TWI479022B - 諾羅病毒衣殼與輪狀病毒ｖｐ６蛋白質做為組合疫苗的用途 - Google Patents

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Description

諾羅病毒衣殼與輪狀病毒VP6蛋白質做為組合疫苗的用途
本發明係關於特別是抑制幼童腸胃炎之疫苗製劑。更特別是，本發明有關於包含至少一諾羅病毒(norovirus)與至少一輪狀病毒(rotavirus)的組合疫苗製劑。
輪狀病毒胃腸炎每年導致全世界超過500000名幼兒的死亡。輪狀病毒(rotavirus;RV)，屬於呼腸孤病毒(Reoviridae )，為已開發國家兒童單一最重要的嚴重腹瀉的病原體，造成比開發中國家較少的死亡病例，但很高的住院成本。自2006年，已有口服活輪狀病毒疫苗可獲取。WHO與許多國家目前均建議對所有的健康兒童接種以預防輪狀病毒。
在口服活輪狀病毒疫苗的開發中，坦佩雷(Tampere)大學的Timo Vesikari教授扮演重要角色。任何輪狀病毒的第一次臨床試驗在1982年的坦佩雷進行。Vesikari教授與他的團隊幫助完成目前2個已認證的口服活輪狀病毒疫苗的效力與安全性關鍵試驗，牛-人重組五合一疫苗(Merck)與人類輪狀病毒疫苗(GSK)(Vesikari et al. Safety and efficacy of a pentavalent human-bovine(WC3) reassortant rotavirus vaccine. N Engl J Med 2006;354:23-33；Vesikari et al. Efficacy of human rotavirus vaccine against rotavirus gastroenteritis during the first 2 years of life in European infants: randomised,double-blind controlled study. Lancet 2007;370:1757-63)。
目前有效且在多國成功使用的減毒口服輪狀病毒疫苗具有潛在地安全問題，長遠來看可能會限制其使用。早先的口服活輪狀病毒疫苗為根據恆河猴輪狀病毒(，Wyeth)所開發，由於在10000位接種第一劑疫苗的接受者有1位會產生腸套疊，因此其在美國已於1999年被撤銷。目前核准的輪狀病毒疫苗並不具有此高風險，但仍不能排除此罕見的可能。
而且，在2010年，發現核准的輪狀病毒疫苗含有豬環狀病毒(PCV)DNA。儘管此發現的影響仍屬未知，但其造成一個輪狀病毒疫苗開發的暫停，且減少整體輪狀病毒疫苗的接種率。這些事件僅為活病毒疫苗原本即存在的問題，且進而增加發展非活病毒之輪狀病毒疫苗的需要。
輪狀病毒基因含有11個雙股RNA片段，位於3層衣殼(capsid)的內核層中。此3層衣殼由一與dsRNA連結的核心蛋白VP2、一內層衣殼蛋白VP6、與一外層衣殼醣蛋白VP7與血球凝集素棘狀蛋白(hemagglutinin spike protein)VP4所組成。主要的衣殼蛋白VP6決定病毒群的特異性，而且是最具有演化保存性的、免疫原性的、及最豐富的輪狀病毒蛋白。外層衣殼蛋白VP7與VP4含有中和性抗原決定位(epitope)，且可藉由中和抗體以誘導保護性免疫。
由口服活輪狀病毒疫苗所誘導之積極保護機制仍未完全了解。表面蛋白VP7與VP4已知可誘導血清型特異性中和抗體。然而，在各血清型之間存在交叉保護，不能以血清特異性免疫來解釋。VP6在輪狀病毒感染與疫苗接種後為一免疫優勢蛋白。儘管VP6不會誘導中和抗體，但其誘導異源性輪狀病毒的特異性免疫。
第一個由rBV表現系統所產生的輪狀病毒重組VP6(rVP6)蛋白至今已超過20年(Estes M et al. 1987)。VP6單獨形成管狀、球狀或層狀的寡聚結構，在體外由數個三聚體(trimer)所構成(Lepaualt J,Embo J,20,2001)。於rBVs中共同表現VP2與VP6可形成雙層類病毒顆粒(double-layered virus-like particle;dl VLPs)。共同表現VP2、VP6與VP7(含或不含VP4)可形成類似自然界具感染性輪狀病毒顆粒的三層VLPs。利用不同的輪狀病毒VLPs或非人類重組VP6蛋白與佐劑可完成動物試驗中大部分的免疫原性與疫苗效力的研究。至今沒有使用VLPs或重組VP6蛋白的非活病毒次單位輪狀病毒蛋白疫苗完成人類臨床試驗。
在許多地區將輪狀病毒消除或減少後，諾羅病毒作為病原菌的相對重要性增加。諾羅病毒(norovirus;NV)屬於杯狀病毒科(Caliciviridae )，會對所有年紀的人類族群造成偶發性急性非細菌性腸胃炎，且與全世界胃腸炎的爆發有關。NV導致全世界每年約1百萬人住院，且超過200000位小於5歲幼童的死亡。在輪狀病毒之後，諾羅病毒成為導致幼童急性腸胃炎的第二重要病毒。
諾羅病毒基因是由約7.6 kb單股RNA組成3個開放閱讀框架(ORF 1-3)所構成。與其他ssRNA病毒類似，ORF1編碼RNA依賴的RNA聚合酶；ORF2編碼主要的衣殼蛋白VP1，ORF3編碼一小結構蛋白VP2。大部分影響人類的NVs屬於二種基因組(genogroups)(GI與GII)，且此二種基因組可被分為至少8種GI與17種GII基因組。近年，GII-4基因型已成為主要散發性腸胃炎與爆發的基因型。
衣殼VP1蛋白的獨特特徵是它能夠自行組裝成空的類病毒顆粒(VLPs)。20年前已將基因組I諾羅病毒衣殼基因複製至一重組桿狀病毒中產生第1個諾羅病毒VLPs(Jiang et al. 1992)。此VLPs的形態和抗原性類似於天然的NV。利用電子影微鏡與電腦圖像處理技術觀察諾羅病毒的3-D結構，顯示此諾羅病毒衣殼為T=3二十面體的對稱結構，其含有180個VP1衣殼分子，組裝成90個直徑38 nm的雙聚體。諾羅病毒VLPs在血清診斷檢測中被廣泛地使用作為抗原，且可發展作為對抗諾羅病毒的抗原。雖然諾羅病毒結合與進入的受體並未完全清楚，但最近發現NV可辨識作為受體之人類組織血型抗原(histo-blood group antigen;HBGAs)。在HBGAs中，大部分遇到的血型組為ABO(ABH)與Lewis。這些複雜的碳水化合物被發現存在於紅血球和黏膜上皮細胞中或作為生物體液中的自由抗原。此外，最近發現NV對HBGAs的辨識具有病毒株特異性，且許多不同受體的結合模式已被確認。
對於諾羅病毒，由於諾羅病毒不可利用細胞培養，故活病毒疫苗並不可行。因此，諾羅病毒的疫苗已為或可能為VLP疫苗或可溶性抗原疫苗。
非複製性的次單位疫苗與亞病毒顆粒的使用在現代疫苗的設計中開始於80年代，在HB感染患者的血液中發現B型肝炎表面抗原(HBsAg)顆粒。這些疫苗因為去除了減毒或死毒病毒或其遺傳物質所以通常較為安全，而且也較容易及低成本大量生產。次單位蛋白疫苗其中的一個例子為類病毒顆粒(virus like particle;VLPs)，其類似於活病毒的空殼，因此具有與活病毒類似的抗原性和免疫原性。疫苗所刺激的血清中和抗體對於防止病毒感染的保護作用非常重要。VLPs的基本特徵包括類似於天然的病毒且因此保留有構形依賴(conformation-dependent)性的中和抗原決定位(epitope)。
NV VLPs與RV VP6蛋白有許多引人注意的特徵與主要特性，因此有希望作為候選疫苗。由於其重複且多價的結構，VLPs極具有免疫原性。在VLPs的表面呈現高度組織化、密集、重複陣列的抗原，使得在非常低劑量下引起強大的抗體反應，然而，相同抗原若為單體，則通常不具有免疫原性。B細胞可有效地被這些重複結構(VLPs或rVP6三聚體組成六聚體且組裝為高層次的結構，如管狀)活化，導致B細胞表面受體的交聯結合。VLPs的顆粒特性，特別是約40 nm的尺寸，為抗原呈現細胞(APC)即樹突狀細胞(DC)巨噬或內噬的最佳微粒(Fifis T.,J Immunol,2004,173)。因此，VLPs與活病毒相似，不需其他細胞，可直接活化與成熟化DC。DC在先天免疫和適應性免疫反應中扮演重要角色，且參與長期記憶的IgG的產生，為活化初始T細胞的唯一APC。VLPs可在無細胞內複製的情況下有效地啟動CTL(Keller SA et al.,Intro,J Immunol,2010)。因此，VLPs可效地刺激細胞性免疫反應(CMI)與體液免疫反應。
如上所述，VP6為諾羅病毒最大量且具疫原性的亞群特異性抗原。VP6形成多聚體結構與增加免疫反應的能力，使其可作為諾羅病毒疫苗的傑出候選。VP6不會誘發針對輪狀病毒的中和抗體，但可藉由刺激促進交叉免疫反應之強大的T輔助(T-helper;Th)細胞反應以誘發異型交叉保護免疫反應(Burns JW et al.,1996 Science;Parez N et al.,2004,J Virol)。VP6-特異性CD4+ Th細胞可協助B細胞針對VP7及/或VP4分子上特異性的中和抗原決定位(Esquirel FR,Arch. Virol 2000,145,813)。此外，VP6-特異性CD4+ Th細胞顯示可藉由直接的細胞毒性機制或抗病毒細胞激素的產生防止小鼠諾羅病毒的感染。
輪狀病毒和諾羅病毒的嚴重感染與有效疫苗的不足，需要一非活諾羅病毒與輪狀病毒疫苗以預防幼童的腸胃炎。對於NV與RV的免疫反應非常複雜，且所產生的保護相關性仍未完全了解。綜上所述，因含有NV VLPs之VLPs與RV之VP6蛋白所產生的上述獨特性質，推測由此兩成分所組成的疫苗為對抗NV與RV感染的可行對策。
本發明驚人地發現，在疫苗中合併諾羅病毒及輪狀病毒抗原不會互相干擾，且可誘發對抗疫苗中各抗原的協同免疫反應。
因此，本發明提供一種疫苗組合物，包括至少一諾羅病毒VLP抗原以及至少一輪狀病毒VP6抗原。
在一些實施例中，此疫苗組合物更包括一種諾羅病毒抗原，其擇自於下列所組成之族群：抗原衣殼胜肽(antigenic capsid peptide)，以及抗原衣殼蛋白(antigenic capsid protein)。此抗原可源自於任何的諾羅病毒株，例如屬於GI與GII基因組(genogroups)及其任何的基因型(genotypes)。在一些實施例中，諾羅病毒抗原為GII-4 VLP，較佳為單價形式。在其他實施例中，諾羅病毒抗原包括一個以上的VLP型。
在一些實施例中，輪狀病毒VP6抗原擇自於下列所組成之族群：rVP6蛋白、雙層VP2/VP6 VLP以及含有VP6蛋白的VLPs。rVP6可為管狀(tubules)、球狀(spheres)或層狀(sheet)的多聚體型式(multimeric form)。
本發明更提供一種利用所述疫苗抑制腸胃炎的使用，特別是在幼童。此發明方面也包括一種抑制一所需個體腸胃炎的方法，特別是幼童，包括對此個體接種此述之本發明之疫苗組合物。
再者，本發明提供一種製備此述本發明之疫苗組合物的方法。此方法包括i)在單一宿主中共同表現至少一諾羅病毒與至少一輪狀病毒抗原，或ii)下列步驟a)生產、分離與純化至少一諾羅病毒抗原；b)生產、分離與純化至少一輪狀病毒抗原；以及c)混合此諾羅病毒與輪狀病毒抗原。較佳此抗原於重組的桿狀病毒(baculovirus)感染之昆蟲細胞宿主所產生。
其它本發明之對象、範疇及細節詳述於下列之圖示、實施方式及實施例。
本發明有關於組合疫苗製劑(combination vaccine formulations)，包括至少一諾羅病毒(NV)抗原與至少一輪狀病毒(RV)抗原。
像許多其它的組合疫苗一樣，諾羅病毒與輪狀病毒抗原並不會互相抑制免疫原性。在本發明疫苗中，個別抗原在組合中不會互相影響，因此，本發明之組合疫苗可引起對抗存在於疫苗中每個抗原的免疫性。適當地說，對抗此組合疫苗中的單一組成的免疫反應為對抗該單一組成個別被測量時的免疫反應的至少50%，較佳為100%或實質上為100%。此免疫反應可被例如抗體反應適當地測量，如實施例所示。本發明疫苗配方不僅在各抗原間沒有負面的干擾，而且具有協同效果。
適合使用於本發明的諾羅病毒抗原包括，但不限於，抗原性衣殼蛋白(antigenic capsid protein)、胜肽、單體、雙體、VLPs或上述任何之組合。諾羅病毒抗原可源自於GI或GII基因組的諾羅病毒，及具有一所需的基因型。在一些實施例中，諾羅病毒抗原擇自於下列所組成之族群：GII-4、GII-12與GI-3 VLPs。由於GII-4基因型為全世界導致急性諾羅病毒胃腸炎的主因，因此本發明所使用的諾羅病毒較佳為GII-4 VLPs。VLPs較佳為單價。
輪狀病毒VP6為一亞群特異性抗原(subgroup-specific antigen)，為最多及誘導交叉反應的抗-輪狀病毒反應之具免疫原性的輪狀病毒蛋白。以本發明疫苗免疫的小鼠之輪狀病毒特異性血清抗體為對不同亞群1與2的人類、牛、猴之輪狀病毒株具有交叉反應，如多數人類所感染輪狀病毒血清型(第12圖)。
輪狀病毒VP6、多聚體型式或任何型式的重組VP6(rVP6)、或任何包含VP6的輪狀病毒VLP皆可作為本發明疫苗配方的輪狀病毒抗原。在重組的桿狀病毒(baculovirus)中共同表現VP2與VP6可形成雙層類病毒顆粒(d1 VP2/VP6 VLPs)。在本發明疫苗製劑中也包含此VLPs為本發明疫苗配方之適當的輪狀病毒抗原。輪狀病毒抗原可源自於任何的輪狀病毒株，但較佳源自於人類輪狀病毒。
上述諾羅病毒與輪狀病毒可以任何適當的組合使用於本發明疫苗配方。在一些實施例中，疫苗配方包括單價GII-4諾羅病毒VLPs與輪狀病毒rVP6蛋白，較佳為多聚體型式。在其它實施例中，疫苗配方包括單價GII-4諾羅病毒VLPs與輪狀病毒雙層VP2/VP6 VLPs。
諾羅病毒與輪狀病毒抗原可分離及純化自天然的來源。在其他實施例中，此抗原可在適當的表現系統中以重組技術產生，包括，但不限於，酵母菌(如S. cerevisiae 、S. pombe 或Pichia pastori )、細菌(如E. coli )、昆蟲細胞(如Sf9細胞)與哺乳動物細胞(如CHO細胞)。對於每個表現系統的適當表現載體為本技術領域人士所公知。
本發明疫苗可包括單一諾羅病毒與輪狀病毒疫苗以任何比例的組合，較佳為相同含量(1:1)。組合疫苗可以至少二種方式製備。第一種方法為，諾羅病毒與輪狀病毒疫苗分別被製成重組蛋白(VLPs、單體、雙體、三聚體、管狀、球狀、層狀或上述任何的組合)，且在體外(in vitro )以特定比例混合以獲得一液體配方，稱為“雞尾酒(cocktail)”疫苗。第二種方法為，藉由共感染具有適當的表現系統(例如，表現諾羅病毒衣殼基因與輪狀病毒VP6基因的重組桿狀病毒)之適當宿主(例如Sf9昆蟲細胞)，以獲得諾羅病毒衣殼(capsid)與輪狀病毒VP6的嵌合蛋白(chimeric protein)。此疫苗配方在本發明中稱為“嵌合”疫苗(chimeric vaccine)。
除了特定類型(同型)的免疫反應外，諾羅病毒與輪狀病毒之病毒是否引發交叉反應(異型)免疫反應為重要的課題。這些病毒具有許多不同的基因型/血清型及病毒株。理想的疫苗誘導對疫苗中存在之病毒的各種同源及異源病毒株的反應。在一些實施例中，GI-3(屬於諾羅病毒基因組I)與GII-12(屬於諾羅病毒基因組II)VLPs確認為疫苗配方中GII-4 VLPs的異源性抗原。經GII-4特異性單一或組合疫苗免疫之小鼠，產生對兩類異源性抗原反應的抗體，橫跨不同的基因組。相較於輪狀病毒VP6單一疫苗，以組合疫苗免疫的小鼠的血清對GI-3的交叉免疫反應增加約50%，顯示輪狀病毒VP6蛋白在疫苗製劑中的佐劑效果(adjuvant effect)。換句話說，本發明組合疫苗之抗原成分提供協同效果(synergistic effect)。在此實施例中，證實RV VP6蛋白具有作為佐劑的能力，可使疫苗抗原誘發的免疫反應變廣，及增加血清的封阻活性(blocking activity)。
除了交叉反應，本發明組合疫苗配方誘導強烈、系統性、長期(記憶)、及封阻IgG抗體反應以及以任何免疫途徑(較佳為ID與IM途徑)誘導的專一性對諾羅病毒與輪狀病毒之細胞免疫(cell-mediated immunity)。這些反應有別於在感染後所引發之短期與特異性的自然反應。因此，對於較長的保護時間，系統性的免疫反應較局部的黏膜型免疫反應(mucosal response)可能更必要。
血清IgG抗體轉移至腸腔可能是提供保護防止腸道感染的重要機制。可預期的是，由腸道外(ID/IM)投予上述之一疫苗所引發的系統性免疫反應愈高，則轉移的抗體濃度愈高，保護愈佳。
而且，本發明疫苗配方包括混合的平衡型(mixed balanced type)免疫反應，稱為第1型及第2型T輔助細胞(Th)反應。此兩種免疫反應可能媒介防止諾羅病毒及/或輪狀病毒感染的保護。
再者，本發明疫苗配方為高親和力抗體的有效誘發物，如實施例所證實。與疫苗保護效果有顯著相關顯示高親和力抗體。
再者，本發明顯示可使用此述疫苗配方可達到各基因組間的交叉保護。以諾羅病毒的特定病毒株/基因型VLPs免疫，如說明書中所述之GII-4 VLP(亦稱為單價疫苗)，不僅可誘導對抗未存在於此疫苗製劑(此處使用GI-3與GII-12)中的其他基因型的交叉反應或異源性免疫反應，也可阻斷異源性病毒結合與中和病毒，如本文所述。
除了引發免疫刺激的活性成分，即諾羅病毒與輪狀病毒抗原之外，本發明配方可包括無菌、無毒的藥學上可接受之生理載體。在一些實施例中，疫苗配方可包括防腐劑，例如酚、2-苯氧乙醇或硫柳汞(thimerosal)，以抑制細菌或真菌汙染，及/或穩定劑，例如蔗糖、乳糖、胺基酸或明膠，以穩定疫苗對抗不佳環境並防止免疫原吸附於安瓶管壁。
在一些實施例中，本發明疫苗配方可包括有效量的一種或以上的佐劑。佐劑物質的主要特徵通常為擴大由疫苗抗原所誘發的免疫反應。本發明所述之“有效量之佐劑”包括可刺激對抗投予的抗原之免疫反應的佐劑量，例如，增加投予抗原組合物的免疫反應的量，例如本發明實施例所述的測量血清中交叉反應與阻斷抗體活性。適當的有效增加包括，相較於不含佐劑的相同抗原組合物而言，為大於5%，較佳大於25%，且特別大於50%。適用於疫苗配方的佐劑為此技術領域之人士所公知。
本發明疫苗配方可以多種型式提供，包括，但不限於，水溶液及乾粉(冷凍乾燥配方)。例如，水溶液可為適於注射、經鼻(如，噴霧或滴鼻)及口服給予的型式。
疫苗配方可以各種途徑給予，為本技術領域人士所了解。本發明之疫苗配方較佳可經由非經腸的注射投予，包括，但不限於，肌肉(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射。
各種給予療程(regime)皆可應用於本發明之疫苗配方。由於急性重症輪狀病毒胃腸炎和諾羅病毒腸胃炎在6個月齡至3歲齡之間具有類似的發病高峰期，因此合併諾羅病毒與輪狀病毒疫苗可以下列的兩個非限制方式針對於此年齡層的兒童來使用：
a)將可注射的諾羅病毒+輪狀病毒疫苗作為嬰幼兒常規接種計劃的一部分。對於嬰兒相信以2劑的疫苗已經足夠，也可後續補強注射1劑。在芬蘭，一般的接種計劃為第3、5及12個月齡。本發明之諾羅病毒+輪狀病毒疫苗可符合此接種時程。當其他國家有不同的接種時程時，此疫苗可輕易地採取不同的計劃，可為第2、4與12個月齡，第4、6與12個月齡等；
b)對於12至15個月齡的幼兒，將可注射的諾羅病毒+輪狀病毒疫苗作為輪狀病毒的1次補強接種(booster vaccination)及諾羅病毒的初次接種(primary vaccination)。可給予二種劑量。此選擇可在2至6個月齡的幼兒使用口服活輪狀病毒作為對抗輪狀病毒的初次免疫時使用。已知抗輪狀病毒的免疫力在第2及第3年會減弱，在許多情況下較佳可進行補強接種。然而，由於較大年紀(即正常補強接種的時間)有更高腸套疊的風險，因此口服活疫苗不可作為補強接種。
可注射的諾羅病毒+輪狀病毒疫苗在第12至15個月齡間給予兩劑可視為輪狀病毒的補強接種及諾羅病毒的初次接種。雖然小於12個月齡的幼兒發生諾羅病毒腸胃炎的比例(小)，大部分案例發生於此年紀之後，此疫苗仍具有潛力抑制多數發生於幼兒的諾羅病毒腸胃炎。
本發明疫苗可用於抑制或減少諾羅病毒與輪狀病毒的感染、諾羅病毒與輪狀病毒引起的腹瀉與嘔吐疾病以及腸胃炎，及藉由接種所需個體藥學上有效量的本發明疫苗配方以誘發該個體內抗諾羅病毒與輪狀病毒的免疫反應。疫苗的“藥學上有效量”為可引發保護接種疫苗者對抗諾羅病毒與輪狀病毒的免疫反應的量。
【實施例】
本技術領域人士自可輕易將發明構思以各種方式執行。本發明及其實施例並不限於下述實施例，但可在申請專利範圍內進行修改。
實施例1.　諾羅病毒VLPs的生產與純化 諾羅病毒GII-4衣殼基因的分離與選殖
諾羅病毒GII-4已於1999年在芬蘭由病人糞便中分離出來。利用QiaAmp RNA病毒mini套組(Qiagen，德國)萃取出糞便中的RNA。利用反轉錄聚合酵素鏈鎖反應(RT-PCR)以下列引子：JV24正向(5′-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3′；序列識別號1)(Buesaet al. ,2002)與逆向(5′-TTATAATGCACGTCTACGCCC-3′；序列識別號2)複製含有完整諾羅病毒VP1衣殼基因(1620 bp)的DNA片段。以ABI PRISMTM 310基因分析儀(Applied Biosystems，USA)進行定序以獲得VP1衣殼序列的全長DNA序列。根據EMBL/GenBank和European Food-borne Virus(FBVE)，諾羅病毒株被分類為遺傳集群(GenBank序列資料庫登錄號AF080551)。利用PTC-200 DNA Engine(MJ Research)以下列引子：GII-4-fwd(5’CACAGGATCCATGAAGATGGCGTCGAATGAC-3′；序列識別號3)與GII-4-rev(5’CTCTGAATTCTTATAATGCACGTCTACGCCCCGCTCCA-3′；序列識別號4)擴增完整的VP1衣殼基因。將擴增的片段選殖(cloned)至pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，USA)並次選殖(subcloned)至桿狀病毒pFastBac1轉殖載體(Invitrogen)。在轉形至TOP10E. coli 化學性勝任細胞後，利用ABI PRISMTM 310基因分析儀(Applied Biosystems)進行定序以確認VP1。
諾羅病毒GII-12與GI-3衣殼基因的分離與選殖
糞便樣本為採集自芬蘭遭諾羅病毒感染的病人。如上述萃取RNAs(Qiagen)。諾羅病毒GII-12 VP1衣殼基因及GI-3 VP1衣殼基因利用下列引子以RT-PCR進行擴增：GII-12-fwd(5’-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3’：序列識別號5)，GII-12 rev(5’TTACTGTACTCTTCTGCGCCC-3’；序列識別號6)，GI-3 fwd(5’-GTAAATGATGATGGCGTCTAA-3’；序列識別號7)，GI-3 rev(5’-TGGGCCATTATGATCTCCTAAT-3’；序列識別號8)。
定序此擴增子(applicons)(1.6 Kb)，並根據EMBL/GenBank和FBVE分類病毒株(GenBank序列資料庫登錄號GII-12 AJ277618與GI-3 AF414403)。將諾羅病毒VP1衣殼基因(GII-12及GI-3)密碼子優化(codon-optimized)。將GII-12選殖至pFastBacDual轉殖載體(Invitrogen)中，且將GI-3選殖至pFastBac1轉殖載體(Invitrogen)中。
諾羅病毒衣殼重組桿狀病毒(BV)的量產
為了產生重組的bacmid，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統(Invitrogen)根據使用說明書，將pFastBac構築體轉形至DH10BacTM的E. coli 勝任細胞中。使用PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep套組(Invitrogen)自隔夜培養的2 ml LB中純化bacmid DNA。利用PCR分析重組bacmid DNA以確認此基因存在於該bacmid中。使用順向與反向引子(Invitrogen)分析pUC/M13。利用Bac-to-Bac表現系統(Invitrogen)，於經上述重組桿狀病毒感染之Spodoptera frugiperda (Sf9)昆蟲細胞中產生VLPs。更詳細的說，將1×106 cells/ml無血清培養基(Sf 900 SFM III；Invitrogen)的Sf9細胞接種於Multidish 6孔盤(Nunc，Thermo Fisher，Denmark)中，並使用Cellfectin試劑(Invitrogen)使bacmid DNA(1μg)轉染。此細胞在26℃下生長並在轉染後72小時收集細胞。此細胞懸浮液以500×g離心5分鐘，並將上清液(P1桿狀病毒)稀釋及儲存於4℃下。以該桿狀病毒P1感染Sf9細胞，在感染後6天(dpi)，將細胞懸浮液以500×g離心5分鐘，並將稀釋的上清液(P2桿狀病毒)儲存於4℃下。以多重性感染(MOI)表現的P2桿狀病毒的力價(溶菌斑形成單位；pfu)，可利用BacPak Rapid力價套組(Clontech laboratories，USA)確認。
重組(r)諾羅病毒衣殼的表現與VLP的生產及純化
關於諾羅病毒VLPs的生產，取200 ml密度1 x 106 cells/ml的Sf9細胞培養液，以MOI為1使P2感染。在第6天，於4℃下以3000×g離心30分鐘以獲得被感染的細胞。於4℃下利用100,000×g超高速離心(L8-60M ultracentrifuge，Beckman SW-32.1 Ti rotor) 2小時以濃縮上清液中的VLPs，將離心顆粒(pellet)重新懸浮於3 ml的0.2 M Tris-HCl(pH 7.3)中。將VLPs加入10%至60%不連續的蔗糖梯度，於4℃下以100,000×g超高速離心1小時。以底部穿刺(bottom puncture)收集各分層(fraction)。收集約25個分層，每一分層以SDS-PAGE分析衣殼蛋白的表現。第1個蔗糖梯度分層的分析顯示，衣殼蛋白的明顯波峰移至35%蔗糖，並收集這些分層。再者，從另一額外額外的不連續蔗糖梯度(35%至60%)中純化出GII-4VLPs。收集並混合含有VLPs的分層。經過磷酸鹽緩衝液(PBS)整晚透析移除蔗糖。以超高速離心濃縮VLPs。簡單的說，根據使用說明，使用Amicon Ultra 30 kDa離心過濾裝置(Millipore Corporation，Germany)將上述透析產物濃縮至15 ml。將VLPs儲存於4℃的PBS中。利用BCA蛋白質分析(Thermo Scientific，USA)檢測總蛋白濃度。以12% SDS-PAGE以及密度分析與EM確認純度和完整性。
實施例2.　輪狀病毒抗原 A.　輪狀病毒rVP6的生產與純化 輪狀病毒VP6的分離與選殖
為獲得VP6基因片段的完整核苷酸序列，以QIAamp RNA viral mini套組(Qiagen)根據操作說明分離源自於G1[P8] RT-PCR陽性急性腸胃炎患者的10%糞便懸浮液的RNA。分離的dsRNA進行RT-PCR反應，使用VP6專一的引子對(Matthijnssens et al.,2006)，產生1362 bp的擴增子。此擴增子使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen)純化，並利用ABI PRISMTM 310基因分析儀(Applied Biosystems)進行定序。使VP6擴增子序列密碼子優化並選殖至pFastBac1載體(Invitrogen)中。
輪狀病毒VP6重組桿狀病毒(BV)的產生
此生產實質上與上述諾羅病毒相同。
輪狀病毒rVP6的產生與純化
對於重組VP6的產生，將含有VP6基因之重組桿狀病毒在5 pfu/cell的MOI下感染200ml的Sf9昆蟲細胞，細胞濃度為1×106 cell/ml。在6 dpi時收取培養上清液，並在+4℃下以1000 rpm離心20分鐘。於+4℃下以100,000×g超高速離心1.5小時以濃縮重組蛋白，所得的顆粒(pellet)重新懸浮於0.2 M的Tris-HCl(pH 7.3)，並於+4℃下在連續蔗糖梯度(10%至60%)中以100,000×g離心16小時進行純化。也可進行額外的蔗糖梯度純化。合併含有VP6蛋白的蔗糖分層(fraction)，以PBS透析隔夜，使用Amicon Ultra-50離心膜(Millipore Corporation)過濾。蛋白質於PBS儲存於4℃。使用BCA蛋白質分析定量總蛋白濃度。利用12% SDS-PAGE以及密度分析與EM確認純度和完整性。
B.　雙層(d1)輪狀病毒VP2/VP6 VLPs的生產與純化輪狀病毒VP2的分離與選殖
為了獲得VP2基因片段的完整核苷酸序列，如產生與純化輪狀病毒rVP6中所述的QIAamp RNA viral mini套組(Qiagen)萃取相同的G1[P8] RT-PCR陽性之急性腸胃炎患者的RNA。使用VP2特異性引子對(Matthijnssens et al.,2006)進行RT-PCR反應以產生2662 bp的擴增子。利用與VP6類似的方法純化並定序此擴增子。使VP2擴增子序列密碼子優化並選殖至pFastBacDual載體(Invitrogen)中。
輪狀病毒VP2重組桿狀病毒(BV)的產生
此產生實質上與上述諾羅病毒相同。
輪狀病毒d1 VP2/VP6 VLPs的產生與純化
為了產生輪狀病毒雙層(d1) VP2/VP6 VLPs，Sf-9昆蟲細胞在相同的MOI/cell下共感染含有VP2與VP6基因的重組BVs，細胞濃度為1×106 cell/ml。在7 dpi時收集培養上清液，並在+4℃下以1000 rpm離心20分鐘。與重組諾羅病毒VLPs的方法類似，在連續蔗糖梯度中濃縮並純化重組VP2/6-VLPs。合併含有VP2與VP6的蔗糖分層，以PBS透析過夜，並以Amicon Ultra-100離心單元(Millipore Corporation)過濾。VLPs於PBS儲存於4℃。使用BCA蛋白質分析(Thermo Scientific)檢測總蛋白濃度。利用12% SDS-PAGE以及EM確認VP2/6的純度和完整性。VP2/VP6樣本中的VP6部分以密度分析定量。
實施例3.　嵌合蛋白(GII-4衣殼+VP6)的產生與純化
以MOI為5的諾羅病毒GII-4 rBV與MOI為5的輪狀病毒VP6 rBV共感染Sf9昆蟲細胞，製備嵌合蛋白。共感染的昆蟲細胞上清液在6 dpi時收集。在4℃下以3000 x g離心30分鐘以獲得細胞培養液，在4℃下以100000 x g高速離心上清液2小時。所得的顆粒(pellet)重新懸浮於0.2 M Tris-HCl(pH 7.3)，在4℃下於連續蔗糖梯度(10%至60%)中以100000 x g離心3小時以共同純化(co-purified)該嵌合蛋白。以底部穿刺(bottom puncture)收集含有重組蛋白(分別為NV衣殼與RV VP6)的分層，並以SDS-PAGE分析。合併含有該嵌合蛋白的40%蔗糖分層，以PBS透析移除蔗糖。利用Amicon Ultra 30 kDa離心過濾裝置濃縮透析產物。將產物儲存於4℃的PBS中。利用BCA蛋白質分析(Thermo Scientific，USA)檢測總蛋白濃度。利用12% SDS-PAGE以及密度分析與EM確認每一蛋白的純度和完整性。
實施例4.　諾羅病毒與輪狀病毒VLPs的特徵 SDS-PAGE與密度定量
將樣本利用含有12%丙烯醯胺之分離膠體與5%丙烯醯胺之焦集膠體(Biorad Laboratories，USA)的聚丙烯醯胺膠體進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)。將樣本在含有2%的SDS、5%的β-巰基乙醇、62. mM的Tris-HCl(pH 6.8)、25%的甘油與0.01%的溴酚藍(Biorad)之Laemmli樣品緩衝液中沸騰5分鐘。以PageBlueTM 蛋白染色溶液(Fermentas，Lithuania)染膠。
根據操作說明，以FC軟體(Alpha Innotech,USA)對SDS-PAGE膠中的蛋白質進行定量。
第1A圖顯示經藍染之膠體，並以箭頭標示出預期的分子量之特定蛋白。在相同的蔗糖梯度分層中可檢測出GII-4衣殼與輪狀病毒VP6的嵌合蛋白。第1A圖顯示SDS-PAGE中純化的蛋白質。
電子顯微鏡(EM)
以3%醋酸鈾醯(UA)(pH 4.6)陰染樣本。將3 μl的蛋白質樣本置於碳塗佈之格子中30秒。將格子乾燥並將3 μl的UA置於格子中30秒。移除液體並利用FEI Tecnai F12電子顯微鏡(Philips Electron Optics，Holland)以120 kV進行檢測。
於EM(第1B圖)下分析每個蛋白的形態，且證實GII-4 VLPs、管狀rVP6(rVP6 tubules)與d1 VP2/VP6 VLPs的高層次結構。雖顯示為管狀rVP6，但可聚合任何形式的rVP6蛋白，包括，但不限於，三聚體與高層次的多聚體結構，包括球狀與層狀。在雞尾酒疫苗中，以1:1混合之GII-4 VLPs與rVP6不會減弱其它蛋白的完整性或在雞尾酒疫苗中任何部分的形態。雞尾酒疫苗與嵌合疫苗具有類似的形態特徵，確認管狀rVP6填充有GII-4 VLPs。也可形成NV衣殼與RV VP6的其它結構。
實施例5.　小鼠免疫
以不同疫苗經皮內(ID)或肌肉(IM)免疫7至9週齡BALB/c母鼠(4至5隻小鼠/組)2次，在第0及第3週。在一些例子中，小鼠僅接受1次免疫。免疫所使用的疫苗包括：GII-4 VLPs、rVP6蛋白、d1 VP2/VP6 VLPs、雞尾酒(GII-4 VLPs與rVP6的混合)、嵌合疫苗、與雞尾酒VLP(GII-4 VLPs與d1 VP2/VP6 VLPs的混合)。疫苗劑量為：50 μg、10 μg、1 μg與0.1 μg。在大部分的例子中，以10 μg之單一疫苗配方或20 μg之組合疫苗(雞尾酒或嵌合)免疫小鼠。雞尾酒疫苗中包含10 μg之各個單一疫苗組成。例如，為獲得雞尾酒疫苗，於體外(in vitro )混合10 μg之GII-4 VLPs於PBS與10 μg之rVP6於PBS，並儲存於+4℃。在第0(預採血，非免疫血清)、2、3與4週收集血液(血清)與糞便樣本。在最終免疫後2週犧牲小鼠，並收集糞便、全血、與淋巴組織。以未接受疫苗製劑的小鼠作為對照組。
實施例6.　以疫苗誘導免疫反應的劑量反應、動力學及期間
於第0及21天以IM與ID對各組小鼠(5隻小鼠/組)免疫10、1或0.1 μg的GII-4 VLPs。在第0、2、3與4週收集血清，且在第5週犧牲小鼠。以1：200稀釋血清後分析NV-特異性IgG。以10與1 μg劑量誘發類似程度的反應，但觀察到以0.1 μg劑量的反應較弱(第2圖)。而且，上述各組小鼠合併之血清的終點力價(end point titer)類似。對照組小鼠對NV沒有反應。第4圖顯示於各週所收集的血清免疫反應的動力特性。免疫時間點以箭頭標示。結果顯示1個劑量的免疫誘發非常有效的免疫反應，特別是，10 μg與1 μg的劑量。50 μg的劑量誘發的反應類似10 μg劑量，確定反應高原期在10 μg劑量。整體而言，雖然此結果表示10與1 μg劑量為理想者，但也可使用疫苗配方的其它劑量。而且，10 μg劑量誘導的長期持久的免疫反應，在25週前不會衰減(第5圖)。
實施例7.　糞便分析
IgG由血清轉移至腸道與腸道病原菌如NV與RV的保護有關。腸道中的IgG媒介對抗RV感染的保護或減緩疾病的功能已見於兒童的被動免疫治療。
為測試單一或組合疫苗配方的IgG轉移效果，將新鮮小鼠糞便懸浮於含有100mM NaCl、1 mM CaCl2 、0.05% Tween、1%抑肽酶(aprotinin)與10 μM leupeptine(皆購自Sigma-Aldrich)的10 mM Tris緩衝液中以回復10%的糞便懸浮液，使其振盪均勻。將均勻懸浮液置於冰上20分鐘，且於+4℃以18 000 X g離心15分鐘。萃取此上清液並儲存於-80°。
以血清抗體ELISA分析糞便樣本中諾羅病毒GII-4與輪狀病毒VP6的特異性IgG。在塗佈與封阻後，將糞便樣本(10%糞便懸浮液)以2倍系列稀釋1：2至1：32，並添加至微孔盤中。將山羊抗-小鼠IgG-HRP(Sigma-Aldrich)稀釋1：3000，並以上述方法完成微孔盤並偵測吸光值。
第8圖顯示經免疫小鼠的糞便具有很高的NV-特異性IgG，但在對照組小鼠中則偵測不到。
實施例8.　血清分析
各組小鼠利用上述方法以單一疫苗配方或組合疫苗進行免疫。經免疫小鼠血清中偵測到IgG亞型IgG1與IgG2a，可被確認因疫苗配方所誘發的免疫反應型。T輔助細胞(Th)1與Th2兩者之間的關係已被證實：IgG1屬於Th2型反應，IgG2a為Th1型反應。Th1型為促進細胞性免疫，Th2型為促進體液性免疫。
諾羅病毒血清IgG與IgG亞型ELISA
利用酵素連結免疫吸附法(ELISA)分析經免疫與對照組小鼠中血清的IgG、IgG1與IgG2a。將諾羅病毒GII-4、GII-12、與GI-3 VLPs塗佈(4℃，隔夜)於96孔盤(Nunc Immuno Maxisorp，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)於10 mM PBS中，濃度分別為0.2 μg/ml、0.4 μg/ml與1 μg/ml(100 μl/well)。在以含有0.05% Tween 20的PBS(PBS-T)清洗3次後，以含有5%脫脂牛奶的PBS(Sigma-Aldrich)於室溫(RT)下封阻1小時。接著，以PBS-T清洗微孔盤3次，並與100 μl之1:200稀釋或2倍系列稀釋於含有1%脫脂牛奶PBS-T的血清於37℃下反應1小時。分析多個微孔中的所有血清樣本。在清洗6次後，將1：4000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)共軛抗-小鼠IgG(Sigma-Aldrich)加至微孔中。
以1：6000稀釋於含1%牛奶之PBS-T的山羊抗-小鼠IgG或IgG2a HRP共軛物(Invitrogen，Carlsbad，California)偵測抗-GII-4 IgG亞型反應。在反應(1小時，37℃)後，清洗微孔盤並加入鄰苯二胺鹽酸鹽(SIGMAFAST OPD，Sigma-Aldrich)使其濃度為0.4 mg/ml。將微孔盤於室溫下避光反應30分鐘，並以2 M硫酸(H2 SO4 )終止反應。以微量盤分析儀(Victor2 1420，Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)讀取490 nm的吸光值(光密度，OD)。將正對照組血清與來自於負對照組小鼠之負對照組血清加至微孔盤中作為對照組。將微孔盤所有的OD值減去空白微孔(不含血清)的背景值。若吸光值大於上述閥值則視為陽性反應，計算方式為：OD(負對照小鼠)平均值+3 x SD與至少0.100 OD值。
輪狀病毒血清IgG與IgG亞型ELISA
使用VP6蛋白塗佈於96孔盤中的碳酸氫鈣/碳酸鈣緩衝液(0.1 mM Na2CO3，0.8 mM NaHCO3 ，pH 9.55)中，濃度為1μg/ml(100 μl/孔)。在上述步驟後，進行與用於諾羅病毒ELISA類似的ELISA方法。為偵測交叉反應之輪狀-特異性血清抗體，以碳酸氫鈣/碳酸鈣緩衝液1：200稀釋之多株兔子抗-輪狀病毒(人類)(DAKO)塗佈於微孔盤上(+4℃隔夜)100 μl/孔。在以PBS-T清洗4次後，微孔盤塗佈100 μl/孔以上述方法製備的輪狀病毒抗原(4℃隔夜)。在以PBS-T清洗4次後，以含有5%脫脂牛奶的PBS於37℃下封阻1小時。在此步驟後，進行與用於諾羅病毒ELISA類似的ELISA方法。
血清IgG量(magnitude)與亞型
第6與7圖顯示諾羅病毒與輪狀病毒特異性血清IgG力價。除了對照組小鼠，每組經免疫小鼠的終點力價很高(交叉力價>4至5 log10)。此結果顯示組合疫苗中的成分不會對特異性免疫反應產生互相抑制或阻礙。
第9與10圖顯示本發明所有的疫苗製劑促進混合之平衡型免疫反應，又稱Th1型與Th2型。此為重要的發現，兩型式的免疫反應可達到防止NV及/或RV感染的保護。Th細胞可幫助B細胞(藉由細胞對細胞的接觸或可溶性細胞激素)，特別是分化為記憶B細胞，此為一般疫苗所刺激之長期記憶反應所必需。RV VP6-特異性Th細胞可促進針對鼠科輪狀病毒感染的保護，且促使B細胞特異性中和RV異源VP4或VP7之抗原決定位(Esquivel FR,Arch. Virology 2000;Peralta et al.,Virology Journal,2009)。因此，Th細胞對於異源性免疫反應的促進極為重要。
實施例9.　免疫反應的親和力(avidity)
抗體親和力為功能性抗體成熟或親和力成熟的一測量方法。高親和力抗體與疫苗的保護效應有顯著相關(Makidon et al.,2008)。如上所述(Nurminen et al.,2010)，血清中含有高親和力NV-特異性IgG抗體之年齡較大的兒童比起含有低親和力之小於2歲的兒童較不易感染NV。
為偵測NV與RV抗體的親和力，使用尿素沖湜以移除低親和力抗體[Kanno and Kazuyama,2002]。除了額外的尿素處理步驟外，如上述內容進行ELISA分析。在塗佈於微孔盤之抗原(諾羅病毒GII-4 VLP或輪狀病毒VP6蛋白)與血清反應後，將血清由微孔盤中吸出並加入含8 M尿素(Sigma-Aldrich)的PBS-T。在處理5分鐘後，重覆進行處理。微孔盤在加入HRP-共軛抗-小鼠IgG前清洗4次，並如上所述完成微孔盤的處理。親和力指數的計算為[含尿素之OD/不含尿素之OD] x 100%，指數>50%表示高親和力。
單一疫苗或組合疫苗的免疫性可刺激高親和力之NV-與RV-特異性IgG抗體(親和力指數分別>50%)。此結果顯示本發明疫苗製劑為具保護效果之高親和力抗體的強促進劑(第11圖)。
實 施例10.　交叉免疫反應
將不同血清型之輪狀病毒(G1P8、G2P6、G4P6、G8P10、G12P4、BRV與RRV)以恒河猴胎腎(MA104)細胞(MA104)培養，且作為交叉免疫反應研究中ELISA的抗原。
如實施例8所述，分析經免疫或對照組小鼠的血清以用作ELISA中諾羅病毒及輪狀病毒的抗體。諾羅病毒GII-4-刺激之血清抗體可對異源性GI-3與GII-12抗原(第12圖，上圖)產生交叉反應。而且，經疫苗製劑免疫小鼠之輪狀病毒-特異性抗體可對不同人、牛和猴輪狀病毒株的亞群(subgroup)1與2產生交叉反應(第12圖，下圖)。
另人驚訝的是，相較於輪狀病毒VP6單一疫苗，輪狀病毒VP6抗原可對經組合疫苗免疫之小鼠血清中的GI-3增加約50%的交叉免疫反應(第12圖，上圖)。此結果顯示本發明組合疫苗的抗原成分提供協同效果。
實施例11.　封阻試驗
以封阻試驗代替NV的中和試驗。NV不可生長於in vitro 的細胞培養，因此不可進行以抗體阻止病毒結合或感染至寄主性細胞(permissive cells)的傳統中和試驗。人類組織血型抗原(HBGA)已知可作為黏膜表面(如，腸)細胞中表現NV的受體。例如，碳水化合物的H型3(carbohydrate H type 3)已知為NV GII-4的載體，因此將GII-4 VLPs結合至上述碳水化合物(L Huhti et al.,2010)。NV VLPs與受體的結合預期可被抗體的中和特性所阻斷。在急性腸胃炎的水媒流行(waterborne outbreak)期間，GII-4 VLPs與H-型3的結合可被未經NV感染之兒童血清所阻斷(K Nurminen et al.,2010)。防止NV的保護與血清強大的阻斷能力有關。因此，在考慮不同的疫苗時，抗體的阻斷能力可作為NV保護的替代標誌。用於阻斷NV VLPs與HBGA H-型3結合的分析可利用經免疫及對照組小鼠的血清進行。將微孔盤塗佈溶於PBS(pH 7.2)之GII-4或GI-3 VLPs，濃度為2 μg/ml，且於室溫下反應4小時。在清洗後，將微孔盤於4℃下置於含5%牛奶的PBS中隔夜。將由1:200至1:6400系列稀釋的血清添加至微孔中，並將微孔盤於37℃下反應1小時。在移除血清後，添加100 μl溶於含1%牛奶之PBS-T中之生物素化之H-型-3或Lewis B(Leub )(Lectinity Holdings,Inc.,Moscow，***)作為對照組，濃度為20 μg/ml或40 μg/ml。在37℃下4小時後，清洗微孔，且加入1：2000稀釋之鏈黴菌-共軛HRP(Thermo Fisher Scientific Inc.)於37℃下反應1小時。呈色反應與偵測波長490 nm吸光值的進行如上所述。未經與血清反應之微孔的吸光值可視為H-型3與GII-4 VLP結合的最大吸光值。阻斷指數以下列方法計算：100%-(OD[含血清]/OD[不含血清] x 100%)。可偵測到VLPs不會與負對照組Leub HBGA結合。將所有由樣本所測得的OD值減去空白微孔(blank well(微孔中不含HBGA))之背景值。
第13 A與13B圖顯示GII-4與GI-3與其受體H型3的結合分別被阻斷。相較於組合疫苗，單一疫苗免疫必須增加2倍的力價才可最大限度地阻斷GII-4 VLPs與經單一疫苗免疫小鼠之H型3的結合(第13C圖)。此結果顯示組合疫苗中的VP6蛋白不會抑制或阻礙GII-4特異性血清的封阻能力。相反地，經組合疫苗製劑免疫小鼠血清之顯著地阻斷能力顯示出rVP6蛋白的佐劑功效，此類似於先前實驗的偵測結果。而且，我們的數據顯示各基因組間的交叉保護很容易在使用疫苗製劑之實驗中被偵測到。此發現在諾羅病毒疫苗研究領域中非常獨特。此結果也顯示單一種病毒株/基因型(又稱單價疫苗)的免疫接種不僅會對其他非存在於疫苗製劑中之病毒株刺激產生交叉反應或異型免疫反應，也會阻斷異源性病毒的結合並中和此病毒。
實施例12.　抗體分泌細胞(ASC) ELISPOT
抗體分泌細胞(ASC)可分為血漿B細胞與記憶B細胞，其負責對抗病原菌的長期保護效果(記憶反應)以及在病原菌再次出現時可快速地反應，其為接種任何疫苗所誘發的記憶反應的特徵。以ELISPOT分析偵測經免疫小鼠臟脾中IgG抗體分泌血漿細胞與記憶細胞的頻率。
收集犧牲後小鼠的脾臟置於Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Sigma-Aldrich)中。用解剖刀將脾臟組織絞碎，並利用70 μm的細胞過濾器(Becton,Dickinson and Company，USA)分離成單細胞懸浮液。將懸浮液以300 x g離心10分鐘並重新懸浮於HBSS中。將紅血球以1：10稀釋的HBSS裂解(lysed)，之後，將懸浮液的莫耳數以2 x HBSS回復。將脾臟细胞懸浮液清洗3次，冷凍於結凍的培養基(含40% FBS與10% DMSO的RPMI，Sigma-Aldrich)中，並儲存於液態氣中備用。
將96-孔PVDF盤(Millipore)於+4℃下塗佈諾羅病毒GII-4 VLPs或輪狀病毒VP6蛋白隔夜，濃度為40 μg/ml，體積為100 μl/well。將脾臟细胞由液態氮中解凍，清洗，並懸浮於細胞培養基中(含有10% FBS，100 U/ml青黴素，100 μg/ml鏈黴素，50 μM 2-巰基乙醇與2mM L-麩醯胺的RPMI-1640)。在清洗並封阻微孔盤後，加入脾臟细胞，濃度為4×105 細胞/孔，且在+37℃下於5% CO2 的環境下培養隔夜。以PBS-T清洗微孔盤6次，並將1:1000稀釋的山羊-抗-小鼠IgG-HRP(Sigma-Aldrich)加至微孔中。於室溫反應3小時後，強烈地清洗微孔盤並以DAB介質(SigmaFAST DAB，Sigma-Aldrich)反應，並計數染色斑點。將實驗組微孔中的染色斑點減去負對照組動物之染色斑點。此數值表示GII-4 VLP或VP6特異性抗體-分泌細胞(ACS)，且以1×106 細胞常態化(normalized)。
在某些例子中，將細胞與GII-4 VLPs或rVP6於in vitro 培養4天，清洗，並進行培養，如記憶B細胞定量所述。計數由對無in vitro 刺激之細胞進行ELISPOT分析所獲得的染色斑點為具分泌活性的血漿細胞。培養4天所獲得之染色斑點在減去血漿細胞所得之染色斑點代表記憶B細胞活性。
第14圖顯示本發明疫苗製劑可促進產生NV與RV特異性IgG抗體的血漿B細胞。而且，大量分泌特異性IgG抗體之記憶B細胞被經單一疫苗或組合疫苗誘發具有相似的量，顯示此誘導反應屬於記憶型。
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以下，本發明發明較佳實施例以附圖更詳細描述。
第1A圖為PAGE藍染12% SDS-PAGE膠體的照片，證明表現諾羅病毒GII-4 VLPs(lane A)、輪狀病毒rVP6(lane B)、雙層VP2/VP6 VLPs(lane C)、雞尾酒疫苗(諾羅病毒GII VLPs+rVP6；lane D)、與嵌合疫苗(共感染諾羅病毒GII-4衣殼與輪狀病毒VP6；lane E)桿狀病毒的純度。不同的蛋白質以箭頭表示於膠體的右側。每個蛋白相對應的分子量(kDa)表示於膠體的左側。
第1B圖顯示重組蛋白聚合後的形態結構之電子顯微照片。此蛋白經純化且經3%醋酸鈾醯(uranyl acetate)染色後以電子顯微鏡觀察。偵測到諾羅病毒(NV)GII-4衣殼的VLP結構，以及觀察到VP6蛋白(B格)的輪狀病毒(RV)VP2/VP6(A格與C格)與管狀結構。在D格(雞尾酒疫苗配方)與E格(嵌合疫苗配方)中觀察到VP6的GII-4 VLPs與管狀結構。
第2圖顯示經GII-4 VLPs以不同劑量及途徑(肌肉內(IM)及皮內(ID))免疫BALB/c小鼠之諾羅病毒(NV)-特異性IgG反應的ELISA分析結果。
第3圖顯示經不同劑量GII-4 VLPs以ID途徑免疫後的NV-特異性IgG血清終點力價分析結果。
第4圖顯示以不同劑量GII-4 VLPs免疫之小鼠血清的NV-特異性免疫反應動力特性，以ELISA進行偵測。上圖顯示ID免疫的結果，下圖為IM免疫的結果。
第5圖顯示在以GII-4 VLPs經IM免疫後NV-特異性IgG反應的持續期間，以ELISA進行偵測。
第6圖顯示單獨以GII-4 VLPs或在雞尾酒配方或嵌合配方中合併rVP6藉由皮內(上圖)或肌肉內(下圖)免疫小鼠實驗組血清IgG終點力價分析的ELISA結果。
第7圖顯示單獨以rVP6或在雞尾酒或嵌合配方中合併GII-4 VLPs藉由皮內(上圖)或肌肉內(下圖)免疫小鼠的實驗組的血清IgG終點力價分析的ELISA結果。
第8圖顯示在單獨以GII-4 VLPs或在雞尾酒或嵌合配方中合併rVP6免疫小鼠後的NV-特異性糞便IgG終點力價分析的結果。
第9圖顯示單獨以GII-4VLPs、雞尾酒、或嵌合配方藉由ID(左圖)或IM(右圖)免疫之NV-特異性IgG1與IgG2a亞型抗體反應的終點力價。
第10圖顯示以rVP6、雞尾酒、或嵌合配方藉由ID(左圖)或IM(右圖)免疫小鼠之RV-特異性IgG1與IgG2a亞型抗體的終點力價分析。
第11圖顯示單獨免疫或雞尾酒、或嵌合配方免疫後GII-4(上圖)或rVP6(下圖)特異性IgG抗體的平均親和力(avidity)指數(%)。親和力指數50%代表高親和力。
第12圖之上圖顯示GII-4 VLP-誘導之IgG抗體對不同NV基因型(GII-12與GI-3)的交叉反應。下圖顯示rVP6誘導之抗體對不同人類(G1P8、G2P6、G4P6、G8P10、與G12P4)、牛(BRV)與恒河猴(RRV)輪狀病毒株的交叉反應，以ELISA進行偵測。
第13圖顯示NV GII-4特異性血清抗體阻斷同源GII-4 VLPs(A圖)或異源GI-3 VLPs(B圖)對人類組織血型抗原(HBGA) H型3(假定的NV GII-4受體)結合的能力。C圖顯示最大限度阻斷GII-4 VLPs對H型3結合所需要的血清終點力價。阻斷指數的計算如下：100%-(OD[含血清]/OD[不含血清]×100%)。
第14圖顯示經不同疫苗配方免疫之小鼠胰臟細胞的ELISPOT分析結果。上圖顯示收取細胞當天的GII-4 VLP-特異性IgG抗體分泌細胞(ASCs)，下圖顯示與GII-4 VLPs培養4天後的GII-4 VLP-特異性ASCs數目。上圖與下圖間ASCs數目的差異代表記憶B細胞的反應。

Claims (12)

  1. 一種疫苗組合物，包括至少一諾羅病毒VLP抗原與至少一輪狀病毒VP6抗原。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合物，更包括擇自於抗原衣殼胜肽及抗原衣殼蛋白所組成之族群的諾羅病毒抗原。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合物，其中該諾羅病毒抗原源自於GI與GII諾羅病毒及其基因型所組成之族群。
  4. 如申請專利範圍第1至3項任一項所述之疫苗組合物，其中該諾羅病毒抗原為GII-4 VLP。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之疫苗組合物，其中該GII-4 VLP為單價。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合物，其中該諾羅病毒抗原包括一種以上的VLP型。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合物，其中該輪狀病毒VP6抗原擇自於下列所組成之族群：rVP6蛋白、雙層VP2/VP6 VLP、包含VP6蛋白的VLPs、以及上述任合的組合。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之疫苗組合物，其中該rVP6為一種多聚體型式，其擇自於下列所組成之族群：管狀(tubules)、球狀(spheres)、層狀(sheet)、以及上述任合的組合。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合物，更包括 一無菌、無毒之藥學上可接受之生理載體。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組合物，用於抑制擇自於諾羅病毒與輪狀病毒的感染、病毒所引起的腹瀉和嘔吐的疾病、及腸胃炎所組成之族群的疾病。
  11. 一種生產申請專利範圍第1至8項任一項所述之疫苗組合物的方法，包括在單一宿主內共同表現至少一諾羅病毒VLP抗原與至少一輪狀病毒VP6抗原，或包括下列步驟：a)生產、分離及純化至少一諾羅病毒VLP抗原；b)生產、分離及純化至少一輪狀病毒VP6抗原；以及c)混合上述諾羅病毒抗原與輪狀病毒抗原。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該抗原產生於經重組的桿狀病毒感染之昆蟲細胞宿主內。
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