TWI496578B

TWI496578B - 流感病毒感染症的治療劑

Info

Publication number: TWI496578B
Application number: TW099133967A
Authority: TW
Inventors: Naoyuki Moriya; Yukiko Moriya; Yasuhiro Futagawa; Tamiko Nishino; Kisato Kusano; Tadaaki Miyazaki
Original assignee: Aureo Co Ltd
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2015-08-21
Also published as: EP2486931B1; EP2486931A4; JP5560472B2; TW201119661A; US20140199346A1; JPWO2011043435A1; EP2486931A1; US20120202771A1; WO2011043435A1

Description

流感病毒感染症的治療劑

本發明係有關流感病毒感染症之治療劑。

流感病毒感染症呈現喉嚨痛、流鼻水、發高燒、頭痛、關節痛等症狀，亦會併發支氣管炎、肺炎等而重症化，尤其在高齡者等，死亡率變高。又，在學校或老人設施等因集體感染而有更多人被捲入，引起社會性流行。

對於流感病毒感染症的對策以往基本上以接種疫苗來預防。惟，流感病毒的抗原性容易變異，只用疫苗要完全壓制其流行有困難。又，疫苗要在短期間大量生產有困難，而有在新型流感病毒出現或流行菌株不在預測內之情況等不能對應的問題。

對於該等問題，近年來使用奧司他偉(Oseltamivir)(商品名「克流感(Tamiflu)」，中外製藥(股)公司製造)、金剛胺(Amantadine)(商品名「新美挫(Symmetrel)」，諾華(股)公司製造)、扎那米偉(Zanamivir)(商品名「瑞樂沙()」，葛蘭素史克藥廠製造)等抗流感病毒藥。惟，被指出若未在發症後48小時以內服用，則不能期待更有效的效果、使用方便性差、因果關係不明確、有副作用、出現具耐性之病毒等問題。

另一方面，於下述專利文獻1記載將培養屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之菌而獲得之含有β-1,3-1,6-葡聚糖之培養物作為免疫賦活劑之有效成分使用。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]特開2005-220065號公報

以往，利用源自天然物之有效成分之抗流感病毒用組成物其有效性不充分。

本發明之目的為提供利用源自天然物之有效成分的流感病毒感染症治療劑，而具有優越效果者。

本發明人等為了達成上述目的，經過深入研究而完成本發明。亦即，本發明為如下所述。

[1]以含有從屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物獲得之含有β-葡聚糖之組成物作為有效成分，用於抑制流感病毒感染症重症化，促進治癒為特徵之流感病毒感染症之治療劑。

[2]上述[1]之流感病毒感染症之治療劑，屬於上述短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物為出芽短梗黴M-1(Aureobasidium pullulans M-1)(FERM BP-08615，BCRC 930069)或出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014，BCRC 930107)。

[3]上述[1]或[2]之流感病毒感染症之治療劑，另含有乳酸菌之菌體作為有效成分。

[4]上述[3]之流感病毒感染症治療劑，上述乳酸菌之菌體為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)之死菌體。

[5]上述[1]至[4]中任何一項之流感病毒感染症治療劑，係以與選自由流感神經胺酸水解酶(influenza neuraminidase)阻礙劑、抗病毒劑、抗生物質及類固醇劑所成組群之至少一種組合投予為特徵。

根據本發明之流感病毒感染症治療劑，可抑制流感病毒感染症重症化，促進治癒。其有效成分為含有從屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)微生物培養物獲得之含有β-葡聚糖之組成物，即使長期攝取也沒有副作用之慮，即使以簡便之攝取形態亦可安心地享受其優越之效果。又，經由併用乳酸菌菌體，效果更提高。另，經由與選自由流感神經胺酸水解酶阻礙劑、抗病毒劑、抗生物質及類固醇劑所成組群之至少一種組合投予，效果更高。

本發明係含有從屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)微生物培養物獲得之含有β-葡聚糖之組成物(以下，稱為「含有源自短梗黴之β-葡聚糖之組成物」)作為有效成分。該源自短梗黴之含有β-葡聚糖之組成物為將屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)，具有β-葡聚糖生產能之微生物(以下，稱為「短梗黴微生物」)培養而得之培養物，不僅包括經由離心分離等將菌體分離除去之培養液、該培養液之濃縮液、該培養液之稀釋液或從該培養液除去水分之固體物等，亦包含將該等脫鹽等而提高β-葡聚糖含量者或從該等將β-葡聚糖精製者。

本發明使用之上述源自短梗黴之含有β-葡聚糖之組成物為將經由培養上述短梗黴微生物生產之β-葡聚糖含量換算為對於該培養物之質量100g之含量，較好為含有50至3,000mg者，更好為含有100至2,000mg者。

β-葡聚糖含量之決定可以例如下述之方法進行。亦即，在培養液中使用澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、蛋白酶等實施酵素處理，除去蛋白質、普魯蘭多糖(pullulan)等α-葡聚糖，並進行乙醇沉澱。另，用玻璃過濾器過濾，獲得高分子試料。此時，為了除去含有單糖之低分子物質，用80%乙醇充分洗淨。經洗淨之高分子試料再用丙酮洗淨，加入硫酸進行水解。水解後進行中和，採取該濾液，經由葡萄糖氧化酶法將葡萄糖定量，以下述數式1為基礎計算而得之值作為β-葡聚糖量。

數式1：β-葡聚糖(g/100g)=葡萄糖(g/100g)×0.9

β-葡聚糖含量之測定亦可作為所謂含糖鏈高分子物質(多糖)量之測定。此時，在培養液中使用澱粉酶、澱粉葡糖苷酶、蛋白酶等實施酵素處理，除去蛋白質、普魯蘭多糖等α-葡聚糖，並進行乙醇沉澱。另，用玻璃過濾器過濾，獲得高分子試料。此時，為了除去含有單糖之低分子物質，用80%乙醇充分洗淨。測定經洗淨之高分子試料另再用丙酮洗淨者之重量，作為含糖鏈高分子物質(多糖)量。

由此操作定量之β-葡聚糖係作為具有硫酸基、磷酸基等官能基者進行定量。所以，該等作為廣義之含糖鏈高分子物質(多糖)將β-葡聚糖定量時，將經由培養上述短梗黴微生物生產之β-葡聚糖含量換算為對於該培養物之質量100g之含量，較好為含有70至5,000mg者，更好為含有140至3,000mg者。

於本發明使用之上述短梗黴微生物只要是屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)，若為具有β-葡聚糖生產能之微生物即可，較好使用例如出芽短梗黴M-1(Aureobasidium pullulans M-1、獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心受託編號FERM BP-08615)或出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2、獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心受託編號FERM BP-10014)。又，該等菌株產生之β-葡聚糖根據NMR測定(13C NMR：Varian公司製造UNITY INOVA500型，1H NMR：Varian公司製造UNITY INOVA600型)進行構造解析，明瞭係葡萄糖從β-1,3-結合之主鏈以β-1,6-結合而具有葡萄糖係分歧構造的β-1,3-1,6-葡聚糖。

上述短梗黴微生物之培養可以公知之方法(參照特開昭57-149301號公報等)為基準進行。亦即，將菌接種於加入碳源(蔗糖)0.5至5.0質量%、N源0.1至5.0質量%、其他微量物質(例如維生素類、無機質)之培養基(pH5.2至6.0)，於溫度20至30℃通氣培養2至14日，較好為通氣攪拌培養。生成β-葡聚糖，因而培養液之黏度上昇，成為黏性高之膠狀。經由此操作獲得之培養液通常含有0.6至10質量%之固形物，該固形物中含有β-葡聚糖5至80質量%。又，除了β-葡聚糖之外由於亦含有幫助該葡聚糖作用之成分之磷、鈣、鎂、維生素C等其他有用成分，而可有效率地發揮β-葡聚糖具有之生理活性效果。

於本發明，由上述培養獲得之培養物可以原狀加熱使用或加壓加熱殺菌使用，亦可經由離心分離等將菌體分離除去後將該培養液殺菌使用。又，必要時使用經濃縮者、亦可使用再經乾燥者。又，可只萃取β-葡聚糖使用。以屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物作為增黏安定劑等之食品添加物使用，安全性高。

其使用之方法為製造成經口用，例如口攝取，從體內即可發揮其生理活性效果。

應投予量係依治療目的或預防目的之不同，可根據症狀之強弱，病患的年齡、投予方法、投予次數、投予時期等適當決定。列舉通常之有效投予量為例如經口攝取時，以β-葡聚糖量換算以1日約0.06至60mg/kg(體重)之量攝取。本發明之流感病毒感染症之治療劑用於流感病毒感染後引起之併發症之預防及治療亦有效。列舉例如中耳炎、副鼻腔炎、支氣管炎、慢性支氣管炎惡化、肺炎、腦炎、腎不全等，對於所謂細胞激素風暴(cytokine storm)引起之疾病或組織破壞性疾病(TH1亢進引起之疾病)之預防特別有效。

本發明之流感病毒感染症治療劑作為上述短梗黴培養物以外之有效成分，可另含有乳酸菌之菌體。根據此，可期待與乳酸菌生理活性效果相乘之作用。

乳酸菌係使用可用於食品之乳酸菌等無安全性問題之乳酸菌。具體而言可例示糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus Acidophilus)，凱氏乳桿菌(Lactobacillus casei)、短乳酸菌(Lactobacillus brevis)、乳脂鏈球菌(Streptococcus cremoris)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、分歧雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum)等。上述乳酸菌可單獨使用，亦可併用2種以上。

又，糞腸球菌、屎腸球菌為用於乳酸菌製劑等之乳酸菌，凱氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌為用於起司、發酵乳、優格、乳酸菌飲料等之乳酸菌，乳脂鏈球菌、乳鏈球菌、嗜熱鏈球菌為用於起司、優格等之乳酸菌，比菲德氏龍根菌、短雙歧桿菌、分歧雙叉桿菌為用於發酵乳等之乳酸菌。所以，該等乳酸菌，任何一種均為業者容易購得之乳酸菌。

乳酸菌不僅限於生菌，亦可為經加熱殺菌之死菌體。使用死菌體時保存安定性變高，作為醫藥品或機能性食品之原料使用時之安全性亦高。該等乳酸菌之死菌體市售有糞腸球菌、植物性短桿型乳酸菌(Lactobacillus brevis subspecies coagulans)之死菌體，可理想使用。

上述乳酸菌的培養只要根據常法進行即可。又，死菌體只要從上述乳酸菌之培養物經由過濾、離心分離等方法將菌體回收、水洗後懸濁於水等，在80至115℃加熱殺菌30分鐘至3秒即可。經加熱殺菌之乳酸菌必要時可經濃縮、乾燥後使用。

上述乳酸菌之投予量依治療目的或預防目的之不同，可根據症狀之強弱，病患的年齡、投予方法、投予次數、投予時期等適當決定。列舉通常之有效投予量為例如經口攝取時，以乾燥死菌體量換算較好以1日約1×10⁹ 至4×10¹¹ 個/kg(體重)，更好以2×10⁹ 至1×10¹¹ 個/kg(體重)之量攝取。

於本發明，上述乳酸菌中以糞腸球菌之死菌體特別好使用。已知糞腸球菌的死菌體具有強力免疫賦活活性，經由與上述短梗黴培養物併用，對於抗流感病毒效果亦可期待該等之相乘效果。

於本發明，其投予之一形態為可與選自由流感神經胺酸酶阻礙劑、抗病毒劑、抗生物質及類固醇劑所成組群之至少一種組合投予。經由此，可期待與該等藥之抗流感病毒效果之相乘效果。流感神經胺酸酶阻礙劑可例示奧司他偉、扎那米偉。抗病毒劑可例示金剛胺。抗生物質較好可例示開羅理黴素(Clarithromycin)、西華克樂(Cefaclor)、頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、鹽酸頭孢噻乙胺唑(cefotiam HCl)、鹽酸頭孢卡品酯(Cefcapene Pivoxil HCl)、頭孢妥侖匹酯(Cefditoren pivoxil)、頭孢美唑鈉(Sod. Cefmetazole)、鹽酸頭孢噻乙胺唑(cefotiam HCl)、鹽酸頭孢唑蘭(Cefozopran HCl)、鹽酸匹美西林(Pivmecillinam HCl)、對甲苯磺酸舒他西林(Sultamicillin tosylate)、磷黴素鈣(phosphormycin calcium)、硫酸異帕米星(Isepamicin Sulfate)、硫酸紫菌素(Gentamicin Sulfate)、硫酸康絲菌素(kanamycin sulfate)。類固醇劑較好可例示甲基潑尼松龍(methylprednisolone)。

於本發明，其投予之一形態為與選自由流感神經胺酸酶阻礙劑、抗病毒劑、抗生物質及類固醇劑所成組群之至少一種組合投予時，可將該等抗病毒劑以各個抗病毒劑之較佳形式投予，接著投予短梗黴培養物。此種情況，短梗黴培養物未顯示特別明顯的副作用，因此可連續投予較長時間，亦可短時間將上述抗病毒劑併用投予。

[實施例]

列舉以下之實施例對本發明作具體的說明，惟，本發明之範圍不只限於該等實施例。

[製造例]

經由下述操作，調製出芽短梗黴M-1(Aureobasidium pullulans M-1)(FERM BP-08615)之培養液。

將上述培養液適量接種於含有蔗糖1%、抗壞血酸0.1%、米糠0.1%之液體培養基(pH 5.3)，於25℃進行通氣攪拌培養72至96小時(依製造批號不同而異)。培養完成後將該培養液在121℃殺菌15分鐘。獲得之殺菌後之培養液含有固形物約1.2質量%，該固形物100g中之β-葡聚糖含量為16.7g，換算為培養液質量100g中所含之量為含有0.2g/100g。將該培養液用於以下之試驗。

[試驗例1]

對於下述表1記載之各試驗群及對照群，分別準備各試驗液，研究將該等經口投予，對於已感染流感病毒之小鼠顯示何種效果。又，作為抗流感藥之奧司他偉係利用「克流感乾糖漿3%」(商品名，中外製藥(股)公司製造)。

使用小鼠(C57BL/6NJc1系統，雄性，6週齡)作為實驗動物，使用H1N1亞型流感病毒A/PR/8作為流感病毒。小鼠感染流感病毒係依照下述操作進行。亦即，將小鼠放進充滿異氟烷(Isoflurane)之容器，確認呼吸變緩慢後取出，將用PBS階段性稀釋使病毒力價成為2×10⁴ pfu/mL而調製之稀釋病毒液，以微量吸管從小鼠之兩鼻交互注入50μL(1,000pfu/隻)。確認從麻醉甦醒，放回飼養籠。

以下述表2表示之形態‧方法進行試驗液之投予。又，短梗黴培養液(試驗群1)在試驗期間以探針法每日1次經口投予200μL，抗流感藥之奧司他偉(試驗群2)其投予方法係以更有效的方法(參照「DIRK B. MENDEL et al.,ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,Mar. 1998,p.640-646」)為基準，在病毒感染後於5日間經由探針法1日2次經口投予(早晚各1次，每次200μL)。每日測定病毒感染後小鼠的體重，尋求體重的推移及生存率。

其結果試驗群1表示於第1圖，試驗群2表示於第2圖，對照群1表示於第3圖。

如第1圖所示，試驗群1之生存率為100%。感染後，1隻在感染時體重沒有減少，在14日後試驗完成時與感染初日相比，增加5%。另1隻在感染後約7日後體重開始減少，惟，再3日後之感染第10天體重減少最大約15%，之後體重即回復，以與感染初日相同體重完成試驗。另1隻在感染後5日或6日體重開始減少，再2日後之感染第8天體重減最大約6%，之後體重回復，以與感染初日相同體重完成試驗。

如第2圖所示，試驗群2之生存率為100%。感染後，1隻在感染時體重沒有減少，在14日後試驗完成時與感染初日相比，增加5%。另1隻在感染後約6日後體重開始減少，再3日後之感染第9天體重減少最大約20%，之後體重即回復，以與感染初日相同體重完成試驗。另1隻從感染後5日體重開始減少，再4日後之感染第9天體重減少最大約25%，之後體重回復，以與感染初日相比體重減少3%完成試驗。

如第3圖所示，對照群1之生存率為66.6%(3隻中有1隻死亡)。感染後，1隻在第7天體重開始顯著減少，體重沒有回復，感染後第12日死亡。另1隻在感染後4日後體重開始減少，再5日後之感染第9天體重減少最大約28%，之後體重即回復，以與感染初日相比體重減少6%完成試驗。另1隻從感染後5日體重開始減少，從感染後第11日到感染後第14日，體重減少最大約28%，感染後第14日體重回復一些，完成試驗。

歸納以上之結果，經由投予短梗黴培養液，可抑制流感病毒感染引起之症狀之小鼠體重減少，且促進其從體重減少之情況回復。因此，其效果與作為抗流感病毒藥之奧司他偉(商品名「克流感」，中外製藥(股)公司製造)相同或在其之上。因此明瞭從屬於短梗黴屬微生物之培養物獲得之含有β-葡聚糖之組成物用於治療流感病毒感染症，尤其是抑制病毒感染後重症化，促進治癒之治療有效。

源自短梗黴之含有β-葡聚糖之組成物以何種作用機序發揮效果仍不明白，認為不僅是經由巨噬細胞吞噬作用活化等免疫賦活作用，亦因體內具有之免疫平衡機能提高，例如確保Th1細胞系免疫與Th2細胞系免疫之平衡，抑制過剩的免疫反應不必要的攻撃自己組織。

[製造例2]

與製造例1相同操作，調製出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2)、(FERM BP-10014)之培養液。該培養液含有固形物約1.2質量%，該固形物100g中之β-葡聚糖含量為54.2g，換算為培養液質量100g中所含之量為0.65g/100g。將該培養液用於以下之試驗。

[試驗例2]

如下述表3記載，對於各試驗群及對照群，準備各試驗液，研究將該等經口投予，對於已感染流感病毒之小鼠顯示何種效果。又，表中之EF乳酸菌死菌體為市售之糞腸球菌之加熱殺菌菌體粉末。

實驗動物小鼠之感染流感病毒係以病毒力價為試驗例1之2倍進行。除了將稀釋病毒液4×10⁴ pfu/mL用微量吸管從小鼠之兩鼻交互注入50μL(2,000pfu/隻)以外，以與試驗例1相同之操作進行。

各試驗液之投予以下述表4表示之形態、方法進行。亦即，試驗群3至5、對照群2，在試驗期間以探針法每日1次經口投予200μL試驗液。併用短梗黴培養液及奧司他偉之試驗群6，與試驗例1之試驗群2相同，為了使奧司他偉可有效地投予，在病毒感染後5日間，將奧司他偉懸濁在短梗黴培養液中並1日2次(早晚各1次，每次200μL)經口投予，以外之期間只經口投予短梗黴培養液1日1次，200μL。為了比較奧司他偉單獨之最大效果，單獨投予奧司他偉之試驗群7在病毒感染後之17日間繼續每日(早晚1次，每次200μL)經口投予。

每日測定病毒感染後小鼠的體重，尋求體重的推移及生存率。

其結果試驗群3表示於第4圖，試驗群4表示於第5圖，試驗群5表示於第6圖，試驗群6表示於第7圖，試驗群7表示於第8圖，對照群2表示於第9圖。第10圖表示各群小鼠生存率之推移。

該試驗2係進行小鼠感染之病毒力價為試驗例1之2倍之結果，在投予PBS之對照群2(第9圖)，至感染後第10日為止有4隻死亡(第10圖)。

在投予短梗黴培養液之試驗群3(第4圖)及試驗群4(第5圖)，試驗群3及4小鼠總數10隻中4隻(40%)在試驗期間死亡(第10圖)。又，在試驗群3(第4圖)5隻有4隻，在試驗群4(第5圖)5隻有3隻體重減少最大約41%，體重減少的小鼠在死亡或體重幾乎未回復之情況下完成試驗。

另，在投予奧司他偉之試驗群7(第8圖)4隻中有4隻體重減少最大約34%。4隻中有2隻(50%)在試驗期間死亡(第10圖)。

相對於此，如第7圖所示，在將短梗黴培養液與奧司他偉併用之試驗群6，雖然在病毒感染後6至9日間4隻中體重全都減少，惟，4隻中除了1隻死亡(25%)，體重減少都停在最大約25%，之後回復到正常水平。將短梗黴培養液與乳酸菌之加熱殺菌菌體粉末併用之試驗群5亦看到相同的傾向。亦即，在試驗期間4隻中只有1隻死亡(25%)，病毒感染後3至10日間，雖然4隻中有3隻體重減少，惟，除了1隻死亡之外，之後顯著地回復到接近正常水平。

根據以上可明瞭含有源自短梗黴之β-葡聚糖之組成物用於流感病毒感染症的治療，尤其用於抑制病毒感染後之重症化、促進治癒之治療有效，經由併用乳酸菌之菌體或奧司他偉，該效果更高。

[試驗例3]

另，研究與乳酸菌之菌體併用之效果。具體而言，對於下述表5表示之各試驗群及對照群，準備各試驗液，與試驗例2相同操作，將該等經口投予，同時研究感染流感病毒之小鼠體重之推移及生存率。又，表中之EF乳酸菌死菌體為市售之糞腸球菌之加熱殺菌菌體粉末。

各試驗液之投予係以下述表6表示之形態、方法進行。亦即，試驗群8係在β-葡聚糖濃度調製為0.2g/100g之出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)之培養液200μL中懸濁上述乳酸菌死菌體6.7×10⁹ 個，將其在試驗期間以探針法每日1次經口投予。在試驗群9除了上述乳酸菌死菌體係懸濁10.1×10⁹ 個以外，與試驗群8相同操作進行試驗。於試驗群10，除了上述乳酸菌死菌體係懸濁3.4×10⁹ 個以外，與試驗群8相同操作進行試驗。於試驗群11，除了使用上述β-葡聚糖濃度調製為0.1g/100g者作為短梗黴培養液之外，與試驗群8相同操作進行試驗。試驗群12係將上述乳酸菌死菌體6.7×10⁹ 個懸濁於PBS，將此在試驗期間以探針法1日1次經口投予。

其結果試驗群8表示於第11圖，試驗群9表示於第12圖，試驗群10表示於第13圖，試驗群11表示於第14圖，試驗群12表示於第15圖，對照群3表示於第16圖。又，第17圖表示各群小鼠生存率之推移。

該試驗例3與試驗例2相同，係進行小鼠感染之病毒力價為試驗例1之2倍之結果，在投予PBS之對照群3(第16圖)，至感染後第9日為止5隻中有4隻死亡(第17圖)。

在投予乳酸菌加熱殺菌菌體粉末之試驗群12(第15圖)，4隻中4隻之體重減少最大約33.3%，4隻中有2隻(50%)在試驗期間死亡(第17圖)。

對於此，如第11圖至第14圖所示，併用短梗黴培養液與乳酸菌加熱殺菌菌體粉末之試驗群8至試驗群11，各試驗群小鼠總數19隻中，試驗期間死亡者在各群各1隻，另一方面，體重未減少之小鼠在各群至少有2隻，合計9隻。其他小鼠在試驗期間均回復到接近正常水平。尤其在試驗群9及試驗群10，各試驗群除了1隻死亡之外，體重減少最大約19.16%，之後顯著地回復到正常水平。

根據以上可明瞭含有源自短梗黴β-葡聚糖之組成物用於流感病毒感染症的治療，尤其用於抑制病毒感染後之重症化、促進治癒之治療有效，經由併用乳酸菌之菌體，該效果更高。

[試驗例4](小鼠肺中病毒力價)

為了研究試驗例1至試驗例3所示效果之作用機序，調查在感染流感病毒之小鼠肺中病毒力價給予的影響。具體而言，對於下述表7表示之各試驗群及對照群準備各試驗液，將該等經口投予同時研究感染流感病毒之小鼠肺中病毒之力價。又，表中之EF乳酸菌死菌體為市售之糞腸球菌之加熱殺菌菌體粉末。

各試驗液之投予以下述表8表示之形態、方法進行。亦即，除了將從開始投予試驗液之期間改為1週之外與試驗例2相同操作，使小鼠感染流感病毒。在試驗群13，將作為試驗液之出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)培養液之β-葡聚糖濃度調製為0.2g/100g，將其200μL在試驗期間以探針法每日1次經口投予。在試驗群14除了在上述短梗黴培養液200μL中懸濁上述乳酸菌死菌體6.7×10⁹ 個併用以外，與試驗群13相同操作進行試驗。在單獨投予奧司他偉之試驗群15，為了比較奧司他偉單獨之最大效果，在病毒感染後繼續每日(早晚各1次，每次200μL)經口投予。

小鼠肺中病毒力價的測定如以下操作進行。

在病毒感染後1日、3日、5日後每個群解剖3隻，採取用PBS洗淨，除去血液之肺。採取之肺碾碎，將組織作成細胞懸濁液取出後以5,000rpm離心分離10分鐘，採取上澄液作為試料。採取之試料以1×MEM製作從10^-1 至10^-6 之稀釋系列，以10倍階段稀釋。另一方面將MDCK細胞從前一天先培養起來，確認MDCK細胞(1試樣：12洞盤1個)增加至無間隙後除去MDCK細胞之培養基，用1mL之PBS洗淨。除去洗淨用之PBS，每次添加階段稀釋之試料100μL後在5%CO₂ 恆溫箱(37℃)靜置1小時。每隔15分鐘進行搖盤之操作使中途細胞不會乾掉。接著將2×MEM與1.6%瓊脂液以同量混合，加入胰蛋白酶使最終濃度成為0.0005%，調製MEM-瓊脂溶液，在42℃之水浴保溫。1小時後除去病毒溶液，用1mL之PBS洗淨，在各洞添加調製之MEM-瓊脂溶液各1mL，暫時靜置至固化，然後在5%CO₂ 恆溫箱(35℃)培養，48小時後計算溶菌斑(plaque)數。

該結果表示於第18圖。

該結果為小鼠肺中病毒力價在感染第1天，在投予PBS之對照群4為6.31(log₁₀ PFU)、在投予短梗黴培養液之試驗群13為6.36(log₁₀ PFU)、在短梗黴培養液與乳酸菌併用群之試驗群14為5.59(log₁₀ PFU)、在為陽性對照之奧司他偉(抗流感藥克流感之有效成分)投予群之試驗群15為5.88(log₁₀ PFU)。在感染第3天、第5天，投予PBS之對照群4之值分別為8.80(log₁₀ PFU)、9.43(log₁₀ PFU)，與感染第1天相比，病毒量增加154倍、2,057倍，在投予短梗黴培養液之試驗群13，感染第3天為7.75(log₁₀ PFU)，感染第5天為7.18(log₁₀ PFU)，與感染第1天相比，分別增加22.8倍、8.3倍。又，在短梗黴培養液與乳酸菌併用群之試驗群14，分別為7.61(log₁₀ PFU)、7.24(log₁₀ PFU)，與感染第1天相比，增加81.4倍、40.1倍，與對群群4相比，病毒力價之上昇受到抑制。另一方面，單獨投予抗病毒藥克流感之有效成分之奧司他偉時(試驗群15)在感染第3天為6.83(log₁₀ PFU)，在感染第5天為7.76(log₁₀ PFU)，與感染第1天相比，增加15.4倍、122倍。

將結果歸納於表9。亦即，以投予PBS之對照群4感染後每天之病毒量作為1時，將對應之感染後每天之試驗群之病毒量作成一覽表。

如表9所示，將投予PBS之對照群4作為1時，在投予短梗黴培養液之試驗群13，病毒量在第3天為1/12，在第5天為1/425，在短梗黴培養液與乳酸菌併用群之試驗群14，病毒量在第3天為1/16，在第5天為1/442。因而認為經由投予短梗黴培養液(試驗群13)或短梗黴培養液與乳酸菌併用(試驗群14)可有效地抑制肺中病毒的增殖。又，如試驗群14之結果，在該試驗例，若在感染第1天將短梗黴培養液與乳酸菌之菌體併用，則比單獨使用短梗黴培養液可更抑制病毒力價的上昇。

[試驗例5](小鼠肺中T細胞活性及NK細胞活性)

為了研究試驗例1至試驗例3所示效果之作用機序，調查在感染流感病毒之小鼠肺中之活化T細胞及活化NK細胞。具體而言，對於下述表10表示之各試驗群及對照群準備各試驗液，將該等經口投予，同時研究感染流感病毒之小鼠第5天肺中之T細胞數及其中之活化T細胞或NK細胞數及其中之活化NK細胞。又，表中之EF乳酸菌死菌體為市售之糞腸球菌之加熱殺菌菌體粉末。

各試驗液之投予與上述試驗例4相同操作，以下述表11表示之形態、方法進行。亦即，除了將開始投予試驗液之期間改為1週之外，與試驗例2相同操作，使小鼠感染流感病毒。在試驗群16，將出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014)培養液之β-葡聚糖濃度調製為0.2g/100 g作為試驗液，將其200μL在試驗期間以探針法每日1次經口投予。在試驗群17除了在上述短梗黴培養液200μL中將上述乳酸菌死菌體6.7×10⁹ 個懸濁併用以外，與試驗群16相同操作進行試驗。在單獨投予奧司他偉之試驗群17，為了比較奧司他偉單獨之最大效果，在病毒感染後繼續每日(早晚各1次，每次200μL)經口投予。

小鼠肺中之活化T細胞數及活化NK細胞數如以下操作進行。亦即在病毒感染後第5日在各群各解剖3隻，採取用PBS洗淨，除去血液之肺。對於小鼠1隻份之肺加入HEPES緩衝液4.9mL、膠原酶D(100mg/Ml in HEPES)100μL、DNase 1 10μL，均化，將組織輕輕碾碎。於37℃振動30分鐘，進行酵素處理。再度均化，將組織完全碾碎。在每群將碾碎之3隻份肺組織收納為1個，通過篩網，除去細胞以外之其餘部分，用PBS反覆進行細胞之洗淨，計算細胞數。

將1試樣以2×10⁶ 細胞/洞分注在96洞盤，為了封鎖使抗體不會黏在多餘之細胞中，添加封阻用「LEAF Purified anti-Mouse CD16/32」1μL/洞(於100μL FACS緩衝液)在冰上靜置30分鐘。將對於T細胞之CD3 APC抗體、對於NK細胞之NK1.1 FITC抗體、對於活化T細胞之PE Cy7-CD69抗體、對於活化NK細胞之PE Cy7-CD69抗體之各抗體每次少量添加1μL/洞，於4℃邊遮光邊靜置30分鐘。為了除去未結合於細胞之抗體，用FACS緩衝液洗淨數次，每1試樣添加用於標識死細胞區別用之7-AAD 10μL，用流式細胞分選儀(Flow Cytometry Cell Sorter)裝置進行FACS解析，尋求活細胞中NK細胞或T細胞之比例。又，尋求各細胞中經活化之細胞之比例。

該結果表示於第19圖至第22圖。

在感染第5天，對於在自然免疫擔任重要角色之NK細胞，在肺活細胞中之NK細胞比例，在投予PBS之對照群5為7.5%、在投予短梗黴培養液之試驗群16為6.4%、在短梗黴培養液與乳酸菌併用之試驗群17為3.7%。在投予奧司他偉(抗流感藥克流感之有效成分)之試驗群18為約1.8%，只有對照群之約1/4量(以上第19圖)。又，各NK細胞中經活化之NK細胞比例，在投予PBS之對照群5為64.7%、在投予短梗黴培養液之試驗群16為66.4%、在短梗黴培養液與乳酸菌併用之試驗群17為57.2%。另一方面，在投予奧司他偉(抗流感藥克流感之有效成分)之試驗群18為46.2%(以上第20圖)。試驗群16及試驗群17之抑制流感病毒增殖理由之一係NK細胞之活化上昇，如上述試驗例4(第18圖)所示，試驗群16(與上述試驗例4之試驗群13對應)及試驗群17(與上述試驗例4之試驗群14對應)與PBS投予群之對照群5相比，抑制流感病毒之增殖在試驗群13為1/425，在試驗群14為1/442，暗示即使在NK細胞活化亢進以外之路徑，亦有抑制流感病毒之機構存在。另一方面，在試驗群18，經活化之NK細胞數比其他群少之理由為奧司他偉係作為流感病毒之NA阻礙劑直接作用於流感病毒而抑制增殖，推測未參予NK細胞之活化。

接著，對於在獲得免疫擔任重要角色之T細胞，在病毒感染後第5天肺之活細胞中之T細胞數，各群都在3%左右，非常少，細胞數幾乎無差異(以上第21圖)。惟，在該T細胞中活化之T細胞數在投予PBS之對照群5為22.9%、在投予短梗黴培養液之試驗群16為38.5%，與對照群5相比，活化多1.68倍。又，在短梗黴培養液與乳酸菌之併用群之試驗群17為17.3%。在投予奧司他偉(抗流感藥克流感之有效成分)之試驗群18為7.3%，與投予PBS之對照群5相比，經活化之T細胞只有約1/3之量(以上第22圖)。

如上述，單獨使用短梗黴培養物或與乳酸菌併用時，經活化之T細胞或NK細胞比使用奧司他偉(抗流感藥克流感之有效成分)者增加，暗示不僅可抑制流感病毒之侵入、增殖，亦可抑制因感染流感病毒而引起之症狀重症化。又，投予短梗黴培養物或短梗黴培養物與乳酸菌之併用物，認為可順利進行從自然免疫轉移到獲得免疫，其結果暗示有助於體重減少率或降低死亡率。

又，由於推測短梗黴培養物與奧司他偉(抗流感藥克流感之有效成分)分別具有不同的流感病毒感染防禦作用機序，如上述試驗例2之試驗群6所見(第10圖)，經由將該等併用，可更有效地抑制流感病毒之侵入、增殖或因感染流感病毒之症狀重症化。

第1圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予出芽短梗黴M-1培養液時，小鼠體重變動之結果(試驗群1)之圖表(試驗例1)。

第2圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予抗流感藥奧司他偉(商品名「克流感」，中外製藥(股)公司製造)時，小鼠體重變動之結果(試驗群2)之圖表(試驗例1)。

第3圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)時，小鼠體重變動之結果(對照群1)之圖表(試驗例1)。

第4圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予出芽短梗黴M-1培養液時，小鼠體重變動之結果(試驗群3)之圖表(試驗例2)。

第5圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予出芽短梗黴M-2培養液時，小鼠體重變動之結果(試驗群4)之圖表(試驗例2)。

第6圖為表示對於感染流感病毒之小鼠併用投予出芽短梗黴M-1培養液及糞腸球菌之加熱殺菌菌體時，小鼠體重變動之結果(試驗群5)之圖表(試驗例2)。

第7圖為表示對於感染流感病毒之小鼠併用投予出芽短梗黴M-1培養液及抗流感藥奧司他偉(商品名「克流感」，中外製藥(股)公司製造)時，小鼠體重變動之結果(試驗群6)之圖表(試驗例2)。

第8圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予抗流感藥奧司他偉(商品名「克流感」，中外製藥(股)公司製造)時，小鼠體重變動之結果(試驗群7)之圖表(試驗例2)。

第9圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)時，小鼠體重變動之結果(對照群2)之圖表(試驗例2)。

第10圖為表示試驗例2之試驗期間各試驗群小鼠生存率之推移之圖表。

第11圖為表示對於感染流感病毒之小鼠併用投予出芽短梗黴M-2培養液及糞腸球菌之加熱殺菌菌體時小鼠體重變動之結果(試驗群8)之圖表(試驗例3)。

第12圖為表示對於感染流感病毒之小鼠併用投予出芽短梗黴M-2培養液及糞腸球菌之加熱殺菌菌體時，小鼠體重變動之結果(試驗群9)之圖表(試驗例3)。

第13圖為表示對於感染流感病毒之小鼠併用投予出芽短梗黴M-2培養液及糞腸球菌之加熱殺菌菌體時，小鼠體重變動之結果(試驗群10)之圖表(試驗例3)。

第14圖為表示對於感染流感病毒之小鼠併用投予出芽短梗黴M-2培養液及糞腸球菌之加熱殺菌菌體時，小鼠體重變動之結果(試驗群11)之圖表(試驗例3)。

第15圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予糞腸球菌之加熱殺菌菌體時，小鼠體重變動之結果(試驗群12)之圖表(試驗例3)。

第16圖為表示對於感染流感病毒之小鼠投予磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)時，小鼠體重變動之結果(對照群3)之圖表(試驗例3)。

第17圖為表示試驗例3之試驗期間各試驗群小鼠生存率之推移之圖表。

第18圖為表示試驗例4之各試驗群小鼠肺中病毒力價之圖表。

第19圖為表示對於試驗例5各試驗群小鼠肺中之活細胞，NK細胞之比例之圖表。

第20圖為表示相對於試驗例5各試驗群小鼠肺中之NK細胞，經活化NK細胞之比例之圖表。

第21圖為表示相對於試驗例5各試驗群小鼠肺中之活細胞，T細胞之比例之圖表。

第22圖為表示相對於試驗例5各試驗群小鼠肺中之T細胞，經活化T細胞之比例之圖表。

由於本案的圖為試驗例數據之圖表，並非本案的代表圖。

故本案無指定代表圖。

Claims

一種含有β-葡聚糖之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，係用於製造抑制流感病毒感染症重症化，且促進治癒之流感病毒感染症治療劑。
如申請專利範圍第1項所述之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，其中，屬於上述短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物為出芽短梗黴M-1(Aureobasidium pullulans M-1)、(FERM BP-08615，BCRC 930069)或出芽短梗黴M-2(Aureobasidium pullulans M-2)(FERM BP-10014，BCRC 930107)者。
如申請專利範圍第1項所述之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，其中，該治療劑另含有乳酸菌之菌體作為有效成分。
如申請專利範圍第2項所述之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，其中，該治療劑另含有乳酸菌之菌體作為有效成分。
如申請專利範圍第3項所述之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，其中，上述乳酸菌之菌體為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)之死菌體者。
如申請專利範圍第4項所述之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，其中，上述乳酸菌之菌體為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)之死菌體者。
如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之屬於短梗黴屬(Aureobasidium sp.)之微生物培養物之用途，其中，該治療劑係與選自由流感神經胺酸水解酶阻礙劑、抗病毒劑、抗生物質及類固醇劑所成組群之至少一種組合投予者。