TWI436778B - Ｉｌ－１８受體抗原結合蛋白 - Google Patents

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TWI436778B
TWI436778B TW097128186A TW97128186A TWI436778B TW I436778 B TWI436778 B TW I436778B TW 097128186 A TW097128186 A TW 097128186A TW 97128186 A TW97128186 A TW 97128186A TW I436778 B TWI436778 B TW I436778B
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Description

IL-18受體抗原結合蛋白
本發明提供IL-18受體抗原結合蛋白及編碼該等IL-18受體抗原結合蛋白之聚核苷酸。亦提供表現載體及包含該等表現載體、用於產生抗原結合蛋白之宿主細胞。此外，提供診斷及治療由IL-18受體介導之疾病的組合物及方法。
IL-18為屬於IL-1配位體家族的促炎細胞因子(proinflammatory cytokine)。Okamura等人，1995,Nature 378:88-91。亦稱為IFN-γ誘導因子之IL-18，為在TH1反應中主要藉由其在T細胞及天然殺傷細胞(killer cell)中誘導IFN-γ-產生之能力而具有重要作用的細胞因子。IL-18在結構與功能上與IL-1家族有關。就結構而言，IL-18及IL-1β共有相當多的一級胺基酸序列且均摺疊為β摺疊多肽。就功能而言，IL-18誘導IL-1、TNF、Fas配位體及若干細胞因子之基因表現及合成。
IL-18之活性經由藉由形成IL-18受體(IL-18R)複合物而起始之信號轉導途徑轉導。IL-18R包括稱為α-IL-18受體(α-IL-18R)(先前鑑別為IL-1R相關蛋白(IL-1Rrp)之IL-1R家族成員)之結合鏈，及稱為β-IL-18受體(β-IL-18R)(亦為IL-1R家族成員且先前鑑別為AcPL)之鏈；兩條鏈為信號傳導所必需的。Born等人，1998,J. Biol. Chem. 273:29445-50。IL-18/IL-18R複合物募集IL-1R活化激酶及TNF受體相關因子6，從而磷酸化核因子kappaB(NFkappaB)誘導激酶，隨後活化NFkappaB。IL-18參與先天與後天免疫。Dinarello,1999,J. Allergy Clin. Immun. 103:11-24。
在發病機理中IL-18含量增加及/或IL-18介導信號牽連已於多種人類疾病狀態中證實，包括自體免疫疾病(WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；Mallat等人，2002,Circ. Res. 91:441-448)，肝病(Finitto等人，2004,Liver 53:392-400；Tsutsui等人，2000,Immunological Reviews 174:192-209；Ludwiczek等人，2002,J. Clinical Immunology 22:331-337)，胰臟疾病及心血管疾病(Gerdes等人，2002,J. Exp. Med. 195:245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；Raeburn等人，2002,Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283:H650-H657)。因此，需要產生能夠調節IL-18/IL-18受體相互作用之新穎藥劑。
本文提供α-及β-IL-18受體(本文亦共同稱為"IL-18受體"或"IL-18R")抗原結合蛋白及編碼其之聚核苷酸。IL-18受體抗原結合蛋白抑制、干擾或調節由IL-18介導之至少一種生物反應，且因而可用於改善IL-18介導之疾病或病症的影響。亦提供用於產生α-及β-IL-18受體抗原結合蛋白之表現系統(包括細胞株)及用於診斷及治療與異常IL-18活性相關之疾病的方法。
在一實施例中，抗原結合蛋白結合α-及β-IL-18受體，且包含(a)支架結構(scaffold structure)；及(b)至少一個互補決定區(complementary determining region，CDR)，係選自SEQ ID NO:89-139中之任一者之CDRH區或SEQ ID NO:140-190中之任一者之CDRL區。在此實施例中，尤其有用為分別具有SEQ ID NO:91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139或SEQ ID NO:142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190之CDRH3或CDRL3區之抗原結合蛋白。其他實施例利用具有選自SEQ ID NO:89-139中之任一者之CDRH區及SEQ ID NO:140-190中之任一者之CDRL區的一個CDR之抗原結合蛋白(例如，抗原結合蛋白具有兩個CDR區(一個重鏈區及一個輕鏈區)；此外在特定實施例中，抗原結合蛋白具有CDRH3與CDRL3區)。
抗原結合蛋白可與分別具有SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:71之胺基酸序列之IL-18受體α-或β-鏈結合。
本文描述包含重鏈胺基酸序列及/或輕鏈胺基酸序列之抗原結合蛋白，該重鏈胺基酸序列包含至少一個選自由以下各物組成之群的CDR：(a)SEQ ID NO:89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137中之任一者之CDRH1；(b)SEQ ID NO:90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138中之任一者之CDRH2；及(c)SEQ ID NO:91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139中之任一者之CDRH3；該輕鏈胺基酸序列包含至少一個選自由以下各物組成之群的CDR：(a)SEQ ID NO:140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188中之任一者之CDRL1；(b)SEQ IDNO:141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189中之任一者之CDRL2；及(c)SEQ ID NO:142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190中之任一者之CDRL3。
在某些態樣中，抗原結合蛋白包含具有SEQ ID NO:89-139中之任一者之CDRH1、CDRH2及CDRH3的重鏈胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO:140-190中之任一者之CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈胺基酸序列。較佳之抗原結合蛋白包含選自由SEQ NO:1-17組成之群的重鏈胺基酸序列及/或選自由SEQ ID NO:18-34組成之群的輕鏈胺基酸序列。較佳之CDRH3包括SEQ ID NO:91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139中之任一者中所闡明之彼等CDRH3。較佳之CDRL3包括SEQ ID NO:142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190中之任一者中所闡明之彼等CDRL3。
在某些態樣中，抗原結合蛋白包含一或多個IgG重鏈或IgG輕鏈，包括IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型之彼等IgG重鏈或IgG輕鏈。較佳之IgG重鏈包括(但不限於)SEQ ID NO:73、77、81及85中所闡明之彼等IgG重鏈。較佳之IgG輕鏈包括(但不限於)SEQ ID NO:75、79、83及87中所闡明之彼等IgG輕鏈。
如本文所述，與由成熟α-IL-18受體(SEQ ID NO:69)所形成之三維結構的胺基酸殘基250-253及267-271結合之抗原結合蛋白尤其適用於阻斷IL-18與IL-18受體之相互作用。
抗原結合蛋白可為單株抗體、人類抗體、重組抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體或其片段。抗體片段包括(但不限於)微型抗體(miniboby)、域抗體(domain antibody)、F(ab)片段、F(ab')片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段、雙功能抗體(diabody)或單鏈抗體分子。
在其他態樣中，本文提供編碼一或多個IL-18受體抗原結合蛋白之經分離核酸。該等核酸可包含於載體內且與控制序列可操作地連接。本文亦提供用該等經分離核酸轉型之宿主細胞。
另外，本文提供包含IL-18受體抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。該等醫藥組合物適用於用以預防或治療患者與IL-18受體相關之病況的方法中，其包含向患者投與有效量之該等醫藥組合物。與IL-18受體相關之疾病及病況包括發炎性疾病及自體免疫疾病(諸如牛皮癬、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎(juvenile idiopathic arthritis)、史提爾氏病(Still's disease)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、骨關節炎、潰瘍性關節炎、腹腔病(coeliac disease)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、慢性阻塞性肺病、哮喘(尤其慢性重度哮喘)、急性呼吸窘迫症候群、敗血症(sepsis)、阿茲海默氏病(Alzheimer disease)、狼瘡、過敏性鼻炎、特發性血小板減少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)、移植、異位性皮膚炎、II型糖尿病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、多發性硬化症、自體免疫性肝炎、HIV、異位性皮膚炎、重症肌無力、肉狀瘤病(sarcoidosis)、肝病(諸如肝炎)、胰臟疾病(諸如慢性胰腺炎或急性胰腺炎)及心血管疾病(諸如急性心臟發作、粥瘤斑塊破裂(atheromatous plaque rupture)、缺血後心臟衰竭、再灌注損傷、血管發炎、慢性心臟衰竭、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎之心血管併發症及粥樣化形成(atherogenesis))。
本文進一步提供抑制IL-18與IL-18受體結合之方法，其包含使IL-18受體與IL-18受體抗原結合蛋白接觸。結合IL-18受體後，IL-18受體抗原結合蛋白將防止或阻斷受體與IL-18之結合。
本文所用之分段標題係僅出於組織目的且不應解釋為限制所述之標的物。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉型、蛋白質純化等。可根據製造商之說明書或如在此項技術中通常所完成或如本文所述，實行酶促反應及純化技術。以下程序及技術通常可根據此項技術中所熟知的習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般性參考文獻及更具體之參考文獻中所述來執行。參見例如Sambrook等人，2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual ，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，其以任何目的以引用的方式併入本文中。除非提供特定定義，否則結合本文所述之分析化學、有機化學及醫藥化學所用之命名法及其實驗程序與技術為此項技術中所熟知且常用之彼等命名法及程序與技術。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳送、及患者之治療。
A.一般概述
本文提供結合α-或β-IL-18受體之抗原結合蛋白；人類α-及β-IL-18受體之胺基酸序列分別於SEQ ID NO:69及71中描述。本發明之抗原結合蛋白包含一支架結構，其具有一或多個如圖2A-圖2E、圖3A及圖3B中所述之互補決定區(CDR)，亦即SEQ ID NO:1-34(亦參見SEQ ID NO:89-292，其描述各種CDR之胺基酸序列)之CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3部分。在某些實施例中，抗原結合蛋白之支架結構係基於抗體(包括(但不限於)單株抗體、人類抗體、鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體)、抗體片段(諸如微型抗體、域抗體、F(ab)片段、F(ab')片段、F(ab)2 片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段)、合成抗體(本文有時稱為"抗體模擬物(antibody mimetic)")、抗體融合物(有時稱為"抗體共軛物(antibody conjugate)")，該等抗體融合物包括Fc融合物。下文進一步描述且定義各種結構。
如以下進一步所述，α-及β-IL-18受體抗原結合蛋白適用於治療與IL-18活性相關之病況，包括TH1驅動之自體免疫疾病(WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；Mallat等人，2002,Circ. Res. 91 :441-448)、肝疾病(Finitto等人，2004,Liver 53 :392-400；Tsutsui等人，2000,Immunological Reviews 174 :192-209；Ludwiczek等人，2002, J. Clinical Immunology 22 :331-337)、胰臟疾病(Yoshida等人，1998,Anticancer Res. 18 :333-5)及心血管疾病(Gerdes等人，2002,J. Exp. Med. 195 :245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；Raeburn等人，2002,Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283 :H650-H657)。抗原結合蛋白之其他用途包括例如，IL-18相關疾病或病況之診斷，及用以確定α-或β-IL-18受體存在與否之篩檢檢定。亦提供α-或β-IL-18受體抗原結合蛋白，尤其包括至少一個互補決定區(CDR)之抗原結合蛋白，該至少一個互補決定區包括如下更全面描述之重鏈CDR及/或輕鏈CDR及其組合。
本發明之抗原結合蛋白干擾、阻斷或調節IL-18與IL-18受體之間的相互作用。在一些實施例中，抗原結合蛋白中斷IL-18途徑，藉此降低IL-18之至少一種生物活性，包括(但不限於)誘導IFN-γ產生、誘導殺傷細胞形成及增強殺傷細胞之細胞毒性。如本文之實例部分所證實，降低IL-18誘導之RG細胞IFN-γ產生的抗原結合蛋白包括彼等包含AMH 8及AML 11、AMH 9及AML 9、AMH 10及AML 8、AMH 11及AML 7、AMH 15及AML 3、AMH 13及AML 4、AMH 13及AML 5、AMH 16及AML 2、AMH 2及AML 16、AMH 2及AML 17、AMH 1及AML 16、AMH 1及AML 17、AMH 4及AML 14、AMH 4及AML 15、AMH 3及AML 14、AMH 3及AML 15、AMH 6及AML 12、AMH 6及AML 13、AMH 5及AML 12及AMH 5及AML 13之抗原結合蛋白。
因此本發明之抗原結合蛋白可用以鑑別與IL-18或IL-18受體誘導之免疫反應相關之病況。此外，抗原結合蛋白可用以調節及/或抑制IL-18或IL-18受體介導之免疫反應，因而具有治療及預防由過度免疫反應所引起之各種疾病(例如發炎性疾病)的功效。因此，本發明之α-及β-IL-18受體抗原結合蛋白可用於診斷、預防或治療與IL-18及IL-18受體介導之信號轉導途徑相關之疾病或病況。
B. IL-18受體抗原結合蛋白
在一態樣中，提供結合α-或β-IL-18受體之抗原結合蛋白。如本文所用之"抗原結合蛋白"意謂特異性結合指定抗原之蛋白質。在特定實施例中，抗原為人類α-或β-IL-18受體。
如本文所用之"蛋白質"意謂至少兩個共價連接之胺基酸，其包括蛋白質、多肽、寡肽及肽。在一些實施例中，兩個或兩個以上共價連接之胺基酸係藉由肽鍵連接。如下所述，蛋白質可由天然存在之胺基酸及肽鍵組成，例如當蛋白質使用表現系統及宿主細胞重組製備時。或者，蛋白質可包括合成胺基酸(例如，高***酸、瓜胺酸、鳥胺酸及正白胺酸)或擬肽結構，亦即"肽或蛋白質類似物"，諸如類肽(peptoid)(參見以引用的方式併入本文中之Simon等人，1992,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 :9367)，其可抵抗蛋白酶或其他生理及/或儲存條件。尤其當抗原結合蛋白藉由此項技術中熟知之習知方法活體外合成時，可引入該等合成胺基酸。此外，可使用擬肽、合成及天然存在之殘基/結構之任何組合。"胺基酸"亦包括亞胺基酸殘基，諸如脯胺酸及羥基脯胺酸。胺基酸"R基團"或"側鏈"可為(L)-構型或(D)-構型。在一特定實施例中，胺基酸為(L)-構型或(D)-構型。
在某些態樣中，本發明提供結合IL-18受體(在一些實施例中為人類IL-18受體)之重組抗原結合蛋白。關於此點，"重組蛋白質"為使用重組技術，亦即經由如本文所述之重組核酸的表現形成之蛋白質。在此項技術中熟知產生重組蛋白質之方法及技術。
在一些實施例中，抗原結合蛋白為經分離蛋白質或實質上純蛋白質。"經分離"蛋白質不帶有至少一些在其自然狀態中通常相關之材料，較佳構成所給樣本中總蛋白質之至少約5重量%、更佳至少約50重量%。"實質上純"蛋白質包含總蛋白質之至少約75重量%，其中較佳為至少約80重量%，且尤其較佳為至少約90重量%。定義包括在不同生物體或宿主細胞中自一種生物體產生抗原結合蛋白。或者，蛋白質可經由使用誘導性啟動子或高表現啟動子，以與通常所見濃度相比顯著較高之濃度製備，以便使蛋白質以高濃度水準製備。
抗原結合蛋白可與IL-18受體、較佳人類IL-18受體特異性結合。如本文所用之"特異性結合"意謂平衡解離常數為至少10-6 M、較佳10-7 M至10-10 M、更佳<10-8 M至<10-10 M、甚至更佳<10-9 M至<10-10 M。在一特定實施例中，抗原結合蛋白與具有SEQ ID NO:69或71之胺基酸序列的人類IL-18受體結合。以下詳述較佳之抗原結合蛋白所特異性結合之α-或β-IL-18受體中之抗原決定基。
在抗原結合蛋白用於治療性應用之實施例中，IL-18受體抗原結合蛋白之重要特徵為其是否可抑制、干擾或調節IL-18受體之一或多種生物活性。在此情況下，當過量抗體使與IL-18受體結合之IL-18的量(或反之亦然)降低至少約20%、40%、60%、80%、85%或更多(例如藉由在活體外競爭性結合檢定中量測結合)，抗原結合蛋白與IL-18之受體特異性結合且/或實質上抑制IL-18與其受體之結合。IL-18受體具有許多獨特生物效應，該等效應可在不同細胞型中在許多不同檢定中得以量測。IL-18受體抗原結合蛋白抑制、干擾或調節IL-18之生物活性的能力可例如藉由如實例4中所述量測對KG1細胞中IFN-γ釋放的抑制作用或使用量測抗原結合蛋白抑制IFN-γ釋放之能力的類似檢定來測定。
並非所有與抗原特異性結合之抗原結合蛋白均可阻斷抗原與其正常配位體結合且因此抑制或調節抗原之生物效應。如此項技術中所已知，該作用可視抗原結合蛋白與抗原之何部分結合而定，且視抗原及抗原結合蛋白(在此情況下，為IL-18受體及IL-18受體抗原結合蛋白)之絕對及相對濃度而定。能夠抑制或調節IL-18受體的生物活性在本文中意謂，當IL-18濃度在某一範圍內時(例如在約EC80 或EC90 時)(在該範圍內，一種藥劑抑制其生物活性的作用可顯而易見)，抗原結合蛋白能夠例如將在IL-18存在下所觀察到之IFN-γ釋放(如在實例4之KG1細胞檢定或類似檢定中所量測)抑制至少約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%、99%或更多。EC80 在本文中意謂觀察到IL-18最大效應80%所需之IL-18量。若IL-18濃度遠遠超過EC90 ，則由於IL-18過量，使得抑制劑之作用可能不太明顯。抑制、干擾或調節IL-18受體之生物活性所需之抗原結合蛋白濃度可廣泛變化且可視抗體與IL-18受體結合緊密程度而定。舉例而言，在KG1細胞檢定中每個IL-18分子一分子或更少抗原結合蛋白可能就足以抑制、干擾或調節生物活性。在一些實施例中，當IL-18濃度為約EC50 至約EC90 時，可能需要約1,000:1至約1:1,000(包括約2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、1:40、1:60、1:100、1:500、1:1,000或更多)之IL-18受體/抗體比率以抑制、干擾或調節IL-18受體之生物活性。IL-18受體抗原結合蛋白比率亦可能在該等值之間。
作為一般結構，本發明之抗原結合蛋白包含(a)支架及(b)一個或多個對抗原結合特異性及親和力起決定作用之CDR區。如本文所用之"互補決定區"或"CDR"係指構成用於抗原結合之主要表面接觸點的結合蛋白區。將一或多個CDR嵌入抗原結合蛋白之支架結構中。抗原結合蛋白之支架結構可為抗體或其片段或變異體之構架，或可實際上為完全合成的。下文進一步描述抗原結合蛋白之各種支架結構。
1.互補決定區(CDR)
抗原結合蛋白可具有6個CDR(如天然存在之抗體的每一"臂"通常形成的)，例如一重鏈CDR1("CDRH1")、一重鏈CDR2("CDRH2")、一重鏈CDR3("CDRH3")、一輕鏈CDR1("CDRL1")、一輕鏈CDR2("CDRL2")、一輕鏈CDR3("CDRL3")。如整個說明書中結合生物材料(諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物)使用之術語"天然存在"係指在自然界中所見之材料。在天然存在之抗體中，CDRH1通常包含約五(5)至約七(7)種胺基酸，CDRH2通常包含約十六(16)至約十九(19)種胺基酸，且CDRH3通常包含約三(3)至約二十五(25)種胺基酸。CDRL1通常包含約十(10)至約十七(17)種胺基酸，CDRL2通常包含約七(7)種胺基酸，且CDRL3通常包含約七(7)至約十(10)種胺基酸。圖2A-圖2E、圖3A及圖3B中描述較佳之CDR。
本部分於下文進一步描述天然存在之抗體內CDR之結構及特性。簡言之，在傳統抗體支架中，將CDR嵌入重鏈及輕鏈可變區中之構架內，在其中其構成負責抗原結合及辨誠之區域。參見上述(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD；亦參見Chothia及Lesk,1987,J. Mol. Biol. 196 :901-9I7；Chothia等人，1989,Nature 342 :877-883)，在構架區(指定構架區1-4、FR1、FR2、FR3及FR4,Kabat等人，1991，同上：亦參見Chothia及Lesk，1987，同上)內，可變區包含至少三個重鏈CDR或輕鏈CDR。參見下述。然而，本發明所提供之CDR不僅可用以定義傳統抗體結構之抗原結合域，而且可嵌入多種如本文所述之其他支架結構中。
在某些實施例中，抗原結合蛋白之一或多個CDR各自獨立地選自SEQ ID NO:89-139中之任一者的CDRH區及SEQ ID NO:140-190中之任一者的CDRL區。因此，在一實施例中，本發明提供與α-或β-IL-18受體結合之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含(a)支架結構(如下所述)；及(b)至少一個CDR，係選自SEQ ID NO:89-139中之任一者的CDRH區及SEQ ID NO:140-190中之任一者的CDRL區。在此實施例中，尤其有用為具有CDRH3或CDRL3區之抗原結合蛋白。其他實施例利用具有選自SEQ ID NO:89-139中之任一者之CDRH區及SEQ ID NO:140-190中之任一者之CDRL區的一個CDR之抗原結合蛋白(例如，抗原結合蛋白具有兩個CDR區(一個CDRH區及一個CDHL區)；在一特定實施例中為具有CDRH3與CDRL3區之抗原結合蛋白)。
如熟悉此項技術者所瞭解，尤其有用之實施例可含有1、2、3、4、5或6個獨立選擇之SEQ ID NO:89-190之CDR。然而，如熟悉此項技術者所瞭解，特定實施例通常利用非重複CDR之組合，例如抗原結合蛋白通常並非由兩個CDRH2區形成等。
在一些實施例中，產生包含CDRH3區及CDRL3區之抗原結合蛋白，尤其其中CDRH3區為選自SEQ ID NO:91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139中之任一者的CDRH3區，且CDRL3區為選自SEQ ID NO:142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190中之任一者的CDRL3區。圖4中描述特定組合。
在其他實施例中，使用包含獨立地選自SEQ ID NO:89-139之CDRH1、CDRH2及CDRH3區的抗原結合蛋白。在更特定實施例中，尤其有用為具有選自SEQ ID NO:1-17中之任一者的同一可變區之所有三個CDRH區的此類型之抗原結合蛋白。
在另一實施例中，使用包含獨立地選自SEQ ID NO:140-190之CDRL1、CDRL2及CDRL3區之抗原結合蛋白。在更特定實施例中，尤其有用為具有選自SEQ ID NO:18-34中之任一者的同一可變區之所有三個CDRL區的此類型之抗原結合蛋白。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含獨立地選自SEQ ID NO:89-139之CDRH1、CDRH2及CDRH3區(此外在一實施例中具有選自同一SEQ ID NO之所有三個區)及獨立地選自SEQ ID NO:140-190之CDRL1、CDRL2及CDRL3區(此外在一實施例中具有選自SEQ ID NO:1-34中之任一者的同一可變區之所有三個區)。
在本發明之另一態樣中，提供與α-或β-IL-18受體結合之抗原結合蛋白，其中經分離抗原結合蛋白包含含有CDRH1、CDRH2或CDRH3(各自選自SEQ ID NO:89-139中之任一者)之重鏈胺基酸序列或其片段，或含有CDRL1、CDRL2或CDRL3(各自選自SEQ ID NO:140-190中之任一者)之輕鏈胺基酸序列或其片段。如本文所用之重鏈可變區或輕鏈可變區"片段"包括至少一個CDR及SEQ ID NO:1-34之抗體構架之至少一部分構架區，該部分包含至少一種胺基酸。
在另一態樣中，本發明提供結合α-或β-IL-18受體之抗原結合蛋白，其中經分離抗原結合蛋白包含含有CDRH1、CDRH2及CDRH3(各自獨立地選自SEQ ID NO:89-139中之任一者)之重鏈胺基酸序列，或含有CDRL1、CDRL2及CDRL3(各自獨立地選自SEQ ID NO:140-190中之任一者)之輕鏈胺基酸序列。在一特定實施例中，CDR係來自SEQ ID NO:1-17之同一鄰近重鏈胺基酸序列或來自SEQ ID NO:18-34之同一鄰近輕鏈胺基酸序列。
本發明之另一態樣提供結合α-或β-IL-18受體之經分離抗原結合蛋白，其中經分離抗原結合蛋白包含含有CDRH1、CDRH2及CDRH3(各自獨立地選自SEQ ID NO:89-139中之任一者)之重鏈胺基酸序列，或含有CDRL1、CDRL2及CDRL3(各自獨立地選自SEQ ID NO:140-190中之任一者)之輕鏈胺基酸序列。在一特定實施例中，重鏈CDR係來自SEQ ID NO:1-17之同一鄰近重鏈胺基酸序列，且輕鏈CDR係來自SEQ ID NO:18-34之同一鄰近輕鏈胺基酸序列。
本發明之另一態樣提供結合α-或β-IL-18受體之經分離抗原結合蛋白，其中經分離抗原結合蛋白包含SEQ ID NO:1-17中之任一者的重鏈胺基酸序列或SEQ ID NO:18-34中之任一者的輕鏈胺基酸序列。
本發明之另一態樣提供結合α-或β-IL-18受體之經分離抗原結合蛋白，其中經分離抗原結合蛋白包含SEQ ID NO:1-17中之任一者的重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:18-34中之任一者的輕鏈胺基酸序列。應注意SEQ ID NO:1-17之任一重鏈序列可與SEQ ID NO:18-34之任一輕鏈序列混合或相配。所得可能組合描述於圖4中。圖4中顯示每一重鏈可變區及每一輕鏈可變區之組合的二聚體。當大多數抗體為四聚體時，本發明之抗原結合蛋白可包含所述二聚體之任兩者的任何組合，因此包括雜四聚體與均四聚體，其中均四聚體(例如，兩個相同二聚體)為特定的。
在另一態樣中，本發明之抗原結合蛋白包含SEQ ID NO:73-88中所述序列中之任一者。
表1提供關於序列(提及其序列識別號)之簡短說明。本發明之可變區內之CDR在圖2A-圖2E、圖3A及圖3B中鑑別。
2.支架(Scaffold)
如本文所述，抗原結合蛋白可包含植入CDR(s)之支架結構。支架結構可基於抗體(包括(但不限於)單株抗體、人類抗體、鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體)、抗體片段(諸如微型抗體、域抗體、F(ab)片段、F(ab')片段、F(ab)2 片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段)、合成抗體(本文有時稱為"抗體模擬物")、抗體融合物(有時稱為"抗體共軛物")，包括Fc融合物。一些實施例包括使用人類支架成份。因而，本發明至少涵蓋任何以下所述包含一或幾個如SEQ ID NOs:89-190、較佳SEQ ID NOs:89-189中所鑑別之CDRs之支架，該等支架可與IL-18受體結合及/或抑制IL-18受體之生物活性。在一些實施例中，支架包含一或幾個如SEQ ID NOs:1-17中所鑑別之重鏈可變區及/或一或幾個如SEQ ID NOs:18-34中任一者所鑑別之輕鏈可變區。在一些實施例中，支架包含如SEQ ID NOs:77-88中任一者所鑑別之IgG鏈。
在一個實施例中，植入一或幾個CDRs之支架為抗體。本文所用之術語"抗體"係指具有傳統抗體結構，包含至少2個、更通常4個多肽鏈之多聚體蛋白。抗體與抗原特異性結合且可能抑制或調節抗原之生物活性。在某些實施例中，抗體藉由重組DNA技術產生。在其他實施例中，抗體藉由天然存在之抗體經酶或化學裂解產生。
傳統抗體結構單元通常包含四聚體。每一四聚體通常由相同的兩對多肽鏈組成，每一對具有一個"輕鏈"(通常具有約25kDa之分子量)及一個"重鏈"(通常具有約50-70kDa之分子量)。每一鏈之胺基端部分包括一個主要負責抗原辨識之約100至110或更多個胺基酸之可變區。每一鏈之羧基端部分界定一個主要負責效應功能(effector function)之恆定區。人類輕鏈分類為κ(kappa)及λ(lambda)輕鏈。重鏈分類為μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)重鏈，抗體之同型(isotype)分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有幾個亞型(subclass)，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有亞型，包括(但不限於)IgM1及IgM2。
在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由一個具有約十二(12)或更多個胺基酸之"J"區連接，重鏈亦包括一個具有約十(10)或更多個胺基酸之"D"區。通常參見Paul W.編，1989 Fundamental Immunology，第7章，第二版，Raven Press,N.Y.。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。
一些天然存在之抗體(例如駱駝及美洲駝中所見之)為由兩個重鏈組成之二聚體且不包括輕鏈。Muldermans等人，2001，J. Biotechnol. 74 :277-302；Desmyter等人，2001，J. Biol. Chem. 276 :26285-26290。駱駝抗體之結晶學研究顯示CDR3區形成與抗原相互作用之表面且因此對抗原結合至關重要(如在更典型之四聚抗體中)。
重鏈及輕鏈之可變區通常展示藉由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)連接之相對保守構架區(FR)之相同一般結構。CDR為抗體(或如本文所述之抗原結合蛋白)之高變區，其負責抗原辨識及結合。每一對之兩個鏈之CDR係由構架區對準，以使其能結合至特異抗原決定基。自N-末端至C-末端，輕鏈與重鏈均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。對於每一域的胺基酸指派係根據Kabat建立的具有免疫學意義之蛋白質序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)之定義。Chothia等人，1987,J. Mol. Biol. 196 :901-917；Chothia等人，1989,Nature 342 :878-883。
CDR構成抗原結合之主要表面接觸點。參見例如Chothia及Lesk，1987,J. Mol. Biol. 196 :901-917。此外，輕鏈之CDR3及尤其重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合中之最重要決定子。參見例如，Chothia及Lesk，1987，同上；Desiderio等人，2001,J. Mol. Biol. 310 :603-615；Xu及Davis，2000,Immunity 13 :37-45；Desmyter等人，2001,J. Biol. Chem. 276 :26285-26290；及Muyldermans，2001,J. Biotechnol. 74 :277-302。在一些抗體中，重鏈CDR3看似構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。Desmyter等人，2001，同上。CDR3單獨變化之活體外選擇流程可用以改變抗體之結合特性。Muyldermans，2001，同上；Desiderio等人，2001，同上。
天然存在之抗體鏈通常包括信號序列，其引導抗體鏈進入分泌蛋白質之細胞途徑且不存在於成熟抗體中。編碼抗體鏈之聚核苷酸可編碼天然存在之信號序列或異源信號序列(如下所述)。
在一實施例中，抗原結合蛋白為一種單株抗體，其具有一(1)至六(6)個來自SEQ ID NO:89-190中之任一者的所述CDR，如本文所述。本發明之抗體可具有任何類型，包括IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA或IgE抗體。在特定實施例中，抗原結合蛋白為IgG型抗體。在進一步特定實施例中，抗原結合蛋白IgG2型抗體。
在一些實施例中，例如當抗原結合蛋白為具有完整重鏈及完整輕鏈之抗體時，CDR全部來自同一物種，例如人類。然而，在一些實施例中，支架成份可為來自不同物種之混合物。因而，若抗原結合蛋白為抗體，則該抗體可為嵌合抗體及/或人類化抗體。一般而言，"嵌合抗體"係指組合來自多於一個物種之區域的抗體。舉例而言，"嵌合抗體"傳統上包含來自小鼠(或有時為大鼠)之可變區及來自人類之恆定區。
舉例而言，在抗原結合蛋白含有小於6個來自上述序列之CDR的實施例中，額外CDR可來自其他物種(例如，鼠科CDR)或可為不同於序列中所述彼等CDR之人類CDR。舉例而言，可使用來自本文所鑑別之適當序列之人類CDRH3及CDRL3區，其中CDRH1、CDRH2、CDRL1及CDRL2視情況選自替代物種或不同的人類抗體序列或其組合。舉例而言，本發明之CDR可替代市售相應嵌合或人類化抗體之CDR區。
本發明之特定實施例利用為人類成份之抗原結合蛋白支架成份。
"人類化抗體"通常係指以可變域構架區替代人類抗體中所見之序列的非人類抗體。通常，在人類化抗體中，除CDR外整個抗體係由人類來源之聚核苷酸編碼或除其CDR內外與此抗體相同。將CDR(一些或所有CDR係由來源於非人類生物體之核酸編碼)移植於人類抗體可變區之β摺疊構架上以產生抗體，該抗體之特異性由所移植之CDR決定。該等抗體之產生描述於(例如)WO 92/11018；Jones，1986,Nature 321 :522-525；Verhoeyen等人，1988,Science 239 :1534-1536中。人類化抗體亦可使用具有遺傳工程改造免疫系統之小鼠產生。Roque等人，2004,Biotechnol. Prog. 20 :639-654。在本發明中，所鑑別之CDR為人類的，且因此關於此點，人類化抗體與嵌合抗體包括一些非人類CDR；例如，可產生包含CDRH3及CDRL3區之人類化抗體，其中其他CDR區中之一或多者具有不同特殊來源。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為多特異性抗體，且尤其為雙特異性抗體，有時亦稱為"雙功能抗體"。該等抗體為結合至兩種(或更多種)不同抗原之抗體。雙功能抗體可以此項技術中已知之多種方法製造(Holliger及Winter，1993，Current Opinion Biotechnol. 4:446-449)，例如化學上製備或自雜交融合瘤(hybrid hybridoma)製備。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為完全人類抗體，亦即完全由人類成份組成之抗體。在此實施例中，如上所述，特定結構包含含有圖2A-圖2E、圖3A及圖3B中所述之CDR域之所述完整重鏈及完整輕鏈。其他實施例利用一或多種本發明之CDR以及來自其他人類抗體之其他CDR、構架區、J及D區、恆定區等。舉例而言，本發明之CDR可替代許多人類抗體、尤其市售相應抗體之CDR。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為抗體片段，亦即保留對α-或β-IL-18受體之結合特異性的本文所述任一抗體之片段。
特異性抗體片段包括(但不限於)(i)由VL、VH、CL及CH1域組成之Fab片段；(ii)由VL、VH、CL及CH1域加上重鏈鉸鏈區組成之Fab'片段；(ii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iii)由單一抗體之VL及VH域組成之Fv片段；(iv)由單一可變區組成之dAb片段(Ward等人，1989，Nature 341 :544-546)；(v)經分離CDR區；(vi)F(ab')2 片段，其為包含兩個連接之Fab'片段之二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域及VL域藉由肽連接子連接，該肽連接子能使兩個域結合以形成抗原結合位點(Bird等人，1988，Science 242 :423-426；Huston等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 :5879-5883)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)；及(ix)"雙功能抗體"或"三功能抗體"，其為藉由基因融合而構築之多價或多特異性片段(Tomlinson等人，2000，Methods Enzymol. 326 :461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 :6444-6448)。抗體片段可經修飾。舉例而言，分子可藉由併入連接VH及VL域之雙硫鍵而穩定化(Reiter等人，1996，Nature Biotech. 14 :1239-1245)。此外，如本文所述，該等片段之非CDR成份較佳為人類序列。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為微型抗體。微型抗體為包含與CH3域連接之scFv的最小化抗體樣蛋白。Hu等人，1996,Cancer Res. 56 :3055-3061。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為域抗體；參加例如美國專利第6,248,516號。域抗體(dAb)為抗體之功能性結合域，對應於人類抗體之重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)。dAB具有約13kDa或小於完整抗體尺寸之十分之一的分子量。dAB在多種宿主(包括細菌、酵母及哺乳動物細胞系統)中良好表現。此外，dAb極穩定且甚至在經受苛刻條件(諸如冰凍乾燥或熱變性)之後仍保留活性。參見例如美國專利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美國專利第2004/0110941號；歐洲專利0368684；美國專利6,696,245、WO04/058821、WO04/003019及WO03/002609。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為抗體融合蛋白或抗體片段融合物，諸如Fc融合物(有時在本文中總稱為"抗體共軛物")。共軛搭配物可為蛋白質的或非蛋白質的；後者通常在抗原結合蛋白(參見關於抗原結合蛋白之共價修飾的論述)上及在共軛搭配物上使用官能基產生。舉例而言，連接子在此項技術中已知；例如，如為人所熟知之同雙功能連接子或異雙功能連接子(homo-or hetero-bifunctional linker)(參見，1994 Pierce Chemical Company關於交聯劑之產品目錄、技術部分，第155-200頁，其以引用的方式併入本文中)。
合適共軛物包括(但不限於)如下所述標記物、藥物及細胞毒性劑，包括(但不限於)細胞毒性藥物(例如，化學治療劑)或毒素或該等毒素之活性片段。合適毒素及其相應片段包括白喉毒素A鏈(diptheria A chain)、外毒素A鏈(exotoxin A chain)、篦麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、麻瘋樹毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及其類似物。細胞毒性劑亦包括藉由使放射性同位素與抗原結合蛋白共軛、或使放射性核素與已與抗原結合蛋白共價連接之螯合劑結合而製備之放射化學試劑。其他實施例利用卡奇黴素(calicheamicin)、阿瑞他汀(auristatin)、格爾德黴素(geldanamycin)及美登素(maytansine)。
在一實施例中，IL-18抗原結合蛋白為抗體類似物，有時稱為"合成抗體"。舉例而言，新近多項工作利用替代蛋白質支架或具有移植CDR之人工支架。該等支架包括(但不限於)為穩定結合蛋白以及由(例如)生物相容性聚合物組成之完全合成支架之三維結構而引入的突變。參見例如，Korndorfer等人，2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics ，第53卷，第1期：121-129。Roque等人，2004,Biotechnol. Prog. 20 :639-654。此外，可使用肽抗體模擬物(peptide antibody mimetic，"PAM")以及基於利用纖維結合蛋白(fibronection)成份作為支架之抗體模擬物之支架。可用以產生IL-18抗原結合蛋白之替代支架評述於Hey等人，2005，Trends Biotechnol. 23 :514-22及Binz等人，Nature Biotechnology 23 :1257-68(兩者均以全文引用的方式併入本文中)中。
3. CDR變異體
本發明亦包括SEQ ID NO:89-190中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3胺基酸序列之變異體。因此變異CDR包括於如本文所用之CDR的定義內。該等變異體屬於三類中之一或多者：取代、***或缺失變異體，其中前者為特定的。
如此項技術中所已知，可使用許多不同程式以鑑別序列一致性或相似性程度，一蛋白質或核酸必為已知序列。
對於胺基酸序列而言，序列一致性及/或相似性藉由使用此項技術中已知之標準技術(包括(但不限於)Smith及Waterman，1981，Adv. Appl. Math. 2 :482之局部序列一致性演算法(local sequence identity algorithm)，Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443之序列一致性比對演算法(sequence identity alignment algorithm)，Pearson及Lipman，1988，Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85 :2444之相似性搜尋法(search for similarity method)，該等演算法之電腦化實施(Wisconsin遺傳學分析軟體包(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，由Devereux等人，1984，Nucl. Acid Res. 12 :387-395所述之Best Fit序列程式，較佳使用預設設定(default setting))，或藉由檢驗(inspection)確定。較佳地，百分比一致性係藉由基於以下參數之FastDB計算：失配罰分(mismatch penalty)為1；間隙罰分(gap penalty)為1；間隙尺寸罰分(gap size penalty)為0.33；且連接罰分(joining penalty)為30，"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis" ，Macromolecule Sequencing and Synthesis Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988)，Alan R. Liss,Inc。
有用演算法之實例為PILEUP。PILEUP使用漸進、成對比對自一組相關序列建立多重序列比對。其亦可繪製顯示用以建立比對之聚類關係之樹。PILEUP使用Feng及Doolittle，1987，J. Mol. Evol.35 :351-360之漸進比對方法之簡化形式；該方法類似於由Higgins及Sharp，1989，CABIOS5 :151-153所述之彼方法。有用PILEUP參數包括預設間隙權重值(default gap weight)3.00、預設間隙長度權重值(default gap length weight)0.10及加權末端間隙(weighted end gap)。
有用演算法之另一實例為以下文獻中所述之BLAST演算法：Altschul等人，1990，J. Mol. Biol. 215 :403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402；及Karin等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 :5873-5787。尤其有用之BLAST程式為WU-BLAST2程式，其獲自Altschul等人，1996，Methods in Enzymology 266 :460-480。WU-BLAST-2使用若干搜尋參數，其中大部分設為預設值。可調參數設定以下值：重疊跨距(overlap span)=1，重疊分數(overlap fraction)=0.125，字組閾值(word threshold)(T)=II。HSP S及HSP S2參數為動態值且視特定序列之組成及特定資料庫(針對其搜尋所關注序列)之組成而定，由程式本身確定；然而可調節該等值以提高靈敏性。
另一有用演算法為間隙BLAST(gapped BLAST)，如由Altschul等人，1993，Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402所報導。間隙BLAST使用BLOSUM-62替代計分(substitution score)；臨限值T參數設為9；觸發非間隙延長(ungapped extension)之兩次打擊法使間隙長度k改變10+k之值；Xu 設為16且Xg 設為40(對於資料庫搜尋階段)及67(對於演算法之輸出階段)。間隙比對係藉由相應於約22位元之計分觸發。
通常，針對本文所述序列而言，個別變異CDR之間的胺基酸同源性、相似性或一致性至少為80%，且更通常具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%之較佳增加的同源性或一致性。
以類似方式，關於本文所鑑別之結合蛋白之核酸序列的"百分比(%)核酸序列一致性"係定義為等同於抗原結合蛋白之編碼序列中之核苷酸殘基的候選序列中之核苷酸殘基百分比。特定方法利用設為預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中重疊跨距及重疊分數分別設為1及0.125。
通常，編碼個別變異CDR之核苷酸序列與本文所述核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性至少為60%，且更通常具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%之較佳增加的同源性或一致性。
核苷酸序列之間的同源性通常藉由其彼此雜交之能力來定義。本文提及之術語"選擇性雜交"意謂可偵測地及特異性地結合。根據本發明之聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在使與非特異性核酸之可偵測結合的明顯量最小化的雜交及洗滌條件下，選擇性地雜交至核酸鏈。可使用高嚴格條件以達成如此項技術中已知及本文所論述之選擇性雜交條件。
高嚴格條件在此項技術中已知；參見例如Sambrook等人，2001，同上及Short Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人編，John Wiley ＆ Sons，1992，兩者均以引用的方式併入本文中。嚴格條件具序列依賴性且在不同情況中不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。對核酸雜交之廣泛指導見於Tijssen，Techniques In Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes ，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)中。
通常，將嚴格條件選擇為在限定離子強度及pH值下低於特定序列之熱熔點(Tm)約5-10℃。Tm為在平衡狀態下與目標序列互補之探針50%與目標序列雜交之溫度(在限定離子強度、pH值及核酸濃度下)(當目標序列過量存在時，在Tm下，在平衡狀態下50%探針被佔用)。嚴格條件將為在pH值為7.0至8.3下鹽濃度小於約1.0M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)且對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少約30℃而對於長探針(例如大於50個核苷酸)而言為至少約60℃的彼等條件。亦可添加諸如甲醯胺之去穩定劑來達成嚴格條件。
在另一實施例中，使用不太嚴格的雜交條件；例如，如此項技術中所已知，可使用中或低嚴格條件；參見，Sambrook等人，2001，同上；Ausubel等人，1992，同上及Tijssen，1993，同上。
通常使用盒式突變或PCR突變或此項技術中所熟知之其他技術，藉由編碼抗原結合蛋白之DNA中之核苷酸的定點突變，以產生編碼變異體之DNA，且此後如本文所述在細胞培養物中表現重組DNA，來製備本發明之變異體。然而，包含具有多達約100-150個殘基之變異CDR的抗原結合蛋白片段可使用確定技術藉由活體外合成來製備。變異體通常展示與天然存在之類似物相同之定性生物活性，例如與IL-18受體結合及抑制信號傳導，儘管亦可選擇如以下更全面描述之具有經改變特徵之變異體。
因此，"變異CDR"為與本發明之親本CDR具有指定同源性、相似性或一致性之CDR且共有生物功能，包括(但不限於)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之親本CDR特異性及/或活性。舉例而言，變異體通常與以下所述之同一IL-18受體抗原決定基結合，且具有對IL-18受體信號傳導之類似抑制作用。
儘管預定引入胺基酸序列變異之位點或區域，但突變本身無需預定。舉例而言，為優化給定位點處突變之效能，可在目標密碼子或區域進行隨機突變且針對所要活性之最佳組合篩檢經表現之抗原結合蛋白CDR變異體。熟知在具有已知序列之DNA的預定位點處進行取代突變之技術，例如，M13引子突變及PCR突變。使用諸如IL-18受體結合之抗原結合蛋白活性之檢定進行突變體之篩檢。
胺基酸取代通常具有單一殘基；***通常為約一(1)至約二十(20)個胺基酸殘基，儘管可容許相當大的***。缺失範圍為約一(1)至約二十(20)個胺基酸殘基，儘管在一些情況下缺失可能大得多。
可使用取代、缺失、***或其任何組合以達成最終衍生物或變異體。通常該等改變在少數胺基酸上進行以最小化分子、尤其抗原結合蛋白之免疫原性及特異性之變化。然而，在某些情況下可能容許較大改變。當希望抗原結合蛋白之CDR的特徵發生較小變化時，通常根據如表2所示之以下圖表進行取代。
功能或免疫性之實質改變藉由選擇與表2中所示彼等取代相比較不保守之取代而進行。舉例而言，可進行更顯著影響變化區域中多肽主鏈之結構，例如α螺旋或β摺疊結構；在目標位點處分子之電荷或疏水性；或側鏈體積(bulk)的取代。一般而言期望多肽之特性產生最大變化之取代為(a)用親水性殘基(例如絲胺醯基或蘇胺醯基)取代(或反之)疏水性殘基(例如白胺醯基、異白胺醯基、***醯基、纈胺醯基或丙胺醯基)；(b)用半胱胺酸或脯胺酸取代(或反之)任何其他殘基；(c)用具有正電性側鏈之殘基(例如離胺醯基、精胺醯基或組胺醯基)取代(或反之)負電性殘基(例如麩胺醯基或天冬胺醯基)；或(d)用具有大體積(bulky)側鏈之殘基(例如***酸)取代(或反之)不具有側鏈之殘基(例如甘胺酸)之彼等取代。
變異體通常展示與天然存在之類似物相同之定性生物活性且引發與其相同之免疫反應，儘管需要時亦可選擇變異體來改變抗原結合蛋白的特徵。載者，可設計變異體以致改變抗原結合蛋白之生物活性。舉例而言，可如本文所述改變或移除糖基化位點(glycosylation site)。
4. VH及VL變異體
如上所述，在本發明之一些實施例中提供分別包含以下各物或分別由以下各物組成之抗原結合蛋白：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17之重鏈可變區及/或SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34之輕鏈可變區或其片段，如上所定義。因此，在彼等實施例中，抗原結合蛋白不僅包含至少一個SEQ ID NO:1-34中所述之CDR或其變異體，而且包含至少部分所述構架序列。此外，本發明涵蓋該等重鏈可變序列或輕鏈可變序列之變異體。
"變異VH"或"變異重鏈可變區"及"變異VL"或"變異輕鏈可變區"通常與本文中所述之彼等可變區共有至少80%之胺基酸同源性、相似性或一致性，且更通常具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%之較佳增加的同源性或一致性。編碼個別變異VH及VL之核苷酸序列與本文所述核酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性為與本文中所述之彼等核酸序列至少為60%，且更通常具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%之較佳增加的同源性或一致性。此外，"變異VH"或"變異重鏈可變區"及"變異VL"或"變異輕鏈可變區"通常共有生物功能，包括(但不限於)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之親本CDR特異性及/或活性。舉例而言，變異體通常與以下所述之同一IL-18受體抗原決定基結合，且具有對IL-18受體信號傳導之類似抑制作用。
上文概述產生變異體之方法以及確定序列同源性、相似性及一致性的方法，參見V.B.1部分。
在一些實施例中，亦可包括恆定區變異體。較佳之恆定區變異體包括改變含有該變異之抗體的生物功能之彼等變異體。舉例而言，抗體可含有改變抗體活化互補序列或誘導抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)之能力的變異。該等變異體可包括產生抗體之糖基化變化的彼等變異。
C. IL-18受體及IL-18受體抗原決定基
本文之"IL-18受體"或"IL-18R"意謂與配位體(包括(但不限於)IL-18)結合之細胞表面受體，且因此在細胞內起始信號轉導途徑。IL-18受體複合物由稱為"α-IL-18受體"(α-IL-18R)或"IL-18Rα鏈"之IL-18結合鏈及稱為"β-IL-18受體"("β-IL-18R")或"IL-18Rβ鏈"之信號鏈組成。如本文所用之術語"IL-18受體"總體而言係指α-及β-IL-18受體。
本文所揭示之抗原結合蛋白與IL-18Rα鏈結合，其中之人類胺基酸序列描述於SEQ ID NO:69(其核酸序列描述於SEQ ID NO:70中)中，或與IL-18Rβ鏈結合，其中之人類胺基酸序列描述於SEQ ID NO:71(其核酸序列描述於SEQ ID NO:72中)中。在一特定實施例中，IL-18受體為人類受體，儘管在一些情況下，可使用其他物種。此外，如下所述，IL-18受體蛋白亦可包括片段。
如下所述，抗原結合蛋白與特定抗原決定基之結合為特異性的。
"抗原決定基"、"抗原決定子"及本文中語法上等效詞彙意謂抗原(例如IL-18受體)中可被抗原結合蛋白特異性結合之區域。如熟悉此項技術者所瞭解，抗原決定基可呈線性(linear)或結構性(conformational)。"線性抗原決定基"係指包含以線性方式連接之至少約五(5)個且不大於約二十(20)個胺基酸之序列的抗原決定基，該等胺基酸自身或作為較大序列之部分，與本發明之抗原結合蛋白結合。"結構性抗原決定基"係指三維、二級及/或三級結構可為抗體結合之實質態樣的抗原決定基。通常但非一律地，包含結構性抗原決定基之胺基酸不包含蛋白質一級結構的線性序列。因此，結構性抗原決定基可由具有非同源線性胺基酸序列之蛋白質所共有。不受理論束縛，結構性抗原決定基可共有，此係因為由抗體所辨識之三級結構可共有於兩個或兩個以上胺基酸序列之間。在一實施例中，合適IL-18受體抗原決定基包括由本發明之抗原結合蛋白所辨識之任何抗原決定基。
本發明提供在人類IL-18Rα之第三Ig域(尤其由胺基酸殘基243-271所界定之區域)中辨識結構性抗原決定基(由SEQ ID NO：69之胺基酸殘基250-253(亦即，殘基MFGE)及胺基酸殘基267-271(亦即，殘基MRIMT)構成)且與結構性抗原決定基結合之抗原結合蛋白。該抗原決定基之胺基酸結構描述於圖5中。與此抗原決定基結合之抗原結合蛋白在阻斷IL-18與IL-18R之相互作用方面尤其有效。此項技術中熟知確定抗原結合蛋白之結合抗原決定基之方法且一種方法描述於本文之實例4中。
實例4證實當由胺基酸243-271所界定之抗原決定基內之殘基(例如250-253或267-271)轉變為相應小鼠殘基時，某些人類IL-18R抗原結合蛋白結合人類IL-18Rα之能力顯著降低。因此，本文提供與人類IL-18R結合之抗原結合蛋白，但當人類IL-18Rα鏈之殘基250-253經相應小鼠胺基酸取代時，該結合降低。本文亦提供與人類IL-18R結合之抗原結合蛋白，但當人類IL-18Rα鏈之殘基267-271經相應小鼠胺基酸取代時，該結合降低。
D.抗原結合蛋白之共價修飾
抗原結合蛋白之共價修飾包括於本發明之範疇內且通常(但並非總是)轉譯後進行。舉例而言，藉由使抗原結合蛋白之特定胺基酸殘基與能夠與選定側鏈或N-末端殘基或C-末端殘基反應之有機衍生劑反應，將幾種類型之抗原結合蛋白共價修飾引入分子中。
半胱胺醯基殘基最通常與α-鹵代乙酸(及相應胺)(諸如氯乙酸或氯乙醯胺)反應，以得到羧甲基或羧胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦可藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯泵苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應來衍生。
組胺醯基殘基可藉由在pH5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)反應來衍生，此係由於此試劑對組胺醯基側鏈具有相對特異性。亦可使用對溴苯甲醯甲基溴(para-bromophenacyl bromide)；反應較佳在pH6.0下在0.1M二甲胂酸鈉(sodium cacodylate)中進行。
離胺醯基及胺基末端殘基可與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。以該等試劑衍生具有使離胺醯基殘基電荷相反之作用。其他適用於衍生含有α-胺基之殘基的試劑包括醯亞胺酯(imidoester)類，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate)、吡多醛(pyridoxal)、硼氫化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮及與乙醛酸酯(glyoxylate)之轉胺酶催化反應。
精胺醯基殘基藉由與一或若干種習知試劑(尤其苯基乙二醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮(ninhydrin))反應而得以修飾。精胺酸殘基的衍生需要使反應在鹼性條件下進行，此係由於胍官能基具有高pKa 。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
酪胺醯基殘基之特定修飾(尤其關注的為將光譜標記物引入酪胺醯基殘基中)可藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應來進行。最常見地，N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷分別用以形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用125 I或131 I將酪胺醯基殘基碘化，以製備放射免疫檢定中所使用之經標記蛋白質，上述氯胺(chloramine)T方法為合適的。
羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N-R')(其中R及R'視情況為不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺)反應而選擇性修飾。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基可藉由與銨離子反應轉化為天冬醯胺醯基及麩胺醯胺醯基殘基。
以雙功能試劑衍生適用於使抗原結合蛋白與用於多種方法中之水不溶性支撐基質或表面交聯。常用之交聯劑包括例如，1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯(例如，與4-疊氮水楊酸之酯)、同雙功能醯亞胺酯(homobifunctional imidoester)，包括二琥珀醯亞胺酯，諸如3,3'-二硫基雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)，及雙功能順丁烯二醯亞胺，諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷。諸如甲基-3-[(對-疊氮苯基)二硫基]丙醯亞胺酯之衍生劑產生能夠在有光時形成交聯之光可活化中間體。或者，反應性、水不溶性基質，諸如溴化氰活化碳水化合物及美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中所述之反應性基質，用於蛋白質固定。
通常分別將麩胺醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基去醯胺基化為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，在略酸性條件下將該等殘基去醯胺基化。該等殘基之任一形式屬於本發明之範疇內。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基之羥基的磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T. E. Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W. H. Freeman＆Co.,San Francisco，第79-86頁[1983])、N-末端胺之乙醯化及任何C-末端羧基之醯胺化。
1.糖基化 (Glycosylation)
包括於本發明範疇內之抗原結合蛋白之另一類型共價修飾包含改變蛋白質之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如，存在或不存在以下所述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分連結至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促連結至天冬醯胺側鏈之辨識序列。為此，此等三肽序列中之任一者在多肽中的存在產生潛在糖基化位點。經O連接之糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連結至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗原結合蛋白添加糖基化位點通常藉由改變胺基酸序列，以使得其含有上述三肽序列中一或多者(對於N連接糖基化位點)來方便地完成。亦可藉由向起始序列添加(或取代)一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來造成改變(對於O連接糖基化位點)。簡單起見，抗原結合蛋白胺基酸序列較佳經由DNA水準之變化而改變，尤其藉由在預先選定之鹼基處使編碼目標多肽之DNA突變以便產生將會轉譯為所要胺基酸之密碼子。
提高抗原結合蛋白上之碳水化合物部分數目之其他方法為藉由醣苷(glycoside)化學或酶促偶合至蛋白質。該等程序的有利之處在於其不需要在宿主細胞中產生具有N連接或O-連接糖基化之糖基化能力的蛋白質。視所用偶合模式而定，可將該(等)糖連結至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基，諸如半胱胺酸之彼等巰基、(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等羥基、(e)芳族殘基，諸如***酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基、或(f)麩胺醯胺之醯胺基。該等方法描述於1987年9月11日公開之WO 87/05330及Aplin及Wriston，1981，CRC Crit. Rev. Biochem. ，第259-306頁中。
存在於起始抗原結合蛋白上之碳水化合物部分的移除可化學或酶促法完成。化學去糖基化需要將蛋白質暴露至化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的絕大多數或所有糖裂解，而使多肽完整。化學去糖基化係由Hakimuddin等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 ：52及Edge等人，1981，Anal. Biochem. 118 ：131描述。多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用如由Thotakura等人，1987，Meth. Enzymol. 138 ：350所述之多種內醣苷酶及外醣苷酶而達到。在潛在糖基化位點處的糖基化可藉由使用如由Duskin等人，1982，J. Biol. Chem. 257 ：3105所述之化合物衣黴素(tunicamycin)防止。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷鍵合形成。
2.聚乙二醇化
抗原結合蛋白之另一類型共價修飾包含以美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所闡明之方式，使抗原結合蛋白與各種非蛋白質聚合物連接，該等非蛋白質聚合物包括(但不限於)各種多元醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylene)。此外，如此項技術中所已知，胺基酸取代可在抗原結合蛋白內之各位置進行以利於添加諸如聚乙二醇(PEG)之聚合物。
3.標記物(label)及效應基團(effector group)
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白之共價修飾包含添加一或多種標記物。
術語"標記基團"意謂任何可偵測標記物。合適標記基團之實例包括(但不限於)以下各物：放射性同位素或放射性核素(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)、螢光基團(例如，FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶基團(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二次報導體(secondary reporter)所辨識之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤(epitope tag))。在一些實施例中，將標記基團經由各種長度的間隔臂與抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法在此項技術中已知且可用以實施本發明。
術語"效應基團"意謂與充當細胞毒性劑之抗原結合蛋白偶合之任何基團。合適效應基團之實例為放射性同位素或放射性核素(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)。其他合適基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。合適基團之實例包括卡奇黴素、阿瑞他汀、格爾德黴素及美登素。在一些實施例中，將效應基團經由各種長度的間隔臂與抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。
一般而言，標記物屬於多種類別(視用於其偵測之檢定而定)：a)同位素標記物，其可為放射性或重同位素；b)磁性標記物(例如，磁性顆粒)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素化基團；及f)由二次報導體辨識之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，將標記基團經由各種長度的間隔臂與抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法在此項技術中已知且可用以實施本發明。
特定標記物包括光學染料，包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，其中在許多情形中後者為特定的。螢光團可為"小分子"螢光體(fluores)或蛋白質螢光體。
"螢光標記物"意謂可經由其固有螢光特性偵測之任何分子。合適螢光標記物包括(但不限於)螢光素(fluorescein)、若丹明、四甲基若丹明、曙紅(eosin)、藻紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基香豆素(methyl-coumarin)、芘(pyrene)、孔雀綠(Malacite green)、(sti1bene)、螢蝦黃(Lucifer Yellow)、級聯藍J(Cascade BlueJ)、德州紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、A1exa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、級聯藍、級聯黃及R-藻紅素(phycoerythrin，PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、若丹明及德州紅(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy 5.5、Cy 7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。包括螢光團在內之合適光學染料描述於Richard P.Haugland之分子探針手冊(Molecular Probes Handbook)中，其藉此以引用的方式明確併入。
合適蛋白質螢光標記物亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白，包括水母(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)物種之綠色螢光蛋白(GFP)(Chalfie等人，1994，Science 263 ：802-805)、增強型綠色螢光蛋白(EGFP)(Clontech Laboratories,Inc.，Genbank登錄號U55762)，藍色螢光蛋白(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve BlVd. West，第8層，Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9:Stauber，1998，Biotechniques 24 ：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol. 6 ：178-182)，增強型黃色螢光蛋白(E YFP，Clontech Laboratories,Inc.)，螢光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol. 150 ：5408-5417)，β-半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A. 85 :2603-2607)及水母(Renilla)(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。以上引用之參考文獻全部以引用的方式明確併入本文中。
E.編碼IL-18受體抗原結合蛋白之聚核苷酸
在某些方面中，本發明提供編碼SEQIDNO：1-34、73、75、77、79、81、83、85、87、89-190之IgG、可變區及CDR之核酸分子。在一實施例中，核酸具有SEQ ID NO:35-68、74、76、78、80、82、84、86、88及191-292中之任一者的核苷酸序列。
如本文所述，可變區或CDR核酸分別編碼可變區或CDR蛋白質。本文之"核酸"意謂任何核酸，包括DNA與RNA。本發明之核酸通常為聚核酸(polynucleic acid)；亦即，由3',5'磷酸二酯鍵共價連接之個別核苷酸之聚合物。
視用途而定，核酸可為雙股、單股或含有雙股或單股序列之部分。如由熟習此項技術者所瞭解，單個股("Watson")之描述亦定義另一股("Crick")之序列；因此SEQ ID NO:35-68中所述之核酸序列亦包括該等序列之互補序列。本文之術語"重組核酸"意謂一般藉由經核酸內切酶操作核酸，以自然界中不常見之形式最初活體外形成之核酸。因此，出於本發明之目的，將線性形式之經分離抗原結合蛋白核酸或藉由連接正常地未連接之DNA分子而活體外形成之表現載體皆視為重組的。應瞭解，一旦製得重組核酸並將其再引入宿主細胞或生物體中，則其將非重組複製，亦即使用宿主細胞之活體內細胞機制而非活體外操作；然而，出於本發明之目的，曾經重組產生之該等核酸(儘管之後非重組地複製)仍被視為重組的。
如熟習此項技術者所瞭解，由於遺傳密碼之簡並性(degeneracy)，故可製備非常多的核酸，所有該等核酸均編碼本發明之CDR(及抗原結合蛋白之重鏈及輕鏈或其他成份)。因此，若已鑑別一特定胺基酸序列，諸如SEQIDNO：1-34，則熟習此項技術者可藉由以不改變所編碼蛋白質之胺基酸序列的方式簡單修改一或多個密碼子之次序而製備許多不同核酸。
F.產生抗原結合蛋白之方法
本發明亦提供呈質體形式之表現系統及構築體、表現載體、轉錄或表現卡匣，其包含至少一種如上之聚核苷酸。此外，本發明提供包含該等表現系統或構築體之宿主細胞。
通常，用於任一宿主細胞之表現載體將含有用於質體維持及用於選殖及表現外源核苷酸序列之序列。在某些實施例中，總稱"接序列(flanking sequence)"之該等序列通常包括以下核苷酸序列中之一或多者：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列(complete intron sequence)、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷化序列(polyadenylation sequence)、用於***編碼待表現之多肽之核酸的多酶切點接頭區(polylinkerregion)，及可選標記(marker)元件。以下論述該等序列中之每一者。
視情況，載體可含有編碼"標籤(tag)"之序列，亦即位於IL-18受體抗原結合蛋白編碼序列的5'或3'末端之寡核苷酸分子；寡核苷酸序列編碼多聚His(polyHis)(諸如6His(hexaHis))，或另一"標籤"，諸如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)，或myc，存在針對其之市售抗體。該標籤通常在多肽表現之後融合至多肽，且可用作自宿主細胞親和純化或偵測IL-18受體抗原結合蛋白的方法。親和純化可藉由例如管柱層析法，使用針對該標籤之抗體作為親和基質來完成。視情況，標籤隨後可藉由各種方法(諸如使用某些用於裂解之肽酶)自經純化之IL-18受體抗原結合蛋白移除。
側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同的物種及/或菌株)、異源(亦即來自不同於宿主細胞物種或菌株之物種)、雜交(亦即來自多於一種來源之側接序列的組合)、合成或天然的。因而，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何有脊椎或無脊椎生物體、或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機制中起作用且可由宿主細胞機制活化。
適用於本發明之載體的側接序列可藉由此項技術中所熟知之若干方法中的任一者獲得。通常，本文適用之側接序列藉由定位(mapping)及/或藉由限制性核酸內切酶消化而預先鑑別且因此可使用適當限制性核酸內切酶自正確組織來源分離。在一些情況下，可能已知側接序列之全核苷酸序列。此處，側接序列可使用本文所述用於核酸合成或選殖之方法合成。
不管側接序列為全部還是僅一部分已知，其均可使用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)及/或藉由用合適探針(諸如來自同一或另一物種之寡核苷酸及/或側接序列片段)篩檢基因組庫(genomic library)來獲得。在側接序列係未知之情況下，可自可能含有(例如)編碼序列或甚至另一或多種基因之較大片DNA分離含有側接序列之DNA片段。可藉由限制性核酸內切酶消化產生正確DNA片段，之後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen管柱層析(Chatsworth,CA)或熟悉此項技術者所已知之其他方法分離而完成分離。用以完成此目的之合適酶選擇對於一般熟習此項技術者將顯而易見。
複製起點通常為彼等市售原核表現載體之一部分，且起點有助於在宿主細胞中擴增載體。若所選載體不含複製起點位點，則可基於已知序列進行化學合成並連接到載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs，Beverly MA)之複製起點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，且各種病毒起源(例如，SV40、多瘤病毒(polyoma)、腺病毒(adenovirus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitus virus，VSV)或乳頭瘤病毒(papillomaviruses)(諸如HPV或BPV))適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。通常，對於哺乳動物表現載體而言，不需要複製起點成份(例如，通常僅使用SV40起點，此係因為其亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之3'末端且用以終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為富含G-C之片段，之後為多聚T(poly-T)序列。雖然該序列易於自庫中選殖或甚至以載體之部分購買，但其亦可易於使用核酸合成方法(諸如本文所述之彼等方法)合成。
可選擇標記基因編碼在選擇性培養基中所生長之宿主細胞的存活及生長所必需之蛋白質。典型選擇標記基因編碼(a)對原核宿主細胞賦予抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))抗性；(b)補充細胞之營養缺陷型缺乏(auxotrophic deficiency)；或(c)提供不能自複合培養基或限定培養基獲得之關鍵養分的蛋白質。特定可選標記為康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。有利地，新黴素(neomycin)抗性基因亦可用以在原核及真核宿主細胞中的選擇。
其他可選基因可用以擴增將要表現之基因。擴增為其中產生對生長或細胞存活關鍵之蛋白質所必需的基因於連續多代重組細胞之染色體內協力重複之過程。適用於哺乳動物細胞之可選標記之實例包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)及無啟動子胸苷激酶(promoterless thymidine kinase)基因。將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力之下，其中僅轉型體藉助於存在於載體中之可選基因獨特地適應於存活。選擇壓力藉由在培養基中選擇試劑之濃度連續升高之條件下培養轉型細胞，藉此導致可選基因及編碼另一基因(諸如與IL-18受體多肽結合之抗原結合蛋白抗體)之DNA擴增而施加。作為結果，諸如IL-18受體抗原結合蛋白之大量多肽由擴增之DNA合成。
核糖體結合位點通常為rnRNA之轉譯起始所必需且特徵為Shine-Dalgamo序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件位於啟動子之3'末端及待表現之多肽的編碼序列之5'末端。
在諸如在真核宿主細胞表現系統中需要糖基化之一些情況下，可利用各種前導肽(presequence)或前序列(prosequence)改良糖基化或產率。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點或添加亦可影響糖基化之前序列。最終蛋白質產物可能在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個易於表現之其他胺基酸，該等胺基酸可不完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可能具有在肽酶裂解位點中所見之連結至胺基末端之一或兩個胺基酸殘基。或者，使用一些酶裂解位點可產生所要多肽之略截短形式(若酶在成熟多肽內之該區域切斷)。
本發明之表現及選殖載體通常含有由宿主生物體所辨識且與編碼IL-18受體抗原結合蛋白之分子可操作地連接之啟動子。啟動子為位於結構基因之起始密碼子上游(亦即5'末端)(通常在約100至1000bp內)而控制結構基因之轉錄之非轉錄序列。習知將啟動子歸為兩類：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子在其控制下回應於培養條件之一些改變(諸如存在或不存在養分或溫度改變)，起始自DNA之增加程度的轉錄。另一方面，組成性啟動子一致地轉錄其可操作地連接之基因，亦即幾乎不控制基因表現。熟知由多種潛在宿主細胞所辨識之大量啟動子。合適啟動子藉由利用限制性酶消化自來源DNA移除啟動子並將所要啟動子序列***載體中，而與編碼構成本發明之IL-18受體抗原結合蛋白之重鏈或輕鏈之DNA可操作地連接。
此項技術中亦熟知適合用於酵母宿主之啟動子。酵母強化子有利地與酵母啟動子一起使用。適合用於哺乳動物宿主細胞之啟動子已熟知，包括(但不限於)獲自病毒之基因組之啟動子，該等病毒諸如多瘤病毒(polyoma virus)、雞痘病毒(fowlpox virus)、腺病毒(adenovirus)(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒(bovine papilloma virus)、禽類肉瘤病毒(avian sarcoma virus)、巨細胞病毒(cytomegalo-virus)、反轉錄病毒(retroviruses)、B型肝炎病毒(hepatitis-Bvirus)及最佳猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)。其他適合之哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克(heat-shock)啟動子及肌動蛋白(actin)啟動子。
可能受到關注之其他啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290 :304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A. 81 :659-663)；勞氏(Rous)肉瘤病毒之3'端長重複序列所含有之啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22 :787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78 :1444-1445)；金屬硫蛋白(metallothionine)基因之啟動子及調節序列(Prinster等人，1982,Nature 296 :39-42)；及原核啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75 :3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80 :21-25)。亦關注以下動物轉錄控制區，其展示組織特異性且已用於轉殖基因動物中：在胰腺腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶I型基因控制區(Swift等人，1984,Cell 38 ：639-646；Ornitz等人，1986,ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol. 50 ：399-409；MacDonald,1987,Hepato-logy 7 ：425-515)；在胰腺β-細胞中具有活性之胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315 ：115-122)；在淋巴細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell 38 ：647-658；Adames等人，1985,Nature 318 ：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol. 7 ：1436-1444)；在睾丸、***、淋巴及肥大細胞中具有活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell 45 ：485-495)；在肝臟中具有活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes and Devel. 1 ：268-276)；在肝臟中具有活性之α-胎兒蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol. 5 ：1639-1648；Ham mer等人，1987,Science 253 ：53-58)；在肝臟中具有活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987,Genes and Devel. 1 ：161-171)；在骨髓細胞中具有活性之β-血球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315 ：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46 ：89-94)；在腦之寡突細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987,Cell ，48 ：703-712)；在骨骼肌中具有活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani，1985,Nature 314 ：283-286)；及在下丘腦中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,Science 234 :1372-1378)。
可將強化子序列***載體中以增強較高級真核生物之編碼構成本發明之IL-18受體抗原結合蛋白之輕鏈或重鏈之DNA的轉錄。強化子為DNA之順式作用元件，通常長度約10-300bp，其作用於啟動子以增強轉錄。強化子不太依賴取向及位置，已在轉錄單元之5'及3'末端多個位置發現。已知可自哺乳動物基因獲得的若干強化子序列(例如，血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α胎兒蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知之SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活化真核啟動子之例示性增強元件。雖然強化子可在載體中位於編碼序列之5'或3'末端處，但其通常位於啟動子之5'末端位點處。可將編碼適當天然或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視將要產生抗體之宿主細胞的類型而定，且異源信號序列可替代天然信號序列。在哺乳動物宿主細胞中起作用之信號肽實例包括以下各物：美國專利第4,965,195號中所述之介白素-7(IL-7)之信號序列；Cosman等人，1984，Nature 312:768中所述之介白素-2受體之信號序列；歐洲專利第0367 566號中所述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述之I型介白素-1受體信號肽；歐洲專利第0 460 846號中所述之II型介白素-1受體信號肽。
本發明之表現載體可由諸如市售載體之起始載體構築。該等載體可能含有或可能不含有所有所要的側胺序列。在本文所述之側接序列中之一或多者尚未存在於載體中之情況下，其可個別獲得且連接到載體中。熟習此項技術者熟知獲得側接序列中之每一者所用之方法。
在載體己構築且編碼構成IL-18受體抗原結合序列之輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈之核酸分子已***載體中正確位點之後，可將所完成的載體***合適宿主細胞中用於擴增及/或多肽表現。將IL-18受體抗原結合蛋白之表現載體轉型至選定宿主細胞中可藉由熟知方法完成，該等方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染或其他已知技術。所選方法部分程度上隨所用宿主細胞之類型而變。該等方法及其他合適方法為熟悉此項技術者所熟知且例如在Sambrook等人，2001，同上中闡明。
當在適當條件下培養時，宿主細胞合成IL-18受體抗原結合蛋白，之後該IL-18受體抗原結合蛋白可自培養基(若宿主細胞將其分泌至培養基中)中或直接自產生其之宿主細胞(若不分泌)中收集。適當宿主細胞之選擇將視各種因素而定，諸如所要表現程度、活化所希望或所必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物活性分子之容易性。
可以用於表現之宿主形式獲得之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知且包括(但不限於)可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之永生化細胞株，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CH O)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(baby hamster kidney，BHK)細胞、猴子腎細胞(monkey kidney cell，COS)、人類肝細胞癌瘤細胞(例如，Hep G2)及許多其他細胞株。在某些實施例中，細胞株可經由確定哪些細胞株具有高表現程度且組成性地產生(constitutively produce)具有IL-18受體結合特性之抗原結合蛋白而選擇。 在另一實施例中，可選擇來自不製備其自身抗體但具有製備及分泌異源抗體能力之B細胞譜系之細胞株。
G.IL-18受體抗原結合蛋白用於診斷及治療目的之用途
本發明之抗原結合蛋白適用於在生物樣本中偵測IL-18受體及鑑別產生IL-18受體蛋白之細胞或組織。與IL-18受體特異性結合之本發明之抗原結合蛋白可用於治療需要治療之患者的IL-18受體介導之疾病。舉例而言，本發明之IL-18受體抗原結合蛋白可用於診斷檢定中，例如偵測及/或量化組織或細胞中所表現之IL-18受體之結合檢定。此外，本發明之IL-18受體抗原結合蛋白可用以阻止IL-18受體與其配位體(例如IL-18)形成複合物，藉此調節細胞或組織中IL-18受體之生物活性。因此，與IL-18受體結合之抗原結合蛋白可調節及/或阻斷與其他結合化合物之相互作用且因而在改善IL-18受體介導之疾病中可具有治療用途。在特定實施例中，IL-18受體抗原結合蛋白可阻斷IL-18與其受體結合，從而可導致由IL-18受體誘導之信號轉導級聯之破壞。
1.適應症
在疾病發病機理中IL-18含量增加及/或IL-18介導信號牽連已於多種病狀及疾病中證實。因此本發明之抗原結合蛋白用以調節或抑制免疫反應且在治療及預防由過度免疫反應所引起之各種疾病中具有功效(參見，WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；Mallat等人，2002，Circ. Res. 91:441-448)。因此，本發明之IL-18受體抗原結合蛋白可用於診斷、預防或治療與IL-18相關之疾病或病狀。
與IL-18相關之疾病或病狀意謂在患者中之發作係由IL-18與IL-18受體的相互作用引起或阻止的任何疾病或病狀。疾病或病狀之嚴重性亦可藉由IL-18與IL-18受體之相互作用增強或減弱。舉例而言，IL-18與以下疾病有關：自體免疫疾病(WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；Mallat等人，2002，Circ. Res. 91:441-448)、肝病(Finitto等人，2004，Liver 53:392-400；Tsutsui等人，2000，Immunological Reviews 174:192-209；Ludwiczek等人，2002，J. Clinical Immunology 22:331-337)、胰臟疾病及心血管疾病(Gerdes等人，2002，J. Exp. Med. 195:245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；Raeburn等人，2002，Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283:H650-H657)。
與IL-18相關之自體免疫疾病之實例包括牛皮癬、發炎性關節炎(諸如類風濕性關節炎)(WO2005/063290；Cannetti等人，2003，J. Immunol. 171:1009-1015；Charles等人，1999，J. Immunol. 163:1521-1528；Cunnane等人，2000，Online J. Rheumatol. 27:58-63；Yoshimoto，1998，J. Immunol. 161:3400-3407)、狼瘡(WO2005/063290)、I型糖尿病、II型糖尿病、克羅恩氏病(Crohn's disease)(Niederau，1997，Online NLM、發炎性腸病(WO2004/002519)、多發性硬化症、自體免疫性肝炎(Tsutsui等人，2000，同上)、原發性膽汁性肝硬化症(primary biliary cirrhosis，PBC)、後天性免疫不全症候群(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、異位性皮膚炎(Konishi等人，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:11340-11345)、重症肌無力及肉狀瘤病。
在類風濕性關節炎中，已證實在患者血清及滑液中有增高含量之成熟IL-18。在一些研究中，證實IL-18含量與疾病活性及對疾病修飾治療(disease modifying treatment)之反應有關。在全身型幼年特發性關節炎及密切相關之成人發作型史提爾氏病中始終量測到IL-18之極高血清含量。WO2005/063290；Cannetti等人，2003，J. Immunol. 171:1009-1015；Charles等人，1999，J. Immunol. 163:1521-1528；Cunnane等人，2000，Online J. Rheumatol. 27:58-63；Yoshimoto，1998，J. Immunol. 161:3400-3407。
與IL-18相關之其他形式之關節炎包括例如，僵直性脊椎炎、背痛、腕淤積症候群(carpal deposition syndrome)、埃勒斯-當洛二氏症候群(Ehlers-Danlos-Syndrome)、痛風(gout)、幼年型關節炎、紅斑狼瘡、肌炎、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、骨質疏鬆症、多動脈炎；多肌炎、牛皮癬性關節炎、雷德氏症候群(Reiter's syndrome)、硬皮病(scleroderma)、伴有腸疾病之關節炎、貝西氏病(Behcets's disease)、兒童關節炎、退化性關節疾病、纖維肌痛症(fibromyalgia)、感染性關節炎、萊姆病(Lyme disease)、馬凡氏症候群(Marfan syndrome)、骨關節炎、骨壞死、帕傑特氏病(Pagets Disease)、風濕性多發肌痛(Polymyalgia rheumatica)、假性痛風(pseudogout)、反射***感神經失養症(reflex sympathetic dystrophy)、類風濕性關節炎、風濕症(rheumatism)、修格蘭氏症候群(Sjogren's syndrome)、家族性腺瘤性息肉症(familial adenomatous polyposis)及其類似疾病。Dai等人，2004，Arthritis Rheum. 50:432-443；Kawashima等人，2004，Online Arthritis Res. Ther. 6:R39-R45；Myers等人，2004，Rheumatology 43:272-276；Wei等人，2001，American Association Of Immunologists，第517-521頁。
當與患有潰瘍性結腸炎或非發炎性腸病之患者相比時，亦在患有克羅恩氏病之患者中發現高含量之IL-18。腸上皮細胞與固有層(lamina propria)單核細胞均已當場(in situ)鑑別為IL-18產生增加之來源。已證實克羅恩氏病病灶以IL-18R表現細胞浸潤。 Niederau，1997,Online NLM。
亦已暗示IL-18與潰瘍性結腸炎及腹腔病相關。
已證實來自患有多發性硬化症之患者的中樞神經系統(CNS)病灶、腦脊髓液及血清含有增加含量之IL-18訊息或蛋白質。在病灶中，認為微神經膠質細胞(microglia)及巨噬細胞(macrophage)為IL-18之來源。在患有非發炎性CNS疾病之個體之對照組織活檢中不能偵測到IL-18。尤其在患有復發-緩解型(relapsing-remitting)疾病之患者子群中已發現高含量之IL-18；且已發現與緩解期間相比，在復發期間IL-18含量增加。Huang等人，2004，Mult. Scler. 10:482-7；Kami等人，2002，J. Neuroimmunol. 125:134-40；Losy等人，2001，Acta Neurol. Scand. 104:171-3；Nicoletti等人，2001，Neurology 57:342-4；Fassbender等人，1999，Neurology 53:1104-6。
在患有牛皮癬之患者中，報導IL-18之血清含量增加，其與皮膚病變之程度及PASI計分有關。已在病變皮膚中證實與非病變或正常皮膚對照組相比，IL-18與IL-18RmRNA之過度表現。文獻所證明的在牛皮癬皮膚中IFN-γ及TNF-α之過度表現與由IL-18發揮之生物活性一致。Arican等人，2005，Mediators Inflamm. 2005:273-9；Piskin等人，2004，Exp. Dermatol. 13:764-72；Companjen等人，2004，Eur. Cytokine Netw. 15:210-6；Pietrzak等人，2003，Acta Derm. Venereol. 83:262-5。
各種其他自體免疫疾病與患病組織中或血清中增加之IL-18含量相關。該等疾病包括全身性紅斑狼瘡、異位性皮膚炎、重症肌無力、I型糖尿病及肉狀瘤病。IL-18亦可能牽連於哮喘、阿茲海默氏病、過敏性鼻炎、特發性血小板減少性紫癡(ITP)、移植及移植體抗宿主疾病(GvHD)中。
IL-18亦牽連於肝臟或肝病中且牽連於與肝臟損害或損傷相關之病狀中。肝臟損害或損傷可能具有各種病因。例如，其可能係由於病毒或細菌感染、酒精濫用、免疫失調或癌症。肝臟損傷亦包括膽管之損害，及在諸如酒精性肝炎、肝硬化、病毒性肝炎、原發性膽汁性肝硬化症及酒精相關肝壞死性發炎(alcohol-related hepatic necro-inflammation)之病狀中肝臟之損害。Finitto等人，2004，Liver 53:392-400；Tsutsui等人，2000，Immunological Reviews 174:192-209；Ludwiczek等人，2002，J. Clinical Immunology 22：331-337。
與IL-18相關之肝病包括C型肝炎及B型肝炎。IL-18已牽連於自體免疫性與傳染性肝炎之發病機理中。據認為其經由上調促凋亡分子(proapoptotic molecule)(包括FasL)而促使肝細胞死亡。已提議C型肝炎中干擾素-α之有益作用可經由降低之IL-18含量而介導。相反，IL-18投與在B型肝炎之轉殖基因模型中具有有益作用，從而經由增加之NK及CTL活性改良病毒清除。Finitto等人，2004，Liver 53:392-400；Tsutsui等人，2000，Immunological Reviews 174:192-209；Ludwiczek等人，2002，J. Clinical Immunology 22：331-337。
除B及C型肝炎病毒外，迄今為止已發現導致病毒相關肝炎之至少4種其他病毒，稱為A、D、E及G型肝炎病毒。
IL-18亦與心血管疾病相關，該等疾病包括粥瘤斑塊破裂、缺血後心臟衰竭、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、慢性心臟衰竭、類風濕性關節炎之心血管併發症及其他心血管病。認為IL-18在敗血症或內毒素休克之環境下明顯降低心輸出量。IL-18為炎性過程與粥樣化形成之間的重要聯繫，尤其是有愈來愈多之證據證明在患有慢性發炎性病狀(包括類風濕性關節炎(RA)及狼瘡)之患者中，來自心血管病因之大大過量死亡。已證實IL-18含量為由心臟事件引起之死亡的強大的、獨立的預測者(與CRP含量相比，預測能力更好)。Gerdes等人，2002，J. Exp. Med. 195:245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；Raeburn等人，2002，Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283:H650-H657。
IL-18亦可能與肺病有關，該等肺病諸如，慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructed Pulmonary Disease，COPD)、慢性重度哮喘及急性呼吸窘迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)。
2.診斷方法
本發明之抗原結合蛋白可用於診斷目的以偵測、診斷或監控與IL-18或IL-18受體相關之疾病及/或病狀。本發明提供在樣本中使用熟習此項技術者已知之經典免疫組織學方法偵測IL-18受體之存在(例如，Tijssen，1993，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第15卷(R.H. Burdon及PH. van Knippenberg編，Elsevier，Amsterdam)；Zola，1987，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press, Inc.)；Jalkanen等人，1985，J. Cell. Biol. 101:976-985；Jalkanen等人，1987，J. Cell Biol. 105:3087-3096)。IL-18受體之偵測可活體內或活體外進行。
本文所提供之診斷應用包括使用抗原結合蛋白偵測IL-18受體之表現及配位體與IL-18受體之結合。適用於偵測IL-18受體存在之方法的實例包括免疫檢定，諸如酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)及放射免疫檢定(radioimmunoassay，RIA)。
對於診斷性應用而言，抗原結合蛋白通常以可偵測標記基團標記。合適標記基團包括(但不限於)以下各物:放射性同位素或放射性核素(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)、螢光基團(例如，FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶基團(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二次報導體所辨識之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，將標記基團經由各種長度的間隔臂與抗原結合蛋白偶合以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法在此項技術中已知且可用以實施本發明。
本發明之一態樣提供對表現IL-18受體之一或多種細胞的鑑別。在一特定實施例中，抗原結合蛋白以標記基團標記且偵測經標記抗原結合蛋白與IL-18受體之結合。在另一特定實施例中，活體內偵測抗原結合蛋白與IL-18受體之結合。在另一特定實施例中，使用此項技術中已知之技術分離並量測抗原結合蛋白-IL-18受體。參見例如，Harlow及Lane，1988，Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor(1991年版及定期增刊)；John E. Coligan編，1993,Current Protocols In Immunology New York:John Wiley&Sons。
本發明之另一態樣提供對與本發明之抗原結合蛋白競爭結合IL-18受體之測試分子存在之偵測。一種檢定之實例包括在含有一定量IL-18受體之溶液中在存在或不存在測試分子之情況下偵測游離抗原結合蛋白之量。游離抗原結合蛋白之量的增加(亦即抗原結合蛋白不與IL-18受體結合)指示測試分子能夠與抗原結合蛋白競爭結合IL-18受體。在一實施例中，抗原結合蛋白以標記基圍標記。或者，標記測試分子且在存在或不存在抗原結合蛋白之情況下，監控游離測試分子之量。
3.治療方法：醫藥調配物，投藥途徑
在一些實施例中，本發明提供包含治療有效量之一或多種本發明之抗原結合蛋白以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑的醫藥組合物。此外，本發明提供藉由投與該醫藥組合物治療患者之方法。術語"患者"包括人類個體及動物個體。
較佳地，可接受之調配材料在所用劑量及濃度下對接受者無毒。在特定實施例中，提供包含治療有效量之IL-18受體抗原結合蛋白之醫藥組合物。
在某些實施例中，可接受之調配材料較佳在所用劑量及濃度下對接受者無毒。在某些實施例中，醫藥組合物可包含用於改變、維持或保存(例如)該組合物之pH值、滲透壓(osmolarity)、黏度、澄清度、顏色、等滲性(isotonicity)、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透性之調配材料。在該等實施例中，合適調配材料包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HC1、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨化劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽平衡離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯已定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如泊洛尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、緩血酸胺(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙伯(tyloxapal)；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物較佳為氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇、山梨糖醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參見，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R. Genrmo編)，1990,Mack Publishing Company。
在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視(例如)期望投藥途徑、傳遞形式及所要劑量而確定。參見，例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些實施例中，該等組份可能影響本發明之抗原結合蛋白之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑天然可為含水或不含水的。舉例而言，合適媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊液，且可能補充有供非經腸投與之組合物中所常用之其他材料。中性緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水為另外的例示性媒劑。在特定實施例中，醫藥組合物包含pH值約70-8.5之Tris緩衝劑或pH值約40-5.5之乙酸鹽緩衝劑，且可進一步包括山梨糖醇或其合適替代物。在本發明之某些實施例中，IL-18受體抗原結合蛋白組合物可藉由使具有所要純度之所選組合物與可選調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)混合而以冷凍乾燥餅或水溶液形式製備儲存。此外，在某些實施例中，IL-18受體抗原結合蛋白產物可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)調配為冷凍乾燥產物。
本發明之醫藥組合物可經選擇用以非經腸傳遞。或者，組合物可經選擇用以吸入或經由消化道(諸如經口)傳遞。該等醫藥學上可接受之組合物的製備係在此項技術之範圍內。
該等調配組份較佳係以投藥部位可接受之濃度存在。在某些實施例中，緩衝劑係用以將組合物維持於生理pH值或略低之pH值，通常在約5至約8之pH值範圍內。
當預期非經腸投藥時，用於本發明之治療組合物可以於醫藥學上可接受之媒劑中包含所要IL-18受體抗原結合蛋白之無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式提供。尤其適用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，在其中將IL-18受體抗原結合蛋白調配為正確保存之無菌、等滲溶液。在某些實施例中，製備可包括將所要之分子與可提供可經由積存注射傳遞之產物受控或持續釋放的試劑一起調配，該等試劑諸如可注射微球體、生物可降解顆粒、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體。在某些實施例中，亦可使用具有促進循環中持續時間之作用的玻糖醛酸(hyaluronic acid)。在某些實施例中，可植入藥物傳遞裝置可用以引入所要抗原結合蛋白。
本發明之醫藥組合物可經調配用以吸入。在該等實施例中，有利地將IL-18受體抗原結合蛋白調配為可吸入乾粉。在特定實施例中，IL-18受體抗原結合蛋白吸入溶液亦可以推進劑調配用於氣霧劑傳遞。在某些實施例中，溶液可經霧化。因此，肺部投藥及調配方法另外描述於國際專利申請案第PCT/US94/001875號中，其以引用的方式併入本文中且描述經化學修飾之蛋白質的肺部傳遞。亦預期調配物可經口投與。以此方式投與之IL-18受體抗原結合蛋白可在存在或不存在固體劑型(錠劑及膠囊)調配中通常所用之載劑情況下調配。在某些實施例中，可設計膠囊以於胃腸道中生物可用性最大且全身循環前(pre-systemic)降解最小之時釋放調配物之活性部分。可包括促進IL-18受體抗原結合蛋白吸收之其他試劑。亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
較佳提供包含有效量之一或多種IL-18受體抗原結合蛋白與適合於製造錠劑之無毒賦形劑之混合物的本發明之醫藥組合物。藉由將錠劑溶解於無菌水或另一適當媒劑中，可以單位劑量形式製備溶液。合適賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑(諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉)、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或***膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
其他醫藥組合物對熟習此項技術者為顯然的，包括持續或受控傳遞調配物中包含IL-18受體抗原結合蛋白之調配物。用來調配多種其它持續或受控傳遞手段(諸如脂質體載劑、生物可降解微粒或多孔珠粒及積存注射劑)之技術亦為熟習此項技術者所已知。參見，例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其以引用的方式併入本文中且描述用於傳遞醫藥組合物之多孔聚合微粒的受控釋放。持續釋放製劑可包括呈成型物件形式(例如薄膜或微膠囊)之半透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示，其各自以引用之方式併入本文中)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸之共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers2：547-556)、聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277及Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備的脂質體。參見，例如以引用的方式併入本文中之Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號。
通常以無菌製劑形式提供用於活體內投藥之醫藥組合物。殺菌可藉由經無菌過濾膜過濾而完成。當組合物經冷凍乾燥時，使用該方法之殺菌操作可於冷凍乾燥及復水之前或之後執行。用於非經腸投藥之組合物可以冷凍乾燥形式或以溶液形式儲存。通常將非經腸組合物置於具有無菌取樣口(access port)之容器中，例如具有皮下注射針可穿透之塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
醫藥組合物一經調配，即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、結晶或脫水或冷凍乾燥粉末形式儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或以於投與前復水之形式(例如冷凍乾燥形式)儲存。本發明亦提供用於產生單次劑量投藥單位之套組。本發明之套組可各自含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有含水調配物之第二容器。在本發明之某些實施例中，提供含有單腔室及多腔室預填充注射器(例如，液體注射器及藥粉注射器(lyosyringe))之套組。
待使用之含有IL-18受體抗原結合蛋白之醫藥組合物的治療有效量將視(例如)治療環境及目標而定。熟習此項技術者將瞭解，治療之適當劑量水準將部分視所傳遞之分子、使用IL-18受體抗原結合蛋白之適應症、投藥途徑及患者之尺寸(體重、體表或器官尺寸)及狀況(年齡及一般健康狀況)而變動。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量及修改投藥途徑以得到最佳治療效果。典型劑量可在約0.1μg/kg至多達約30mg/kg或更多之範圍內，視以上所提及之因素而定。在特定實施例中，劑量可在0.1μg/kg至多達約30mg/kg之範圍內，視情況為1μg/kg至多達約30mg/kg或10μg/kg至多達約5mg/kg。
給藥頻率將視調配物中所用之特定IL-18受體抗原結合蛋白之藥物動力學參數而定。通常，臨床醫師投與組合物直至達到實現所要效果之劑量。因此，組合物可以單劑，或可隨時間以兩劑或兩劑以上(其可含有或可不含相同量之所要分子)，或經由植入裝置或導管連續注入而投與。合適劑量之進一步改進由一般熟習此項技術者按常規進行且在其常規執行之工作範圍內。適當劑量可經由使用合適劑量-反應數據確定。在某些實施例中，可將本發明之抗原結合蛋白長時期投與患者。長期投與本發明之抗原結合蛋白可最小化通常與並非完全人類之抗原結合蛋白相關之不利免疫或過敏反應，例如在非人類動物中針對人類抗原產生之抗體，例如在非人類物種中產生之非完全人類抗體或非人類抗體。
醫藥組合物之投藥途徑係根據已知方法，例如經口，經由藉由靜脈內、腹膜內、腦內(腦實質內(intra-parenchymal))、腦室內(intracerebroventricular)、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施例中，可藉由快速注射(bolus injection)或藉由連續輸注或藉由植入裝置投與該等組合物。
組合物亦可經由植入已吸收或囊封所要分子之薄膜、海綿體或另一種合適材料局部投與。在某些實施例中，使用植入裝置時，可將該裝置植入任何合適組織或器官中，且所要分子之傳遞可經由擴散、經時釋放丸劑(timed-release bolus)或連續投藥而進行。
亦可能期望離體(ex vivo)使用本發明之IL-18受體抗原結合蛋白醫藥組合物。在該等情形中，將已自患者移除之細胞、組織或器官暴露於IL-18受體抗原結合蛋白醫藥組合物，隨後將該等細胞、組織及/或器官植回該患者中。
詳言之，IL-18受體抗原結合蛋白可藉由使用諸如本文所述彼等方法之方法植入經基因工程改造之某些細胞以表現及分泌該多肽來進行傳遞。在某些實施例中，該等細胞可為動物或人類細胞，且可為自體的(autologous)、異源的(heterologous)或異種的(xenogeneic)。在某些實施例中，細胞可永生化。在其他實施例中，為減少免疫反應之機會，可囊封該等細胞以避免浸潤周圍組織。在另一些實施例中，封裝材料通常為生物相容性、半滲透性聚合物殼或膜，其允許釋放該(等)蛋白質產物但防止患者免疫系統或其它來自周圍組織之有害因素破壞該等細胞。
在本說明書全文內所引用之所有參考文獻以全文引用的方式明確併入本文中。
以下實例，包括所進行之實驗及所達成之結果，僅為說明性目的而提供，而不欲解釋為限制本發明。
VI.實例
A.實例1：使用pVE414N瞬時表現構築體之抗IL-18受體抗體之IgG2及IgG4型式的產生
以下實例描述用以產生各種抗IL18受體結合蛋白之IgG2及IgG4型式之瞬時表現構築體的產生，及測試其結合特徵及效能之實驗方法。
1.構築體之產生
用於瞬時表現AMH 9/AML 9、AMH 11/AML 7、AMH 3/AML 14及AMH 6/AML 12之IgG4型式的表現構築體藉由將SEQ ID NO:74、76、78、80、82、84、86及88之聚核苷酸序列次選殖至瞬時表現載體中而產生。同一可變區之IgG2型式藉由將編碼彼等IgG之可變區的聚核苷酸部分次選殖至獨立瞬時表現載體中而產生。
2.瞬時轉瓶轉染(Transient Roller Bottle Tranfection)
對於每一抗體進行至CosPKB細胞株中之8次轉瓶轉染。對IgG2之效價如下：
3.各種抗體之效能及交叉反應性之檢定
KG-1 IFNγ釋放檢定。在活體外干擾素-γ(IFNγ)釋放檢定中測試各種IgG構築體以確定其抑制活性。IFNγ釋放檢定依據表現內源性IL-18R之人類骨髓單核細胞性KG-1細胞響應於IL-18而釋放IFNγ之原理進行。
簡言之，將諸如親和純化scFV之試劑隨KG-1細胞於96孔組織培養板中預先培育。將IL-18(+TNFα)添加至細胞中以誘導IFNγ釋放。TNFα與IL-18一起添加以增強IFNγ反應且因此藉由允許使用較低濃度之IL-18而使檢定更靈敏。此至少部分上可能係由於TNFα誘導IL-18R表面表現之上調。
在限定之培育期之後，收穫細胞上清液且使用ELISA分析IFNγ含量。可藉由顯示IFNγ釋放之降低而在此檢定中評定抑制IL-18R所介導信號傳導之測試化合物。
自歐洲細胞培養保存中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，86111306)獲得KG-1細胞。使細胞在經補充之Iscove's Dulbecco改良培養基(IMD M)中繁殖且維持為1-2×106 個細胞/毫升。自Peprotech(200-18)獲得重組人類IL-18且自R&D Systems(210-TA)購得重組人類TNFα。在每次實驗中監控響應於1nM IL-18(+1.1nM TNFα)所釋放之IFNγ的量，且其在約250pg/ml至4000pg/ml之範圍內。
KG-1檢定在96孔平底細胞培養板(Costar)中進行。抗體之測試溶液(一式兩份)純粹地(neat)(或於Dulbecco's PBS中稀釋為所需濃度)以50μl之體積使用。隨後將抗體以6-9點1/3稀釋系列(6-9 point 1/3 dilution series)(使用KG-1培養基)滴定，之後添加50μl KG-1細胞同時輕輕混合。始終包括僅具有IL-18之"無抗體"對照組及"僅細胞"對照組。在37℃下用5%CO2 培育抗體/細胞混合物30-60分鐘之後，添加100μl於KG-1培養基中稀釋之IL-18+TNFα同時輕輕混合。IMAC純化之scFv的最終濃度通常在25-200μg/ml之範圍內。在所有檢定中使用三種參考抑制劑。前兩種為針對IL-18R之兩個不同鏈之單株抗體，RP1(R&D systems，MAB840)及AcPL(R&D Systems，MAB1181)。除稀釋系列之最終起始濃度為10-20μg/ml之外，該等抗體如上為scFv所述使用。此外，使用重組IL-18BP/Fc嵌合體(R&D Systems，119-BP)以中和IL-18。在此情況下，將50μl KG-1培養基添加至細胞培養板中，之後添加50μl細胞且將細胞如以上為抗體所述培育。在一單獨96孔"U"形底細胞培養板中，將IL-18BP/Fc以6-9點1/2稀釋系列(使用KG-1培養基)以60微升/孔之體積滴定。將等體積之IL-18+TNFα添加至IL-18BP/Fc稀釋系列中。在37℃下用5% CO2 培育IL-18BP/Fc/IL-18混合物30-60分鐘之後，以100微升/孔添加至KG-1細胞培養板中同時輕輕混合。用於稀釋系列之IL-18BP/Fc的最終起始濃度為1mg/ml。KG-1細胞之最終濃度為1.5×106 個細胞/毫升(亦即3×105 個細胞/孔)且IL-18以1nM(+1.1nM TNFα)之最終濃度使用。
亦滴定IL-18以確定IFNγ 反應之EC50 。將IL-18以6-10點1/2稀釋系列(使用KG-1培養基)滴定，其中TNFα保持恆定為1.1nM。在此情況下，將50ml KG-1培養基添加至細胞培養板中，之後添加50ml細胞。在37℃下用5% CO2 將細胞培養板培育30-60分鐘，隨後添加100ml經滴定之IL-18，同時輕輕混合。對於稀釋系列，IL-18之最終濃度起始於5nM。通常，IL-18(+TNFα)之EC50 在0.5-1nM之範圍內，儘管偶而可見低至0.3nM或高至5nM之最小及最大EC50值。
將KG-1細胞培養板在37℃下用5% CO2 培育隔夜。藉由將180ml培養基移至乾淨"U"形底96孔板中，隨後將該板密封且在1200rpm下離心5分鐘而獲得細胞上清液。隨後將160ml無細胞上清液轉移至另一乾淨"U"形底96孔板中，且澄清上清液立刻接受測試或在-20℃下冷凍。
KG-1細胞上清液中IFNγ 之量藉由標準夾心ELISA檢定，使用時間解析螢光讀出器測定。將FLUORONUNC平底96孔板(NUNC，437958)用100毫升/孔之4mg/ml之IFNγ特異單株捕捉抗體(capture antibody)(R&D Systems，MAB2851)塗佈且在+4℃下靜置隔夜。將板用Dulbecco's PBS沖洗，隨後藉由於PBS中添加200毫升/孔3%奶粉且在室溫(RT)下培育1-2小時阻斷非特異蛋白質結合。將重組人類IFNγ標準物(R&D Systems，285-IF-100)於試劑稀釋劑(0.1% BSA、0.05% TWeen-20、20mM Tris、150mM NaCl；pH 7.2-7.4)中稀釋至16,000 pg/ml，隨後以12點1/2稀釋系列滴定。將阻斷緩衝劑自捕捉抗體塗佈之板中移除，且添加100毫升/孔IFNγ標準物或澄清細胞上清液。對於"空白"對照組添加試劑稀釋劑。在室溫下培育1-2小時之後，將板用含有0.1% TWeen-20之PBS洗滌3次。將生物素標記之抗人類IFNγ多株偵測抗體(R&D Systems，BAF285)於補充有2%正常山羊血清之試劑稀釋劑中稀釋至100 ng/ml且以100毫升/孔添加。在室溫下培育1小時之後，將板用含有0.1%TWeen-20之PBS洗滌3次。將抗生蛋白鏈菌素-銪(Streptavidin-Europium)(Perkin-Elmer，4001-0010)於DELFIA檢定緩衝劑(Perkin-Elmer，4002-0010)中以1/1000稀釋且以100毫升/孔添加。在室溫下培育30-60分鐘之後，將板用DELFIA洗滌緩衝劑(Perkin-Elmer，1244-114)洗滌7次。添加100毫升/孔之DELFIA增強溶液(Perkin-Elmer，4001-0010)且將板在室溫下靜置至少10min。利用解離增強時間解析螢光測定法，使用Victor2 V板讀取器(PerkinElmer)，量測所得螢光信號。
自IFNγ標準物之結果減去ELISA"空白"對照組之平均值，而對於細胞上清液結果，減去"僅細胞"對照組之平均值。使用GraphPad PRISM(GraphPad Software,Inc.)利用非線性回歸(具有可變斜率)計算IFNγ標準曲線。隨後藉由使用IFNγ標準曲線之"自Y得未知數X(unknown X from Y)"輸出值確定細胞上清液中IFNγ之濃度。使用非線性回歸(具有可變斜率)且必要時約束上下限，計算響應於IL-18之KG-1細胞中IFNγ釋放的EC50。使用螢光計數數據，將測試化合物對KG-1細胞釋放IFNγ之抑制標準化為"無抗體"僅IL-18對照組之平均值的百分比。隨後可使用非線性回歸(具有可變斜率)且分別約束下上限至0及100%來計算測試化合物之IC50 值。
在量測對KG1細胞產生IFN-γ之影響的檢定中，抗體AMH 9/AML 9、AMH 11/AML 7、AMH 3/AML 14及AMH 6/AML 12之IgG2型式具有與原始IgG4型式至少等效之效能。此外，在量測人類NK細胞INF-γ產生之檢定中，IgG2型式具有與原始IgG4至少等效之效能。
在量測對由IL-18誘導的獼猴(cynomolgus)PBMC#010182細胞產生INF-γ之影響的檢定中，抗體之IgG2型式具有與原始IgG4等效之效能。此確認轉化為IgG2不影響測試抗體之獼猴(cyno)交叉反應性。
4.特異性檢定
藉由ELISA針對一組蛋白質分析各種抗體之IgG的交叉反應性。
將測試抗原在4℃下以於PBS(Dulbecco's w/o Ca及Mg，Invitrogen，Cat＃14190-086)中1μg/ml(一式兩份)以50微升/孔塗佈於蛋白質固定器(Protein Immobiliser)96孔板(Exiqon,Prd＃10203 111-60)上隔夜。
使用96孔板洗滌器(BIO-TEK，ELX405UV)，將板以每孔300μl PBS-Tween(0.1%)(PBS-T)洗滌三次且以300μl PBS洗滌三次。向經洗滌之板中，每孔添加300μl 3% Marvel PBS(MPBS)以作為阻斷劑。將板在室溫(RT)下阻斷1小時。
如先前所述將板用PBS-T洗滌三次且用PBS洗滌三次。
將抗體(hulgG4 )於3% MPBS中稀釋至0.5μg/ml。每孔添加50μl經稀釋hulgG4 。將板在室溫下培育1小時。如先前所述洗滌板。
將一級偵測抗體(單株抗人類lgG4純系HP-6025生物素共軛物，Sigma，Cat＃B-3648)以1:15,000於3% MPBS中稀釋且以50微升/孔添加至板中。在室溫下以一級偵測抗體培育1小時。如先前所述洗滌板。
將二級偵測抗體(ExtrAvidin過氧化物酶共軛物，Sigma，Cat＃E-2886)於3% MPBS中以1:1,000稀釋且以50微升/孔添加至板中。在室溫下以二級偵測抗體培育30分鐘。如先前所述洗滌板。
添加50微升/孔四甲基聯苯胺(Tetramethyl-benzidine，TMB)(用於ELISA之液體底物，Sigma，Cat＃T-0440)且在室溫下培育10分鐘。為停止酶呈色反應(color reaction)，每孔添加50μl0.5M H2 SO4 。
將板在96孔板讀取器(Victor2 V板讀取器(PerkinElmer))上以450nm讀取。
特異性抗IL-18受體IgG4抗體僅對人類及獼猴IL-18受體蛋白為陽性。不存在與其他物種之交叉反應性。以上抗體之IgG2型式具有相同交叉反應特性，亦即其僅與獼猴IL-18受體交叉反應。
B.實例2：IL-18受體抗體之結合親和力特徵化
此實例提供測定IL-18受體抗原結合蛋白對細胞表面表現之人類IL-18Rα之結合親和力的例示性方法。將IL-18受體抗體使用[125 I]-Bolton-Hunter試劑(二碘化；PerkinElmer Life Sciences,Inc.，Boston,MA)碘化。在氮氣流下將提供於無水苯中之1毫居里(millicurie)[125 I]-Bolton-Hunter試劑蒸發至乾。將5微升IL-18受體抗體(16微克)用等體積硼酸鹽緩衝生理食鹽水稀釋且隨後添加至於其原始小瓶中之經乾燥[125 I]-Bolton-Hunter試劑中。在4℃下培育隔夜之後，添加10微升PBS、0.1%明膠且將整個樣本轉移至平衡之2mL P6管柱(BioRad；Hercules,CA)中，在其中藉由以0.1%明膠作為載體蛋白之凝膠過濾，將碘化IL-18受體抗體與游離125 I分離。將含有碘化抗體之部分匯合、於結合培養基(RPMI 1640，含有2.5%牛白蛋白，Fraction V，20mMHepes及0.2%疊氮化鈉，pH7.2)中稀釋至100nM之濃度且在4℃下儲存。藉由胺基酸分析基於抗體之初始蛋白質濃度計算比活性為3.5×1015 cpm/mmol，且自經由省略[125 I]-Bolton-Hunter試劑之碘化方案而使用碘化抗體之等分試樣的對照實驗得到70%的回收率。
1.直接平衡結合(Direct Equilibrium Binding)
在37℃下於5%CO2 中，於含有20%胎牛血清之IMDM培養基中，在20ng/mL人類TNFα存在下，將KG-1細胞刺激20小時。將經刺激KG-1細胞(最終5×105 個細胞/150微升)用PBS洗滌兩次，且隨後以一定濃度範圍之碘化抗體培育。在碘化抗體之單一濃度(約350pM，一式三份)下，在1000倍莫耳過量之未標記抗體存在下，量測非特異性結合，且假定為所存在之碘化抗體濃度的線性函數。將所有試劑於含有疊氮化鈉(0.2%)之結合培養基中稀釋，以抑制細胞對碘化抗體之潛在內化(potential internalization)。
在96孔圓底微量滴定板中在37℃、5%CO2 下於小型回轉式震盪器(miniorbital shaker)上培育細胞。4小時之後，將每一混合物之兩個60微升等分試樣轉移至含有200微升鄰苯二甲酸酯油(1.5份鄰苯二甲酸二丁酯：1份鄰苯二甲酸二辛酯)之冷卻之400微升聚乙烯離心管中，且在4℃台式微量離心機(Sorvall，Asheville,NC)中在10,000rpm下旋轉1.5分鐘，以使細胞結合之(cell associated)碘化抗體與游離碘化抗體分離。切開油管，且將各細胞小球及上清液收集於獨立之12×75mm玻璃管中且加載於COBRA γ計數器(Packard Instrument Company；Boston,MA)上以進行cpm量測。將每一孔之重複等分試樣之cpm平均以進行分析。將數據於Prism 3.03版(GraphPad Software,Inc；SanDiego,CA)中經由非線性回歸擬合為簡單的1-位點結合方程。
在37℃下碘化抗體與經刺激KG-1細胞之結合具有81pM之KD 及約4700個位點/細胞。
2.競爭檢定
將經刺激及洗滌之KG-1細胞(最終5×105 個細胞/150微升)與單一濃度之碘化抗體(15.6pM)及不同濃度之未標記抗體於結合培養基中培育。在1000倍莫耳過量之未標記抗體存在下測定非特異性結合。僅在添加細胞之前混合碘化及未標記抗體，亦即不存在預培育步驟。
在96孔圓底微量滴定板中在37℃、5%CO2 下於小型回轉式震盪器上培育細胞。4小時之後，將每一混合物之兩個60微升等分試樣轉移至含有200微升鄰苯二甲酸酯油(1.5份鄰苯二甲酸二丁酯：1份鄰苯二甲酸二辛酯)之冷卻之400微升聚乙烯離心管中，且在4℃台式微量離心機(Sorvall,Asheville,NC)中在10,000rpm下旋轉1.5分鐘以使細胞結合之碘化抗體與游離碘化抗體分離。切開油管，且將各細胞小球及上清液收集於獨立之12×75mm玻璃管中且加載於COBRAγ計數器(Packard Instrument Company；Boston,MA)上以進行cpm量測。將每一孔之重複等分試樣之cpm平均以進行分析。將數據於Prism中經由非線性回歸使用81pM之Kd值擬合為單一競爭性抑制方程。
未標記抗體結合之Ki 為53pM。
C.實例3：抗IL-18受體抗體之活性特徵化
對於各種IgG構築體如實例1第3部分中所述進行IFNγ釋放檢定，如下所述。
1.以AMH2/AML 16、AMH2/AML 17、AMH 1/AML 16及AMH 1/AML 17構築體抑制KG1細胞INFγ 釋放之比較
將以AMH /AML 抗原結合蛋白構築體AMH 2/AML16、AMH 2/AML 17、AMH 1/AML 16及AMH 1/AML 17處理時對KG1細胞INF-γ釋放的抑制作用，與以IL-18結合蛋白(BP)之對照處理相比較。在抑制IFNγ 釋放上AMH /AML 抗原結合蛋白明顯更有效，所有均證實ED50 在6pM與10pM之間而IL-18BP之ED50 為520pM。
2.以AMH 4/AML 14、AMH 4/AML 15、AMH 3/AML14及AMH 3/AML 15構築體抑制KG1細胞INFγ 釋放之比較
將以AMH /AML 抗原結合蛋白構築體AMH4/AML14、 AMH 4/AML 15、AMH 3/AML 14及AMH 3/AML 15處理時對KG1細胞INF-γ 釋放的抑制作用，與以IL-18結合蛋白(BP)之對照處理相比較。在抑制IFNγ 釋放上AMH /AML 抗原結合蛋白明顯更有效，所有均證實ED50 在3pM與7pM之間而IL-18BP之ED50 為520pM。
3.以AMH 6/AML 12、AMH 6/AML 13、AMH 5/AML 12及AMH 5/AML 13構築體抑制KG1細胞INFγ 釋放之比較
將以AMH/ AML 抗原結合蛋白構築體AMH 6/AML 12、AMH 6/AML 13、AMH 5/AML 12及AMH 5/AML 13處理時對KG1細胞INF-γ 釋放的抑制作用，與以IL-18結合蛋白(BP)之對照處理相比較。在抑制IFNγ 釋放上AMH /AML 抗原結合蛋白明顯更有效，所有均證實ED50 在2.9pM與11.3pM之間而IL-18BP之ED50 為520pM。
4.AMH 8/AML 11、AMH 9/AML 9、AMH 10/AML 8及AMH 11/AML 7 IgG對KG1細胞INFγ釋放之抑制
將以包含AMH 8/AML 11、AMH 9/AML 19、AMH 10/AML 8及AMH 11/AML 7 IgG之組合的AMH /AML IgG抗原結合蛋白構築體對KG1細胞INF-γ釋放的抑制作用，與以IL-18結合蛋白(BP)之對照處理相比較。在抑制IFNγ釋放上AMH /AML 抗原結合蛋白明顯更有效，所有均證實ED50 在3pM與45pM之間而IL-18BP之ED50 為520pM。
5.AMH 15/AML 3、AMH 13/AML 4、AMH 13/AML 5及AMH 16/AML 2 IgG對KG1細胞INFγ釋放之抑制
將以包含AMH 15/AML 3、AMH 13/AML 4、AMH 13/AML 5及AMH 16/AML 2 IgG之組合的AMH /AML IgG抗原結合蛋白構築體對KG1細胞INF-γ釋放的抑制作用，與以IL-18結合蛋白(BP)之對照處理相比較。在抑制IFNγ釋放上AMH /AML 抗原結合蛋白明顯更有效，所有均證實ED50 在17pM與320pM之間而IL-18BP之ED50 為520pM。
D.實例4：所述IL-18受體抗體之結合抗原決定基鑑別
執行實驗以確定人類IL-18受體(IL-18R)中所存在的對於與IL-18受體結合蛋白中之一或多者結合而言重要之胺基酸殘基。例示性抗體以高親和力與人類IL-18R結合但並不結合IL-18R之小鼠直系同源物(ortholog)。實驗旨在檢測人類與小鼠IL-18R之間不同的胺基酸。此可與IL-18R之三維電腦模型之分析結合以測定彼等胺基酸中何者位於受體之表面上且因此更可能與抗體相互作用。藉由使用定點突變以將人類序列之特定胺基酸改變為小鼠序列，且隨後測試突變IL-18R分子與抗體之結合，來檢測候選胺基酸對抗體辨識所起之作用。使用抗體劑量-反應曲線及隨後測定EC50 濃度(最大結合信號50%所需之抗體濃度)，評定抗體結合不同突變體之相對能力。
鑑別人類IL-18R之表面上對於抗體結合尤其重要且因此促成抗原決定基之區域。此區域含有胺基酸243-271(以粗體顯示於圖5中)。當此區域中之特定胺基酸突變為小鼠序列時，抗體結合減弱(對抗體結合之影響報導於表3中)。胺基酸250-253(MFGE突變)及267-271(MRIMT突變)對抗體結合有最深遠之影響，但均不單獨完全影響抗體結合(參見，加下劃線之胺基酸殘基)。當受體在所有4個特定測試位點突變時，抗體結合幾乎消除。對照抗IL-18R受體抗體之結合並不明顯受突變所影響，表明受體之整體結構未受突變破壞。胺基酸243-271編碼所預測IL-18接觸點中之一者，且因此此抗原決定基與抗體阻斷IL-18與受體結合之能力一致。
在所示殘基處將人類IL18R突變為小鼠IL18R序列，且將具有抗生物素蛋白(avidin)標籤之重組突變受體固定於經生物素塗佈之珠粒上。隨後使用經固定受體在可溶性結合檢定中確定相對抗體結合能力。亦使用辨識不同於例示性抗體之抗原決定基之抗hulL-18R抗體進行結合。結合實驗全部進行至少兩次。平均EC50 表示達到最大結合50%所需之抗體濃度。
圖1A、圖1B、圖1C、圖1D、圖1E、圖1F、圖1G、圖1H、圖1I、圖1J、圖1K、圖1L、圖1M、圖1N、圖1O、圖1P及圖1Q描述α-及β-IL-18受體抗原結合蛋白之VH及VL可變域之核酸及胺基酸序列。
圖2A、圖2B、圖2C、圖2D及圖2E顯示抗原結合蛋白之各種重鏈可變區及輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3區。在SEQ ID NO:1-34中鑑別各種重鏈區及輕鏈區之胺基酸序列。在SEQ ID NO:89-190中鑑別個別CDR之序列。
圖3A及圖3B描述α-及β-IL-18受體抗原結合蛋白之重鏈可變序列及輕鏈可變序列之胺基酸序列之比對。CDR1、CDR2及CDR3區以灰色突出顯示。
圖4描述顯示重鏈可變區及輕鏈可變區序列之各種可能組合的圖表。顯示每一重鏈可變區及每一輕鏈可變區之二聚體。當天然存在抗體通常為四聚體時，抗體可包含所述二聚體中之兩個的組合。
圖5描述形成用於特定抗原結合蛋白實施例之抗原決定基的α-IL-18受體胺基酸序列之部分。
圖6描述完整AMH 6重鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:74及73)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖7描述完整AML 12輕鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:76及75)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖8描述完整AMH 4重鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:78及77)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖9描述完整AML 14輕鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:80及79)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖10描述完整AMH 9重鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:82及81)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖11描述完整AML 9輕鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:84及83)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖12描述完整AMH 11重鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:86及85)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
圖13描述完整AML 7輕鏈核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:88及87)。箭頭表示前導序列之裂解位點。
(無元件符號說明)

Claims (17)

  1. 一種分離之抗原結合蛋白，其可結合人類IL-18受體，其中該抗原結合蛋白包含：包含以下之重鏈胺基酸序列：(a)具SEQ ID NO.104之CDRH1、(b)具SEQ ID NO：105之CDRH2及(c)具SEQ ID NO：106之CDRH3；及包含以下之輕鏈胺基酸序列：(a)具SEQ ID NO：173之CDRL1、(b)具SEQ ID NO：174之CDRL2及(c)具SEQ ID NO：175之CDRL3。
  2. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含具SEQ ID NO：6之重鏈胺基酸序列或具SEQ ID NO：29之輕鏈胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含具SEQ ID NO：6之重鏈胺基酸序列及具SEQ ID NO：29之輕鏈胺基酸序列。
  4. 一種分離之抗原結合蛋白，其包含具SEQ ID NO：73之IgG重鏈及具SEQ ID NO：75之IgG輕鏈。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為單株抗體、人類抗體、重組抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體或其片段。
  6. 如請求項1至4中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為IgG2型。
  7. 一種分離之核酸分子，其編碼如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白。
  8. 一種宿主細胞，其係經包含如請求項7之核酸之載體轉型。
  9. 一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其係用於預防或治療患者與IL-18受體相關之病狀的方法。
  11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該病狀係選自由以下組成之群：自體免疫疾病、肝疾病、胰臟疾病、肺疾病及心血管疾病。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其中該自體免疫疾病係選自由牛皮癬、類風濕性關節炎、狼瘡、I型糖尿病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、多發性硬化症、自體免疫性肝炎、異位性皮膚炎、重症肌無力及肉狀瘤病(sarcoidosis)組成之群。
  13. 如請求項11之醫藥組合物，其中該肝疾病為肝炎。
  14. 如請求項11之醫藥組合物，其中該胰臟疾病為慢性胰腺炎或急性胰腺炎。
  15. 如請求項11之醫藥組合物，其中該心血管疾病係選自由急性心臟發作、粥瘤斑塊破裂(atheromatous plaque rupture)、缺血後心臟衰竭、再灌注損傷、血管發炎及粥樣化形成(atherogenesis)組成之群。
  16. 如請求項11之醫藥組合物，其中該肺疾病係選自由慢性阻塞性肺病、慢性重度哮喘及急性呼吸窘迫症候群組成之群。
  17. 一種抑制IL-18與IL-18受體結合之方法，其包含使IL-18受體與如請求項1至6中任一項之抗原結合蛋白接觸，其中該抗原結合蛋白結合該IL-18受體且防止該IL-18受體與IL-18結合。
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