TWI500630B - 具有細胞生長抑制功效之表皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）抑制劑類及彼等於腫瘤治療上之用途 - Google Patents

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Description

具有細胞生長抑制功效之表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑類及彼等於腫瘤治療上之用途
本發明關於生物技術之領域，特別是人之健康。更具體地說，本發明關於能辨識表皮生長因子受體(EGFR)之胞外區域並阻斷該受體之天然配位體之結合但不完全抑制該受體二聚化之新穎抗體。
隨著對腫瘤生物學及導致腫瘤形成之機制上之理解的進展，已經導致鑑別數個腫瘤治療(特別是女性及男性首要死因之一之肺癌)之標靶。在該等標靶中，EGFR(又名HER1)已成為肺癌治療之注意焦點。EGFR是一種主要在上皮來源之細胞中發現之跨膜受體。該受體之胞內區域之自體磷酸化觸發能導致細胞增生之事件的級聯。EGFR經常過度表現於多種固體腫瘤中，並參與細胞存活、增生、轉移及血管形成之控制。
因此，不同策略已經被發展以抑制異常之EGFR相關性信號傳遞級聯。最重要的治療方式包括小分子酪胺酸激酶抑制劑和單株抗體，該等抗體與該受體之胞外區域專一性結合且作為該受體之天然配位體之拮抗劑。目前一些抗EGFR抗體正在進行臨床評估，例如西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(Panitumumab)及馬突茲單抗(Matuzumab)。
西妥昔單抗(爾必得舒(Erbitux))是一種能專一性辨識EGFR之胞外區域之嵌合單株抗體，該抗體已通過FDA核准用於治療結直腸癌及晚期頭頸腫瘤。研究顯示，西妥昔單抗係A431細胞(源自表皮樣癌)增生之強效抑制劑，不論於活體外或將該細胞移植至無胸腺小鼠。研究亦顯示，該抗體與細胞毒性藥物或放射線治療之組合具有協同效應。根據這些結果，不同的臨床試驗接著被進行。
第二期臨床試驗之結果顯示，西妥昔單抗不論是單獨或與愛萊諾迪肯(irinotecan)及草酸鉑(oxaliplatin)組合使用，均可作為晚期轉移性結直腸癌病患之第一線治療，使反應率增加10至20%。
在另一個包含424名晚期局部區域疾病病患之國際性、多中心臨床試驗中，西妥昔單抗與放射線治療之組合幾乎延長一倍的存活時間(從28至54個月)。另外，該組合使病患之存活時間從僅接受放射線治療2及3年後分別為55%及44%，增加至組合治療之62%及57%。整體來說，來自臨床之結果顯示，使用西妥昔單抗(不論以單一治療投予或與細胞毒性藥物組合投予)具有顯著之治療效應。然而，也觀察到習知治療所產生之毒性反應之顯著增加。
帕尼單抗(能辨識EGFR之全人抗體)係另一已通過FDA核准(2006年)之用於單一治療化學治療後疾病惡化之轉移性結直腸癌病患之抗體。帕尼單抗獲得之臨床結果類似西妥昔單抗所獲得者，包括不良反應。
許多不同的EGFR拮抗劑(包括若干單株抗體)已經在臨床上進行評估。對大部分該等藥物而言，所獲得之目標反應是短期的，然而最常見之毒性效應在於嚴重皮疹，該皮疹在許多病例中導致治療中斷。
大部分EGFR拮抗劑之臨床效用與皮膚毒性之直接相關性已被證實。因此，有文獻指出皮疹之發生係抗EGFR作用劑之抗腫瘤反應之預測指標[Jonker et al,2007;Berlin et al,2007](Peedicayil J. y col.,en Correspondence 2004,doi：10.016)。
格里德利等人(Gridelli et al.,in Results of an Experts Panel Metting,Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2007,doi:10.1016)回顧來自不同臨床試驗之結果，發現在該等臨床試驗中皮膚皮疹與治療反應及/或病患存活性之間具有正向相關性。在該文獻中，作者之結論為皮膚皮疹目前被認為是抗EGFR藥物之拮抗活性之間接標記。因此，專家間之共識認為皮膚皮疹係抗腫瘤活性及治療效用之重要替代指標。另外，他們建議可將皮膚反應用來識別最可能得益於該治療之病患。
然而，使用抗EGFR單株抗體h-R3之臨床試驗(EP 0712863B1和US 5,891,996)的結果顯示，病患對該抗體之耐受性良好。在接受重複劑量之h-R3之病患中未偵測到皮膚皮疹(Cormbet et al. in Cancer Biology ＆ Therapy 5;4,375-379,2006)，與在以其他EGFR阻斷藥物治療之病患中所觀察到約80%出現皮膚皮疹者不同(Perez-Soler et al. in Oncologist 2005;10:345-56/and Thomas et al. in Clin J. Oncol N 2005;9:332-8)。
雖然現有技藝以皮膚皮疹與EGFR阻斷之間之直接相關性為共識，本發明之作者認為皮膚皮疹反而是與該特定藥物有關而非與該標靶本身有關之缺點，因此需要繼續尋找新穎之抗EGFR作用劑。
本發明關於表皮生長因子受體(EGFR)之抑制劑類，該等抑制劑類對表現該受體之細胞具有細胞生長抑制活性而非細胞毒性作用。
細胞生長抑制劑係任何能抑制細胞增生，使細胞停在細胞週期中之一期之劑，而細胞毒性劑係指任何能引起細胞死亡之劑。EGFR抑制劑是一種與該受體結合且因此抑制由該受體之天然配位體所引發之細胞***信號之分子。
意外的是，本發明之作者發現一群EGFR抑制劑，由於該群抑制劑以特殊方式與EGFR結合，而使該受體之活化構型和不活化構型之間達到生理平衡，因此能保持基礎程度之受體信號傳遞。該基礎程度之受體自體磷酸化使該細胞停在細胞週期之一期。本發現之臨床應用在於我們能設計以EGFR為標靶之抗腫瘤藥物，該藥物並非引起腫瘤細胞死亡而是展現對腫瘤生長之生物控制。此外，該類型之抗腫瘤藥物具有不產生嚴重不良反應之優點，諸如對腫瘤具有細胞毒性作用之EGFR抑制劑所報告之皮膚皮疹。
本發明描述具有細胞生長抑制功效之EGFR抑制劑類，其特徵為該等抑制劑類辨識EGFR之胞外區域之結構域I或結構域III(較佳為結構域III)，且抑制該受體之天然配位體之結合，因此抑制由該等配位體所誘發之細胞***信號。該等與EGFR胞外區域之結構域I或III結合藉以競爭天然配位體之結合但仍允許該受體採取其活化構型且形成能維持基礎磷酸化程度之同型二聚體或雜二聚體之分子，係對表現EGFR之細胞具有細胞生長抑制活性之分子，因此該等分子可作為表現該膜受體之腫瘤之潛在治療劑。
本發明之作者亦發現以該等能抑制由EGF及其他配位體所觸發之細胞***信號又能維持基礎程度之受體自體磷酸化之分子(較佳為單株抗體)作為惡性腫瘤之治療，對腫瘤具有阻止該腫瘤生長之細胞生長抑制功效。
目前以EGFR為標靶之治療劑的功效有限，包括細胞***配位體之拮抗劑及抑制該受體自體磷酸化之小分子，因為彼等治療劑在許多病例引起嚴重之不良反應而必須中斷該治療。本發明之作者已經發現以EGFR為治療標靶之分子，該等分子能抑制腫瘤生長，但不產生目前為止在臨床上測試之EGFR信號傳遞抑制劑所發生之嚴重不良反應。
本發明之基礎為抑制由EGFR天然配位體所誘發之細胞***活性，但不完全抑制該EGFR之自體磷酸化。如前所述，EGFR在細胞膜上有二種呈現平衡之構型，活化構型和不活化構型。當該受體採取其活化構型時，彼之結構域II能與其他EGFR分子中之相同結構域(或該EGFR家族之其他成員)交互作用，藉以形成同型二聚體或雜二聚體，且因此活化該細胞內結構域之自體磷酸化。此自體磷酸化能觸發維持該細胞存活所需之事件的級聯。
根據估計，當細胞***配位體不存在時，超過90%之EGFR分子採取較為節省能源之不活化構型，然而有5至10%之受體分子採取其活化構型且因此維持磷酸化。該磷酸化之程度不足以引起細胞***，但能讓細胞存活。根據本發明之作者，使用完全抑制受體自體磷酸化之藥物會造成大量細胞死亡，包括表現EGFR之腫瘤及正常組織，這說明嚴重不良反應發生之原因。然而，使用本發明之目標抑制劑造成抑制細胞***活性及因此之腫瘤生長，但維持能讓細胞存活之基礎程度之受體磷酸化。第一種藥物將產生伴隨顯著腫瘤消退之細胞毒性作用，但是也會產生嚴重之不良反應及早期腫瘤復發。本發明之目標藥物不可能產生伴隨驚人腫瘤消退之大量細胞死亡；相反的因為彼等對腫瘤之細胞生長抑制功效而產生疾病穩定狀態，且對正常組織並不造成顯著之不良反應。此外，本發明之作者亦發現該等具有細胞生長抑制活性之EGFR抑制劑保有放射線敏感劑及化學敏感劑之性質，該性質在具有細胞毒性活性之EGFR抑制劑中已被描述。
根據實驗結果，本發明之作者主張以EGFR為標靶之分子為申請專利範圍，該分子之活性在於對腫瘤生長之生物控制，不論彼等係以單一治療或與化學或放射線治療組合之方式投予。
因此，本發明之目的係該等天然或合成之EGFR配位體，較佳為天然的，且甚至更佳為單株抗體，該EGF拮抗劑能抑制EGF與該受體之胞外結構域結合但不干擾受體二聚化，因此不影響基礎程度之自體磷酸化。
本發明之另一目的係一種用於治療癌症病患之方法，該方法包含投予含有EGFR配位體之醫藥化合物，該EGFR配位體較佳係屬於EGF拮抗劑但不抑制基礎受體自體磷酸化之單株抗體。
本發明之另一目的係一種設計及選擇配位體之方法，該配位體較佳係具有細胞生長抑制作用以防止惡性腫瘤生長之單株抗體。
本發明之詳細說明
本發明之目標之EGFR抑制劑包含一天然或合成之分子，該分子與表皮生長因子受體之胞外區域之結構域I或結構域III結合，較佳係與結構域III結合，該分子之特徵在於抑制天然配位體之結合之性質，且另外允許該受體採取其活化構型。意外的是，以此方式辨識受體之抑制劑對表現該受體之細胞具有細胞生長抑制作用，這與過去在本發明之前所描述之對該細胞具有細胞毒性作用之抑制劑類不同。
用於設計本發明之目標治療劑之方法係根據本發明之作者所得到之結果，該結果支持該劑與EGFR受體之交互作用之模型。該等EGF拮抗劑藥物對癌症具有治療效應，且具有超越先前所描述之EGF拮抗劑藥物之優點。在較佳之實施態樣中，該等治療劑可為以EGFR為標靶之單株抗體，較佳為單株抗體hR3。該人化抗體係詳細描述於先前提到之專利申請案EP 0712863B1及美國專利5,891,996以及一些科學發表中，例如Mateo et al.,Immunotechnology 3;71-81,1997。獲得該抗體之詳細方法亦描述於該些文件中。
發明人所描述之交互作用模型亦能解釋來自癌症病患之臨床試驗之結果，在該試驗中評估本發明目標劑之治療效果。
已知的是，EGF與EGFR胞外區域之交互作用誘發信號傳遞級聯，藉以觸發該生長因子之細胞***作用。EGFR胞內結構域之自體磷酸化係此信號傳遞級聯中之第一生化事件之一。為了使自體磷酸化得以發生，該受體之胞外區域必須先發生二聚化。
亦為已知的是，EGF同時與EGFR胞外區域之結構域I及III結合藉以穩定該活化受體構型，其中結構域II係經備妥以與第二單體結合以形成二聚體。
所有已在臨床上測試且已經證實對腫瘤具有治療效應之以EGFR為標靶之單株抗體，係藉由抑制受體二聚化及因此後續之磷酸化以作為EGF拮抗劑之分子。大部分該等抗體藉由產生阻止該活化受體構型形成之立體阻礙以抑制該受體之二聚化。其他抗體直接與EGFR之結構域II結合，因此直接抑制該二聚化。
意外的是本發明之作者發現，阻斷EGF與其受體結合因此抑制由此配位體產生之細胞***信號，但同時允許該受體採取其可二聚化之活化構型是可能的，因此允許基礎程度之受體磷酸化。
現有技藝已知的是，在細胞膜上之EGFR分子被發現呈現活化構型與不活化構型之平衡。有研究指出介於5%至10%之膜受體呈現活化構型。因此，該部分之受體分子可形成二聚體並進行後續之磷酸化。該基礎程度之受體磷酸化不足以觸發細胞增生，但係維持靜止狀態之細胞存活所必須。
因此，使用具有本發明所描述之特徵之分子將在表現EGFR之腫瘤之治療上有極大效用。治療上使用本發明之目標分子將抑制由EGFR所誘發之腫瘤增生，同時能防止目前臨床上使用之EGF拮抗劑所產生之不良反應。
在具有此處所描述之特性之治療劑中，以EGFR之胞外區域為標靶之單株抗體係本發明之較佳實施態樣，以先前描述於US 5,891,996及EP 0712863中之人化單株抗體hR3特別為佳。
即使現有技藝中有能辨識該相同標靶之治療劑，本發明之治療劑所具有之結構及功能特徵提供超越先前描述者之治療優點。
本發明亦關於一種抑制EGF依賴性腫瘤生長之方法，其特徵為投予治療劑量之治療劑所產生之效應，該效應誘發疾病穩定狀態而非驚人之腫瘤消退。本發明之其他目標係包含至少一種該等細胞生長抑制性抑制劑之含水溶液之治療組成物，該組成物可用於治療腫瘤或其他與EGFR調節異常有關之疾病。在本發明之醫藥組成物中，該抑制劑之濃度(特別是該抗體)係介於10至200毫克/毫升之範圍內，更具體地介於50至150毫克/毫升之範圍內。
此外，本發明包含該等EGFR抑制劑(特別是該人化單株抗體hR3(尼妥珠單抗(Nimotuzumab))與放射線治療或其他治療劑諸如化學治療劑組合以用於治療惡性腫瘤上之用途。根據本發明，本發明之目標抑制劑之投予可為經口、非經腸(經靜脈內或肌肉內)、局部、經皮或經吸入。
本發明之另一目標係一種用於選擇具有細胞生長抑制功效之EGFR抑制劑之方法。該方法主要係根據如本發明實施例6所述之細胞中DNA含量以碘化丙啶之納入測定，該細胞先前經通透性處理及固定。
 實施例 實施例1：hR3 Fab片段之晶體結構
hR3 Fab片段之晶體結構係以2.5解析度決定，且具有經精準化至結晶學R因子/自由R因子分別為21.5%及28.8%之良好之立體化學。
hR3 Fab之整體晶體結構係與其他Fab片段之結構類似，但二個在該重鏈之變異結構域中之特殊特徵除外。一明顯之特徵係關於該重鏈之CDR1，該CDR1不對應任何被描述之該CDR之基本構型，相反卻在該環之底部呈現短的α螺旋。圖1顯示hR3 Fab片段之代表性晶體結構，其中該重鏈之CDR1特徵被強調。
利用電腦程式，比較hR3變異區之晶體結構與所有到2007年5月為止寄存於蛋白質資料庫中之類似片段之結構。在此資料庫中，只有二種抗體具有在CDR H1底部之類似特徵(PDB代號1b2w([1b2w])及2cmr([2cmr]))。該二個結構之一對應以CDR植入人化之抗體。
實施例2：抗體-受體之交互作用試驗
利用Biacore設備測定，hR3 Fab片段係以2.1×1O-8 M結合之解離常數(KD )與表皮生長因子受體(EGFR)之胞外結構域結合。在此試驗中，使用商用抗體西妥昔單抗(Cetuximab)作為對照。西妥昔單抗Fab片段所得到之KD 值為1.8×10-9 M，與先前報告之值類似。尼妥珠單抗之KD 高出一個數量級，主要是因為其k on 過低，而其k off 僅稍為較低(表1)。
這二種抗體間之親和性差異可能解釋彼等在生物效應上之差異，特別是當該二種抗體被用於系統性治療癌症病患之不良反應上之差異。
此外，hR3被發現會與西妥昔單抗競爭與EGFR之結合。結合抑制試驗係藉由利用西妥昔單抗之ELISA技術進行，已知西妥昔單抗與EGFR之結構域III專一性及排他性地結合。在此實驗中，ELISA板係以EGFR之胞外區域包被，接著與固定濃度之生物素化hR3 Fab片段及不同濃度之西妥昔單抗Fab片段共同培養。結果觀察到，由該生物素化hR3 Fab片段所提供之信號(以鹼性磷酸酶共軛之鏈黴親和素顯色)隨西妥昔單抗Fab之濃度增加而減少。
此外，利用過度表現EGF受體之A431細胞進行FACS實驗。該細胞係與不同濃度比例之hR3及西妥昔單抗Fab片段共同培養，類似ELISA實驗之情況。該等FACS實驗證實，hR3和西妥昔單抗競爭與EGFR之結合。
由ELISA及FACS所得到之結果顯示，該二種抗體所辨識之表位重疊或彼此非常接近，且二種抗體與EGFR同時結合是不可能的。根據這些結果以及從先前技藝得知之西妥昔單抗係與EGFR之結構域III結合，我們可能推論出hR3係與和西妥昔單抗相同之EGFR結構域也就是結構域III結合之結論。
實施例3：抗體-受體複合體之模型
hR3-EGFR胞外區域複合體之理論模型係根據hR3 Fab片段之晶體結構以及來自蛋白質資料庫之二個EGFR結構(代號1YY9及1IVO)加以建構。該模型之建構首先利用RosettaDock程式對接該二個分子，然後利用NAMD程式在水箱中進行分子動力學模擬，以最佳化該複合體之結構。
該得到之模型係顯示於圖1。圖A顯示該模型之全景，EGFR呈現其不活化構型，其中結構域I及III之間的距離遙遠。圖B亦顯示該模型之全景，但是EGFR呈現其活化構型，其中結構域I及III靠近，形成對配位體具高親和性之結合位置。此圖證明根據我們的模型，hR3能與EGFR結合而不抑制二聚化及後續信號傳遞所需之活化構型。圖C放大顯示hR3/EGFR介面之分子交互作用。
圖2A顯示hR3如何與西妥昔單抗競爭與EGFR結構域III之結合，因為彼等所辨識之表位重疊，然而圖2B顯示抗體hR3阻斷EGF與該受體之結合。
實施例4：與EGFR之結構域I結合之Fv抗體片段之理論模型
該模型(如圖3所示)係藉由手動對接Fv抗體片段之結構與結構域I上之選擇區域而獲得，其中結合之抗體允許該受體採取其活化構型，也就是能讓結構域III接近結構域I，使結構域II得以進行二聚化。另一方面，該EGF(在圖3中以紅色表示)無法***其結合位置因為該抗體形成立體阻礙(在圖3中可清楚看見二個結構間之重疊)。EGFR與EGF之複合體之結構係得自蛋白質資料庫代號1IVO，而Fv片段係由分子模型建構。
實施例5：抗EGFR單株抗體對腫瘤細胞A431及H125之細胞毒性作用
A431及H125細胞(2×105 )係生長於含有10%胎牛血清(FBS)DMEN：F12培養基之24孔板中。12小時後，該細胞係於含有人EGF(500皮克/毫升)之1% FBS DMEN：F12培養基中經單株抗體西妥昔單抗(濃度7至175奈莫耳)或hR3(濃度70至1750奈莫耳)之處理，接著培養48小時。重複該相同處理及48小時培養一次。之後，也就是開始該處理後之96小時，藉由碘化丙啶(10微克/毫升)染色並以FACS測定細胞死亡之量。未經處理之細胞被包括在該實驗中以作為最低死亡對照組。
在二個細胞系中，所有測試濃度之西妥昔單抗相較於hR3誘發較高程度之死亡(圖4)。應注意的是，即使使用高於西妥昔單抗10倍濃度之hR3仍得到該結果，因此彼等於親和性上之差異可由濃度上之差異補償。
實施例6：抗EGFR單株抗體對腫瘤細胞A431及H125之細胞毒性與細胞生長抑制效應
A431及H125細胞(2.5×105 )係生長於含有10%胎牛血清(FBS)DMEN：F12培養基之6孔板中。12小時後，該細胞係於含有人EGF(500皮克/毫升)之1% FBS DMEN：F12培養基中經單株抗體西妥昔單抗或hR3(濃度7至175奈莫耳)或EGFR酪胺酸激酶抑制劑AG1478(濃度10微莫耳)之處理，接著培養48小時。重複該相同處理及48小時培養一次。為了分析經處理96小時後之細胞週期及DNA段裂(晚期細胞凋亡之標記)，該細胞於4℃以甲醇：丙酮(4：1)之混合液固定並以碘化丙啶(400微克/毫升)及RNAse(100微克/毫升)染色。利用FACS進行分析，收集至少20,000個事件。該資料係利用WinMDI 2.8及ModFit3.0程式處理。
如圖5所示，相較於未處理之細胞，該二種單株抗體(西妥昔單抗：175奈莫耳，hR3：1750奈莫耳)在A431(A)及H125(B)細胞中誘發類似之G0-G1期細胞數增加及G2-M及S期中之細胞相對減少。該效應類似用來作為細胞週期停止之陽性對照之AG1478抑制劑所獲得者。表1(A431)及2(H125)顯示在該實驗所使用之廣泛範圍之hR3及西妥昔單抗濃度中，不同細胞週期之期中之細胞百分比。
然而，在該等抗體誘發細胞凋亡之能力方面，雖然該二種抗體對A431及H125細胞具有類似之抗增生效應，西妥昔單抗在所有測試濃度中相較於hR3誘發較高百分比之細胞凋亡細胞(圖5，表2及3)。
實施例7：在異種移植無胸腺小鼠中之抗腫瘤活性
無胸腺小鼠(8至10週齡)係得自查理士河(Charles River)實驗室(德國蘇爾茨費爾德)。該鼠於經相關機構核准且遵守目前法規標準之場所中以無菌條件飼養維持，且該鼠之用途係經當地專責機構核准。為了產生腫瘤，自生長中之(subconfluent)培養以0.25%胰蛋白酶及0.05% EDTA處理以收集細胞。添加10%胎牛血清培養基以終止胰蛋白酶消化。只有超過90%存活率之單細胞懸浮液被用於注射。
每組8隻動物接種來自U87MG細胞系之細胞。107 細胞被經皮下接種至左腹脅，同時2×104 細胞在立體定位裝置之協助下被經腦內接種至右大腦半球。在實驗期間監測小鼠體重。每週測量腫瘤大小三次。腫瘤體積係利用下式計算：0.5×(大直徑)×(小直徑)2 。相對腫瘤體積(RTV)係將每天之中位數體積參照第一測量值(設定為1)計算。當對照組之腫瘤重量超過全動物重量之10%時，所有動物被犧牲。亦測定顱內腫瘤之大小。就此目的而言，收集腦並急速冷凍於2-甲基-丁烷中。製備連續冷凍切片(10毫米)，並以甲苯酚紫染色。利用顯微鏡(蔡司Axioskop)之協助測量腫瘤直徑及周長，接著計算腫瘤體積。
皮下腫瘤被冷凍儲存於-80℃以供額外分析。所有處理在腫瘤注射後3天開始。動物每週以單株抗體hR3或西妥昔單抗(50毫克/公斤/劑量)經腹腔內投予處理三次。在放射線治療組中，動物暴露至總劑量3.0格雷之全身照射(TBI)，從腫瘤接種後72小時開始，在3週期間分成每週1.0格雷。其他組別之動物係經抗體加放射線治療之組合處理。在這些組別中，抗體係於放射線治療前6小時投予。另一有10隻動物之對照組被包括於實驗中。該些動物接受PBS以取代抗體。
圖6顯示由抗EGFR單株抗體造成人腫瘤細胞系U87MG之敏感化，該細胞系經皮下異種移植至無胸腺NMRI小鼠。該抗體係於三週期間以50毫克/公斤/劑量每週三次經腹腔內投予。以放射線治療之動物接受3.0格雷之總劑量，在3週期間分成每週1.0格雷。抗體之投予係以黑色箭頭表示，放射線以虛線箭頭表示。在所示時間測定腫瘤體積。相較於僅接受放射線治療及未經治療之動物，放射線與抗體之組合治療導致顯著(p<0.05)延緩腫瘤生長。相較於單獨以抗體治療之組，與hR3之組合亦延緩腫瘤生長。使用克魯斯卡-瓦立斯檢定；在該圖中，顯示統計差異性之符號如下：(*)相較於PBS具顯著性，(+)相較於單獨抗體具顯著性，(○)相較於放射線具顯著性。
圖7顯示由抗EGFR單株抗體所產生之人腫瘤細胞系U87MG之敏感化，該細胞系經原位異種移植至NMRI裸鼠。所有治療(hR3、西妥昔單抗、放射線治療、hR3加放射線治療、西妥昔單抗加放射線治療及PBS)始於腫瘤接種後3天。該抗體係於三週期間以50毫克/公斤/劑量每週三次經腹腔內投予。以放射線治療之動物接受3.0格雷之總劑量，分成每週1.0格雷。來自接受抗體加放射線治療之小鼠經分析之腦切片顯示腫瘤大小顯著減少(p<0.05)。相較於僅接受放射線治療，hR3與放射線治療之組合導致腫瘤大小顯著降低(p<0.05)。使用曼-惠特尼檢定；在此圖中，顯示統計差異性之符號如下：(*)相較於PBS具顯著性，(+)相較於放射線具顯著性。
血管形成(CD31/PECAM-1)
使腫瘤樣本於室溫中解凍10分鐘，且固定於3.7%三聚甲醛中15分鐘。之後，內源性過氧化酶係以0.03%過氧化氫(加州卡賓特利亞達可(Dako)公司)阻斷15分鐘，接著該樣本於室溫中與經1：100稀釋之抗CD31/PECAM01一級抗體培養2小時。經過清洗後，樣本與該對應之HRP共軛二級抗體培養30分鐘以偵測抗體-抗原交互反應。最後，切片以3,30-二胺基聯苯胺(DAB)(加州卡賓特利亞達可(Dako)公司)作為發色體檢視，該樣本經固定並分析CD31染色。代表性腫瘤切片以40倍目鏡放大之光學顯微鏡(蔡司Axioskop 40)識別。在腫瘤中之內皮微血管面積係以從5個顯微鏡視野所得到之平均值估計。內皮微血管總面積係利用軟體Axio Vison 4.5(蔡司)計算。以hR3處理導致血管面積顯著減少(p<0.01)(圖8)。
CD133。為了測定CD133之表現，使腫瘤樣本於室溫中以丙酮固定15分鐘。之後，內源性過氧化酶係以0.03%過氧化氫(加州卡賓特利亞達可公司)阻斷30分鐘，非專一性結合係以20%胎牛血清於室溫中阻斷20分鐘。之後，該樣本於室溫中與經1：10稀釋之抗CD133/1 AC133一級抗體(美天旎生技)培養1小時。接著該樣本經過清洗，並與過氧化酶共軛鏈黴親和素於室溫中培養1小時。最後，腫瘤切片以DAB發色體(加州卡賓特利亞達可公司)檢視，該樣本經固定並分析CD133染色。代表性腫瘤切片以40倍目鏡放大之光學顯微鏡(日本奧林巴斯)檢視。各分析組別之CD133陽性細胞百分比係以觀察到最強染色之5個視野所對應之切片中之陽性細胞平均數決定。
圖9顯示在經hR3(h-R23)、西妥昔單抗(C225)、該等抗體之一與放射線之組合、或單獨放射線(RT)處理之U87MG人腫瘤異種移植之無胸腺NMRI小鼠中，CD133表現之免疫化學分析結果。相較於單獨放射線治療之處理，以hR3處理導致CD133陽性細胞百分比顯著降低(p<0.05)。相較於單獨以放射線治療處理及未經處理之動物，hR3與放射線治療之組合顯著降低此組中之CD133陽性細胞百分比(p<0.05)。使用曼-惠特尼檢定；在此圖中，顯示統計差異性之符號如下：(*)相較於PBS具顯著性，(+)相較於放射線具顯著性。
統計分析。利用GraphPAD程式第4.0版(美國加州聖地牙哥GraphPAD)計算平均值及標準差。統計分析係利用相同程式進行。組別間差異之顯著性利用曼一惠特尼檢定及鄧恩(Dunn)多重比較檢定評估。若p<0.05則認為差異具顯著性。
實施例8：單株抗體hR3(尼妥珠單抗)與低劑量卡鉑(carboplatin)之組合之抗腫瘤效應
在該等實驗中，無胸腺NMRI小鼠(8至10週齡)經皮下接種人來源之非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤。第0天時，動物接種腫瘤片段。當腫瘤可被偵測時(接種後10至12天)，動物於6週期間以50毫克/公斤之單株抗體hR3每週三次及/或每週劑量50毫克/公斤之卡鉑進行腹腔內注射。PBS係用來作為對照。每週測量二次腫瘤之大直徑及小直徑，且該腫瘤體積係利用公式VT=0.5×(小直徑)2 ×大直徑計算。相對腫瘤體積係根據下式計算：RTV=VT/VT第0天 。圖10顯示相對腫瘤體積及彼之標準差。
圖1：hR3/EGFR複合體之模型。A)卡通式模型全景，顯示呈現其不活化構型之EGFR胞外區域(EGFR為藍色，hR3之Fv片段為黃綠色)。B)類似圖A，但EGFR之胞外區域係呈現活化構型，其不受hR3結合之阻礙。C)放大hR3與EGFR之結構域III之間介面之交互作用。氫鍵係以虛線表示。
圖2：A)hR3抑制西妥昔單抗之結合。西妥昔單抗之Fv片段係以紅色表示(卡通圖示)；EGFR為藍色且hR3之Fv片段為黃綠色。B)hR3抑制EGF之結合，但允許採取活化受體構型。EGFR及hR3之圖A顏色同；EGF係以紅色表示。該圖顯示EGF之C端撞到尼妥珠單抗之輕鏈，EGFR之結構域I接近抗體但不衝突。
圖3：與EGFR(藍色)之結構域I結合之Fv抗體片段(綠色)之理論模型。該抗體阻止EGF(以紅色表示)之結合，但允許該活化EGFR構型。
圖4：hR3相較於西妥昔單抗較不具細胞毒性。A431及H125細胞係經西妥昔單抗(濃度7至175奈莫耳)或hR3(濃度70至1750奈莫耳)處理96小時，之後以碘化丙啶染色，然後由FACS分析。各長條代表計算3孔之死亡細胞百分比之平均值。該些實驗重複三次並產生類似之結果。
圖5：hR3及西妥昔單抗對A431及H125細胞具有類似之細胞生長抑制功效，然而西妥昔單抗在這些細胞誘發較高之細胞凋亡效應。A431及H125細胞係經西妥昔單抗(175奈莫耳)、尼妥珠單抗(1750奈莫耳)或AG1478抑制劑(10微莫耳)處理96小時，然後以碘化丙啶染色並經FACS分析。各圖顯示二個區域。在虛線內之區域對應活細胞。各細胞週期中之該等細胞之百分比被顯示。在實線內之區域對應細胞凋亡之細胞，彼等佔細胞總數之百分比亦被顯示。該些實驗重複三次並產生類似之結果。
圖6：由抗EGFR單株抗體造成人腫瘤細胞系U87MG之敏感化，該細胞系經皮下異種移植至無胸腺NMRI小鼠。始於腫瘤接種三天後之處理包括：○hR3(h-R3)、△西妥昔單抗(C225)、■放射線治療(RT)、●hR3加放射線治療(h-R3+RT)、▲西妥昔單抗加放射線治療(C225+RT)、及□作為對照之PBS(PBS)。
圖7：由抗EGFR單株抗體所產生之人腫瘤細胞系U87MG對放射線治療之敏感化，該細胞系經原位異種移植至無胸腺NMRI小鼠。
圖8：CD31於U87MG人腫瘤中之表現之免疫化學分析，該腫瘤經異種移植至無胸腺NRMI小鼠，並以hR3(h-R3)、西妥昔單抗(C225)、放射線治療(RT)、hR3加放射線治療(h-R3+RT)、C225加放射線治療(C225+RT)、或PBS處理。
圖9：CD133於U87MG人腫瘤中之表現之免疫化學分析，該腫瘤經異種移植至無胸腺NRMI小鼠，並以hR3(h-R3)、放射線治療(RT)、hR3加放射線治療(h-R3+RT)、或PBS處理。
圖10：單株抗體hR3與低劑量卡鉑之組合之抗腫瘤功效。接種人來源之非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤之無胸腺小鼠係於6週期間以每週三次之50毫克/公斤劑量之hR3抗體及每週50毫克/公斤劑量之卡鉑處理。該圖顯示相對腫瘤體積與彼之標準差。

Claims (1)

  1. 一種抗表皮生長因子受體(EGFR)之人化單株抗體hR3或彼之EGFR結合片段於製備藥物之用途，該藥物係用於抑制哺乳動物體內之表皮生長因子(EGF)依賴性腫瘤生長並維持使該EGF依賴性腫瘤細胞存活之基礎程度的EGFR自體磷酸化且未引發皮疹。
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