如例如如下方法之一确定的区分感兴趣抗原和无关抗原的能力。这种方法包括但不限于Western印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色进行评分(例如二抗与辣根过氧化物和四甲基联苯胺与过氧化氢)。某些孔中的反应通过例如450nm的光密度评分。典型背景(=阴性反应)可以是0.1OD；典型阳性反应可以是1OD。这意味着阳性/阴性差异可以多于10倍。典型地，通过使用不是单一的参考抗原而是一组大约3-5种无关抗原如奶粉、BSA、运铁蛋白等确定结合特异性。
然而，“特异性结合”也可以指抗体区分靶抗原和用作参考点的一或多种密切相关抗原的能力。另外，“特异性结合”可以涉及抗体区分其靶抗原的不同部分例如PRLR的不同结构域、亚结构域或区域如PRLR的ECD的N-末端或C-末端区域中的表位或者区分PRLR的ECD的一或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基片段的能力。
“亲和力”或“结合亲和力”KD往往是由测量平衡结合常数(ka)和平衡解离常数(kd)及计算kd对ka的商(KD=kd/ka)而确定。术语″免疫特异性″或″特异性结合″指所述抗体以低于或等于10-6M的亲和力KD(单价亲和力)结合PRLR或其ECD。术语“高亲和力”指所述抗体以低于或等于10-7M的亲和力KD(单价亲和力)结合PRLR或其ECD。与其他不相关分子比较，所述抗体对于靶抗原可以具有基本上更高的亲和力。与同系物比较，所述抗体对于靶抗原也可以具有基本上更高的亲和力，例如对于靶抗原至少1.5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍、10-3-倍、10-4-倍、10-5-倍、10-6-倍或更大的相对亲和力。这种亲和力可以用常规技术容易地确定，如通过平衡透析；通过使用BIAcore2000仪器，使用由生产商推荐的一般程序；用放射性标记的靶抗原通过放射免疫测定；或通过本领域技术人员已知的另一种方法。亲和力数据可以例如通过Scatchardetal.,AnnN.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析。
如本文所用，短语“抗体拮抗促乳素介导的信号传导”意指通过本发明的抗体阻断促乳素受体激活，导致完全抑制促乳素受体介导的信号传导。
如本文所用，短语“抗体竞争结合”意指一种抗体和另一种抗体结合促乳素受体的竞争。
术语″抗体″以最广义使用，包括完全组装的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、能结合抗原的抗体片段(例如Fab′、F′(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)、骆驼抗体和包含前述的重组肽，只要其展示所需的生物学活性。抗体可以在其重链上具有不同的恒定结构域(Fc结构域)，优选衍生自IgG1、IgG2或IgG4同种型(见下文)。可以引入修饰效应物功能的突变。已经鉴定了在和补体蛋白C1q和Fc受体的相互作用中起主要作用的Fc结构域中的氨基酸残基并且描述了影响效应物功能的突变(综述见Labrijnetal.,CurrentopinioninImmunology20:479-485,2008)。特别地，可以通过在氨基酸位置297将天冬酰胺突变为丙氨酸或谷氨酰胺实现IgG1的去糖基化，其已被报道消除了抗体-衍生细胞-介导的胞毒性(ADCC)(Sazinskyetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.105(51):20169,2008;Simmonsetal.,J.ofImmunologicalMethods263:133–147,2002)。在332位将赖氨酸取代为丙氨酸导致ADCC降低并且去除补体-衍生胞毒性(CDC)，而同时在234和235位将两个亮氨酸取代为丙氨酸导致避免ADCC和CDC[Hezarehetal.,J.ofVirology,75(24):12161-12168,2001]。为了应用IgG4同种型在体内作为保留亲合力的二价治疗剂，可以引入修饰如‘核心铰链区(corehingeregion)’中的丝氨酸至脯氨酸交换(Schuurman,J.etal.Immunology97:693–698,1999)。人IgG2分子形成异源共价二聚体的趋势可以通过在127、232和233位将半胱氨酸之一交换为丝氨酸而阻止(Allenetal.,Biochemistry,2009,48(17),pp3755–3766)。另外的具有降低的效应物功能的形式可以是IgG2m4形式，衍生自携带4个IgG4-特异性氨基酸残基改变的IgG2(Anetal.,mAbs1(6),2009)。抗体片段可以通过重组DNA技术或通过酶促或化学裂解完整抗体产生并在下文进一步描述。单克隆抗体的非限制性实例包括鼠、嵌合、人源化、人和HumanEngineeredTM免疫球蛋白、抗体、具有衍生自免疫球蛋白的序列的嵌合融合蛋白或其突变蛋白或衍生物，每种在下文进一步描述。完整分子和/或片段的多聚体或聚集物包括化学衍生抗体也被考虑。
本文所用的术语″单克隆抗体″指得自一群基本上均质抗体的抗体，即包含在该群中的各个抗体是相同的，除了可能天然发生的可能以少量存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。而且，与典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每个单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性，单克隆抗体是有利的，在于其通过未被具有不同特异性和特性的其它免疫球蛋白污染的均质培养物合成。
修饰语″单克隆″表明得自基本上均质的抗体群的抗体的特性，不解释为需要任何特定方法生产抗体。例如，要使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohleretal.,Nature,256:495，1975描述的杂交瘤方法制备或可以通过重组DNA方法制备(见例如美国专利4,816,567)。″单克隆抗体″也可以例如是重组、嵌合、人源化、人、HumanEngineeredTM或抗体片段。
″免疫球蛋白″或″天然抗体″是四聚体糖蛋白。天然免疫球蛋白中，每一四聚体由两个相同多肽链对组成，每对具有一条″轻″(大约25kDa)和一条″重″链(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100至110或更多个氨基酸的“可变”区主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分限定恒定区，主要负责效应子功能。免疫球蛋白可根据其重链恒定结构域的氨基酸序列归入不同类别。重链分为mu(μ)、delta(△)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并限定抗体同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些中的几种可以进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同同种型具有不同效应物功能；例如，IgG1和IgG3同种型通常具有ADCC活性。人轻链分为kappa(K)和lambda(λ)轻链。轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括大约10或更多个氨基酸的″D″区。通常见FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))。
本文抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”典型发现于抗体的一或多个超变区，即CDR-1、-2、和/或–3区；然而，可变“构架”区也可能在抗原结合中起重要作用，如通过给CDR提供支架。优选地，“抗原结合区”包含至少可变轻链(VL)的氨基酸残基4-103和可变重链(VH)的氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，特别优选的是完整VL和VH链[VL的氨基酸残基1-109和VH的氨基酸残基1-113，氨基酸位置的编号根据Kabat数据库(JohnsonandWu,NucleicAcidsRes.,2000,28,214-218)]。用于本发明的优选免疫球蛋白类别是IgG。
术语″超变″区指负责抗原结合的抗体或功能片段的可变结构域VH和VL的氨基酸残基。超变区包含来自″互补决定区″或CDR的氨基酸残基[即图12所示的轻链可变结构域的残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和88-97(LCDR3)及重链可变结构域的残基29-36(HCDR1)、48-66(HCDR2)和93-102(HCDR3)]和/或来自超变环的那些残基[即Chothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所述的轻链可变结构域的残基26-32(LCDR1内)、50-52(LCDR2内)和91-96(LCDR3内)及重链可变结构域的残基26-32(HCDR1内)、53-55(HCDR2内)和96-101(HCDR3内)]。
抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、微抗体(minibody)、线性抗体(Zapataetal.,ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995))；螯合重组抗体、三抗体或bibodies、内体(intrabodies)、纳米抗体(nanobodies)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals，SMIPs)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH抗体或其突变蛋白或衍生物，以及含有足以给多肽赋予特异性抗原结合的至少免疫球蛋白部分如CDR序列的多肽，只要所述抗体保留所需生物学活性；及抗体片段形成的多特异性抗体(C.A.KBorrebaeck,editor(1995)AntibodyEngineering(BreakthroughsinMolecularBiology),OxfordUniversityPress;R.Kontermann&S.Duebel,editors(2001)AntibodyEngineering(SpringerLaboratoryManual),SpringerVerlag)。除了″双特异性″或″双功能性″抗体之外的抗体理解为其每个结合位点均相同。F(ab’)2或Fab可以被工程化为最小化或完全去除CH1和CL结构域之间的分子间二硫键。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为″Fab″片段，每个具有单一抗原结合位点，并且剩余的″Fc″片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个″Fv″片段的F(ab′)2片段。″Fv″片段是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，所述6个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或仅包含特异于抗原的3个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。
优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得Fv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述见PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab′片段不同在于在包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端加入几个残基。Fab′-SH是本文对于Fab′的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是作为Fab′片段对（在其之间有铰链半胱氨酸）生产的。
“构架”或FR残基是超变区残基之外的那些可变结构域残基。
短语″恒定区″指赋予效应物功能的抗体分子的部分。
术语“突变蛋白”或“变体”可以互换使用，指在可变区或等价于可变区的部分含有至少一个氨基酸取代、缺失或***的抗体的多肽序列，条件是突变蛋白或变体保留了期望的结合亲和力或生物学活性。
突变蛋白可以是基本上同源的或基本上与亲代抗体相同。
术语“衍生物”是指通过这样的技术被共价修饰的抗体，如泛素化、缀合至治疗剂或诊断剂、标记（例如用放射性核素或各种酶）、共价聚合物附着如聚乙二醇化（用聚乙二醇衍生）和***或由化学合成的非天然氨基酸取代。
“人”抗体或功能性人抗体片段在此定义为不嵌合的或“人源化”也不来自（不论全部或部分）非人物种的抗体或片段。人抗体或功能性抗体片段可以来自人或可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在本文中定义为具有根据已知的人抗体序列分析而全部或部分经计算机(insilico)衍生自合成序列的序列的抗体。人抗体序列或其片段的经计算机设计可以例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用由此获得的数据衍生多肽序列而实现。人抗体或功能性抗体片段的另一例子是由分离自人源抗体序列文库（即这种文库基于来自人天然来源的抗体）的核酸编码的一个。人抗体的例子包括如由CarlssonandExp.Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001),etal.Nat.Biotech.18,852-856(2000)和美国专利6,989,250所述的n-CoDeR-based抗体。
“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在本文中定义为是（i）衍生自非人来源（例如转基因小鼠，其带有异源免疫***）的，该抗体基于人种系衍生序列或是（ii）CDR-移植的，其中可变结构域的CDR来自非人来源，而可变结构域的一或多个构架是人类来源的并且恒定结构域（如果有的话）是人类来源的。
如本文中所用，短语“嵌合抗体”是指含有衍生自典型来源自不同物种的两种不同抗体的序列的抗体（见例如美国专利4,816,567）。最典型地，嵌合抗体包含人和鼠抗体片段，通常是人恒定和小鼠可变区。
通过根据Studnickaetal.,美国专利5,766,886所述方法改变亲代序列产生“HumanEngineeredTM”抗体，如SEQIDNO：14和15所示和专利申请WO08/022295所述的抗体。
本发明的抗体可以衍生自重组抗体基因文库。开发制备重组人抗体基因的全部组成成分和在丝状噬菌体表面展示编码抗体片段的技术提供了直接制备和选择人抗体的重组手段，其也可以应用于人源化的、嵌合的、鼠或突变蛋白抗体。通过噬菌体技术产生的抗体在细菌中被生产作为抗原结合片段–通常是Fv或Fab片段–因此缺少效应物功能。效应物功能可以通过两种策略之一引入：片段可以被工程化为完全抗体以在哺乳动物细胞中表达，或工程化为具有能够引发效应物功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。典型地，抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)通过PCR和在组合噬菌体展示文库中随机组合而分别克隆，然后可以选择对于特定抗原的结合。Fab片段在噬菌体表面表达，即物理性连接至编码其的基因。因此，通过抗原结合选择Fab对于Fab编码序列进行共选择（co-select），其随后可被扩增。通过几轮抗原结合和再扩增，称为淘选的方法，特异于抗原的Fab被富集并最终被分离。
描述了自噬菌体展示文库衍生人抗体的多种方法。这种文库可能以单一主构架构建，如CarlssonandExp.Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001),etal.Nat.Biotech.18,852-856(2000)和美国专利6,989,250所述允许多样化的体内形成的(即人衍生的)CDR重组进其中。或者，这种抗体文库可以基于经计算机设计的并由合成产生的核酸编码的氨基酸序列。例如通过分析人序列数据库并使用得自其的数据衍生多肽序列实现抗体序列的经计算机设计。设计和获得经计算机产生序列的方法例如在Knappiketal.,J.Mol.Biol.(2000)296:57;Krebsetal.,J.Immunol.Methods.(2001)254:67;和美国专利6,300,064描述。噬菌体展示技术的综述见WO08/022295(Novartis)。
或者，本发明抗体可以来自动物。这种抗体可以是WO08/022295(Novartis)中总结的人源化的或HumanEngineered的；这种抗体可以来自转基因动物[也见WO08/022295(Novartis)]。
如本文所用，不同“形式”抗原例如PRLR在本文定义为得自不同的翻译和翻译后修饰如但不限于初级促乳素受体转录物剪接差异、糖基化差异和翻译后蛋白酶解差异的不同蛋白分子。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特异性三维结构特征，以及特异性电荷特性。如果通过任何本领域技术人员熟知的方法，一个抗体示为与第二抗体在竞争性结合测定中竞争，而且所述两个抗体结合所述表位的所有氨基酸，则两个抗体“结合相同表位”。
术语“成熟抗体”或“成熟抗原结合片段”如成熟Fab变体包括对给定抗原如PRLR的胞外结构域显示更强结合的抗体或抗体片段的衍生物–即以增加的亲和力结合。成熟是鉴定抗体或抗体片段的6个CDR内的导致这种亲和力增加的少数突变的过程。成熟过程是分子生物学方法组合以在抗体中引入突变并筛选鉴定改良的粘合剂。
治疗方法
治疗方法包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明的抗体。“治疗有效”量在此定义为一种抗体的量，其作为单剂或根据多剂方案、单独或处与其他药物组合足以阻断PRLR阳性细胞在对象处理区域中的增殖，其导致不利病症的缓和，但该量是毒理学耐受的。对象可以是人或非人动物（例如兔，大鼠，小鼠，猴或其它低等（lower-order）灵长类动物）。
本发明的抗体可以与已知药物联合给药，在一些情况下，抗体本身可被修饰。例如，抗体可以缀合至免疫毒素或放射性同位素以潜在地进一步增加效力。
本发明的抗体可以作为在多种不期望PRLR高表达的情况中治疗或诊断工具。特别适于用本发明抗体治疗的失调和病症是子宫内膜异位症，子宫腺肌症，非激素女性生育避孕，良性乳腺病和乳腺痛，泌乳抑制，良性***增生，纤维样瘤(fibroids)，高血促乳素性脱发和正常血促乳素性脱发，和协同治疗联合激素治疗抑制乳腺上皮细胞增殖。
为治疗任何上述病症，用于本发明的药物组合物可以使用一或多种生理可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。本发明的抗体可通过任何合适手段给药，其可以根据被治疗的病症类型变化。可能的给药途径包括胃肠外（例如肌内，静脉内，动脉内，腹膜内或皮下），肺内和鼻内，以及如果需要的话对于局部免疫抑制治疗，病灶内给药。此外，本发明的抗体可通过脉冲输注以例如递减剂量的抗体来给药。优选地，给药通过注射，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短暂的或慢性的。要给予的量将取决于多种因素，如临床症状，各个体重，其他药物是否被给予。本领域技术人员将认识到，给药途径将随待治疗失调或病症而变化。
确定本发明所述新多肽的治疗有效量很大程度上将取决于特定患者特性，给药途径，和所治疗失调的性质。一般性指导可例如在InternationalConferenceonHarmonisation的出版物和Remington′sPharmaceuticalSciences,chapters27and28,pp.484-528(18thed.,AlfonsoR.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:MackPub.Co.,1990)中发现。更特别地，确定治疗有效量将取决于因素如毒性和药物效力。毒性可使用本领域熟知的并在上述参考文献中发现的方法来确定。效力可利用与实施例下面描述的方法结合的相同指导确定。
药物组合物和给药
本发明还涉及药物组合物，其可包括PRLR抗体、单独或与至少一种其它物质如稳定化合物组合，其可被在任何无菌、生物相容的药物载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水的中给药。任何这些分子可以在药物组合物中单独或与其它物质、药物或激素组合施用给患者，在药物组合物中其与赋形剂或药学上可接受的载体混合。在本发明的一个实施方案中，所述药学上可接受的载体是药学上惰性的。
本发明还涉及药物组合物的施用。这种施用是肠胃外完成的。胃肠外递送的方法包括局部、动脉内（直接给肿瘤）、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内或鼻内给药。除了活性成分，这些药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体包括赋形剂和有助于将活性化合物加工成可以药学上使用的制备物的辅剂(auxiliaries)。配制和施用的进一步细节可见于最新版Remington′sPharmaceuticalSciences(Ed.MaackPublishingCo,Easton,Pa.)。
肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射，本发明的药物组合物可以在水溶液中配制，优选在生理学相容的缓冲液如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理学缓冲盐水中。含水注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，活性化合物的悬浮液可制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。任选地，悬浮液也可含有增加化合物溶解度以允许制备高浓缩溶液的合适稳定剂或物质。
用于局部或经鼻给药，适用于待被渗透的特定屏障的渗透剂用于制剂中。这种渗透剂通常是本领域已知的。
肠胃外给药还包括胃肠外递送的方法，其还包括动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内和心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、***内或鼻内给药。
试剂盒
本发明进一步涉及医药包和包含填充有本发明上述组合物的一或多种成分的一或多个容器的试剂盒。伴随这种容器的可以是管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的（反映所述机构批准用于人类给药的产品的制造、使用或销售）通知。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可以含有编码本发明抗体的DNA序列。优选编码这些抗体的DNA序列在适于转染进并由宿主细胞表达的质粒中提供。该质粒可以含有启动子（通常是可诱导启动子）以调节宿主细胞中DNA的表达。所述质粒也可以含有适当的限制位点以促进其它DNA序列***到所述质粒以产生各种抗体。所述质粒还可以含有许多其它元件，以促进所编码蛋白质的克隆和表达。这种元件是本领域技术人员熟知的，包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等等。
制造和储存
本发明的药物组合物可以本领域已知的方式制造，例如通过常规混合、溶解、粒化、制备糖衣、磨细、乳化、包囊、包埋或冻干方法。
所述药物组合物可以提供为在1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇、pH范围4.5-5.5中的冻干粉末，在使用前组合缓冲剂。
制备了在可接受载体中配制的包含本发明化合物的药物组合物后，其可以放置在适当容器中并标记为治疗指示病症。对于PRLR抗体的给药，如标签将包括给药量、频率和方法。
治疗有效量
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中含有有效量的所述活性成分以实现预期目的，即治疗特征在于PRLR表达的特定疾病状态。有效量的确定是在本领域技术人员的能力内。
对于任何化合物，治疗有效量可最初在细胞培养测定例如淋巴瘤细胞或在动物模型通常是小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估计。动物模型也可以用来实现所希望的浓度范围和给药途径。这种信息随后可用于确定用于人类的有用剂量和给药途径。
治疗有效量指的是减轻症状或病症的蛋白质或其抗体、拮抗剂或抑制剂的量。这类化合物的治疗效力和毒性可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中确定，例如ED50（在50％的群体中治疗有效的剂量）和LD50（致死50％群体的剂量）。治疗和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，并且它可以表示为比率ED50/LD50。呈现大治疗指数的药物组合物是优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于配制用于人类的剂量范围。这类化合物的剂量优选在包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量根据所用剂型、患者的敏感性和给药途径在此范围内变化。
通过个体医师根据待治疗患者选择确切剂量。调节剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持期望的作用。可考虑的其他因素包括疾病状态的严重程度，例如子宫内膜异位病灶的大小和位置；患者的年龄、体重和性别；饮食，给药时间和频率，药物组合，反应敏感性，对治疗的耐受/应答。长效药物组合物可以每3-4天、每周、或每两周一次、或每月内一次给药，取决于特定制剂的半衰期和清除率。
正常剂量可从0.1-100,000微克变化，直至约2g总剂量，取决于给药途径。关于特定剂量和递送方法的指导在文献中提供。见US4,657,760；US5,206,344；或US5,225,212。对于多核苷酸，本领域技术人员将使用与蛋白或其抑制剂不同的制剂。类似地，递送多核苷酸或多肽对于特定细胞、病症、位置等将是特异的。对于放射性标记抗体的优选特异性活性范围可以从0.1-10mCi/mg蛋白(Rivaetal.,Clin.CancerRes.5:3275s-3280s,1999;Wongetal.,Clin.CancerRes.6:3855-3863,2000;Wagneretal.,J.NuclearMed.43:267-272,2002)。
本发明通过以下实施例进一步描述。提供实施例仅是通过参考特异实施方案来阐述本发明。这些阐述本发明某些特异方面的示例不限制或限定所公开发明的范围。
使用本领域技术人员熟知和常规的标准技术进行所有实施例，除非另外详细描述。下列实施例的常规分子生物学技术可如标准实验室手册如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989所述进行。
附图描述
图1：促乳素-mRNA（PRL-mRNA）（通过实时TaqManPCR分析进行分析）在从健康女性和患子宫内膜异位症女性的人子宫内膜及病变（异位组织）的表达。
图2：促乳素受体-mRNA（PRL-mRNA）（通过实时TaqManPCR分析进行分析）在从健康女性和患子宫内膜异位症女性的人子宫内膜及病变（异位组织）的表达。
图3A：中和性促乳素受体抗体Mat3在用于良性乳腺疾病的高血促乳素症代替模型的小鼠乳腺中抑制旁侧分枝。非特异性抗体无效果。健康正常促乳素血症小鼠(无垂体)显示减少的旁侧分枝，而垂体移植(高血促乳素症)增强旁侧分枝和小叶肺泡发展。特异性抗体Mat3拮抗高血促乳素症的作用。
图3B：中和性促乳素受体抗体Mat3抑制良性乳腺疾病的高血促乳素症代替模型小鼠乳腺中促乳素靶基因elf5的诱导。非特异性抗体无效果。健康正常促乳素血症小鼠（无垂体）显示乳腺中减少的elf5表达，而垂体移植（高泌乳素血症）强烈刺激elf5基因表达。特异性抗体Mat3但不是非特异性对照抗体拮抗高血促乳素症的作用。
图4：构架氨基酸位置根据JohnsonandWu(NucleicAcidsRes.2000,28,214-218)的Kabat编号。
图5A：用抗-PRLR抗体HE06642的FACS分析结果。相比于不表达PRLR的亲代细胞系，在表达人和小鼠PRLR的HEK293细胞中在固定浓度确定抗体结合。Y-轴：#，0.37μg/mlHE06642作为IgG1分子的中值荧光强度。*，1=具有人PRLR的HEK293；2=具有鼠PRLR的HEK293；3=无PRLR的HEK293。
图5B：用抗-PRLR抗体Mat3的FACS分析结果。与不表达PRLR的细胞系（HEK293）相比，在表达人PRLR的HEK293细胞和表达恒河猴PRLR的Ba/F细胞中于一系列不同浓度确定抗体结合。在最高抗体浓度的最大信号强度依赖于细胞表面上表达的PRLR数量，即HEK293和Ba/F细胞在其表面上不携带相同数量的PRLR。Y轴：＃，中值荧光强度，X轴：°，不同浓度的μg/ml的抗体Mat3作为IgG2分子；*，1（圆圈）=具有人PRLR的HEK293；2（三角形）=具有恒河猴PRLR的Ba/F；3（正方形）=无PRLR的HEK293。
图6A：Mat3-VL结构域的序列区与VBASE2中鉴定的最相似人V片段的对比(Mat3-VL与种系序列humIGLV056是90%相同的)。
图6B：Mat3-VH结构域的序列区与VBASE2中鉴定的最相似人V片段的对比(Mat3-VH与种系序列humIGHV313是90%相同的)。
图6C：HE06642-VL结构域的序列区与VBASE2中鉴定的最相似人V片段的对比(HE06642-VL与种系序列humIGKV083是80%相同的)。
图6D：HE06642-VH结构域的序列区与VBASE2中鉴定的最相似人V片段的对比(HE06642-VH与种系序列humIGHV313是89%相同的)。
图7：成熟Fab变体的基于ELISA的结合测试：
测试含有Fab的大肠杆菌上清液对人PRLR的固定化胞外结构域的结合。该图以柱状图说明Fab变体的结合。Y轴给出信号强度（消光）（＃），x轴是Fab变体（*）的名称。成熟Fab变体005-C04-20-2相比亲本抗体005-C04的非成熟Fab提高的信号强度证明005-C04-20-2相比005-C04具有更好的PRLR结合。“变体”pET28表示不表达任何Fab的携带Fab表达质粒pET28a的大肠杆菌菌株的上清液(Novagen,EMDChemicalsGroup,Merck,Darmstadt,Germany)。
图8：肽扫描ELISA结果的棒图表示
各标绘的值表示用SEM（平均值标准误差）表示的对于54个肽得到的平均值。黑色柱条代表抗体HE06642的相对结合强度。白色柱条表示抗体Mat3的相对结合强度。数据标准化为在整个2916肽数据集的平均并根据背景信号进行校正。
图8A示出对于范围从氨基酸103-PDPPLELAVEVKQPE-117（在X轴上表示为‘117’）至127-WSPPTLIDLKTGWFT-141（表示为‘141’）的一亚组肽的ELISA，即沿着ECD氨基酸序列以3个氨基酸移动的这些肽覆盖人PRLR的ECD的从氨基酸位置103-141的区域。此数据集内所观察到的最强差异是肽109-LAVEVKQPEDRKPYL-123（表示为′123′）具有4×10-12的显著性p值，而肽121-PYLWIKWSPPTLIDL-135（表示为‘135’）具有7×10-40的显著性p值。
图8B示出对于范围从139-WFTLLYEIRLKPEKA-153（在X轴上表示为‘153’）至163-QQTEFKILSLHPGQK-177（表示为‘177’）的一亚组肽的ELISA，即沿着ECD氨基酸序列以3个氨基酸移动的这些肽覆盖人PRLR的ECD的从氨基酸位置139-177的区域。此数据集内所观察到的最强差异是肽148-LKPEKAAEWEIHFAG-162（表示为′162′）具有6×10-26的显著性p值，而肽160-FAGQQTEFKILSLHP-174（表示为‘174’）具有8×10-8的显著性p值。
这些数据表明，两种抗体结合人PRLR的ECD的S2亚结构域（氨基酸101至210），因此与主要结合S1结构域的天然配体PRL是非竞争性的。然而，这种肽扫描示出Mat3和HE06642之间结合S2亚基存在差异。这一发现表明为什么抗体Mat3相比HE06642显示不同的物种特异性和效力。
图9：通过中和性促乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制促乳素诱导的BaF3细 胞(稳定转染了人促乳素受体的单克隆细胞)增殖。对于如下IgG1形式的抗体确定IC50值：Mat3(实心圆)，IC50=0.7nM[在1μg/ml(=6.7nM)100%抑制]；HE06.642(空心方形)，IC50=4.2nM[在1μg/ml(=6.7nM)81%抑制]；非特异性对照抗体(空心三角形)：无抑制作用。
图10：通过中和性促乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制促乳素诱导的BaF3细 胞(稳定转染了鼠促乳素受体的单克隆细胞)增殖。对于如下IgG1形式的抗体确定IC50值：Mat3(实心圆)，IC50=3.0nM[在1μg/ml(=6.7nM)97.4%抑制]；HE06.642(空心方形)，无抑制作用；非特异性对照抗体(空心三角形)：无抑制作用。
图11A和B：通过中和性促乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制促乳素诱导的 BaF3细胞(稳定转染了恒河猴促乳素受体的单克隆细胞)增殖。对于如下IgG1形式的抗体确定IC50值：Mat3(实心圆)，IC50=4.6nM[在1μg/ml(=6.7nM)99.1%抑制](见图11A)；HE06.642(空心方形)，IC50=206nM[在240μg/ml(=1600nM)92.4%抑制](见图11A和B)；非特异性对照抗体(空心三角形)：无抑制作用(见图11A和B)。
图12：用中和性PRLR抗体Mat3治疗SHN小鼠的子宫腺肌病(=宫内子宫内膜异位 症)。结果如实施例5所述描绘在y轴作为疾病分数（子宫腺肌病分数）。每个实验组的中值疾病分数表示为水平条。实验组如下：1组，无垂体同系移植（正常促乳素血症小鼠宫内子宫内膜异位症发展到一定程度，中值疾病分数=1）；2组，具有垂体同系移植（由于垂体同系移植的高泌乳素血症提高疾病分数，中值疾病分数=3）；3组，具有垂体同系移植用非特异性鼠IgG2a同种型对照抗体以30mg/kg剂量每周一次治疗（中值疾病分数=3）；组4，具有垂体同系移植用鼠IgG2a形式的Mat3抗体（Mat3-mIgG2a）以30mg/kg剂量每周一次治疗（Mat3完全治愈动物。每周一次给予30mg/kg的Mat3后的疾病分数（中值疾病分数=0）甚至比正常促乳素血症小鼠（中值疾病分数=1）的疾病分数更低；5组，具有垂体同系移植用抗体Mat3-mIgG2a在10mg/kg剂量每周一次治疗（中值疾病分数=2）；组6，具有垂体同系移植用抗体Mat3-mIgG2a以3mg/kg剂量每周一次治疗（中值疾病分数=2.5）；组7，具有垂体同系移植用抗体Mat3-mIgG2a以1mg/kg剂量每周一次治疗（中值疾病分数=2.5）。用抗体Mat3治疗显示中值疾病分数的剂量依赖性减少。因此Mat3适于治疗女性的宫内子宫内膜异位症（=子宫腺肌病）和宫外子宫内膜异位症。
图13A和B：抑制稳定转染了人和鼠PRLR的HEK293细胞中的荧光素酶报道基因活 性。图13A中人PRLR-依赖性活性针对抗体浓度作图，而图13B示出鼠PRLR-依赖性活性。荧光 素酶活性表示为不添加任何抗体时获得的最大荧光素酶活性的百分比。对于如下IgG1形式的抗体确定IC50值：Mat3(实心圆)，IC50=0.5nM(图13A，hPRLR)和1.3nM(图13B，mPRLR)；HE06.642(空心方形)，IC50=4.6nM(图13A，hPRLR)和>>1333nM(=20μg/ml)(图13B，mPRLR)；非特异性同种型对照抗体(空心三角形)：无抑制作用(见图13A和B)。这些数据示出Mat3相比HE06.642对于hPRLR改良的活性，并证明Mat3对于mPRLR的活性，而HE06.642不抑制mPRLR-依赖性荧光素酶活性。
图14：使用流式细胞术表明的中和性PRLR抗体对于表达来自人、小鼠和猴的PRLR的细胞的细胞结合。中值荧光信号强度针对抗体浓度作图。应用如下IgG1抗体：Mat3(实心圆)，HE06.642(空心方形)，非特异性同种型对照抗体(空心三角形)。测试不同细胞系：A)稳定转染人PRLR的HEK293细胞系，B)稳定转染鼠PRLR的HEK293细胞系，C)未转染任何PRLR基因的HEK293细胞系(阴性对照细胞系)，D)人乳腺癌细胞系T47D，E)稳定转染恒河猴PRLR的BaF3细胞系，F)稳定转染人PRLR的BaF3细胞系，G)稳定转染鼠PRLR的BaF3细胞系。抗体对不同细胞系的细胞系结合效力从作为EC50值的剂量应答曲线推断(见表8)。剂量应答图表明Mat3相比HE06.642更好的细胞结合性质。
SeqIDNO:1表示Mat3VH的氨基酸序列
SeqIDNO:2表示Mat3VL的氨基酸序列
SeqIDNO:3表示Mat3VH的核酸序列
SeqIDNO:4表示Mat3VL的核酸序列
SeqIDNO:5表示Mat3HCDR1的氨基酸序列
SeqIDNO:6,表示Mat3HCDR2的核酸序列
SeqIDNO:7表示Mat3HCDR3的核酸序列
SeqIDNO:8表示Mat3LCDR1的核酸序列
SeqIDNO:9表示Mat3LCDR2的核酸序列
SeqIDNO:10表示Mat3LCDR3的核酸序列
SeqIDNO:11表示融合至Fc-His的食蟹猴和恒河猴PRLR的胞外结构域的氨基酸序列
SeqIDNO:12表示人ECD_PRLR，氨基酸位置1–210，S1结构域1-100(S1结构域构建体1-102)，S2结构域101-210
SeqIDNO:13表示鼠ECD_PRLR，氨基酸位置1–210
SeqIDNO:14表示Novartis(WO2008/22295)HE06642VH的氨基酸序列
SeqIDNO:15表示Novartis(WO2008/22295)HE06642VL的氨基酸序列
SeqIDNO:16表示Novartis(WO2008/22295)HE06642VH核酸序列
SeqIDNO:17表示Novartis(WO2008/22295)HE06642VL核酸序列
实施例
实施例1
通过中和性促乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制促乳素诱导的BaF3细胞(稳 定转染了人促乳素受体的单克隆细胞)增殖。
为分析中和性PRLR抗体的体外效力，使用BaF3细胞的促乳素激活的细胞增殖的抑制。细胞稳定转染人PRLR并常规培养在含有2mM谷氨酰胺存在10%FCS和10ng/ml人促乳素的RPMI中。在含有1%FCS、不含促乳素培养基中饥饿6小时后，将细胞以25000细胞/孔的密度种植在96-孔板中。用35ng/ml促乳素刺激细胞并与增加剂量的中和性PRLR抗体共保温2天。使用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega)分析细胞增殖。产生对于促乳素刺激的细胞生长的抑制的剂量应答曲线并计算IC50值。作为阴性对照，用非特异性对照抗体刺激。测试抗体Mat3相比抗体HE06.642(两种均是IgG1形式)(图9)。
实施例2
通过中和性促乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制促乳素诱导的BaF3细胞(稳 定转染了鼠促乳素受体的单克隆细胞)增殖。
为分析中和性PRLR抗体的体外效力，使用Ba/F3细胞促乳素激活的细胞增殖的抑制。细胞稳定转染鼠PRLR并常规培养在含有2mM谷氨酰胺存在10%FCS和10ng/ml人促乳素的RPMI中。在含有1%FCS不含促乳素的培养基中饥饿6小时后，将细胞以20000细胞/孔的密度种植在96-孔板中。用50ng/ml促乳素刺激细胞并与增加剂量的中和性PRLR抗体共保温3天。使用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega)分析细胞增殖。产生对于促乳素刺激的细胞生长的抑制的剂量应答曲线并计算IC50值。作为阴性对照，用非特异性对照抗体刺激。测试抗体Mat3相比抗体HE06.642(两种均是IgG1形式)(图10)。
实施例3
通过中和性促乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制促乳素诱导的BaF3细胞(稳 定转染了恒河猴促乳素受体的单克隆细胞)增殖。
为分析中和性PRLR抗体的体外效力，使用Ba/F3细胞促乳素激活的细胞增殖的抑制。细胞稳定转染恒河猴PRLR并常规培养在含有2mM谷氨酰胺存在10%FCS和10ng/ml人促乳素的RPMI中。在含有1%FCS不含促乳素的培养基中饥饿6小时后，将细胞以25000细胞/孔的密度种植在96-孔板中。用100ng/ml促乳素刺激细胞并与增加剂量的中和性PRLR抗体共保温2天。使用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega)分析细胞增殖。产生对于促乳素刺激的细胞生长的抑制的剂量应答曲线并计算IC50值。作为阴性对照，用非特异性对照抗体刺激。测试抗体Mat3相比抗体HE06.642(两种均是IgG1形式)(图11)。
实施例4
通过实时TaqManPCR分析定量分析来自患者和健康对照的在位内膜和异位内膜 以及子宫内膜异位病变中的促乳素和促乳素受体基因表达。
使用ABIPrism7700SequenceDetectorSystem(PEAppliedBiosystems)根据厂商指导并如Endocrinolgy2008,149(8):3952-3959)所述以及本领域技术人员所知进行实时TaqmanPCR分析。PRL和PRLR的相对表达水平归一化至亲环素(cyclophyllin)的表达。我们使用定量实时TaqmanPCR分析分析了健康女性子宫内膜以及患者子宫内膜和子宫内膜异位病变中PRL和PRLR的表达。与健康子宫内膜或来自患者的子宫内膜相比，子宫内膜异位病变中促乳素及其受体的表达明显上调。
结果示于图1和2。
这些发现暗示自分泌促乳素信号传导在子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症，局限于子宫的子宫内膜异位症形式)的发展和维持中起作用。
实施例5
用中和性PRLR抗体Mat3治疗SHN小鼠的子宫腺肌病(=宫内子宫内膜异位症)。
为测试中和性PRLR抗体在子宫内膜异位症中的效力，使用依赖于全身高血促乳素症的子宫腺肌病SHN小鼠模型(Actaanat.116:46-54,1983)。SHN小鼠高血促乳素症通过在7周龄雌鼠肾囊下垂体同系移植诱导(Actaanat.116:46-54,1983)。垂体同系移植两周后开始皮下施用中和性PRLR抗体Mat3(30mg/kg；10mg/kg，3mg/kg，1mg/kg)或非特异性抗体(30mg/kg)。用所述抗体每周一次处理动物7周。如前所述评估腺体组织对子宫肌层的侵润(LaboratoryAnimalScience1998,48:64-68)。尸检时(垂体移植后第66天)，子宫在缓冲的4%***中固定过夜并包埋在石蜡中。如下评估子宫腺肌病(=宫内子宫内膜异位症)的程度：
0级=无子宫腺肌病
1级=子宫肌层内层失去其同心取向
2级=子宫内膜腺体侵入子宫肌层的内层
3级=子宫内膜腺体在子宫肌层的内层和外层之间
4级=子宫内膜腺体侵入子宫肌层的外层
5级=子宫内膜腺体在子宫肌层的外层以外
所述实验包含如下实验组：
1.无垂体移植的动物，即正常促乳素血症小鼠
2.具有垂体移植的动物，即高血促乳素症小鼠
3.具有垂体移植的动物，用非特异性对照抗体每周一次以30mg/kg的剂量处理
4.具有垂体移植的动物，用鼠IgG2a形式的中和性促乳素受体抗体Mat3每周一次以30mg/kg的剂量处理
5.具有垂体移植的动物，用鼠IgG2a形式的中和性促乳素受体抗体Mat3每周一次以10mg/kg的剂量处理
6.具有垂体移植的动物，用鼠IgG2a形式的中和性促乳素受体抗体Mat3每周一次以3mg/kg的剂量处理
7.具有垂体移植的动物，用鼠IgG2a形式的中和性促乳素受体抗体Mat3每周一次以1mg/kg的剂量处理
中和性PRLR抗体Mat3抑制宫内子宫内膜异位症(=子宫腺肌病)(图12)。中和性PRLR抗体Mat3因此适于治疗女性宫内子宫内膜异位症(=子宫腺肌病)和宫外子宫内膜异位症。
实施例6
中和性PRLR抗体Mat3适于治疗良性乳腺疾病。
激活PRLR突变或局部或全身高血促乳素症能够引起良性乳腺疾病。因此，使用乳腺增殖提高的高血促乳素症小鼠模型(最严重形式的良性乳腺疾病的标志)。12周龄雌性Balb/c小鼠在肾囊下接受垂体同系移植或未手术。垂体同系移植的小鼠保持不治疗或垂体移植后第15、22、29和36天用IgG2形式的中和性PRLR抗体Mat3(=IgG2Mat3)或IgG2形式的非特异性对照抗体每周一次皮下治疗。抗体剂量为30mg/kg。实验组大小为8只动物。
所述实验包含如下实验组：
1.无垂体移植的动物，即正常促乳素血症小鼠
2.具有垂体移植的动物，即高血促乳素症小鼠
3.具有垂体移植的动物，用非特异性对照抗体每周一次以30mg/kg的剂量处理
4.具有垂体移植的动物，用中和性促乳素受体抗体Mat3每周一次以30mg/kg的剂量处理
垂体移植后第38天处死小鼠。死亡前2小时，动物接受腹膜内注射BrdU以监测上皮细胞增殖。左腹股沟乳腺在Carnoy’s溶液中固定并且制备乳腺全标本包埋(wholemount)并用CarmineAlaune染色。在乳腺全标本包埋中评估旁侧分枝(Side-branching)。结果示于图3A。抗体Mat3抑制乳腺中的旁侧分枝，非特异性对照抗体无作用(图3A)。
之后将乳腺全标本包埋包埋在石蜡中并进行BrdU免疫染色，如前所述(Endocrinology149(8):3952-3959;2009)。在每个动物4个组织学乳腺切片中分析上皮细胞增殖。
将无***的横向右腹股沟乳腺的三分之一在液氮中冷冻并进行RNA制备。逆转录后，使用ABIPrism7700SequenceDetectorSystem根据厂商指导(PEAppliedBiosystems)进行实时TaqmanPCR分析。评估促乳素靶基因elf5的表达并归一化至细胞角蛋白18表达。通过比较ΔCT-法计算相对mRNA水平。垂体同系移植即高血促乳素症增强了促乳素靶基因elf5的表达(图3B)。特异性抗体Mat3、但不是非特异性对照抗体抑制elf5基因表达，表明成功阻断促乳素受体(图3B)。
抗体Mat3因此适于治疗良性乳腺疾病。
实施例7
自人抗体噬菌体展示文库分离靶特异性抗体
为分离能够中和人PRLR活性的抗体组，平行研究了3个表达Fab和scFv片段的人抗体噬菌体展示文库。用于文库淘选的靶是分别由SEQIDNO：12和13的氨基酸1-210表示的人和小鼠促乳素受体的可溶性胞外结构域（ECD）。替代靶为C-末端连接至6个组氨酸或通过具有氨基酸序列“异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸”的接头连接至人IgG1-Fc结构域的PRLR的ECD。
通过Marksetal.(MethodsMoIBiol.248:161-76,2004)所述方法从噬菌体展示选择靶特异性抗体。将噬菌体展示文库与50pmol生物素化ECD在室温保温1小时，然后使用100μl的链霉抗生物素蛋白珠悬浮液捕获形成的复合物(DynabeadsM-280Streptavidin,Invitrogen)。通过用洗涤缓冲液(PBS+5%乳)洗涤珠去除非特异性噬菌体。用0.5ml的100nM三乙胺(TEA)洗脱结合的噬菌体，并通过添加等体积的IMTRIS-ClpH7.4立即中和。洗脱的噬菌体混合物(pool)用于感染生长在对数期的TG1大肠杆菌细胞，并如所述拯救噬粒(MethodsMoIBiol.248:161-76,2004)。重复选择共3轮。在ELISA测定中对得自感染了来自第三轮淘选的洗脱的噬菌体的TG1细胞的单个菌落筛选结合活性。简言之，得自感染了洗脱的噬菌体的TG1细胞的单个菌落用于接种96-孔板中的培养基。
微生物培养物生长至OD60O=0.6，在该点通过添加1mMIPTG诱导可溶性抗体片段的表达，之后在摇床培养箱中在30℃过夜培养。细菌离心，制备细胞周质提取物并根据微平板厂商提供的标准ELISA方案用于检测抗体对固定在96孔微平板（96孔平底Immunosorb板，Nunc）的ECD的结合活性。
使用Biacore2000估计抗促乳素受体(PRLR)抗体结合重组胞外结构域(ECD)的亲和力并用于抗体的亲和力排名。
实施例8
抗体变体的成熟：
抗体亲和力成熟是两步过程，其中组合饱和诱变和基于孔的高通量筛选(well-basedhighthroughputscreening)鉴定导致亲和力增加的少数突变。在第一轮的亲和力成熟，根据BMCBiotechnology7:65,2007使用NNK-三核苷酸盒通过定点诱变引入野生型抗体的位置多样化(其中N表示25%混合每种腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸，表示50%混合每种胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸)。这样，所有20种氨基酸引入各个氨基酸位置。这种位置随机化限于6个互补决定区(CDR)。在第二轮亲和力成熟中，组合有益取代并筛选进一步的改良。
通过ELISA测试筛选成熟的“005-C04”Fab变体：
96孔微滴定平板用1μg/ml的人PRLR包被。平板在4℃保温过夜。用含有3%牛血清白蛋白的PBS封闭，添加含有Fab变体的正态化(normalized)大肠杆菌衍生上清。通过添加标记了辣根过氧化物酶的抗flag抗体(Sigma,A8592)检测形成的复合物。
添加AmplexRed作为辣根过氧化物酶荧光底物并在室温保温30分钟。使用TecanInfiniteF500读数器测量在570nm的吸收和585nm的消光。获得的结果筛选hit“005-C04-20-2”示于图7。在筛选hit“005-C04-20-2”(图7)中有益于亲和力改良的各个取代评估其对抗体热稳定性的影响，以确保在温度升高变性期间Fab结构域的协同解折叠(cooperativeunfolding)。抗体Mat3是“005-C04-20-2”衍生物，其中热去稳定化取代逆转为亲代抗体“005-C04”。
实施例9
抗体对细胞表面上表达的小鼠和人PRLR的交叉反应性
a)为了解抗体HE06642对于携带鼠PRLR的细胞的失去的抗增殖活性，通过对分别稳定表达人和鼠PRLR的HEK293细胞进行流式细胞术确定HE06642对细胞上表达的小鼠和人PRLR的结合特性。收获所述细胞以及无PRLR的亲代HEK293细胞系，离心并以大约5x106细胞/ml重悬在含有2%FBS和0.1%叠氮钠的1xPBS(FACS缓冲液)。抗体HE06642在FACS缓冲液中稀释至2-倍终浓度，加入适当的样品孔(50μl/孔)。对于二抗和自身荧光对照，将50μlFACS缓冲液加入适当孔。将50μl细胞悬浮液加入每个样品孔。样品在4℃保温1小时，用冷FACS缓冲液洗涤两次，并重悬在含有1:100稀释的PE-缀合山羊抗人IgG的FACS缓冲液中。在4℃保温30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬在含有1mg/ml碘化丙啶的FACS缓冲液中(Invitrogen,SanDiego,CA)并通过流式细胞术分析。如图5A所示，抗体HE06.642仅结合人PRLR而不结合鼠PRLR。这一观测与实施例2和12报道的关于HE06.642在鼠PRLR依赖性增殖和荧光素酶报道基因测定中失去活性的发现一致。
b)为证明抗体Mat3对携带人和恒河猴PRLR（其胞外结构域的氨基酸序列与食蟹猴的相同）的细胞的细胞结合，通过对分别稳定表达人和猴PRLR的HEK293细胞进行流式细胞术确定Mat3对细胞上表达的人和猴PRLR的结合特性。收获细胞，离心并以大约2x106细胞/ml重悬在含有3%FBS和0.05%叠氮钠的1xPBS(FACS缓冲液)中。在FACS缓冲液中将抗体Mat3稀释至2-倍终浓度并加入适当样品孔(50μl/孔)。对于二抗和自身荧光对照，将50μlFACS缓冲液加入适当孔。将50μl细胞悬浮液加入每个样品孔。在4℃保温样品1小时，用冷FACS缓冲液洗涤两次并重悬在含有1:100稀释的PE-缀合山羊抗人IgG的FACS缓冲液中。在4℃保温30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬在含有1mg/ml碘化丙啶的FACS缓冲液中(Invitrogen,SanDiego,CA)并通过流式细胞术分析。如图5B所示，抗体Mat3结合人PRLR以及猴PRLR。在最高抗体浓度的最大信号强度依赖于细胞表面表达的PRLR数量，即HEK293和Ba/F细胞在其表面不携带相同数量的PRLR。基于图5B所示的剂量应答曲线计算EC50值以产生对于Mat3对于细胞的结合强度的测量值(表2)。Mat3的基于细胞的结合效力对于具有人PRLR的HEK293细胞是0.53nM，对于具有猴PRLR的Ba/F细胞是2.94nM。这些数据支持这样的发现，即Mat3不仅是非常强力的人特异性物质，而且在合理剂量对于低纳摩尔范围的猴PRLR是有活性的。
实施例10
使用表面等离子共振分析纯化的胞外PRLR结构域的结合研究
在BiacoreT100设备(GEHealthcareBiacore,Inc.)上通过表面等离子共振分析确定抗体Mat3的结合亲和力。抗体通过间接捕获试剂抗人IgGFc固定在CM5传感器芯片。来自“HumanAntibodyCaptureKit”(BR-1008-39,GEHealthcareBiacore,Inc.)的试剂如厂商所述使用。每个细胞固定大约5000RU单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体。抗体Mat3以5μg/ml浓度、10μl/min注射10秒以达到大约200-600RU的捕获水平。将HEPES-EP缓冲液(GEHealthcareBiacore,Inc.)中不同浓度(400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.12nM)的人、猴或鼠PRLR的ECD以60μl/min流速注射固定的Mat3抗体3分钟并允许解离10分钟。人PRLR(SEQIDNO:12)、猴PRLR(SEQIDNO:11，通过因子Xa消化蛋白酶解去除Fc-His-标签后)和鼠PRLR(SEQIDNO:13)的ECD代表单价分析物。在线参考细胞校正随后通过缓冲液样品扣除后产生传感图。基于结合(kon)和解离速度(koff=kd)常数的比率计算解离平衡常数(KD)，通过使用BiaEvaluation软件将传感图与一阶1:1结合模型拟合获得。单价解离常数(KD，亲和力)和解离速度(kd=koff)值示于表1。
实施例11
肽扫描
a)肽合成：
为再构建人PRLR的ECD、靶分子SEQIDNO.12的氨基酸位置1-210的不连续表位，合成结构肽(structuredpeptide)文库。这使用Pepscan所有的ChemicallyLinkedPeptidesonScaffolds(CLIPS)技术(Timmermanetal.,2007,J.Mol.Recognit.20:283-99;PepscanTherapeutics,Lelystad,Netherlands)进行。CLIPS技术允许将肽结构化为单一环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠及其组合。CLIPS模板连接半胱氨酸残基。肽中多个半胱氨酸的侧链连接一或两个CLIPS模板。例如，将0.5mM的T2CLIPS模板1,3-双(溴甲基)笨溶液溶解在碳酸氢铵(20mM,pH7.9)/乙腈(1:1(v/v)中。将这种溶液加入肽阵列。固相中存在的两个半胱氨酸的侧链结合的CLIPS模板结合肽阵列的肽(具有3ul孔的455孔平板)。肽阵列在溶液中轻轻摇动30-60分钟，同时在溶液中完全覆盖。最终，用过量H2O充分洗涤肽阵列并在70℃于PBS(pH7.2)中含有1%SDS/0.1%β-巯基乙醇的破坏缓冲液中超声30分钟，随后在H2O中再超声45分钟。以相似方式但是用3个半胱氨酸制备携带肽的T3CLIPS。
b)肽扫描ELISA：
在基于PEPSCAN的ELISA中测试抗体Mat3和抗体HE06642对每种肽的结合(Slootstraetal.,1996,MolecularDiversity1:87-96)。肽阵列与5%-100%结合缓冲液预保温(1小时，20℃)。结合缓冲液组成为1%Tween-80、4%马血清、5%卵白蛋白(w/v)并用PBS稀释。洗涤后，肽阵列与在含有1%Tween-80的PBS中的一抗溶液(1-5μg/ml)保温(4℃过夜)。洗涤后，肽阵列与抗体过氧化物酶缀合物100%结合缓冲液的1/1000稀释液在25℃保温1小时(anti-human,humpo)。洗涤后，过氧化物酶底物2,2′-连氮基-二-3-乙基苯磺(ABTS)并加入2μl/ml的3%H2O2。1小时后，测量显色。用电荷耦合器件(CCD)-相机和图像处理***定量显色。
c)数据处理：
原始数据是通过CCD-相机获得的光学值。值范围从0-3000mAU，相似于标准96-孔平板ELISA-读数器。定量结果并储存在Peplab数据库。提取结合值用于分析。偶尔地，孔含有气泡产生假阳性值，该卡被手动检查，气泡导致的任何值记为0。
d)数据分析和表示：
热图是从实验数据的经验值被组织成二维图、然后被表示为颜色的数据图形表示(Brinton,1914,GraphicMethodsforPresentingFacts,NewYork:TheEngineeringMagazineCompany;GowerandDigby,1981,“Expressingcomplexrelationshipsintwodimensions”inInterpretingMultivariateData,ed.Barnett,V.,Chichester,UK:JohnWiley&Sons,pp.83-118)。对于双环CLIPS肽，这种二维图能够衍生自第一环和第二环的独立序列。
对于靶蛋白(人PRLR的ECD)，2916个CLIPS肽具有在两个相继CLIPS环中组合的有效排列的54个独特亚序列的序列。因此，观测的PepscanELISA数据可以在54x54矩阵中作图，其中每个X坐标是第一环的氨基酸序列，每个Y坐标是第二环的氨基酸序列。对于矩阵中的每个XY坐标，放置的PepscanELISA值衍生自具有序列X+Y的肽。为进一步促进目测，用连续梯度的颜色代替PepscanELISA值。在这种情况中，极低值是绿色，极高值是红色，平均值是黑色。这种色彩图用于所述数据矩阵时，产生色彩热图。基于这些热图表示选择揭示抗体Mat3和HE06642之间ELISA结果中最显著差异的肽。对于这些肽，处理每个ELISA信号值以在柱形图中表示(图8A和8B)。每个作图值表示得自54个肽的平均值和S.E.M(平均值的标准差)。数据归一化至全部2916个肽数据组的平均值并对背景信号校正。
图8A示出范围自氨基酸103-PDPPLELAVEVKQPE-117（在X轴表示为‘117’）至127-WSPPTLIDLKTGWFT-141(表示为‘141’)的肽亚组的ELISA结果，即沿着ECD氨基酸序列移动3个氨基酸的这些肽覆盖了人PRLR的ECD的氨基酸位置103-141的区域。在这个数据组中观测到的最强差异是肽109-LAVEVKQPEDRKPYL-123(表示为‘123’)具有显著性p-值4x10-12，和肽121-PYLWIKWSPPTLIDL-135(表示为‘135’)具有显著性p-值7x10-40。
图8B示出范围自139-WFTLLYEIRLKPEKA-153(在X轴表示为‘153’)至163-QQTEFKILSLHPGQK-177(表示为‘177’)的肽亚组的ELISA结果，即沿着ECD氨基酸序列移动3个氨基酸的这些肽覆盖了人PRLR的ECD的氨基酸位置139-177的区域。在这个数据组中观测到的最强差异是肽148-LKPEKAAEWEIHFAG-162(表示为‘162’)具有显著性p-值6x10-26，和肽160-FAGQQTEFKILSLHP-174(表示为‘174’)具有显著性p-值8x10-8。
这些数据证明两种抗体结合人PRLR的ECD的S2亚结构域(氨基酸101-210)并因此与主要结合S1结构域的天然配体PRL是非竞争性的。然而，这种肽扫描示出Mat3和HE06642结合S2结构域之间存在差异。这种发现表明为什么抗体Mat3相比HE06642示出不同的物种特异性和效力。
实施例12
抑制稳定转染人和鼠PRLR的HEK293细胞中的荧光素酶报道基因活性
为进一步分析中和性PRLR抗体Mat3对于人和鼠PRLR的体外活性，使用报道基因测定。稳定转染了鼠PRLR的HEK293细胞瞬时转染了在LHRE(催乳激素反应元件)控制下的荧光素酶报道基因。之后，细胞以20000细胞/孔(80μl)的密度种植在具有4.5g/L葡萄糖、2mMGlutamax、0.5%FCS和1%青霉素/链霉素的DMEM高葡萄糖培养基的96-孔平板中。次日，加入有和无增加剂量测试抗体(10μl)的200ng/ml人促乳素(10μl)。24小时后确定荧光素酶活性。为了对比，也测试了抗体HE06642和靶向称为CTX的霍乱毒素的非特异性抗体。所有抗体测试为IgG1分子(图13A和13B)。
实施例13
使用表面等离子共振分析进行的纯化的胞外PRLR结构域的结合研究
在BiacoreT100设备(GEHealthcareBiacore,Inc.)上通过表面等离子共振分析平行确定抗体Mat3和HE06642的结合亲和力。抗体通过间接捕获试剂抗人IgGFc固定在CM5传感器芯片。如厂商所述使用来自“HumanAntibodyCaptureKit”(BR-1008-39,GEHealthcareBiacore,Inc.)的试剂。每个细胞固定大约5000RU单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体。每种测试抗体以5μg/ml的浓度10μl/min注射10秒以达到大约200-600RU的捕获水平。HEPES-EP缓冲液(GEHealthcareBiacore,Inc.)中不同浓度(400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.12nM)的人、猴或鼠PRLR的ECD以60μl/min的流速注射固定的测试抗体3分钟并允许解离10分钟。人PRLR(SEQIDNO:12)、猴PRLR(SEQIDNO:11，通过因子Xa消化蛋白酶解去除Fc-His-标签后)和鼠PRLR(SEQIDNO:13)的ECD表示单价分析物。在线参考细胞校正随后通过缓冲液样品扣除后产生传感图。基于结合(kon)和解离速度(koff=kd)常数的比率计算解离平衡常数(KD)，通过使用BiaEvaluation软件将传感图与一阶1:1结合模型拟合获得(见表7)。
表7：通过表面等离子共振对Mat3和HE06.642确定的人、猴和鼠PRLR(在HEK293细胞中表达)的纯化的胞外结构域的单价解离常数和解离速度
#WO2008/022295中HE06642公开的亲和力是KD(人PRLR)=2.6x10-9M，KD(猴PRLR)=38.9x10-9M以及KD(鼠PRLR)=2.7x10-9M。
如表7所示，Mat3相比于HE06.642对于猴和鼠PRLR显示改良的亲和力。与HE06.642相比，Mat3对于人PRLR改良的细胞结合和抗增殖活性不被对于hPRLR的改良的亲和力反映。尽管结合纯化的鼠PRLR的ECD，HE06.642不结合表达鼠PRLR的细胞或抑制表达鼠PRLR的细胞的增殖(图10和14，表8)。相反，在所有三种物种中，Mat3以纳摩尔至亚纳摩尔级别阻断细胞增殖。
另外，通过固定的测试抗体Mat3和HE06642将可溶性ECD-PRLR(SEQIDNO:12)捕获在表面，因此，对于所有结合的ECD-PRLR分子，捕获抗体的表位被阻断。人PRL立即通过表面结合固定的ECD-PRLR。这样，可以测定PRL是否结合ECD-PRLR，尽管ECD被测试抗体捕获。
可以观测到PRL结合ECD-PRLR，独立于结合Mat3和HE06.642。因此，两种抗体不竞争ECD-PRLR上的天然配体PRL。
实施例14
抗体对表达人、小鼠和猴PRLR的不同细胞系的细胞结合研究
用IgG1形式的抗体Mat3和HE06642以及霍乱毒素特异性同种型对照进行细胞结合研究。测试的细胞系是分别稳定表达人和小鼠PRLR的HEK293细胞，表达人、小鼠和恒河猴PRLR的人乳腺癌细胞系T47D以及Ba/F细胞系。通过流式细胞术对于上述细胞确定细胞结合。收获细胞，离心并以大约2x106细胞/ml重悬在含有3%FBS和0.05%叠氮钠的1xPBS(FACS缓冲液)中。在FACS缓冲液中将每周测试抗体稀释至2-倍终浓度并加入适当的样品孔(50μl/孔)。对于二抗和自身荧光对照，将50μlFACS缓冲液加入适当的孔。将50μl细胞悬浮液加入每个样品孔。将样品在4℃保温1小时，用冷FACS缓冲液洗涤两次并重悬在含有1:100稀释的PE-缀合山羊抗人IgG的FACS缓冲液中。在4℃保温30分钟后，细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，重悬在含有1mg/ml碘化丙啶的FACS缓冲液(Invitrogen,SanDiego,CA)中并通过流式细胞术分析。
获得数据示于图14中的剂量应答曲线。从这些曲线推断EC50值，表明细胞结合效力(表8)。总之，数据表明在不同的PRLR表达细胞系中Mat3相比HE06.642的优异细胞结合性质。
表8：自流式细胞术推断的IgG1形式的中和性PRLR抗体Mat3和He06.642对表达人、小鼠和猴PRLR的细胞的细胞结合效力
*无显著结合；#图14中的剂量应答图表

Claims (24)

1.拮抗促乳素受体-介导的信号传导的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有相应于SEQIDNO：5的HCDR1序列、相应于SEQIDNO：6的HCDR2序列和相应于SEQIDNO：7的HCDR3序列，且所述轻链可变区含有相应于SEQIDNO：8的LCDR1序列、相应于SEQIDNO：9的LCDR2序列、和相应于SEQIDNO：10的LCDR3序列。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区如SEQIDNO：1的氨基酸序列所示，且所述轻链可变区如SEQIDNO：2的氨基酸序列所示。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由特异性结合人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域的一或多个区域的抗原结合区组成，并且其中人PRLR的氨基酸序列由SEQIDNO：12和SEQIDNO：12的人多态性变体的1-210位的氨基酸序列所示，猴PRLR的氨基酸序列由SEQIDNO：11的猴PRLR的1-210位的氨基酸序列所示，和小鼠PRLR的氨基酸序列由SEQIDNO：13的小鼠PRLR的1-210位的氨基酸序列所示。
4.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其中对于人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域的亲和力不大于100nM。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中所述亲和力不大于10nM。
6.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由特异性结合人PRLR的胞外结构域的一或多个区域的抗原结合区组成，并且其中亲和力小于1nM。
7.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其中重链恒定结构域为修饰的或未修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
8.编码权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。
9.权利要求8的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子如SEQIDNO：3和4所示。
10.包含权利要求8或9的核酸分子的表达载体。
11.包含权利要求10的表达载体或者权利要求8或9的核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞是高等真核宿主细胞，低等真核宿主细胞，或原核细胞。
12.权利要求11的宿主细胞，其中所述高等真核宿主细胞是哺乳动物细胞。
13.权利要求11的宿主细胞，其中所述低等真核宿主细胞是酵母细胞。
14.权利要求11的宿主细胞，其中所述原核细胞是细菌细胞。
15.使用权利要求11至14任一项的宿主细胞生产抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适当条件下培养权利要求10的宿主细胞并回收所述抗体或其抗原结合片段。
16.通过权利要求15的方法产生的抗体或其抗原结合片段。
17.纯化至至少95％重量均一性的权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段。
18.作为药物的权利要求1-7任一项的抗体或抗原结合片段。
19.药物组合物，其包含权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段，以及至少一种其它试剂。
20.包含治疗有效量的权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段的试剂盒，其包装在容器中，所述试剂盒任选含有第二种治疗剂，并且进一步包含附于容器或与容器包装的标签。
21.权利要求1-7任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防子宫内膜异位症和子宫腺肌病的药物中的用途。
22.权利要求1-7任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防良性乳腺疾病和乳腺痛的药物中的用途。
23.权利要求1-7任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防抗***抗性乳腺癌的药物中的用途。
24.权利要求19的药物组合物，包含权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段和包括赋形剂和辅剂的药学可接受载体。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140135233A (ko) 2012-03-14 2014-11-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다중특이성 항원-결합 분자 및 그것의 용도
LT2935331T (lt) 2012-12-24 2018-06-25 Abbvie Inc. Prolaktino receptorių surišantys baltymai ir jų panaudojimas
TWI641620B (zh) * 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
US9545451B2 (en) 2013-08-21 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PRLR antibodies and methods for killing PRLR-expressing cells
MX2017017117A (es) 2015-07-06 2018-03-06 Regeneron Pharma Moleculas multiespecificas de union a antigenos y usos de estas.
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
EP3548514A1 (en) 2016-11-29 2019-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating prlr positive breast cancer
TW201836647A (zh) 2017-04-06 2018-10-16 美商艾伯維有限公司 抗－ｐｒｌｒ抗體藥物軛合物（ａｄｃ）及其用途
JP2020527552A (ja) 2017-07-10 2020-09-10 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト 男性型脱毛症および女性型脱毛症用のプロラクチン受容体抗体
ES2973864T3 (es) * 2017-08-10 2024-06-24 Grifols Diagnostic Solutions Inc Composiciones, métodos y/o kits que comprenden un dominio extracelular de CD38 recombinante humano
MX2020008274A (es) 2018-02-07 2020-11-11 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la administracion de proteinas terapeuticas.
UY39610A (es) 2021-01-20 2022-08-31 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
CN116655791B (zh) * 2023-05-06 2023-11-07 浙江触奇生物科技有限公司 一种抗泌乳素受体的纳米抗体、重组载体、重组菌和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008022295A2 (en) * 2006-08-18 2008-02-21 Novartis Ag Prlr-specific antibody and uses thereof

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
GB9701425D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
WO2003008583A2 (en) 2001-03-02 2003-01-30 Sagres Discovery Novel compositions and methods for cancer
US7705120B2 (en) 2001-06-21 2010-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
EP1325930A1 (en) * 2002-01-08 2003-07-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mammal prolactin variants
AU2006235258A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Cancer-related genes
US7422899B2 (en) 2005-10-05 2008-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Antibodies to the human prolactin receptor
EP2332995A1 (en) * 2009-12-10 2011-06-15 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008022295A2 (en) * 2006-08-18 2008-02-21 Novartis Ag Prlr-specific antibody and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anti-Growth Action on Mouse Mammary and Prostate Glands of a Monoclonal Antibody to Prolactin Receptor;JANICE F. SISSOM等;《American Journal ofPathology》;19881231;第133卷(第3期);589-595 *

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Publication number Publication date
US20160319029A1 (en) 2016-11-03
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HK1195081A1 (zh) 2014-10-31
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