TWI434695B - 新穎乳酸菌株在降血脂之用途與其組合物 - Google Patents

Description

新穎乳酸菌株在降血脂之用途與其組合物

本發明係關於新穎之乳酸菌株與其降血脂之用途，以及其組合物。

乳酸菌為一群能利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌，利用乳酸菌製作發酵產品已有四千年之歷史。乳酸菌近年來已累積許多研究成果，有文獻證實益生菌在人體腸道有抑制害菌的生長，進而預防腸癌、促進維生素合成、增強免疫力、幫助乳糖消化、降膽固醇及鈣的吸收等功用。Mann和Spoerry在1974年發現非洲的馬賽族人在吃了大量由Lactobacillus 菌株所醱酵的牛奶後，血漿中的膽固醇濃度有降低現象之情形，開啟了乳酸菌降膽固醇相關研究方面之探討。

膽固醇是由肝臟自行合成，經由不同脂蛋白輸送代謝，或送回肝臟中。膽固醇的***作用途徑主要經肝臟代謝形成膽酸，與甘胺酸或牛磺酸結合後可溶於水，再與鉀或鈉離子形成鹽類，經由糞便排出體外。膽鹽是膽固醇代謝過程中的水溶性產物，這些膽鹽於大腸中會被許多具有膽鹽水解酶的腸內菌，將膽酸和膽固醇進行降解，與甘胺酸或牛磺酸形成去結合型之膽鹽，其水溶性較低，會與膽固醇形成共沉澱作用而排出，不僅能避免膽固醇被吸收，更能因膽鹽減少而加快膽固醇形成膽鹽的速率。乳酸菌具有膽鹽去結合的活性，使膽固醇沉澱排出，此可能是乳酸菌能減少動物血液中膽固醇含量的原因之一，亦有文獻指出可能是因為某些乳酸菌會吸附腸內的膽固醇，而造成其膽固醇較不易被腸道吸收(Jinet al .,Poultry science. 1998;77:1259-1265)。

目前這方面之研究已有：

(一)　試管試驗

Gilliland等學者發現具降膽固醇功效之乳酸菌株在含有膽鹽培養基中生長速率較快，而培養於未添加膽鹽之培養基時，菌株就不具有降低膽固醇的能力。他們推測乳酸菌必須要有膽鹽的存在，才能降低培養基中的膽固醇，而具降低膽固醇功效的菌株，亦具有較好的膽鹽耐受性(Journal of dairy science. 1980;63:964-972)；又將具有降膽固醇功效之L. acidophilus 培養於含有膽固醇培養基中，同時分析培養基與菌體中的膽固醇含量，發現培養基中減少的膽固醇量，和菌體中增加的膽固醇量近乎相等，因此推測膽固醇似乎是以某種方式進入菌體內，或是和菌體結合。

Klaver及van der Meer發現B. bifidum 會將培養基中所添加的結合性膽鹽，轉變成非結合性膽鹽，使其和膽固醇形成共沈澱(Applied and environmental microbiology. 1993;59:1120-1124)。另有文獻指出乳酸菌降低膽固醇的能力和環境中膽鹽的量成正相關，當培養基中膽鹽的含量增加，乳酸菌降低膽固醇的能力也就越強(Tahriet al .,Current microbiology. 1997;34:79-84)。

Corzo與Gilliland發現L. acidophillus 的膽鹽水解酶具有將膽鹽水解成非結合性膽鹽之能力，且由於結合性膽鹽對菌體具有毒性，故菌體也因此存活(Journal of dairy science. 1999;82:466-471)。因為非結合性膽鹽不能被小腸壁所吸收利用，所以這項發現說明了乳酸菌可以水解腸道中的膽鹽，使其不易被腸道所吸收，進而降低體內膽固醇的含量。

(二)　細胞試驗

原漿微粒三酸甘油酯轉移蛋白(microsomal triglyceride transferprotein，MTP)主要存在於肝細胞與腸細胞的內質網中，為一種具脂質轉移能力的異質雙元體蛋白質，其中97KD的分子次單元具有脂質轉移能力；而55KD的分子次單元則為蛋白質雙硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)，主要在維持整個MTP結構的完整。穩定的MTP-PDI異質雙元體可將細胞中三酸甘油酯(triglyceride)、膽固醇(cholesterol)、和磷脂質(phospholipids)等脂質轉移到新形成的主體脂蛋白B(apolipoprotein B，apo B)以合成極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)或乳糜微粒(chylomicron)。

Wilcox等人發現阿托瓦史達汀(atorvavastatin)可顯著減少HepG2細胞主體脂蛋白(apo B)的分泌，且降低MTP mRNA(Journal of lipid research. 1999;40:1078-1089.)。Jamil等人利用MTP抑制劑BMS-200150處理HepG2，結果顯示BMS-200150可顯著抑制三酸甘油酯及膽固醇酯的轉移並降低主體脂蛋白(apo B)的分泌(Proceedings of the national academy sciences. U.S.A. 1996;93:11991-11995)。

(三)　動物試驗

目前已有許多文獻以乳酸菌降膽固醇進行動物試驗，Taranto等學者發現L. reuteri CRL 1098可使Swiss Albino品系小鼠體內高密度脂蛋白與低密度脂蛋白之比率增加，並可降低總膽固醇及三酸甘油脂(Journal of dairy science.2000;83:401-403)。Nguyen等學者利用自嬰兒糞便篩選出之L. plantarum PH04(10⁷ CFU/天)餵食高膽固醇血症之小鼠，結果顯示其可降低血清總膽固醇及三酸甘油脂，但對體重則無明顯影響(International journal of food microbiology. 2007;113:358-361)。

(四)　人體試驗

Xiao等學者以23位高膽固醇血症的病人，分別進食S. thermophilus 和L. delbrueckii subsp. Bulgaricus 共同發酵的優酪乳4週，另一組則進食多一株B. longum BL1所發酵的優酪乳，結果顯示含B. longum BL1的病人膽固醇降低將近一半，而另一組則無明顯效果(Journal of dairy science. 2003;86:2452-2461)。

根據本國行政院衛生署統計國人的十大死因，其中心臟疾病、腦血管疾病兩項皆為心血管相關疾病，且此兩項皆為前三大死因，而粥狀動脈硬化(atherosclerosis)是引起腦血管疾病及冠狀動脈疾病的重要致病原因之一，降低膽固醇可降低粥狀動脈硬化之發生，以及降低腦血管與冠狀動脈疾病，故倘能找到具有降血脂功能性益生菌，並以其做為食品原料或產品，提供給國人食用，將有助國人之健康，可幫助降低心血管相關疾病，亦進而有助降低其死亡率。

為篩選出具有降低血脂功能之乳酸菌株，收集不同來源之乳酸菌包括自嬰兒糞便分離、植物性來源之乳酸菌菌株及購自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)的菌株。以膽鹽水解酵素篩選盤方法(BSH-screening plate method)進行菌株篩選，選出具有膽鹽水解酵素(BSH)活性之菌株。

是以，本發明提供經分離之新穎鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)與乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)，其分別寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存標號分別為BCRC 910473與BCRC 910474。

本發明提供一種乳酸菌株用於製備降低血脂之藥物的用途，其中該乳酸菌株為鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC 910474或青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609。鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici )與青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609具有耐酸與耐膽鹽之特性，其具有膽鹽去結合的活性，能降低膽固醇、三酸甘油脂、主體脂蛋白B、血清總膽固醇、血清三酸甘油脂、血清低密度脂蛋白、血清脂質過氧化物、肝臟總膽固醇、肝臟三酸甘油脂、肝臟脂質過氧化物，達到降低血脂之功能，而且可進一步改善腸道菌相。

本發明亦提供一種降低血脂之組合物，其包含具有降低血脂功能之乳酸菌株，其中之乳酸菌株為鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC 910474或青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609，熟悉此領域之技藝人士可得知進一步依需要而適當地添加習知的各種添加劑成分，例如賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、增粘劑、表面活性劑、滲透壓調節劑、電解質、甘味劑、香料、色素、pH調節劑等，亦可依需要而添加香料、著色劑、保存劑、風味劑、甘味劑等或其他醫藥品。個體服用本發明之組合物能降低膽固醇、三酸甘油脂、主體脂蛋白B、血清總膽固醇、血清三酸甘油脂、血清低密度脂蛋白、血清脂質過氧化物、肝臟總膽固醇、肝臟三酸甘油脂、肝臟脂質過氧化物之含量，因而降低血脂，減少心血管疾病發生之機率，並且可進一步改善腸道菌相。

本發明之組合物可做為膳食補充劑、食品、飼料、飲料、乳品或其組成的形式；其中乳品可為流體乳品(如：牛奶與濃縮牛奶)、發酵乳品(優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳酸菌發酵飲料)、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶與發酵豆奶等。飲料可為蔬果汁、果汁及運動飲料等；食品可為甜點、糖果、嬰兒食品、動物飼料等。該組合物可被製成溶液、乳劑、粉末、錠劑、膠囊或供用於口服投藥的其他形式。

本發明所述之個體為哺乳動物，較佳為人。

實施例一　菌種特性試驗 實驗菌株

收集不同來源之乳酸菌包括自嬰兒糞便分離、植物性來源之乳酸菌菌株及購自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)菌株。將益生菌培養於乳酸桿菌MRS培養液(Lactobacilli MRS broth)(含0.05% L-半胱胺酸，Sigma)，於37℃厭氧培養24小時，二次活化後取菌液加入含20%甘油之MRS培養液保存於-80℃。

篩選具膽鹽水解酶活性之益生菌

針對收集自各種不同來源的益生菌，以膽鹽水解酵素(BSH)篩選盤方法(BSH-screening plate method)進行菌株篩選，實驗步驟參考Pereira等人(Applied and environmental microbiology. 2003;69: 4743-4752)的方法再經修飾。將直徑6毫米的紙錠放入4毫升MRS培養液中後滅菌，接種入20微升隔夜培養的乳酸菌液，在37℃下厭氧培養24小時後，以無菌鑷子取出紙錠，分別平放在含0.5%的去氧牛膽酸鈉鹽(taurodeoxycholic acid sodium salt，TDCA)或牛膽酸(taurocholic acid，TCA)和0.37克/升的CaCl₂ 之MRS平板培養基上，將培養基置於厭氧缸中於37℃培養72小時，將具有沉澱環之菌株測量直徑大小，挑選出直徑較大之菌株再進行之後的試驗。

在800株益生菌中，絕大部分的菌株皆無沉澱環產生，表示可能不具膽鹽水解酵素活性或活性較低以致沉澱環試驗無法測得，其中以NBHK001、NBHK002、NBHK003、NBHK004、NBHK005、NBHK006、NBHK007、NBHK008等八株產生沉澱環大小約17-24毫米，意即表現出高度膽鹽水解酵素活性(如表一和圖一)。從表一可知，同一菌種名稱但不同菌株，其膽鹽水解酵素活性亦不相同。Dora等學者(2003)提出TCA結合型膽鹽在腸道中會經由再吸收回到肝臟，而去結合型膽鹽再吸收之效率較差，將隨糞便排出體外。因此，具有BSH活性的益生菌能在動物或人體腸道內有效的進行膽鹽去結合作用，有助降低腸道中的膽固醇。

耐酸性耐膽鹽試驗

取1毫升培養之益生菌液(10⁹ CFU/毫升)分別加入9毫升經0.1 N HCl調至pH 2.0、2.5和3.2之磷酸鹽緩衝溶液，在37℃培養3小時。菌液加入相同條件之pH 7.2磷酸鹽緩衝溶液作為控制組。培養後經序列稀釋，傾倒法培養於MRS洋菜膠，於37℃下培養48小時，計數存活的益生菌菌數。

Gilliland等學者認為耐膽鹽的特性是乳酸菌能否為在腸道中生存的必備條件(Journal of dairy science. 1989;72:2483-2494)。本試驗利用體外磷酸鹽溶液系統，使乳酸菌存在pH 2.0、pH 2.5、pH 3.2及pH 7.2的環境下3小時後，進行乳酸菌的耐膽鹽試驗。以膽鹽培養液(MRS-bile broth)(0.3%牛膽汁(oxgall))分析乳酸菌對膽鹽的耐受性。將經耐酸試驗(pH 2.0,1×PBS，培養於37℃經過3小時)存活之益生菌液，取1毫升離心(6,000轉/分鐘(rpm))10分鐘後，沉澱物以緩衝溶液清洗回溶，將菌移至含或不含0.3%牛膽鹽(oxgall bile)9毫升MRS培養液培養3、12和24小時，培養後經序列稀釋，傾倒法培養於MRS洋菜膠，再計數存活的菌數，以評估受試菌株在膽鹽存在下的菌數(Gilliland and Walker,Journal of dairy science. 1990;73:905-911)。

結果顯示NBHK006、NBHK007、NBHK008具有較佳耐酸性(如表二)。經pH 2.0磷酸鹽溶液處理3小時之乳酸菌株分別加入MRS培養液及膽鹽培養液(MRS-bile broth)中培養3小時，NBHK002在添加膽鹽之培養基中菌數較不含膽鹽之培養基多0.05個對數值，而其餘四株乳酸菌在膽鹽培養液(MRS-bile broth)中的菌數只比在MRS培養液中的菌數少0.05～0.33個對數值。而培養至12或24小時的乳酸菌菌數顯示，在膽鹽培養液(MRS-bile broth)中的膽鹽對五株乳酸菌的生長有些微抑制，雖然菌數比MRS培養液中少0.33～2.21個對數值，但除了NBHK008外，其餘四株在膽培養液(MRS-bile broth)中之菌數量相較於0小時皆多0.29～1.43個對數值(如表三)。因此NBHK006和NBHK007兩株乳酸菌具有良好的耐酸和耐膽鹽特性。Wang等學者指出益生菌在不同pH值的環境下的存活菌數隨著pH的下降及時間的增加而遞減(Journal of applied microbiology. 1999;87:631-639)。據Tripathi等學者指出某些乳酸菌在pH4.5的環境下會影響其增殖(Indian journal of dairy science. 2002;55:17-21)。本實施例耐酸性試驗結果與文獻具有相同趨勢。

膽鹽去結合能力分析

實驗方法參考自Corzo與Gilliland(1999)及Pereira等人(2003)之步驟。滅菌後之50毫升MRS培養液，待冷卻添加終濃度為1毫莫耳濃度的無菌過濾牛磺膽酸鈉鹽(sodium taurocholate)，接種隔夜活化之1%益生菌菌液，於37℃下厭氧培養24小時，培養期間於0、4、8、12及24小時取樣測定OD₆₀₀ nm吸光值和pH值，並且於0、4、8、12及24小時進行膽鹽萃取，以HPLC分析結合型膽鹽濃度(Yeh et al.,Journal of chromatographyB. 2000;751:1-8)；另外，以未添加益生菌發酵培養的MRS培養液作為對照組。

膽鹽萃取之方法亦參考Pereira等人(2003)的萃取步驟，取2毫升不同時間培養的益生菌發酵液，在5℃下以8,000轉/分鐘(rpm)離心10分鐘移除菌體，取1毫升上清液加入10微升的6 N HCl以中止BSH之活性。樣品加入4毫升異丙醇來萃取膽鹽(樣品：異丙醇=1：4，v/v)，再以420轉/分鐘震盪60分鐘混勻後，於1,000轉/分鐘(rpm)下離心10 min，取異丙醇層至無菌試管中，再以氮氣在37℃下吹乾，加入800微升甲醇溶解膽鹽萃取物之後，以0.45微米過濾膜過濾，最後將樣品保存於-20℃待高效能液相層析法(HPLC)分析。

高效能液相層析法(High Performance Liquid Chromatograpy,HPLC)分析條件如下：

分析條件：管柱-Gemini 5u C 18 110A,250 x 4.6毫米

移動相(A) 0.3%碳酸銨(ammonium carbonate)

(B) 100%乙腈(acetonitrile)

(C) 5%甲醇

(D) 65%甲醇

幫浦：HITACHI，Pump L-2130

分析時間：30分鐘

流速：1毫升/min

偵測器：(HITACHI，UV Detector L-2400)

偵測波長：210 nm

樣品注射量：20微升

C液：流速1毫升/分鐘，洗30分鐘

D液：流速1毫升/分鐘，洗30分鐘

藉由HPLC系統分析樣品中TCA，並以標準品TCA製作標準曲線，計算樣品中之膽鹽含量(Pereira et al.,2003)。

體外試驗證實可表現BSH活性的菌株有較高的膽鹽去結合能力，結合型膽鹽(如TCA)在腸道中會經由再吸收回到肝臟，而去結合型膽鹽再吸收之效率較差，將隨糞便排出體外。因此，倘具有表現BSH活性的益生菌能夠在動物或人體腸道內有效的進行膽鹽去結合作用，將可促使血液中的膽固醇在肝臟中生合成為膽鹽，而導致血液膽固醇的降低(Dora et al.,2003)。本試驗將挑選出的八株益生菌與結合型膽鹽(TCA)進行共培養後，以HPLC方法分析膽鹽量。結果顯示如圖二，NBHK002、NBHK005、NBHK006、NBHK007及NBHK008五株菌株比其他三株具較佳的膽鹽去結合活性，且NBHK005、NBHK007及NBHK008皆於培養24小時後，可完全去除結合型膽鹽。在篩選菌株去膽鹽結合能力時同時檢測在TCA培養基中之生長曲線及pH值變化，如圖三顯示除NBHK008外皆有較好的生長速度；菌株之產酸能力部分如圖四，除了NBHK004產酸速度相對較慢些，其他菌株產酸能力則無明顯差異。其中NBHK008不易培養，故不適合商業量產，因此排除NBHK008。

益生菌降膽固醇之試驗

為了評估乳酸菌在腸道環境中是否能降低膽固醇的吸收，本試驗將NBHK002、NBHK005、NBHK006、NBHK007及NBHK008等具膽鹽去結合能力較佳之益生菌進行膽固醇體外試驗，模擬膽固醇在腸道中經膽鹽乳化後的乳糜微粒型式，以評估受試乳酸菌在腸道中降低膽固醇被腸道吸收之能力。

1.　膽固醇乳糜微粒的製作與益生菌培養

製作膽固醇乳糜微粒(cholesterol micelles)的方法乃參考Daniel等人(Journal of nutritional biochemistry. 2003;14:326-332)及Emilio(Atherosclerosis. 2000;151:357-379)之研究報告修飾後進行之。將6.6毫莫耳濃度的牛膽酸鹽(taurocholate)、2.4毫莫耳濃度的卵磷脂(lecithin)及0.5毫莫耳濃度的膽固醇以甲醇溶解後混合均勻，再以氮氣吹乾，加入同體積的MRS培養液，充分混合均勻後，再以超音波振盪器(130 W、20 kHz)振盪之，每5分鐘中斷5分鐘，重複3次，即可產生乳糜微粒，成品經0.45微米無菌過濾膜過濾後，加入隔夜活化之1%菌液，在37℃下進行培養，於0、6、12、18及24小時取樣，以進行膽固醇萃取及分析。

2.　膽固醇的萃取與分析

方法參考自Gilliland等人(Applied and environmental microbiology. 1985;49:377-381)之方法再經修飾。取1毫升菌液與膽固醇乳糜微粒(cholesterol micelles)共培養18小時的菌液，以7000轉/分鐘(rpm)下離心10分鐘，取上清液0.5毫升，加入3毫升的95%乙醇，再加入2毫升50%的KOH溶液，混合均勻後，於水浴鍋中加熱60℃ 10分鐘，待冷卻後加入5毫升的正己烷，震盪30秒後再加入3毫升的蒸餾水清洗兩次，靜置15分鐘，分離水層和有機層，吸取有機層以氮氣吹乾，之後加入4毫升o-phthalaldehyde溶液，室溫下靜置10分鐘，之後緩慢加入2毫升濃硫酸，震盪均勻後再靜置10分鐘，以OD₅₅₀ nm分析吸光值，並配製1毫莫耳濃度之膽固醇標準溶液，連續稀釋後做標準曲線以計算樣品中膽固醇的含量(每樣品皆經過三重複試驗)。

結果顯示如圖五，NBHK002、NBHK007和NBHK008隨著培養時間的增加，其膽固醇濃度均顯示緩慢下降的趨勢，而NBHK006則在6小時至12小時之間膽固醇量明顯下降，約降低35%。Klaver及van der Meer(1993)指出乳酸菌降低膽固醇的效果則是源自於膽鹽去結合的能力。另外，也有體外研究指出乳酸菌降低膽固醇的原因，乃經由菌體的直接吸附膽固醇而造成共同沉澱(Gilliland et al.,1985)。

實施例三　細胞實驗 細胞內三酸甘油酯(Triglyceride，TG)含量測定

Sharon等學者以十八碳烯酸、硬脂酸、次亞麻油酸、亞麻油酸、油酸、花生四烯酸、花生酸和二十五碳五烯酸誘發HepG2分泌三酸甘油脂及主體脂蛋白B，結果顯示以油酸具最佳誘發效果，其次為亞麻油酸(Atherosclerosis. 2000;150(2):255-264)。在本實施例故選擇油酸做試驗，將NBHK002、NBHK006和NBHK007三株乳酸菌進行細胞實驗，於細胞培養液中額外添加油酸，以誘發HepG2產生三酸甘油酯，分別加入NBHK002、NBHK006和NBHK007三株乳酸菌之上清液、菌體或菌液等方法處理，分別共培養12、24、36和48小時，以市售套組檢測細胞內三酸甘油酯的含量。

詳細之實驗步驟如下：將培養到八分滿的HepG2細胞株，倒掉舊的培養液，以1×PBS buffer清洗兩次後倒掉，加入2毫升1%胰蛋白酶(trypsin/EDTA)進行消化，輕拍數下，使細胞懸浮。加入最小必需培養液(minimum essential medium，MEM)添加胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和青黴素-鏈黴素之細胞培養液，搖勻後(細胞濃度調至10⁵ 細胞/毫升)加入24孔培養盤，每個孔加入1毫升細胞懸浮液，在37℃下，5% CO₂ 培養隔夜，每個孔以1×PBS buffer重複清洗兩次後，再加入1毫升新鮮的細胞培養液，培養液分為含有牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)之MEM，以及將油酸(Oleic acid，OA)與BSA以8：1比例混合之MEM。分別加入100微升乳酸菌上清液(spent culture supernatant，SCS)、菌體或菌液，於5% CO₂ 氣體，在37℃下分別培養12、24、36、48小時。將細胞與乳酸菌共培養完後，加入含1% Triton-X 100，以細胞破碎機微波震盪15秒使細胞破碎。離心後利用市售組合試劑組GPO-RAP之酵素(Randox laboratories Ltd. Co.,U.K.)以呈色法測定。分析時先取出10微升細胞萃取液，對照組則以蒸餾水測定，分別加入1000微升酵素混合液，於37℃下水浴5分鐘。最後以分光光度計測其500 nm吸光值，並以下列公式算出TG含量。

TG濃度=(A_sample /A_standard )×2.29=毫莫耳/升

結果如圖六～圖八顯示，額外添加油酸組較未添加油酸組其三酸甘油酯的含量高約0.2毫莫耳/升(33%)；NBHK002乳酸菌能抑制三酸甘油酯的分泌，其中NBHK002上清液於12小時即顯著抑制三酸甘油酯的分泌，並於48小時後更降低三酸甘油酯含量至0.15毫莫耳/升(約降低81%)(圖六(a))，NBHK002菌體及菌液之抑制作用雖不如上清液明顯(圖六(b)與(c))，但在統計上仍具有顯著抑制三酸甘油酯分泌的效果。NBHK006乳酸菌與HepG2細胞共培養36-48小時，無論是上清液、菌體或菌液皆顯著抑制三酸甘油酯含量約25-35%(圖七)。NBHK007與HepG2細胞共培養至12小時，皆有微抑制三酸甘油酯之作用(圖八)，且經36小時後細胞內三酸甘油酯含量更大幅度減少至0.05-0.18毫莫耳/升(約降低77%-93%)，共培養48小時後上清液、菌體或菌液皆可完全抑制三酸甘油酯的產生，其中NBHK007菌液又36小時內即可達完全抑制。Casaschi等學者以油酸誘發較未經誘發組其三酸甘油酯組含量高，經啤酒花提取物Xanthohumol處理24小時後，其三酸甘油酯分泌量減少25%(American society for nutritional sciences. 2004;134(6):1340-1346)。以上文獻與本實施例結果相似，且本實施例以NBHK007乳酸菌處理48小時後具有完全抑制三酸甘油酯分泌之效果。

主體脂蛋白B(Apolipoprotein B)含量測定

方法參考Casaschi等學者(2004)修飾之。細胞前處理步驟與三酸甘油酯(Triglyceride，TG)含量測定實驗相同，細胞培養液配法與三酸甘油酯含量測定實驗相同，亦分別加入100微升乳酸菌上清液、菌體或菌液，於5% CO₂ 氣體，在37℃下培養24小時，取細胞培養液進行主體脂蛋白B酵素免疫測定法(Apo B ELISA)試驗，以標準品做出之標準曲線估算Apo B之含量。

結果顯示如圖九～圖十一，NBHK002乳酸菌之上清液、菌體或菌液與HepG2細胞共培養48小時，細胞之主體脂蛋白B分泌量隨著時間的增加有減少的趨勢，其上清液和菌體在油酸誘導試驗中，培養12小時，亦有明顯抑制主體脂蛋白B的分泌作用，但12至48小時間則抑制效果趨緩(圖九)。在油酸誘導下，NBHK006乳酸菌之上清液、菌體或菌液與HepG2細胞共培養48小時，於12小時即有明顯抑制主體脂蛋白B分泌之作用(圖十)。NBHK007之結果顯示如圖十一，結果顯示在BSA試驗中，經NBHK007上清液、菌體或菌液與HepG2細胞共培養48小時，其主體脂蛋白B分泌量有下降之趨勢；經油酸誘導試驗中，以NBHK007之上清液、菌體或菌液處理HepG2細胞，隨著時間的增加其主體脂蛋白B濃度也顯著隨之遞減。

目前文獻並無以乳酸菌抑制肝腫瘤細胞HepG2的主體脂蛋白B分泌之相關報導，只有針對大蒜、紅麴或藥物等作處理的探討。Casaschi等人(2004)以油酸誘發主體脂蛋白B，以及以啤酒花提取物黃腐酚(Xanthohumol)培養HepG2細胞，可造成主體脂蛋白B 17%與31%的抑制。相較於本實施例NBHK002、NBHK006和NBHK007三株乳酸菌與HepG2共培養24、36與48小時可達抑制率分別約為33%、38%及39%。

實施例三　菌種鑑定

將NBHK002和NBHK007兩株菌株送至財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心，委託其進行菌株之菌種學名鑑定，鑑定結果如下：

NBHK002為革蘭氏陽性球菌，不具觸酶、氧化酶及運動性，於好氧及厭氧環境下皆會生長。以16S rDNA部分序列分析及API鑑定系統分析，依據16S rDNA部分序列分析NBHK002與乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici )之相似性達98%以上，其部分序列如SEQ ID NO：1所示。綜合鑑定結果顯示「NBHK002」為乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici )菌株，並於2010年4月29日將該株菌寄存於台灣新竹的財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)，其寄存BCRC編號為BCRC 910474，學名Pediococcus acidilactici PA318。

NBHK007為革蘭氏陽性桿菌，不具觸酶、氧化酶及運動性，於好氧及厭氧環境下皆會生長。以16S rDNA部分序列分析、dnaK 基因序列分析及生理生化試驗加以鑑定分析，依據16S rDNA部分序列分析NBHK007與鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus )之相似性達98.8%以上，其部分序列如SEQ ID NO：2所示。綜合鑑定結果顯示「NBHK007」為鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus )菌株，並於2010年4月29日將該株菌寄存於台灣新竹的財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)，其寄存BCRC編號為BCRC 910473，學名Lactobacillus rhamnosus LCR177。

NBHK006取自台灣新竹食品工業發展研究所(FIRDI)，其BCRC編號為BCRC 14609，其為青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )。

實施例四　配製益生孅-23(PROBIO S-23)

配製具有降低血脂功能之乳酸菌株的配方益生孅-23(PROBIO S-23)供後續實施例使用，主要包含：鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC 910474與青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609等乳酸菌。

實施例五　動物試驗 實驗動物

購自國家動物實驗中心之三週齡雄性Syrian品系倉鼠(Hamster)共50隻。動物飼養於獨立通氣飼養籠中(Individual Ventilated Cages,Allentown,USA)，先使用一般標準粒狀飼料(Rat chew，福壽牌，台中)，餵養四週，使倉鼠適應飲食及環境，於七週齡時開始進行實驗。

飼料配製

實驗飼料的基本組成根據AIN-76(American Institute of Nutrition,1977)配方作適度調整。本實施例分為五組(控制組、HFC(高油脂高膽固醇)、低劑量PROBIO S-23、中劑量PROBIO S-23、高劑量PROBIO S-23)，飼料成份組成如表一。

1.　酪蛋白(casein)、膽固醇(cholesterol)、AIN-76礦物質混合物(AIN-76 mineral mixture)、AIN-76維生素混合物(AIN-76 vitamin mixture)、纖維素(Cellulose)、甲硫胺酸(DL-Methionine)、膽鹼(Choline bitartrate)：皆由MP Biomedicals Llc，USA製造。

2.　動物油(Lard)：採購於桂格食品公司。

3.　蔗糖(sucrose)：購於台糖公司。

4.　玉米澱粉(Corn starch)：購於食品原料行。

5.　大統玉米胚芽油(Corn oil)：購自於全聯福利中心。

首先將各種粉末狀材料過篩避免結塊，依照表四比例混合均勻，之後依配方比例分別拌入各種試驗油脂，再加入適當水份使其成糰，切成塊狀後利用真空冷凍乾燥機MODEL:F0-20L-6S(Kingmech,Ltd，Taiwan)進行乾燥，再置於-80℃冰箱備用。

試驗樣品用量

本實施例使用實施例四之益生孅-23(PROBIO S-23)粉末，建議成人每日使用量為3g/包，本實施例將此劑量設為中劑量，並增加低劑量(中劑量的1/5倍)與高劑量(中劑量的5倍)之組別進行實驗。根據表五實驗動物與人體表面積比等效劑量換算比率表，換算成倉鼠的劑量分別為78mg/Kg BW/day(低劑量)、390mg/Kg BW/day(中劑量)及1950mg/Kg BW/day(高劑量)。

計算：以中劑量組體重100g之倉鼠為例

倉鼠體重介於小鼠及大鼠間，本實施例以小鼠作為依據，表三小鼠20g對照成人70kg換算比率為0.0026，而成人每日使用量為3g/包，故0.0026×3g=7.8mg/20g小鼠，100g÷20g=5倍，5倍×7.8mg=39mg/100g BW倉鼠/day=390mg/Kg BW/day(中劑量)，依此類推即可求得其他不同體重之倉鼠每日所需灌食的劑量。

*低劑量：39mg×1/5倍=7.8mg/100g BW倉鼠/day=78mg/Kg BW/day

*高劑量：39mg×5倍=195mg/100g BW倉鼠/day=1950mg/Kg BW/day

動物分組與飼養

自國家動物實驗中心購入50隻三週齡雄性Syrian品系倉鼠，飼養於獨立通氣飼養籠(Individual ventilated cages，IVC)，動物房內溫度控制為22±2℃，相對濕度維持在55±5%，使用自動定時器來控制光照週期，早上08：00~晚上20：00為光照期(Light period)，晚上20：00~早上08：00為黑暗期(Dark period)。動物自由取用飲用水及攝食，每隔三至四天更換一次墊料及飲用水，飼料則每天更換。動物飼料為AIN-76老鼠標準飼料，動物墊料為Aspen Chip(Northeastern Products Corp，USA)購自樂斯科生物科技股份有限公司。實驗期間記錄每天攝食量、飲水量及每週一次體重測量，並觀察其生長情況。倉鼠經四週適應期後，體重依S形分籠法分為五組，每組十隻，二隻一籠，初體重平均約93-94克，並將每組初始體重平均值標準差維持於無差異(P ＞0.05)為原則。

實驗期間倉鼠健康情況、體重、攝食量及臟器重量之變化 1.　外觀和活動力

在飼養十週期間，各組別之倉鼠反應敏捷，整體活動力正常，觀察毛色正常且無脫毛現象，糞便***量及狀態也無明顯的差異。且實驗過程中未發現倉鼠產生疾病或身體不適情況。

2.　體重與攝食量變化

餵食正常飲食與高油脂高膽固醇飲食之倉鼠於十週飼養期間，各組之平均體重變化情形如圖十二所示。隨著飼養週數增加，各組倉鼠之平均體重有增加的趨勢，表示灌食PROBIO S-23並不會影響倉鼠之消化功能。第十週因犧牲前禁食之緣故，整體體重些許下降。

由表六可知倉鼠的起始平均體重約為93~94克，各組間並無顯著性差異(P ＞0.05)。餵食高油脂高膽固醇飲食+無菌水之HFC組的倉鼠最終平均體重為123.53±13.51 g，整個實驗期間每天約增加0.37±0.17 g，與正常飲食+無菌水之控制組(111.96±6.43 g；每天約增加0.22±0.08 g)相較下，有明顯的增加(P ＜0.05)。而經餵食高油脂高膽固醇飲食+灌食不同濃度的PROBIO S-23之低、中、高劑量組倉鼠最終平均體重分別為113.56±7.61 g、109.5±8.95 g、113.53±6.45 g，與HFC組相較下，於統計上具有顯著性差異(P ＜0.05)，下降幅度分別為8.07%、11.36%、8.09%。另外，PROBIO S-23之低、中、高劑量組倉鼠的最終平均體重與控制組比較，並無顯著差異(P ＞0.05)。因此推論，灌食倉鼠PROBIO S-23，對於攝取高油脂高膽固醇飲食倉鼠而導致的肥胖體質具有改善之效果。

在攝食方面，可發現控制組和HFC組之倉鼠每日攝食量並無明顯差異(P ＞0.05)，表示在飼料中添加高劑量的油脂及膽固醇，對於倉鼠的攝食量並沒有顯著影響(表六)。而三組灌食低、中及高劑量PROBIO S-23之組別，倉鼠的攝食量也與控制組和HFC組無顯著差異性存在(P ＞0.05)。由此可見，灌食PROBIO S-23，並不會影響倉鼠的食慾，且經平日觀察各組倉鼠對於飼料攝取狀況皆良好，進食後也無便秘或腹瀉等問題。

3.　臟器重量的變化

如表七所示，經十週餵食正常飼料之控制組的倉鼠平均肝重及相對肝重顯著低於其他餵食高油脂高膽固醇飼料之組別，顯示攝取高油脂高膽固醇飲食會增加倉鼠肝臟之重量，推估可能是因為膽固醇與脂肪的堆積。而PROBIO S-23之低劑量、中及高劑量組倉鼠平均肝重皆低於HFC組，但在相對肝重並無明顯差異(P ＞0.05)。

血液生化檢驗 1.　血清中總膽固醇之測定

血清總膽固醇之分析，依照Enzymatic CHOD-PAP法(Deeg et al.,1983)分析。使用市售之Cholesterol FS套組(Cat No.1.13009910023，Diasys Diagnostic Systems GmbH，Holzheim，Germany)檢測，利用全自動生化分析儀(HITACHI-7150，Japan)進行分析。其原理是藉由三種酵素：膽固醇酯酶(cholesterol esterase，CHE)、膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase，CHO)及過氧化酶(peroxidase，POD)作用後，經水解、氧化生成淡紅色之醌亞胺(quinoneimine)，並在500 nm波長下測其吸光值，測量此物質之吸光值來計算總膽固醇含量。

由表八及圖十三結果可看出，經餵食高油脂高膽固醇飲食之HFC組，其血清中總膽固醇濃度隨著實驗週數而增加，直到第十週，HFC組中血清總膽固醇濃度為289.00±25.66 mg/dL，比餵食正常飲食之控制組的血清總膽固醇濃度134.38±18.07 mg/dL明顯高出115.06%，證實攝取高油脂高膽固醇飲食，會提高血清中總膽固醇濃度，表示藉由給予倉鼠高油脂高膽固醇飲食，可成功誘導其高膽固醇血症之實驗動物模式。實驗期間從第二週開始至第十週，PROBIO S-23之低、中、高劑量組與HFC組比較，血清中總膽固醇濃度皆有顯著性降低(P ＜0.05)，其中又以PROBIO S-23高劑量組具有最明顯的效果，分別在第二週減少了17.61%；第四週減少19.90%；第六週減少17.13%；第八週減少14.96%以及第十週減少了22.88%。由此可證明PROBIO S-23具有調節血清中總膽固醇濃度之效果。

2.　血清中三酸甘油脂之測定

依據Enzymatic GPO-PAP法(Cole et al.,1997)分析。使用市售之三酸甘油脂分析套組(Cat No.1.57109910023，Diasys Diagnostic Systems GmbH，Holzheim，Germany)，利用全自動生化分析儀(HITACHI-7150，Japan)進行分析。其原理是藉由脂酶(Lipase，LP)、甘油激酶(Glycerol kinase，GK)、磷酸甘油氧化酶(Glycerol phosphate oxidase，GPO)及過氧化酶(Peroxidase，POD)四種酵素，先後與三酸甘油脂作用後，生成紅色之醌亞胺(quinoneimine)，並在500 nm波長下測其吸光值，測量此物質之吸光值來計算三酸甘油脂含量。

如表九與圖十四所示，HFC組從第二週開始，倉鼠血清中三酸甘油酯濃度比其他組別來的高，與控制組比較具有顯著差異(P＜0.05)。然而經餵食不同濃度的PROBIO S-23之低、中、高劑量組與HFC組比較，在實驗第四週開始皆具有顯著降低血清三酸甘油酯之濃度(P＜0.05)。尤其是PROBIO S-23的高劑量組，從第二週起至第十週，分別降低了(32.68%、27.80%、23.23%、30.31%、25.53%)，且其老鼠的血清三酸甘油酯數值趨向於控制組，兩組間沒有顯著的差異性(P＞0.05)。

3.　血清高密度脂蛋白膽固醇含量分析

血清高密度脂蛋白膽固醇之分析，依照Enzymatic Colorimetric法(Izawa et al.,1997)分析。使用市售之HDL Cholesterol Liquicolor套組(LOT No.10015，Human GmbH，Wiesbaden，Germany)檢測，利用全自動生化分析儀(HITACHI-7150，Japan)進行分析。其原理是藉由四種酵素：膽固醇酯酶(cholesterol esterase，CHE)、膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase，CHO)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及過氧化酶(peroxidase，POD)分離低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、乳糜微粒(Chylomicron)後，經水解、氧化生成紅色之醌類色素(quinone pigment)，並在600 nm波長下測其吸光值，以此物質之吸光值來計算高密度脂蛋白膽固醇含量。

步驟一：

步驟二：

由表十與圖十五結果顯示，控制組倉鼠血液中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量顯著低於其他組別(P ＜0.05)。主要因為高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)皆是膽固醇，在餵食老鼠高膽固醇飲食後，其血液中的高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇之含量會明顯高於餵食正常飲食的倉鼠。而高密度脂蛋白膽固醇可將週邊膽固醇送到肝臟儲存，清除血中膽固醇，進而可降低動脈硬化的風險。此實驗之PROBIO S-23低、中、高劑量組與HFC組比較，血液中的高密度脂蛋白膽固醇含量皆無顯著的差異性存在(P ＞0.05)。由此可見，餵食高油脂高膽固醇飲食老鼠，不論是低、中或高劑量PROBIO S-23，皆無提升血液中高密度脂蛋白膽固醇的功效。

4.　血清低密度脂蛋白膽固醇含量分析

血清低密度脂蛋白膽固醇之分析，依照Homogeneous enzymatic colorimetric法分析。使用市售之LDL-C plus套組(Cat No.04711220190，Roche Diagnostics GmbH，Germany)檢測，利用全自動生化分析儀(HITACHI-7150，Japan)進行分析。

其原理為

(HSDA為N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉鹽(Sodium N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline))

提高血液中總膽固醇濃度，尤其是低密度脂蛋白膽固醇，會增加冠心病(coronary heart disease)的風險。表十一及圖十六中，控制組倉鼠血液低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量顯著低於其他組別(P ＜0.05)。另外，自實驗第二週開始PROBIO S-23低、中、高劑量三組倉鼠血中低密度脂蛋白膽固醇的含量皆明顯低於HFC組(P ＜0.05)。其中又以PROBIO S-23高劑量組具有較佳的效果，在第二及四週時產生最明顯的減少，降幅分別達55.23%及56.96%。其第六、八及十週則分別為37.26%、36.35%及35.08%，可看出PROBIO S-23不論是低劑量或中、高劑量，皆具有降低高油脂高膽固醇飲食血液中低密度脂蛋白膽固醇的功效。

5.　血清TBARS(硫代巴比妥酸反應物質，Thiobarbituric acid reactive substance)值測定

根據Yagi(1998)方法加以修飾。其測定原理是利用脂質過氧化產物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)能夠與硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)結合，並生成紅色物質(TBARS)，此物質在波長532nm下有強烈之吸光值。吸光值愈高表示MDA產物愈多，因此若樣品可降低此吸光值，則表示具有抗氧化效果。取100 μL血清樣品置於試管內，加入100 μL SDS(Sodium dodecyl sulfate)混合均勻，再加入4 mL的TBA，並於沸水中煮1個小時，取出試管於冰水中冷卻10分鐘，以3000 rpm離心10分鐘，取150 μL的上清液於96孔盤內，在532 nm波長下測其吸光值。經由對照MDA標準曲線以內插法即可換算出樣品之MDA含量。

由表十二及圖十七可知，從實驗第二週直到第十週HFC組別倉鼠其MDA含量都呈現最高狀態，與控制組比較具顯著差異性(P ＜0.05)。PROBIO S-23低、中劑量組在第四、六、八週時倉鼠血清中MDA含量明顯的低於HFC組(P ＜0.05)。而在整個實驗期PROBIO S-23高劑量組倉鼠的MDA含量數值趨向於控制組，並無顯著性差異(P ＞0.05)。由此可知，PROBIO S-23高劑量組具有較佳降低高油脂高膽固醇飲食血液中脂質過氧化之功效，其與HFC組比較之下，自第二週開始分別降低28.55%、45.33%、52.44%、48.92%和35.95%。實驗證實餵食PROBIO S-23可有效降低高油脂高膽固醇飲食倉鼠血清中脂質過氧化情況。

肝臟檢測 1.　肝臟脂質之變化 1.　肝臟總膽固醇含量分析

肝臟膽固醇的含量是以Enzymatic CHOD-PAP法測得。取肝臟萃取液，以氮氣去除溶劑。再以市售之Cholesterol FS套組(Cat No.1.13009910023，Diasys Diagnostic Systems GmbH，Holzheim，Germany)檢測，利用全自動生化分析儀(HITACHI-7150，Japan)分析，在500 nm波長下測其吸光值。

由表十三及圖十八結果顯示，正常飲食之控制組倉鼠的肝臟膽固醇含量相當低(6.32±1.43 mg/g)，而給予高油脂高膽固醇飲食HFC組膽固醇為48.07±5.76 mg/g含量非常的高，兩者間達顯著差異(P ＜0.05)，可以確認添加高油脂高膽固醇飲食組之肝臟中確實會造成倉鼠膽固醇的堆積。經由給予PROBIO S-23低、中、高劑量後，與HFC組相比其肝臟中膽固醇含量降低了23.9%、30.41%和28.77%，具有顯著性差異(P ＜0.05)。

2.　肝臟三酸甘油脂含量之檢測

利用Enzymatic GPO-PAP法。取肝臟萃取液，以氮氣去除溶劑。加入市售之三酸甘油脂分析套組(Cat No. 1.57109910023，Diasys Diagnostic Systems GmbH，Holzheim，Germany)，利用全自動生化分析儀(HITACHI-7150，Japan)進行分析。在500 nm波長下測吸光值。

在肝臟三酸甘油脂的含量，HFC組明顯的高於控制組，具顯著性差異(P ＜0.05)，顯示給予倉鼠高油脂高膽固醇飲食會使三酸甘油脂堆積在肝中。餵食PROBIO S-23益生菌複方產品十週，其低、中、高劑量組倉鼠肝臟三酸甘油酯濃度分別為38.39±4.54 mg/g、35.20±3.33 mg/g和32.91±5.99 mg/g，其較HFC組肝臟三酸甘油酯濃度47.24±4.79 mg/g顯著降低18.73%、25.48%與30.33%(表十三與圖十九)。證實PROBIO S-23之低、中及高劑量，皆可明顯降低高油脂高膽固醇飲食之肝臟三酸甘油酯濃度，並達統計上的意義(P ＜0.05)。

3.　肝臟脂質過氧化TBARS值之測定

根據Ohkawa等人(1979)之方法加以修飾。稱取約25 mg組織於1.5 mL離心管中，加入250 μL PBS緩衝液及蛋白酶抑製劑(protease inhibitors)，進行均質後(需冰浴)，在3000 rpm下離心10分鐘。取上清液置於試管內，加入100 μL SDS(Sodium dodecyl sulfate)混合均勻，再加入4 mL的TBA，並於沸水中煮1個小時，取出試管冰浴10分鐘後，以3,000 rpm離心10分鐘，取150 μL的上清液於96孔盤內，在532 nm波長下測其吸光值。標準曲線經由MDA配置。

由表十四及圖二十結果可觀察到，餵食高油脂高膽固醇飼料之HFC組與餵食正常飼料的控制組相比，具有顯著提高倉鼠肝臟MDA之數值(P ＜0.05)。而餵食高油脂高膽固醇飼料+PROBIO S-23之低、中、高劑量三個組別，其倉鼠肝臟中MDA濃度與HFC組相較皆有下降趨勢，分別下降(25.59%、18.83%、36.10%)具有顯著差異(P ＜0.05)。

糞便菌相分析

依照行政院衛生署所公佈『健康食品之腸胃道功能改善評估方法』進行糞便菌相檢測。於實驗期第0週及第9週收集老鼠新鮮糞便，利用按摩老鼠腹部，使其順利排便，將取出的新鮮糞便置於密閉的容器內，以方便維持厭氧狀態，再於厭氧操作台內秤取0.5 g，加入含有玻璃珠及4.5 mL無菌厭氧稀釋液之離心管中，以震盪器均質後備用。在厭氧條件下，將均質液充分震盪混合均勻後，使用厭氧稀釋液進行一系列十倍稀釋。再取適當之稀釋倍數，利用傾注平板法(pour plate method)加入於MRS-CaCO₃ 及BIM-25培養基中並混合均勻，待凝固後將培養皿倒置於厭氧缸內，於37℃培養箱中培養48小時。而後分別計數乳酸桿菌(Lactobacillus )和雙歧桿菌(Bifidobacterium )總菌落數。檢測此兩種益生菌若於糞便中數量有明顯增加，即可認定益生菌產品具有改善腸道菌叢顯著之功效。

從表十五、圖二十一及圖二十二得知，在實驗第0週時，各組間的倉鼠腸道糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌之活菌數並無顯著差異(P ＞0.05)。而經灌食倉鼠PROBIO S-23於九週後，倉鼠腸道糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌之活菌數，隨著灌食濃度的增加而有逐漸提升的趨勢。顯示PROBIO S-23低、中、高劑量三個組別的倉鼠腸道糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌之活菌數，與餵食高油脂高膽固醇飼料+無菌水之HFC組及餵食正常飼料+無菌水的控制組相比，於統計上具有顯著性差異(P ＜0.05)。因此，食用PROBIO S-23，會顯著增加倉鼠腸道益生菌。依據行政院衛生署所公佈『健康食品之腸胃道功能改善評估方法』中指出，若糞便中益生菌有明顯增加，即表示PROBIO S-23具有明顯改善腸道菌相之功效。

<110> 麗豐實業股份有限公司

<120> 新穎乳酸菌株在降血脂之用途與其組合物

<130> 1002-NB-TW

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> Pediococcus acidilactici

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(500)

<400> 1

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> Lactobacillus rhamnosus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(500)

<400> 2

圖一係表示具膽鹽水解酵素(BSH)活性菌株之沉澱環；利用篩選膽鹽水解酵素(BSH)篩選盤之方法篩選具有BSH活性之菌株。

圖二係菌株之膽鹽去結合活性分析；將牛磺膽酸鈉鹽(sodium taurocholate)加入培養液後，接種隔夜活化1%菌液，在37℃下厭氧培養24小時，並於0、4、8、12及24小時進行膽鹽萃取，再以HPLC分析結合型膽鹽之濃度。

圖三係菌株在添加TCA之MRS培養基中的生長曲線圖；將牛磺膽酸鈉鹽(sodium taurocholate)加入培養液後，接種隔夜活化之1%菌液，在37℃下厭氧培養24小時，並於0、4、8、12及24小時取樣測量OD₆₀₀ nm的吸光值。

圖四係菌株在添加TCA之MRS培養基中的pH變化曲線圖；將牛磺膽酸鈉鹽(sodium taurocholate)加入培養液後，接種隔夜活化之1%菌液，在37℃下厭氧培養24小時，並於0、4、8、12及24小時取樣測定pH值。

圖五係菌株對乳麋微粒膽固醇濃度之影響；將乳麋微粒膽固醇與乳酸菌共培養18小時，取其菌液經過7000轉/分鐘(rpm)離心10分鐘，取上清液萃取其中之膽固醇，並測量OD₅₅₀ nm的吸光值以推估其濃度。

圖六係NBHK002乳酸菌之上清液、菌體或菌液對HepG2細胞分泌三酸甘油酯(triglyceride,TG)之影響；將油酸與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)以8：1比例混合，並加入100微升之乳酸菌上清液、菌體或菌液至含有油酸與BSA之MEM培養液，以其培養HepG2細胞12、24、36與48小時後，萃取細胞內之三酸甘油脂，並測量其500毫微米(nm)吸光值，算計其含量。

圖七係NBHK006乳酸菌之上清液、菌體或菌液對HepG2細胞分泌三酸甘油酯(triglyceride,TG)之影響。

圖八係NBHK007乳酸菌之上清液、菌體或菌液對HepG2細胞分泌三酸甘油酯(triglyceride,TG)之影響。

圖九係NBHK002乳酸菌之上清液、菌體或菌液對HepG2細胞分泌主體脂蛋白B(Apolipoprotein B)之影響；將油酸與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)以8：1比例混合，並加入100微升之乳酸菌上清液、菌體或菌液至含有油酸與BSA之MEM培養液，以其培養HepG2細胞24小時後，取其細胞培養液，以主體脂蛋白B酵素免疫測定法(Apo BELISA)偵測其主體脂蛋白B之含量。

圖十係NBHK006乳酸菌之上清液、菌體或菌液對HepG2細胞分泌主體脂蛋白B(Apolipoprotein B)之影響。

圖十一係NBHK007乳酸菌之上清液、菌體或菌液對HepG2細胞分泌主體脂蛋白B(Apolipoprotein B)之影響。

圖十二係飼養十週期間，各組倉鼠體重之變化趨勢。

圖十三係不同組別餵食十週期間，對倉鼠血清膽固醇的影響。

圖十四係不同組別餵食十週期間，對倉鼠血清三酸甘油脂的影響。

圖十五係不同組別餵食十週期間，對倉鼠血清高密度脂蛋白的影響。

圖十六係不同組別餵食十週期間，對倉鼠血清低密度脂蛋白的影響。

圖十七係不同組別餵食十週期間，倉鼠血清脂質過氧化物含量的影響。

圖十八係不同組別餵食十週後，倉鼠肝臟膽固醇含量的變化。

圖十九係不同組別餵食十週後，倉鼠肝臟三酸甘油脂含量的變化。

圖二十係不同組別餵食十週後，倉鼠肝臟脂質過氧化物含量的變化。

圖二十一係餵食不同濃度PROBIO S-23，對倉鼠糞便中乳酸桿菌之活菌數的影響。

圖二十二係餵食不同濃度PROBIO S-23，對倉鼠糞便中雙歧桿菌之活菌數的影響。

Claims (12)

1. 一種經分離之鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存標號為BCRC 910473。
2. 一種經分離之乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存標號為BCRC 910474。
3. 一種乳酸菌株用於製備降低血脂之藥物的用途，其中該乳酸菌株係選自由以下所組成之群組：鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC 910474與青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609。
4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該乳酸菌株為鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473。
5. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該乳酸菌株為乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC 910474。
6. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該乳酸菌株為青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609。
7. 如申請專利範圍第3項之用途，其中降低血脂的功能係降低膽固醇、三酸甘油脂、主體脂蛋白B、血清總膽固醇、血清三酸甘油脂、血清低密度脂蛋白、血清脂質過氧化物、肝臟總膽固醇、肝臟三酸甘油脂、肝臟脂質過氧化物。
8. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該乳酸菌株可進一步改善腸道菌相。
9. 一種降低血脂之組合物，其包含具有降低血脂功能之乳酸菌株，該乳酸 菌株係選自由以下所組成之群組：鼠李糖乳酸桿菌LCR177(Lactobacillus rhamnosus LCR177)BCRC 910473、乳酸片球菌PA318(Pediococcus acidilactici PA318)BCRC 910474與青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis )BCRC 14609。
10. 如申請專利範圍第9項之組合物，其中降低血脂的功能係降低膽固醇、三酸甘油脂、主體脂蛋白B、血清總膽固醇、血清三酸甘油脂、血清低密度脂蛋白、血清脂質過氧化物、肝臟總膽固醇、肝臟三酸甘油脂、肝臟脂質過氧化物。
11. 如申請專利範圍第9項之組合物，其中該組合物可進一步改善腸道菌相。
12. 如申請專利範圍第9項之組合物，其為膳食補充劑、食品、飼料、乳品、飲料或其組成的形式。