JP2018078806A

JP2018078806A - ノロウイルスｒｎａの検出方法

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Publication number: JP2018078806A
Application number: JP2016221394A
Authority: JP
Inventors: 蔵人宇根; Kurato Une; 隆哉俵田; Takaya Tawarada
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2018-05-24

Abstract

【課題】ノロウイルスＲＮＡのジェノグループＩ（ＧＩ）、および、ジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）を単一の密閉容器かつ一定温度でそれぞれ区別して検出する方法を提供する。【解決手段】試料中に存在するノロウイルスＲＮＡのジェノグループＩとジェノグループＩＩを区別して検出する方法であって、（１）ノロウイルスＲＮＡ中のジェノグループＩとジェノグループＩＩを区別しうる特定塩基配列を増幅する工程、及び（２）増幅した前記配列を検出する工程、を有し、前記増幅する工程および前記検出する工程が、単一の密閉容器内かつ一定温度で行われることを特徴とする前記方法。【選択図】なし

Description

本発明は、迅速、高感度かつ特異的にノロウイルスＲＮＡのジェノグループＩ（以下、「ＧＩ」とする場合がある）およびジェノグループＩＩ（以下、「ＧＩＩ」とする場合がある）を密閉された単一容器および一定温度で区別して検出する方法に関する。

ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。ノロウイルスは、小型球形ウイルス（ＳｍａｌｌＲｏｕｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅｄＶｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）とも呼ばれている。ノロウイルスは遺伝子型によりジェノグループＩＲＮＡ（以下、「ノロウイルスＧＩＲＮＡ」と表記）とジェノグループＩＩＲＮＡ（以下、「ノロウイルスＧＩＩＲＮＡ」と表記）の２種の遺伝子群に大別される。さらに各遺伝子群についても、現時点でノロウイルスＧＩＲＮＡは１から９の遺伝子型に、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡは１から２２の遺伝子型に区別される。

我が国で届け出されている食中毒の約２０％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイルス性食中毒例の約８０％以上からノロウイルスが検出される。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎からもノロウイルスが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性も示唆されている。ノロウイルスの流行を阻止するためにはできる限り迅速に対応することが必要である。以上から、ノロウイルスの迅速検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっており、遺伝子増幅法を用いた、高感度、かつ迅速でしかもあらゆる遺伝子型の検出が可能もしくは検出率の高い検査法の開発が望まれている。さらに、感染経路の特定や流行している遺伝子群の特定につながるノロウイルスＧＩＲＮＡおよびノロウイルスＧＩＩＲＮＡを識別して検出する検査法は公衆衛生上、非常に有用である。
これに対し、ノロウイルスの検出は、ヒトカリシウイルスのウイルス様中空粒子を用いた、特異抗体検出ＥＬＩＳＡの試薬が開発されている（特許文献１）。しかし、検出感度は決して高感度とはいえない。

ノロウイルスを高感度に測定する手段としてノロウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる（特許文献２）が、該方法の場合、一般的には逆転写（ＲＴ）工程およびＰＣＲ工程の二段階の工程が必要である。このことは操作を煩雑にして再現性を悪化させる要因となるだけでなく、二次汚染の危険性をも増加させることになる。前記ＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、多数検体処理や検査コストの低減には不向きであった。

標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をインターカレーター性蛍光色素存在下で実施して蛍光増加を測定するＲｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ法が汎用されている（非特許文献１）が、該方法ではプライマーダイマーなどの非特異増幅産物も検出してしまうという問題もあった。

また、非特異増幅産物を検出しない標的ＲＮＡの定量法としては、ＲＴ工程に引き続いて実施されるＰＣＲ工程をＴａｑＭａｎプローブといったハイブリダイゼーションプローブを用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献２）があげられるが、前述したようにＲＴ工程およびＰＣＲ工程を合わせると通例２時間以上の時間を要し、迅速とはいえない。さらに、ＰＣＲは急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。

一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４参照）、およびＴＭＡ法（特許文献５参照）などが報告されている。該ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。

以上のように前記ＲＮＡ増幅方法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とし、再現性良く定量できないという課題がある。

簡便にＲＮＡを増幅および測定する方法としては，Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（特許文献６および非特許文献３参照）の方法があげられる。該方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブの存在下、前記ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、簡便、一定温度、一段階、かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を同時に実施することが可能である。

前記の各核酸増幅方法は、いずれもセンスプライマー（第一のプライマー）およびアンチセンスプライマー（第二のプライマー）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせにより標的ＲＮＡを増幅する方法であり、該組み合わせが前記核酸増幅の効率および特異性に重要な意義を持つことは周知である。しかし、ノロウイルスはきわめて多様な遺伝子型を有するため、全ての遺伝子型を一様かつ高効率に増幅するプライマーセットの構築、および、ノロウイルスＧＩＲＮＡ、および、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡをそれぞれ区別して検出するオリゴヌクレオチドプローブセットを構築することは困難である。中でも比較的低温の一定温度（４０から５０℃が好ましい）条件下で標的とするＲＮＡの増幅検出を行うことが可能な増幅方法を利用する場合、プライマー／プローブが高次構造を形成しやすくなるため、プライマー／プローブセットの構築はきわめて困難である。
前述したように、ノロウイルスＧＩＲＮＡには９種の遺伝子型、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡには２２種の遺伝子型が、それぞれ存在し、さらに、塩基配列が高度に保存された領域は十分に長くない。そのため、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ一種類ずつ用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせにより、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に検出することは困難であった。

そこで以前発明者らは、第一のプライマー、第二のプライマーをそれぞれ二種類以上用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることで、ノロウイルスＧＩＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に測定することを見出した（特許文献７）。また、切断用オリゴヌクレオチドを二種類以上用いることで、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出することを見出した（特許文献８）。

さらに、ノロウイルスＧＩＲＮＡとノロウイルスＧＩＩＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出可能なオリゴヌクレオチドをそれぞれ最適化して組み合わせることで、ノロウイルスＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず一度の測定で迅速、かつ高感度に検出する方法を見出した（特許文献９）。

ＷＯ２０００／０７９２８０号特許３７５２１０２号公報特許２６５０１５９号公報特許３１５２９２７号公報特許３２４１７１７号公報特開２０００−１４４００号公報特開２００９−６３号公報特開２００９−１７８２４号公報特開２０１０−４３９３号公報

ＫａｇｅｙａｍａＴ．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，１５４８−１５５７（２００３）食安監発第１１０５００１号、２００３年１１月５日ＩｓｈｉｇｕｒｏＴ．ｅｔａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）

しかし、前記方法ではノロウイルスＧＩＲＮＡとノロウイルスＧＩＩＲＮＡを区別して検出することができず、公衆衛生上、遺伝子群を区別して検出する方法が必要とされていた。

本発明者らは、上記課題について鋭意検討の結果、迅速、かつ高感度にノロウイルスＧＩＲＮＡ、および、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡを区別して検出するための方法を見出した。

即ち本発明は以下のとおりである。
［１］試料中に存在するノロウイルスＲＮＡのジェノグループＩとジェノグループＩＩを区別して検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中のジェノグループＩとジェノグループＩＩを区別しうる特定塩基配列を増幅する工程、及び
（２）増幅した前記配列を検出する工程、
を有し、
前記増幅する工程および前記検出する工程が、単一の密閉容器内かつ一定温度で行われることを特徴とする前記方法。
［２］前記検出する工程が、リアルタイムモニタリングによって行われる、［１］に記載の方法。
［３］（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）、並びにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と、該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列とを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列を有するＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
を有し、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブの共存下で、該シグナル特性の変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが、配列番号１に記載の配列中の連続する１５塩基以上、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号２に記載の配列中の連続する１５塩基以上、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである、［１］または［２］に記載の方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において、ＧＩとＧＩＩとを区別しうる特定塩基配列とは、ノロウイルスＧＩＲＮＡ及びノロウイルスＧＩＩＲＮＡそれぞれに特異的に見出される塩基配列であり、かつ、高次構造を取りにくい領域に存在する塩基配列である。

増幅工程に採用し得る核酸増幅方法としては、ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法またはＴＭＡ法を例示できるが、本発明で使用するオリゴヌクレオチドプローブが高次構造を取りにくい領域に存在する特定塩基配列に向けられたものであることから、一定温度（比較的低温）で簡便かつ迅速に実施可能なＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が好ましい。

特に好ましい増幅工程は、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用い（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加している）を使用し、以下（１）から（３）の各ステップを行うものである。
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）、並びにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と、該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列とを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列を有するＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程。

前述した増幅工程は、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により進行する。これらの酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用しても良く、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用しても良い。例えば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素と、二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ合成酵素とを組み合わせて使用することが例示できる。もっとも、この三つの活性を有する逆転写酵素とＲＮＡ合成酵素に、必要に応じてＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素をさらに添加する等しても良い。前述の三つの活性を有する逆転写酵素として、例えばＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体があげられ、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が特に好ましい。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。

前述した増幅工程を進行させるためには、試料と前記各酵素に加えて、さらに、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸およびリボヌクレオシド−三リン酸を添加し、必要に応じて反応効率を調節するためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および糖等を添加し、適当な条件下で酵素反応を進行させる。例えばＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、３５から６５℃の範囲、好ましくは４０℃から５０℃の範囲で反応温度を設定すれば良い。

前述した増幅工程において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡと相同の配列を含み、第二のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡの相補的配列を含むことになる。プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始し得る配列であれば良く、種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的な公知のプロモーター配列を使用することができる。例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等の分子生物学的実験で通常用いられるプロモーター配列が特に制限なく使用できる。なおプロモーター配列に加えて、さらに、エンハンサー配列等の転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。

前記した増幅工程を実施する場合、第一または第二のプライマーのいずれか一方にプロモーター配列を付加しておけば良いが、第一のプライマーにプロモーター配列を付加する場合には、第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、ノロウイルスＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程（前記した工程（１））の前に、または当該ステップと同時に、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行うのが好ましい。このように特定塩基配列の５’末端部位で切断しておくことで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として効率的に機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成することができるからである。切断方法としては、当該部位を特異的に切断できれば特に限定されないが、ノロウイルスＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドＤＮＡ（以下、「切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ」とする）を添加してＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、当該２本鎖中のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素などにより切断する方法が、切断特異性及び簡便性から好ましい。また切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために、例えばアミノ化等、適当な修飾を行っておくことが好ましい。
ノロウイルスＧＩＲＮＡとノロウイルスＧＩＩＲＮＡの広範囲な遺伝子型に対して迅速、かつ高感度に検出可能なオリゴヌクレオチドとして、第一のプライマーが配列番号１２、１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、第二のプライマーが配列番号１４から１６に記載のオリゴヌクレオチド、切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして、配列番号１７から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドが例示できる。

検出工程はオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記増幅工程で増幅されたＲＮＡ転写産物量を測定する工程からなる。本発明の試料中に存在するノロウイルスＧＩＲＮＡ、および、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡを識別して検出するためのオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１（オリグヌクレオチドプローブ１）に記載の配列中の連続する１５塩基以上、またはその相補配列、および、配列番号２（オリグヌクレオチドプローブ２）に記載の配列中の連続する１５塩基以上、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。
また、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ１としては、配列番号３、４、５、６に記載の配列のいずれか、またはそれらの相補配列、および、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ２としては配列番号７、８、９、１０、１１に記載の配列のいずれか、またはそれらの相補配列からなる、オリゴヌクレオチドプローブを例示できる。より好ましくは、配列番号５に記載の配列、またはその相補配列、および、配列番号１０に記載の配列、またはその相補配列からなる、オリゴヌクレオチドプローブを例示できる。
また、ストリンジェントな条件で前記プローブにハイブリダイゼーション可能な配列からなるオリゴヌクレオチドプローブも本発明のプローブに含まれる。ストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム等が共存する条件下でハイブリダイズ可能であることを意味する。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いた検出は、例えば電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法により行うことができる。その他にも、前記プローブを例えば検出可能な標識物質と結合等し、ハイブリダイゼーション法により検出を行うことも可能である。標識物質としては例えば酵素、蛍光色素、放射性同位元素、発光色素等、公知のものを使用することができる。なお簡便な検出操作を可能とするｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ（米国特許５９２５５１７号、米国特許６１０３４７６号）、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許５２１００１５号、米国特許５４８７９７２号）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許３４３７８１６号）、サイクリングプローブ（米国特許５０１１７６９号、米国特許５４０３７１１号）、インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（特許文献７及び非特許文献２参照）が、好ましい本発明のオリゴヌクレオチドプローブとして例示できる。

中でもインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、前述の増幅工程の過程で検出を行うことができるため、前述のオリゴヌクレオチドＤＮＡ、プライマー、酵素および酵素基質等を含む試薬類とともに容器に投入するだけで増幅工程と検出工程を実施することが可能なため、特に好ましい。前記特に好ましい態様では、上記の試薬等を予め容器に投入しておき、一定量の試料を分注するという操作のみで本発明を迅速に実施可能であり、しかも、例えば蛍光色素が発する信号を外部から検出可能なように容器の一部を透明な材料で構成しておけば、試料を分注した後に容器を密閉し、試料間のコンタミネーションを防止することもできる。

インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されず、オキサゾールイエローやチアゾールオレンジ等のシアニン色素、ヘミシアニン色素、エチジウムブロマイド、メチルレッド等のアゾ色素、またはこれらの誘導体を使用することが例示できる。例えばオキサゾールイエローは、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４７０ｎｍ）が顕著に増加する色素である。このような色素は、オリゴヌクレオチドプローブの末端、リン酸ジエステル部または塩基部分に適当なリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合すれば良い。さらに、２種類以上のＲＮＡ増幅産物を区別して検出するにはそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブに異なる色素を使用すれば良い。
なお、増幅工程の過程で検出を行う場合、オリゴヌクレオチドは、その３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で当該水酸基を修飾しておくことが好ましい。

本発明によれば、ノロウイルスＧＩＲＮＡおよびノロウイルスＧＩＩＲＮＡそれぞれに特異的な配列を識別して検出することが可能である。しかもこのオリゴヌクレオチドプローブセットは、４０℃から５０℃という、比較的低温条件でもダイマーやループ等の高次構造を形成しにくいため、温度変化を必要としないＲＮＡを特異的に増幅する増幅方法を用いて増幅工程を実施し、その過程で特定塩基配列を検出する際に特に有効である。

本発明に用いるオリゴヌクレオチドプローブとして、インターカレーター性蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドの存在下で増幅工程を行い、その過程で蛍光強度を経時的に検出すれば、有意な蛍光増加が認められた任意の時間で検出を終了することが可能であり、増幅に要する時間を加えても、なおノロウイルスＲＮＡ検出を２０分程度で終了することが可能である。

このように、本発明によれば、試料中に含まれるノロウイルスＲＮＡを迅速、高感度かつ特異的にノロウイルスＧＩＲＮＡ、および、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡを区別して検出するためすることが可能となる。

以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）から（Ｉ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ＩＮＡＦプローブ」と記載する）を非特許文献３に記載の方法を参照して作製した。
ＩＮＡＦプローブ（Ａ）：配列番号３に記載の配列のうち、５’末端から２番目のチミンと３番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識して得られた、ＧＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｂ）：配列番号４に記載の配列のうち、５’末端から１５番目のチミンと１６番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識して得られた、ＧＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｃ）：配列番号５に記載の配列のうち、５’末端から１４番目のチミンと１５番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識して得られた、ＧＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｄ）：配列番号６に記載の配列のうち、５’末端から１５番目のチミンと１６番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識して得られた、ＧＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｅ）：配列番号７に記載の配列のうち、５’末端から１２番目のシトシンと１３番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介して式（１）を標識して得られた、ＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｆ）：配列番号８に記載の配列のうち、５’末端から１６番目のシトシンと１７番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介して式（１）を標識して得られた、ＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｇ）：配列番号９に記載の配列のうち、５’末端から２番目のシトシンと３番目のグアニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介して式（１）を標識して得られた、ＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｈ）：配列番号１０に記載の配列のうち、５’末端から１４番目のシトシンと１５番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介して式（１）を標識して得られた、ＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
ＩＮＡＦプローブ（Ｉ）：配列番号１１に記載の配列のうち、５’末端から１４番目のシトシンと１５番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介して式（１）を標識して得られた、ＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブ。

実施例２標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したノロウイルスＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているノロウイルスｃＤＮＡ配列のうち、表１に示す遺伝子型、および塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅＩ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。

実施例３ノロウイルスＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価
実施例１で作製したＩＮＡＦプローブを用いて、以下に示す方法で、検出性能および特異性について評価を行った。

（１）以下の組成からなる反応液を調製した。

反応液の組成（最終濃度）：
６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭトレハロース
各０．３０ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭＧＴＰ
３．４ｍＭＩＴＰ
０．８μＭ第一のプライマー１（配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータを付加したもの）
０．８μＭ第一のプライマー２（配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータを付加したもの）
０．５μＭ第二のプライマー１（配列番号１４）
０．５μＭ第二のプライマー２（配列番号１５）
０．２μＭ第二のプライマー３（配列番号１６）
０．３２μＭ切断用オリゴヌクレオチド１（配列番号１７）
０．３２μＭ切断用オリゴヌクレオチド２（配列番号１８）
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド３（配列番号１９）
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド４（配列番号２０）
６０ｎＭＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン
１４２ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
６．４ＵＡＭＶ逆転写酵素。

（２）検出性能を評価するために、上記の反応液に実施例２で調製した標準ＲＮＡ４００コピー／ｔｅｓｔになるように添加した。
また、特異性を評価するために、上記の反応液に表２に示す標準ＲＮＡ試料を４×１０^６コピー／ｔｅｓｔになるように添加した。その後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液を添加し撹拌した。

開始液組成（最終濃度）：
９．５％ジメチルスルホキシド
１９ｍＭ塩化マグネシウム
９５ｍＭ塩化カリウム。

（３）引き続き、各試薬を添加したチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４５０ｎｍ、または５００ｎｍ、蛍光波長４９５ｎｍ、または５４５ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。

開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が２．０を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表２および３に示す。表３の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が２．０以下（陰性判定）であったことを意味する。

ノロウイルスＲＮＡの検出性能（表２）については、本実施例で検討したＧＩ検出用、および、ＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブいずれもが４００コピー／ｔｅｓｔのノロウイルスＧＩＲＮＡまたはノロウイルスＧＩＩＲＮＡを２０分以内に検出した。特に、配列番号３から１０のオリゴヌクレオチドプローブは４００コピー／ｔｅｓｔのノロウイルスＲＮＡを１０分以内に検出しており、ノロウイルスＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドプローブといえる。

特異性（表３）については、本実施例で検討したＧＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブいずれもが４×１０^６コピー／ｔｅｓｔのＧＩＩ標準ＲＮＡを検出せず、ノロウイルスＧＩＲＮＡに対して高い特異性を有しているといえる。同様に、本実施例で検討したＧＩＩ検出用オリゴヌクレオチドプローブいずれもが４×１０^６コピー／ｔｅｓｔのＧＩ標準ＲＮＡを検出せず、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡに対して高い特異性を有しているといえる。

実施例４ノロウイルスＧＩＲＮＡ、および、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡの同時検出
実施例１で作製したＩＮＡＦプローブを用いて、ノロウイルスＲＮＡのＧＩ、および、ＧＩＩを同時に識別して検出することが可能か以下に示す方法で、評価を行った。

（１）以下の組成からなる反応液を調製した。

反応液の組成（最終濃度）：
６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭトレハロース
各０．３０ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭＧＴＰ
３．４ｍＭＩＴＰ
０．８μＭ第一のプライマー１（配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータを付加したもの）
０．８μＭ第一のプライマー２（配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号を付加したもの）
０．５μＭ第二のプライマー１（配列番号１４）
０．５μＭ第二のプライマー２（配列番号１５）
０．２μＭ第二のプライマー３（配列番号１６）
０．３２μＭ切断用オリゴヌクレオチド１（配列番号１７）
０．３２μＭ切断用オリゴヌクレオチド２（配列番号１８）
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド３（配列番号１９）
０．１６μＭ切断用オリゴヌクレオチド４（配列番号２０）
６０ｎＭＧＩ検出用ＩＮＡＦプローブ（配列番号５）
６０ｎＭＧＩＩ検出用ＩＮＡＦプローブ（配列番号１０）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン
１４２ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
６．４ＵＡＭＶ逆転写酵素。

（２）上記の反応試薬に表４に示す標準ＲＮＡ試料を４００コピー／ｔｅｓｔになるように添加した。但し、「ＧＩ．６＋ＧＩＩ．４」については、ＧＩ．６とＧＩＩ．４とを各４００コピー／ｔｅｓｔになるように添加した。その後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液を添加し撹拌した。

開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が２．０を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表４に示す。表４の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が２．０以下（陰性判定）であったことを意味する。

ノロウイルスＧＩＲＮＡ、および、ノロウイルスＧＩＩＲＮＡの同時検出（表４）については、単一の密閉容器かつ一定温度でノロウイルスＧＩＲＮＡおよびノロウイルスＧＩＩＲＮＡが区別して検出できることが確認された。

Claims

試料中に存在するノロウイルスＲＮＡのジェノグループＩとジェノグループＩＩを区別して検出する方法であって、
（１）ノロウイルスＲＮＡ中のジェノグループＩとジェノグループＩＩを区別しうる特定塩基配列を増幅する工程、及び
（２）増幅した前記配列を検出する工程、
を有し、
前記増幅する工程および前記検出する工程が、単一の密閉容器内かつ一定温度で行われることを特徴とする前記方法。
前記検出する工程が、リアルタイムモニタリングによって行われる、請求項１に記載の方法。
（１）ノロウイルスＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、いずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加した第一のプライマーおよび第二のプライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）、並びにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列と、該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列とを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（２）該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより、前記特定塩基配列あるいはその相補配列を有するＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（３）該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に該ＲＮＡ転写産物を増幅する工程、
（４）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
を有し、前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程（４）が、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブの共存下で、該シグナル特性の変化を測定することによってなされ、前記核酸プローブが、配列番号１に記載の配列中の連続する１５塩基以上、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号２に記載の配列中の連続する１５塩基以上、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである、請求項１または２に記載の方法。