TWI411442B - Application of Glutenin in Inhibiting Leukemia - Google Patents
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Description
本發明係關於一種可治療白血病之稻米萃取物,尤其係關於一種可抑制白血病癌細胞生長並誘導白血病癌細胞分化為正常細胞之稻米醇溶蛋白(prolamin)。
水稻(Oryza sativa
)係為全球重要的糧食作物之一,亦是台灣地區栽培最廣且最主要的糧食作物,其富含澱粉、蛋白質(主要為儲藏性蛋白質[storage protein])、維生素與礦物質等營養成分,可提供人類所需基本營養。稻米除具營養價值外,研究指出其亦具有許多重要的生理活性,例如稻米所含黃酮類成分可調節細胞色素P450(cytochrome P450)的活性(Noda,H.,and Koizumi,Y. 2003. Sterol biosynthesis by symbiotes:cytochrome P450 sterol C-22 desaturase genes from yeastlike symbiotes of rice planthoppers and anobiid beetles. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 33(6):649-58)、稻米之油脂中具有可抗真菌之有效成份(Paranagama,P. A.,Abeysekera,K. H.,Abeywickrama,K.,and Nugaliyadde,L. 2003. Fungicidal and anti-aflatoxigenic effects of the essential oil of Cymbopogon citratus(DC.)Stapf.(lemongrass)against Aspergillus flavus Link. isolated from stored rice. Letters in Applied Microbiology. 37(1):86-90)以及米糠(rice bran)具有降低血液膽固醇(Qureshi,A. A.,Sami,S. A. Salser,W. A.,and Khan,F. A. 2002. Dose-dependent suppression of serum cholesterol by tocotrienol-rich fraction(TRF25)of rice bran in hypercholesterolemic humans. Atherosclerosis. 161(1):199-207)、增進老化小鼠腹腔之自然殺手細胞(natural killer cells)的活性(Ghoneum,M.,and Abedi,S.,2004. Enhancement of natural killer cell activity of aged mice by modified arabinoxylan rice bran (MGN-3/Biobran). J. Pharm. Pharmacol. 56,1581-1588)與誘發子宮內膜腫瘤細胞凋亡之作用(Fan,H.,Morioka,T.,and Ito,E.,2000. Induction of apoptosis and growth inhibition of cultured human endometrial adenocarcinoma cells(Sawano)by an antitumor lipoprotein fraction of rice bran. Gynecol. Oncol. 76,170-175)。
白血病(leukemia)俗稱血癌,位居兒童惡性腫瘤發生率首位,佔所有腫瘤的40%左右,其形成主因為白血球前驅細胞受遺傳、病毒感染、藥物等因素的影響,使造血幹細胞分化異常,造成血液或骨髓內白血球不正常的過度增生。雖然目前臨床上治療有許多治療進展,然而治療時仍常有副作用大及高復發率所致無法完全治癒的困難。由於白血病治癒率低,因此能否開發副作用少且可有效治療該癌症之新穎藥物仍是當前迫切需要解決的課題。
雖然研究顯示稻米具有藥學治療功效,但究竟係稻米中何種有效成分可達到抑制腫瘤細胞與增強免疫力之效果,迄今仍無定論,因此若能找出該有效成分,並將其應用於抑制白血病癌細胞生長上,對於人類白血病之治療實將產生莫大的助益。
為有效治療白血病並減少於治療時所致副作用,本發明係提供一種稻米醇溶蛋白(prolamin)在製備用於抑制白血病(leukemia)之藥物的應用,且本發明另提供一種用於抑制白血病(leukemia)之醫藥組成物,包含一有效劑量之稻米醇溶蛋白(prolamin)以及一藥學上可接受之載體。
所述應用及醫藥組成物中,該醇溶蛋白係刺激人類週邊血液單核細胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)產生細胞激素(cytokine)例如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors,TNF-α),進而抑制白血病細胞之生長或促進白血病細胞分化(differentiation),其中該白血病細胞係為U937細胞系,且該醇溶蛋白不含麩質(gluten)。
藉由本發明稻米醇溶蛋白能刺激人類週邊血液單核細胞(PBMC)並有效抑制人類白血病U937細胞生長之活性,可將稻米醇溶蛋白應用於白血病之治療上,亦可進一步用作抑制白血病醫藥組成物之成份。由於稻米醇溶蛋白係為天然成分且不含會引起腸道過敏疾病之麩質(gluten)蛋白質,同時其係經由間接免疫而誘導白血病細胞分化為成熟之正常細胞,故於治療白血病時,不會引發副作用。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式,下述所列舉的實施例係用以闡明本發明,並非用以限定本發明之範圍,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可做些許更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
為找出稻米中何種成分具有抑制人類白血病細胞生長之功用,本發明之一實施例係先檢測稻米蛋白萃取物之抑癌生物活性,結果發現稻米蛋白質萃取物對於人類白血病細胞U937生長之抑制有顯著影響,進一步藉由二維電泳以及質譜分析得知與抑癌活性相關之數種蛋白質群組。
由於癌細胞是一種未分化或分化不成熟的細胞,研究發現癌細胞經細胞分化誘導物質處理後,可分化成近似正常的細胞,如此可使癌細胞的增殖性降低甚至消失。目前研究指出某些間接免疫促進物質例如植物凝集素(phytohemagglutinin,以下以PHA稱之)可藉由先刺激免疫細胞,增強其功能後,再使其釋放出大量的細胞激素,進而誘導白血病細胞分化為成熟並具正常生理功能的血球細胞。此種間接免疫調控而誘導分化方式可降低化學藥物治療或放射性療法所致副作用,且可達到抑制腫瘤細胞生長之目的,係為目前較具積極性之療法。惟PHA係屬於細胞促***劑(mitogen),常伴隨著一定的毒性,於臨床應用上有一定的問題存在,故發展一些不具毒性及副作用的免疫促進劑為現今的一大重點。
因此,本發明之一實施例係利用人類週邊血液單核細胞(PBMC),以間接免疫調控的方式,測試稻米蛋白質萃取物對人類白血病細胞U937的生長抑制作用,並分析稻米蛋白質萃取物對腫瘤免疫之影響。結果發現稻米的儲藏性蛋白質可經由人類週邊血液單核細胞(PBMC)之間接免疫方式,抑制白血病細胞的生長,進一步使用二次水、鹽溶液、鹼溶液與酒精自稻米中分離出四種儲藏性蛋白,包含:白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、穀蛋白(glutelin)和醇溶蛋白(prolamin),測試後發現儲藏性蛋白質中的醇溶蛋白(prolamin)的抑癌效果為最佳,且經由試驗分析確認醇溶蛋白具有活化及刺激人類週邊血液單核細胞(PBMC)產生較多細胞激素之功用,並具有顯著抑制人類白血病細胞U937生長之抗腫瘤免疫活性。
其中人類白血病細胞株U937(購自American Type Culture Collection,ATCC,Rockville,MD,USA)係以含10%胎牛血清之RPMI 1640培養基(GIBCO,Grand Island,USA)進行培養至指數生長期以備用之。
另一方面,週邊血液單核細胞(PBMC)之分離及其條件培養基(conditioned media)之製備如下,將正常健康捐血者之周邊全血置入一Ficoll-Hypaque溶液中(溶液密度約為1.077g/mL,Pharmacia Fine Chemicals,USA),並經離心以獲得週邊血液單核細胞(PBMC)。接著取濃度為1.5×106
cells/mL之週邊血液單核細胞(PBMC)培養於含10%熱不活化胎牛血清(heat-inactivated fetal calf serum,FCS,Hyclone,Logan,USA與盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)之RPMI 1640培養基,此時可於培養基中加入測試物質例如稻米蛋白質萃取物,經適當培養時間,再將培養基中的細胞去除後,可獲得經前述測試物質處理之週邊血液單核細胞之條件培養基(peripheral blood mononuclear cell conditioned media,PBMC-CM),再藉此條件培養基進行人類白血病細胞株U937生長活性之試驗。
本發明實施例所有實驗皆至少重複三次以上,實驗結果以平均值±標準誤差(mean±standard error)表示,各組間差異以Student’s t-test計算,並且以*p
<0.05,代表具有統計上的意義。
為確認稻米中何種成分可抑制白血病癌細胞之生長,本發明實施例係針對稻米所含蛋白質進行抑癌測試。
本發明之一實施例係以台梗九號(Taikeng 9,TK9)白米(由行政院農業委員會提供)進行試驗,分別將1公克(g)之台梗九號白米完整顆粒、台梗九號白米的米糠(rice bran)以及台梗九號白米的胚乳(endosperm)研磨成粉,接著各加入50ml之沸水並均勻攪拌30分鐘,以過濾方式收集萃取物,而獲得完整米粒萃取物(total rice-extracts)、米糠萃取物(rice bran-extracts)以及胚乳萃取物(endosperm-extracts)。
本發明之一實施例係分別以經完整米粒萃取物、米糠萃取物以及胚乳萃取物處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM),探討稻米蛋白質對於人類週邊血液單核細胞生長之影響及經由間接模式對人類白血病細胞U937之影響。
首先將完整米粒萃取物、米糠萃取物以及胚乳萃取物分別以濃度為50μg/mL之蛋白酶(protease K)於37℃下處理2小時,再將其煮沸使蛋白酶失活(此作為實驗組),並各自以未經蛋白酶處理之萃取物作為對照組。將濃度為100μg/ml之實驗組與對照組的萃取物分別添加於培養有週邊血液單核細胞(PBMC)之RPMI 1640培養基中,於37℃下培養24小時,將該些培養基以過濾方式濾除細胞,獲得經前述萃取物處理之週邊血液單核細胞之條件培養基(PBMC-CM)。
將濃度為1×105
/mL人類白血病細胞U937置於經實驗組與對照組萃取物處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM),並以未添加任何物質之培養基作為空白組,於37℃下培養5天後,以橡膠刮片(rubber policeman,Bellco Glass,Vineland,USA)將黏附在培養皿底層的U937細胞輕輕刮下,並利用錐藍染液排出法(trypan blue dye exclusion),將細胞懸浮液與錐藍染液(trypan blue,先以PBS溶液稀釋10倍後使用)以適當比例混合後,利用血球計數板於顯微鏡下分別計數活細胞與死細胞之數目,並以下列公式計算其生長抑制率(growth inhibition rate):
生長抑制率(%)=(1-試驗組或對照組之活細胞數量/空白組之活細胞數量)×100%
其中,錐藍染液排出法之原理為正常健康的細胞之細胞膜完整,可以排除錐藍染液之進入,所以不會被染色,而死亡細胞或是損傷嚴重的細胞,其細胞膜通透的完整性已經被破壞,故染劑可進入細胞內而使細胞染色,故可藉由錐藍染液排出法評估細胞之生長抑制率。其結果如第一圖所示。
請參閱第一圖,該圖係本發明之一實施例,分別為完整米粒萃取物、米糠萃取物以及胚乳萃取物經蛋白酶(protease K)處理及未經處理之組別,經由間接模式對人類白血病細胞U937之生長抑制率的結果圖。由圖中可知,未經蛋白酶(protease K)處理之三種稻米萃取物(對照組)之人類白血病細胞U937的生長抑制率約為10~20%,其中以胚乳萃取物之抑制活性為最佳;而當該三種稻米萃取物經蛋白酶(protease K)處理,使稻米中所含蛋白質降解而失去作用,其生長抑制率則降至約6%以下,亦即不含蛋白質之稻米萃取物之抑制人類白血病細胞U937的效果不佳。此結果顯示稻米中可抑制人類白血病細胞U937細胞生長之成分係為蛋白質。
由於實施例1之數據顯示,抑制白血病U937細胞生長的作用為稻米中的蛋白質成分,且胚乳萃取物之抑制活性顯著優於米糠萃取物,因此本發明實施例進一步利用二維電泳分析方法分析比較台梗九號米之胚乳和米糠中蛋白質表現量有顯著差異之蛋白質,再配合質譜的鑑定蛋白質身份,以找出具有抑制人類白血病細胞U937細胞生長之蛋白質種類。
本發明實施例之二維電泳的相關設備及實驗操作方法皆來自Bio-Rad(Hercules,CA)。將台梗九號(TK9)白米之米糠(rice bran)以及胚乳(endosperm)研磨成粉,經適當前處理及定量後,分別取適當濃度之25μl之米糠蛋白質溶液與100μl之胚乳蛋白質溶液,加入50mM之二硫代蘇糖醇:(dithiothreitol,DTT)、0.5%之readystrip IEF buffer(Bio-Lyte pH3-10和pH5-8 ampholyte Bio-Rad,Hercules,CA)以及再水合緩衝溶液(rehydration buffer),使其最終體積為330μl,並進行等電點電泳分析(IEF),接者使用visPRO 5 minutes protein stain Kit(Visual protein biotechnology corp,Taipei,Taiwan)進行鋅染色(zine stain)。其結果如第二A圖與第二B圖所示。
將染色後之二維電泳膠體利用Image J(Version 1.38t,National Institutes of Health,Bethesda,Maryland)軟體進行膠體間蛋白質點的比對,判別出米糠(rice bran)以及胚乳(endosperm)之膠體上相對位置的蛋白質表現量的差異和變化,以兩膠體上表現量呈現差異之蛋白質進行鑑定分析。將膠體上欲作進一步鑑定分析的蛋白質點,以膠內蛋白質水解方式自膠體取下,經適當處理後,以質譜儀(MALDI-QUAD-TOF,由中研院蛋白質體核心中心提供)進行分析,將所得到的質譜數據利用mascot網站進行蛋白質的資料比對,並以其分子量、pI以及Score作為可信的依據。其結果如表一所示。
依據質譜儀鑑定結果及蛋白質資料庫比對而得之蛋白質身分,再根據蛋白質的功能特性,將可能具有抑制人類白血病U937細胞生長之生物活性的蛋白質分成七群(如表一所示)包含:(1)代謝相關蛋白(Metabolism-related protein),包括dihydropteroate synthase(DHPS)等;(2)傳送相關蛋白(Transport portein),包括response regulator receiver等;(3)儲藏性蛋白(Storage protein),包含穀蛋白(glutelin)等;(4)抗氧化相關蛋白(Antioxidant-related protein),包含1-Cys peroxiredoxin A等;(5)生長發育蛋白(Development protein),包含putative synovial sarcoma,X breakpoint 2 interacting protein;(6)抗疾病相關蛋白(Disease-resistance protein),包含NBS-LRR-like protein CR372;以及(7)未知蛋白質(Unknown protein),包含hypothetical protein OsI_12089等。
從表一可知,於該些鑑定出之蛋白質群組種類中,以儲藏性蛋白所佔比例較高,尤其是鹼溶性之穀蛋白(glutelin),顯示儲藏性蛋白對人類白血病細胞U937生長之抑制可能有一定程度之影響。
雖實施例2結果顯示儲藏性蛋白中之穀蛋白(glutelin)具有抑制人類白血病細胞U937生長之生物活性,然而由於稻米中存在較多之穀蛋白,例如稻米胚乳所含穀蛋白高達80%,因此進行前述抑癌生物活性試驗時,可能僅測得此大量之穀蛋白(glutelin)之生物活性,而忽略其他含量較少但可能亦具有抑癌生物活性之儲藏性蛋白。因此,進一步針對所有儲藏性蛋白包含白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(prolamin)以及穀蛋白(glutelin)進行抑制白血病之生物活性分析。
本發明實施例稻米的四種儲藏性蛋白質之萃取係依照Ju等人之方法(Z.Y. Ju.,N.S. Hettiarachchy,and N. Rath. 2001. Extraction,denaturation and hydrophobic Properties of Rice Flour Proteins.Journal of Food Science
,66(2):229-232.)修改,此方法之流程圖如第三圖所示。
取10g稻米胚乳於研缽中研磨成粉狀,加入40ml之己烷(Hexane)並靜置24小時以去除稻米所含脂肪後,於粉末中加入40ml的ddH2
O進行萃取,在20℃下搖晃4小時,之後以3000g之轉速離心30分鐘,此步驟重複兩次,以完全移除此部份之蛋白質,混合該兩次之上清液,此為水溶性之白蛋白萃取液(Albumin extract solution);在經過ddH2
O萃取後,於殘留之沉澱物(precipitation)中加入40ml的5% NaCl,在20℃下搖晃4小時,以3000g之轉速離心30分鐘,此步驟重複兩次,混合該兩次之上清液,此為鹽溶性球蛋白萃取液(Globulin extract solution);再經過5% NaCl萃取後,於殘留之沉澱物中加入30ml的0.02M之NaOH(pH值調至11.0),在20℃下搖晃30分鐘,於4℃下以3000g之轉速離心30分鐘,此步驟重複兩次,混合該兩次之上清液,此為鹼溶性穀蛋白萃取液(Glutelin extract solution);再經過0.02M NaOH萃取後,於殘留之沉澱物中加入30ml的70%乙醇(ethanol),在20℃下搖晃4小時,以3000g之轉速離心30分鐘,此步驟重複兩次,混合該兩次之上清液,此為醇溶性醇溶蛋白萃取液(Prolamin extract solution)。將醇溶蛋白萃取液先以減壓濃縮機於40℃、130rpm的轉速下抽除有機溶劑,再和另外三種蛋白質萃取液一起在-50℃下冷凍乾燥,置於4℃下保存,備用之。
本發明之一實施例係以經白蛋白萃取液、球蛋白萃取液、醇溶蛋白萃取液以及穀蛋白萃取液處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM),探討稻米之四種儲藏性蛋白質對於人類週邊血液單核細胞生長之影響及經由間接模式對人類白血病細胞U937之影響。
首先將濃度為100μg/ml之白蛋白萃取液、球蛋白萃取液、穀蛋白萃取液與醇溶蛋白萃取液(此些蛋白質萃取液係為實驗組)、PBS與DMSO(控制組)、PHA(正對照組,濃度為20μg/mL)以及濃度為100μg/ml之實施例1所製備之胚乳萃取物(對照組)分別添加於培養有週邊血液單核細胞(PBMC)之RPMI 1640培養基中,於37℃下培養24小時,將該些培養基以過濾方式濾除細胞,獲得經前述萃取物或測試物質(PBS、DMSO、PHA)處理之週邊血液單核細胞之條件培養基(PBMC-CM)。
將濃度為1×105
/mL人類白血病細胞U937置於分別經白蛋白萃取液、球蛋白萃取液、穀蛋白萃取液與醇溶蛋白萃取液(前述為實驗組)、PBS與DMSO(控制組)、PHA(正對照組)以及胚乳萃取物(對照組)處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM),並以未添加任何物質之培養基作為空白組,於37℃下培養5天後,收集黏附在培養皿底層的U937細胞,並利用錐藍染液排出法(trypan blue dye exclusion),計算得各條件培養基(PBMC-CM)之生長抑制率,其結果如第四圖所示。
請參閱第四圖,該圖係本發明實施例稻米所含四種儲藏性蛋白質萃取物,經由間接模式對人類白血病細胞U937之生長抑制率的結果圖。由圖中可知,白蛋白、穀蛋白以及球蛋白對於人類白血病U937細胞的生長抑制率約為20-25%,而相較於該些儲藏性蛋白,醇溶蛋白呈現之生長抑制率約為35%;醇溶蛋白係為儲藏性蛋白中含量最少者(其含量約為每1克之胚乳含有11.8±2.9mg之醇溶蛋白,亦即醇溶蛋白之含量僅約佔儲藏性蛋白之5~10%),但分析結果顯示醇溶蛋白藉由刺激人類週邊血液單核細胞而間接抑制白血病U937細胞的生長之效果,係為該些儲藏性蛋白中最佳者,顯見醇溶蛋白在人類白血病細胞U937生長之抑制上扮演重要角色。
此外,藉由觀察與分析經醇溶蛋白處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM)中白血病細胞U937之型態(morphology)及分化(differentiation)情形(結果未示),可得知醇溶蛋白能誘導白血病細胞U937分化為成熟的單核球(monocytes),此可使白血病細胞U937成為近似正常的細胞,進而達到抑制癌細胞之功效;另一方面,經醇溶蛋白處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM)中之細胞激素例如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors,TNF-α)的含量亦有顯著增加(結果未示),該細胞激素可活化B細胞及T細胞或引發使血管通透性增加等免疫反應,以助益於癌細胞之抑制。該些結果皆顯示醇溶蛋白可能是重要的調控免疫反應物質。
為進一步證明醇溶蛋白於抑制白血病上扮演重要角色,本發明實施例係利用醇溶蛋白以習知方法製備抗醇溶蛋白(anti-prolamin)之多株抗體,其方法大致為以70%乙醇處理台梗九號(TK9)稻米之胚乳而萃取得到醇溶蛋白,將醇溶蛋白真空凍乾的粉末回溶後,進行小型聚丙烯醯胺凝膠電泳(mini SDS-PAGE),取下欲誘發免疫的醇溶蛋白之蛋白條帶(位於約15.5kDa處),經適當處理後,將200μg之醇溶蛋白注射兔子(兔子品系為New Zealand white rabbits,且其餵食飼料中不含稻米),接著於第二、四及六個禮拜再注射100μg之醇溶蛋白抗原,全程免疫時間約兩個半月。以聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(結果如第五A圖所示)以及西方墨點法(Western blot)(結果如第五B圖所示)確認該多株抗體之性質與特異性。
分別將500μg/mL之台梗九號白米完整顆粒萃取物、500μg/mL之台梗九號白米的胚乳萃取物以及100μg/mL之醇溶蛋白萃取物與抗醇溶蛋白之多株抗體(稀釋比例1:100)進行中和反應(neutralization)後,同時以未經多株抗體之中和反應處理者為對照組,再將該些萃取物製備其週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM),並分析該些萃取物對U937細胞之生長抑制率的影響。其結果如第六圖所示。
請參閱第六圖,該圖係本發明實施例完整稻米顆粒萃取物、胚乳萃取物及醇溶蛋白萃取物與抗醇溶蛋白之多株抗體行中和反應後,對U937細胞之生長抑制率之結果圖。該圖結果顯示,相較於有加入抗醇溶蛋白之多株抗體的實驗組,未加入抗醇溶蛋白之多株抗體之對照組對於人類白血病U937細胞的生長抑制效果皆呈現顯著下降之趨勢,此係因添加之抗醇溶蛋白之多株抗體會與醇溶蛋白結合,而使醇溶蛋白無法發揮其生物活性作用,亦即此結果說明醇溶蛋白具有刺激人類週邊血液單核細胞(PBMC)之能力,且經醇溶蛋白處理之週邊血液單核細胞的條件培養基(PBMC-CM)可有效抑制U937細胞之生長,證實醇溶蛋白係為具有抗白血病免疫能力之主要成分。
研究指出小麥(wheat)所含由醇溶穀蛋白(gliadin)以及麥穀蛋白(glutenin)組成之麩質(gluten)以及來自黑麥(secalin)、裸麥(rye)或大麥(barley)之醇溶性蛋白質例如醇溶蛋白(prolamin),會導致人體的腸道自體免疫反應,進而引發麩質敏感症(gluten sensitivity disease,GSD)或乳糜瀉(celiac disease,CD)等自體免疫疾病(Fasano,A. and Catassi,C. 2001. Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease:an evolving spectrum. Gastroenterology,120(3):636-651),症狀包括持續性腹瀉、心痛、多氣以及腹脹等,且目前對於該些疾病並沒有藥物可以治療,只有避免吃含有麩質的蛋白質才不會引起。因此本發明實施例進一步分析稻米之醇溶蛋白是否含有會引起免疫問題之醇溶穀蛋白(gliadin)胜肽(peptide)。
分別取適量之醇溶穀蛋白(gliadin)、麩質(gluten)、台梗九號白米完整顆粒萃取物、台梗九號白米的胚乳萃取物以及台梗九號白米之白蛋白萃取物、穀蛋白萃取物、球蛋白萃取物與醇溶蛋白萃取物進行西方墨點法(Western blot),再以抗醇溶穀蛋白(Mouse anti-gliadin,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Heidlberg,Germany)之抗體(稀釋比例1:500)進行抗體抗原反應(hybridization),結果如第七A圖與第七B圖所示。
請同時參閱第七A圖與第七B圖,其中,第七A圖係為本發明之一實施例台梗九號白米之胚乳與米糠萃取物中醇溶穀蛋白之表現結果,第七B圖係為本發明實施例台梗九號白米之白蛋白萃取物、穀蛋白萃取物、球蛋白萃取物與醇溶蛋白萃取物中醇溶穀蛋白之表現結果。由該些結果可觀察到,小麥之醇溶穀蛋白(gliadin)與麩質(gluten)皆可偵測到醇溶穀蛋白(gliadin)之存在,而台梗九號白米的胚乳、米糠以及由胚乳分離出來的四種儲藏性蛋白質皆未偵測到醇溶穀蛋白(gliadin)之存在,顯示該些稻米萃取物皆不含會導致人體腸道自體免疫疾病之醇溶穀蛋白(gliadin),因此該些稻米萃取物的攝取並無引發麩質敏感症(GSD)或乳糜瀉(CD)等自體免疫疾病之虞。
綜上所述,稻米之蛋白質係具有抑制白血病U937細胞生長之效用,且由二維電泳及質譜分析該些有變化的蛋白質點係為與代謝、運輸、儲存、抗氧化、抵抗疾病和發育相關蛋白,且進一步分析發現儲存性蛋白質中的醇溶蛋白(prolamin)具有刺激人類週邊血液單核細胞(PBMC)分泌細胞激素、誘導人類白血病細胞分化為正常細胞以及抑制人類白血病細胞生長之功效;此外,醇溶蛋白的食用不會引起麩質敏感症或乳糜瀉等對人體有害之自體免疫疾病。
另一方面,可將醇溶蛋白(prolamin)製備成醫藥組成物,藉以應用於抑制白血病之治療。所述醫藥組成物除包含有效劑量之醇溶蛋白(prolamin)之外,尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑,但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造,將前述該些物質之有效成分劑量與一種以上之載體相混合,製備出所需之劑型,此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑,但未以此為限。
第一圖係本發明實施例經蛋白酶(protease K)處理及未經處理之完整米粒萃取物、米糠萃取物以及胚乳萃取物,經由間接模式對人類白血病細胞U937之生長抑制率的結果圖。圖中實驗組與未經處理之對照組相比較,*p
<0.05,表示有顯著差異。
第二A圖係本發明實施例台梗九號稻米之胚乳蛋白質之二維電泳圖。圖中箭號所指係為經分析後具有表現差異性之蛋白質之相對位置。
第二B圖係本發明實施例台梗九號稻米之米糠蛋白質之二維電泳圖。圖中箭號所指係為經分析後具有表現差異性之蛋白質之相對位置。
第三圖係本發明實施例分離自稻米胚乳之四種儲藏性蛋白質:白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(prolamin)以及穀蛋白(glutelin)之萃取流程圖。
第四圖係本發明實施例稻米所含四種儲藏性蛋白質萃取物,經由間接模式對人類白血病細胞U937之生長抑制率的結果。圖中實驗組與對照組相比較,*p
<0.05,表示有顯著差異。
第五A圖係本發明實施例確認抗醇溶蛋白(anti-prolamin)多株抗體之性質的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果圖。
第五B圖係本發明實施例確認抗醇溶蛋白(anti-prolamin)多株抗體之性質的西方墨點法(Western blot)結果圖。
第六圖係本發明實施例完整稻米顆粒萃取物、胚乳萃取物及醇溶蛋白萃取物與抗醇溶蛋白之多株抗體行中和反應後,對U937細胞之生長抑制率之結果圖。圖中實驗組與對照組相比較,*p
<0.05,表示有顯著差異。
第七A圖係本發明實施例台梗九號白米之胚乳與米糠萃取物中醇溶穀蛋白之表現結果。
第七B圖係本發明實施例台梗九號白米之白蛋白萃取物、穀蛋白萃取物、球蛋白萃取物與醇溶蛋白萃取物中醇溶穀蛋白之表現結果。
Claims (4)
- 一種醇溶蛋白(prolamin)在製備用於抑制白血病(leukemia)之藥物的應用,其中該醇溶蛋白的來源為台梗九號(Taikeng 9,TK9)稻米。
- 如申請專利範圍第1項所述之應用,其中該醇溶蛋白係刺激人類週邊血液單核細胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)產生細胞激素(cytokine),進而抑制白血病細胞之生長或促進白血病細胞分化(differentiation)。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之應用,其中該白血病細胞係為人類白血病細胞系。
- 如申請專利範圍第1項所述之應用,其中該醇溶蛋白不含麩質(gluten)。
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