TWI500426B - 鉑奈米粒子用於製備治療癌症藥物的用途 - Google Patents

Description

鉑奈米粒子用於製備治療癌症藥物的用途

本發明係關於一種鉑奈米粒子的用途，特別是製備用以毒殺癌細胞之鉑奈米粒子的用途，以及該鉑奈米粒子之製作方法。

癌症係國人死因中之首位。目前治療癌症的方法包括習知放射線治療法及習知化學治療法。該習知放射線治療法係以X光或高能量射線照射癌細胞聚集的部位，惟，於殺死癌症患者的癌細胞的同時，也殺死了組織附近的正常細胞，因此，該習知放射線治療法對於癌症患者的身體負擔極大，也會產生使癌症患者不適的副作用(例如：頭痛、疲倦、噁心、嘔吐、掉髮或照射部位的皮膚產生紅、乾、搔癢或壓痛感等症狀)，而降低癌症患者的生活品質。

而習知化學治療法係以一習知化療藥物殺死癌症患者體內的癌細胞，以緩解癌細胞之擴散，延長癌症患者的生存時間。該習知化療藥物係針對會快速複製的細胞進行抑制，特別係指抑制該等細胞的DNA複製機制。然而，由於人體的造血細胞、腸黏膜細胞、毛髮細胞及生殖細胞等亦屬於快速複製的細胞，該等細胞也會受到該習知化療藥物的影響，使癌症患者進行化學治療的過程中，會發生噁心、嘔吐、腹痛、腹瀉、貧血、掉髮或生殖系統受到破壞等副作用，使癌症患者的生活品質低落而不願意持續進行治療。是以，無論該習知放射線治療法或是該習知化學治療法，皆因殺死正常細胞而引發嚴重之副作用。

當物質大小位在「奈米」範圍時，在奈米層級的材料則會出現許多特殊的物理化學性質，如有較大的原子表面積及高度的活性。當某些材質之奈米粒子粒徑小於100nm以下，即具有殺死細胞之能力。惟，該被殺死之細胞不分癌細胞或是正常細胞，故該習知奈米粒子係為一非選擇性藥物。有鑑於此，尋找一治療癌症之藥物，具有殺死癌細胞之能力，但對正常細胞影響較小，亦即具有選擇性殺死癌細胞之奈米粒子，遂成產業上發展之重點。

本發明之主要目的乃改善上述問題，以提供一種鉑奈米粒子用於製備治療癌症之藥物的用途，係於光能環境下始具選擇性地毒殺癌細胞，以降低藥物服用之副作用者。

本發明再一目的係提供一種鉑奈米粒子之製作方法，係能製備於光能環境下始具有選擇性地毒殺癌細胞之鉑奈米粒子，趨使癌細胞進入細胞凋亡，不會引發癌細胞周圍組織發炎反應者。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種鉑奈米粒子之用途，係用於製備治療癌症之藥物，係將該鉑奈米粒子投予一生物體，並於該生物體之患部提供一光能4~10分鐘，該光能之光波長係1064nm；其中，該鉑奈米粒子係經由包含如下步驟之方法製備獲得：混合200mg之一氯鉑酸六水合物與90mM、10ml之一保護劑，得一混合液；使該混合液於100~140℃下，與1mM、50μl一氫氧化鈉進行親核性還原反應，反應15~60分鐘，以生成一鉑奈米粒子。

其中，該保護劑係包含一水溶性聚合物及乙二醇，且該水溶性聚合物係選自聚乙烯醇、明膠、聚丙烯醯胺、聚亞乙基亞胺或聚乙烯吡咯烷酮。

其中，係於120℃下進行親核性還原反應30分鐘。

其中，製備該鉑奈米粒子之方法中更包含以體積比1：3之比例混合添加氫氧化鈉之該混合液與丙酮，離心以去除上清液，得一純化之鉑奈米粒子。

綜合上述，本發明鉑奈米粒子用於製備光能環境下始具選擇性毒殺癌細胞藥物的用途，係透過吸收光能，轉換成熱能，產生光熱效應，以誘發細胞進入細胞凋亡，因而可以達到治療癌症之功效。再者，本發明鉑奈米粒子若無照射光能，係無明顯影響未照射癌細胞，達到光能環境下始具選擇性誘發癌細胞死亡之功效。由於習知治療法之副作用乃因正常細胞係一同遭受毒殺所造成，故與習知之治療方法相較，本發明鉑奈米粒子可減輕習知治療方法所引起之副作用，進而提供癌症患者良好生活品質之功效。

本發明係另提供一種鉑奈米粒子之製作方法，係能製備光能環境下始具有選擇性毒殺癌細胞之鉑奈米粒子，該鉑奈米粒子使癌細胞透過細胞凋亡方式死亡，而不會引發癌細胞周圍組織發炎反應，進而省略治療發炎反應之醫療程序，以提升臨床醫療水準，為本發明之功效。

第1圖係本發明較佳實施例之鉑奈米粒子之穿透式電子顯微鏡電顯圖。

第2圖係本發明較佳實施例之鉑奈米粒子粒徑分佈柱狀圖。

第3A圖係本發明較佳實施例之鉑奈米粒子投予神經細胞株(Neuro 2A)且照射雷射光後，該細胞溫度隨時間上升之情形。

第3B圖係本發明較佳實施例之鉑奈米粒子投予神經細胞株(Neuro 2A)且照射雷射光後，該細胞溫度隨不同劑量上升之情形。

第4圖係本發明較佳實施例之鉑奈米粒子投予神經細胞株(Neuro 2A) 且有無照射雷射光之細胞存活率。

第5圖係本發明較佳實施例之鉑奈米粒子投予神經細胞株(Neuro 2A)且有無照射雷射光，以趨使該神經細胞株進行細胞凋亡之MALDI-MS圖。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明具有光能環境下始具選擇性毒殺癌細胞之鉑奈米粒子，較佳係能夠以如下方式進行製作：混合一鉑離子與一保護劑，於一反應溫度下施予一氫氧化鈉，經親核性還原反應(nucleation-reduction reaction)生成。較佳地，更可以沉澱該鉑奈米粒子，以獲得一純化之鉑奈米粒子。

詳言之，當鉑離子添加保護劑之後，再與氫氧化鈉混合，該氫氧化鈉係可以提供一價電子，與該鉑離子進行親核性還原反應，還原該鉑離子，並以金屬鉑形式產生沉澱；並且，一旦該金屬鉑生成，係可以立即與該保護劑結合，進而生成該鉑奈米粒子。其中，該保護劑係可以選擇但不限於聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，簡稱PVA)、明膠(gelatin)、聚丙烯醯胺(polyacrylamide，簡稱PAM)、聚亞乙基亞胺(polyethylenmine，簡稱PEI)或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，簡稱PVP)；該保護劑一方面可以防止該鉑離子過度聚集，而生成過於巨大的該金屬鉑粒子，另一方面也可預防已生成的該金屬鉑粒子相互碰撞而產生團聚現象。

舉例而言，本發明較佳實施例係選擇以氯鉑酸六水合物(dihydrogen hexachloroplatinate(Ⅳ)hexahydrate)提供鉑離子，聚乙烯吡咯烷酮係為該保護劑。如此，本實施例遂將200mg的氯鉑酸六水合物與10ml的聚乙烯吡咯烷酮(90mM)攪拌至溶解，以形成一混合液；該混合液置於一反應槽中，並使該反應槽升溫至120℃，逐滴加入50μl之氫氧化鈉水溶液(1mM)，即得 鉑奈米粒子。較佳地，將氫氧化鈉水溶液加入混合液後，係可以經由持續攪拌30分鐘以上，以確保親核性還原反應完全。

接著，續沉澱鉑奈米粒子，以得純化之鉑奈米粒子，較佳者，係利用丙酮沉澱該鉑奈米粒子。於本較佳實施例中，係可以將上述添加氫氧化鈉之混合液與丙酮以體積比1：3相互混合，續進行離心，並且去除上清液，即可以獲得該純化之鉑奈米粒子。

請詳閱第1圖，其係由穿透式電子顯微鏡(TEM)拍攝鉑奈米粒子之電顯圖。由圖可知，該鉑奈米粒子係為立方體形狀，其粒徑大小為4~7nm，且該鉑奈米粒子明顯呈現均勻粒子狀。續參照第2圖所示，係為進一步分析鉑奈米粒子粒徑分佈柱狀圖，顯示鉑奈米粒子粒徑分佈約75%集中於5~6nm。綜上可知，本發明係將鉑離子經由親核性還原反應，即可以產生本發明較佳實施例之鉑奈米粒子。

經由上述方法製備之鉑奈米粒子係具有毒殺癌細胞之功效，該鉑奈米粒子較佳係可以將該鉑奈米粒子投予癌細胞，再施以一光能，使該鉑奈米粒子可以吸收該光能，並轉換為熱能，以提升該癌細胞之溫度，使癌細胞溫度上升至41~47℃，進而可以促進癌細胞之死亡。

為證實本較佳實施例之鉑奈米粒子可以吸收光能，並轉換為熱能，以提升癌細胞之溫度，進而可以促進該癌細胞之死亡，遂進行本試驗。詳言之，本試驗係選一神經細胞株(Neuro 2A)，係購自台灣新竹食品工業科學研究所，該神經細胞株培養於最低必需培養基(Minimum Essential Medium，簡稱MEM)，並補充10%(體積比)去活化胎牛血清(Fetal Bovine Serum，簡稱FBS)及1%(體積比)盤尼西林/鏈黴素，培養環境為37℃、5%二氧化碳增濕培養箱。該神經細胞株係為一種癌細胞，將本較佳實施例之鉑奈米粒子施予該神經細胞株，並選擇光能為光波長1064nm摻釹釔鋁石榴石雷射光(Nd：YAG laser)照射，分別觀察該神經細胞株溫度上升之情形，及該神經細胞株死亡之狀況。

第3A圖係為將本發明鉑奈米粒子投予神經細胞株(Neuro 2A)，且照射一光波長1064nm雷射光後，該神經細胞株(Neuro 2A)溫度上升之情形。第A1組中，係以未投予該鉑奈米粒子之該神經細胞株作為控制組，並以投予50μg該鉑奈米粒子之該神經細胞株作為試驗組(第A2組)，將第A1及A2組分別以雷射光照射480秒，並於第30、60、120、180、240、300、360、420及480秒分別測量各組該神經細胞株之溫度。由此圖可知，第A1組照射該光波長1064nm雷射光480秒，該神經細胞株溫度僅上升約1℃，而第A2組照射480秒，該神經細胞株溫度上升約7.5℃。續參照第3B圖所示，係為投予不同劑量之本發明鉑奈米粒子，對該神經細胞株(Neuro 2A)造成之影響。第B1組係未投予該鉑奈米粒子之該神經細胞株，以作為控制組，第B2~B5組係分別投予5、10、25或50μg該鉑奈米粒子之該神經細胞株。結果顯示，第B1組之該神經細胞株溫度僅上升至約38℃，第B2組之該神經細胞株溫度上升至約44℃，而第B3~B5組之該神經細胞株溫度皆上升至約47~48℃。由此可知，本較佳實施例之鉑奈米粒子係可以有效吸收該光波長為1064nm雷射光，並將光能轉變為熱能，而提升該神經細胞株之溫度，最高至48℃(以下簡稱此一現象為〝光熱效應〞)。

本試驗係證實癌細胞溫度升高後，進一步促使癌細胞死亡。遂此，本試驗係取5oμg本發明鉑奈米粒子，施予1×10⁶ 個神經細胞株(Neuro 2A)細胞，8小時後照射光波長1064nm雷射光，再經24小時後，以MTT分析細胞存活率。

請參照第4圖所示，係本發明鉑奈米粒子施予神經細胞株(Neuro 2A)，有無照射光波長1064nm雷射光之細胞存活率。各組之試驗條件如表一。

結果顯示，未施予本發明鉑奈米粒子之第C1及C2組之神經細胞株，無論有無照光，細胞存活率並無明顯差異。反之，第C3組之神經細胞株細胞存活率高於90%，而第C4組之神經細胞株細胞存活率僅剩約10%，亦即細胞死亡率達90%。再者，比較第C2組之該神經細胞株與第C4組之該神經細胞株細胞存活率，第C4組之該神經細胞株細胞存活率，在統計上明顯低於第C2組之該神經細胞株(P<0.0001)。是以，光波長1064nm雷射光對於未投予本發明鉑奈米粒子之該神經細胞株，並無明顯影響細胞存活率；且投予本發明鉑奈米粒子之該神經細胞株且照射該光波長1064nm雷射光，亦無明顯影響細胞存活率。惟，投予本發明鉑奈米粒子且照射該光波長1064nm雷射光，使該神經細胞株死亡率達90%，殺死該神經細胞株效果明顯。由此可知，本發明鉑奈米粒子，僅在該光波長1064nm雷射光照射部位，才會殺死該神經細胞株，相較於未照射部位之該神經細胞株，並無影響。

綜上所知，本發明鉑奈米粒子，係可以在光波長1064nm雷射光照射部位，利用光熱效應，使神經細胞株溫度上升，而造成該神經細胞株死亡；在非該光波長1064nm雷射光照射部位，雖該神經細胞株仍被施予本發明鉑奈米粒子，惟，該神經細胞株並無明顯死亡之現象。故，本發明鉑奈米粒子由此可證實為一光能環境下始具選擇性殺死該神經細胞株之鉑奈米粒子。

細胞死亡係可以區分為細胞壞死(necrosis)與細胞凋亡(apoptosis)兩大類，其中，細胞壞死(necrosis)係為細胞遭受環境劇烈變化，細胞膨脹、終至破裂而死亡，並且會引發該細胞周圍組織發炎反應，嚴重之細胞壞死會形成壞疽、潰瘍，甚至造成生物體的死亡；反之，細胞凋亡(apoptosis)則為生物體內自然清除細胞之方式，細胞係會萎縮，並 由巨噬細胞所吞噬清除，不會引發細胞周圍組織發炎反應，因而不會壞疽、潰瘍等副作用。

為證實本發明鉑奈米粒子係可以促進神經細胞株以細胞凋亡方式死亡，本試驗係以已知可以誘發細胞凋亡之HTI藥物施予該神經細胞株作為正控制組，並且以未處理任何藥物之該神經細胞株作為負控制組。將這兩組該神經細胞株選擇以基質輔助雷射脫附離子化質譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometer，簡稱MALDI-MS)進行質荷比(mass-to-charge ratio，簡稱m/z)分析，在質荷比5697、11389及13897處，負控制組無訊號而正控制組出現訊號時，表示該神經細胞株已進入細胞凋亡，該些訊號可視為標準之細胞凋亡訊號。

詳而言之，取2×10³ 個神經細胞株置於該基質輔助雷射脫附離子化質譜儀之一樣品托盤(target plate)，覆蓋上一基質(matrix)，使該基質與該神經細胞株形成一結晶狀固態物；於本試驗中，該基質取0.5μl之α-氰基-4-羥基桂皮酸(濃度為0.05M)，吸收波長為337nm。接著，以波長為337nm之雷射光束照射該結晶狀固態物，使該結晶狀固態物可以被激發，以形成氣相離子，該氣相離子經由電場加速後，可以進入一飛行管進行自由飛行(free flight)，飛行時間質量分析器係可以偵測該氣相離子之飛行時間，以得待測神經細胞株之質荷比。

請參閱第5圖所示，係以本發明鉑奈米粒子施予神經細胞株(Neuro 2A)，有無照射光波長1064nm雷射光之MALDI-MS分析圖。各組之試驗條件如表二。

在質荷比(m/z)5697、11389及13897處，第D1組(負控制組)並無出現明顯之訊號，反之，第D2組(正控制組)出現明顯之訊號。請續閱第D3與D4組，本發明鉑奈米粒子施予神經細胞株，但無照射光波長1064nm雷射光(第D3組)，在質荷比(m/z)5697、11389及13897處並無明顯訊號，該些訊號模式與第D1組相同，表示本組之該神經細胞株存活。而第D4組之神經細胞株，經投予本發明鉑奈米粒子、且照射光波長1064nm雷射光，在質荷比(m/z)5697、11389及13897處呈現訊號，該些訊號模式與第D2組相同，表示本組係經由細胞凋亡途徑促使該神經細胞株死亡。據此，本較佳實施例之鉑奈米粒子，在生物體內係可以誘發癌細胞進入細胞凋亡，因而不會引起發炎反應。再者，本試驗再度證實，投予本發明鉑奈米粒子在無照射光波長1064nm雷射光，並不會誘發該癌細胞死亡，僅在照射光波長1064nm雷射光時，才會誘發該癌細胞死亡。故，本發明鉑奈米粒子由此可再度證實為一光能環境下始具選擇性殺死該癌細胞之鉑奈米粒子，且係透過細胞凋亡方式誘發該癌細胞死亡。

本發明之鉑奈米粒子係可以有效殺死癌細胞，因而係能夠作為一種治療癌症之活性成分，較佳係可以將該鉑奈米粒子用於製備治療或輔助性治療腫瘤之藥物，該鉑奈米粒子可以與醫藥學上可以接受之載劑或賦形劑組合形成一醫藥組合物，其中，該鉑奈米粒子可以製備成任何方便食用之型式，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑等，或者將該鉑奈米粒子 與其他食品或飲料組合，以一適於食用之樣態供生物體以口服方式服用；該鉑奈米粒子另可以製備成任何提供注射之製劑，以供局部治療之使用。

綜合上述，本發明鉑奈米粒子用於製備光能環境下始具選擇性毒殺癌細胞藥物的用途，係透過吸收光能，轉換成熱能，產生光熱效應，以誘發細胞進入細胞凋亡，因而可以達到治療癌症之功效。再者，本發明鉑奈米粒子若無照射光能，係無明顯影響未照射癌細胞，達到光能環境下始具選擇性誘發癌細胞死亡之功效。由於習知治療法之副作用乃因正常細胞係一同遭受毒殺所造成，故與習知之治療方法相較，本發明鉑奈米粒子可減輕習知治療方法所引起之副作用，進而提供癌症患者良好生活品質之功效。

本發明係另提供一種鉑奈米粒子之製作方法，係能製備光能環境下始具有選擇性毒殺癌細胞之鉑奈米粒子，該鉑奈米粒子使癌細胞透過細胞凋亡方式死亡，而不會引發癌細胞周圍組織發炎反應，進而省略治療發炎反應之醫療程序，以提升臨床醫療水準，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (4)

1. 一種鉑奈米粒子的用途，係用於製備治療癌症之藥物，其中，係將該鉑奈米粒子投予一生物體，並於該生物體之患部提供一光能4~10分鐘，該光能之光波長係1064nm；其中，該鉑奈米粒子係經由包含如下步驟之方法製備獲得：混合200mg之一氯鉑酸六水合物與90mM、10ml之一保護劑，得一混合液；使該混合液於100~140℃下，與1mM、50μl一氫氧化鈉進行親核性還原反應，反應15~60分鐘，以生成一鉑奈米粒子。
2. 如申請專利範圍第1項所述之鉑奈米粒子之用途，其中，該保護劑係包含一水溶性聚合物及乙二醇，且該水溶性聚合物係選自聚乙烯醇、明膠、聚丙烯醯胺、聚亞乙基亞胺或聚乙烯吡咯烷酮。
3. 如申請專利範圍第1項所述之鉑奈米粒子之用途，其中，係於120℃下進行親核性還原反應30分鐘。
4. 如申請專利範圍第1項所述之鉑奈米粒子之用途，其中，製備該鉑奈米粒子之方法中更包含以體積比1：3之比例混合添加氫氧化鈉之該混合液與丙酮，離心以去除上清液，得一純化之鉑奈米粒子。