TWI330199B - Microorganism strain and its preparation method and uses - Google Patents

Description

Ι33Ό199 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種藉發酵作用以製造如：0-乙醯基-L-絲氨 ，、N-乙醯基-L-絲氨酸、L-半胱氨酸、ll-胱氨酸及卜半胱氨酸 讨生物等填酸甘油酸酯族胺基酸及胺基酸衍生物之方法。 【先前技術】 ^目前二十種天然蛋白質胺基酸通常係經由微生物發酵作用製 得。此處所利用的事實是：微生物具有該等天然胺基酸合成所需 之適當生物合成途徑。 但，該等生物合成途徑係在野生型菌珠内加以嚴格地調節， 以確保細胞所製造之該等胺基酸僅供其本身需要。所以有效製造 方法之重要先決條件是：在與野生型微生物對比之情況下，可浐 得之適當微生物，其製造預期胺基酸之功能業經大幅提高。又 該等胺基酸生產過剩之微生物可藉助於傳統突變/選擇方法及 /或現代特定重組體技術(”代謝工程”)製得。由其修飾作用、激活(活 化)作用及失活(鈍化)作用，後者首先涉及基因或等位基因識別 定)工作進而導致生產過剩。藉助於分子生物技術，隨後將 因/對偶基因引進-微生物g株喊施妓活作肋達成最佳生^ 過剩。但，通常，唯獨將許多不同措施組合起來方可達到直正 效的生產。 ~ 甘崎麟絲於料絲岐藉生物合 成作用由3-磷酸甘油酸衍生出來之事實而加以界定者。初始 謝途仫抵達L-絲氰馱。L-絲氨酸可進一步轉化為甘氨酸 乙醯基-L-絲氨酸轉化為乙_半胱氨酸。 ""ί _ 既有技術業已習知、可造成胺基酸生產過剩、用 酸醋族胺基酸(尤其L-絲氨酸及L_半胱氨酸)發酵製造之若干基因/ 5 133*0199 對偶基因為： -

SerA-對偶基因，如歐洲專利Ep 〇62〇853B1或Ep 〇93i8幻A2 中所，。該等SerA對偶基因將y磷酸甘油酸醋去麟編碼， -絲氨酸對該等3 4酸甘油触去氫酶施以減低反饋抑制作 用。如此對自細胞絲氨酸等級之3_經基丙酮酸醋之形成施以大 幅去偶合作用。 ~ cysE對偶基因，如 WO 97/15673 (併此以供參考)或 中森等人所著，1998 ,應用環境微生物64 : 1607_1611 (併此以 供參考)或 南木等人，1999 ’歐洲生物化學學會聯合會通訊，452 :323_327 中，述，該等cysE對偶基因係經引進一微生物菌株内。 該等^ysE對偶基因編碼為絲氨酸〇_乙醯基轉移酶、[-半胱氨酸 對該等絲氨酸〇_乙酿基轉移酶施以減低反饋抑制作用。如此對 自細胞半胱氨酸等級之〇_乙醯基_L•絲氨酸或L_半胱氨酸之形 成施以大幅去偶合作用。 —外流基因，如歐洲專利Ep〇885962Al中所述，該所述之〇rf基 ，可能將一外排系統編碼，該外排系統適於輸出抗生素及其他 毒性，質並造成L·半胱氨酸、l-胱氨酸、L-乙醯基-絲氨酸及/ 或四氫°塞°坐衍生物之生產過剩。 —CysB ’如德國專利DE 19949579C1中所述，該cysB基因將硫 代謝之中央(心)基因調節物編碼，因此對半胱氨酸生物合成之提 供硫化物工作扮演決定性的角色。 自既有技術同樣可知所述諸方法亦可製得半胱氨酸衍生物。 因此，在發酵過程中，由L-半胱氨酸可形成LL-胱氨酸作為氧化 作用產物或由L_半胱氨酸及丙酮酸可形成2-曱基四氫噻唑-2,4-二 羧酸作為縮合作用產物。蓋因L_半胱氨酸係細胞之中心硫予(供） 1330199 石，Π·代謝物即為L-半胱氨酸衍生物。 ° 利用一適當程序，亦可製得N•乙醯基丄_絲 及0至乙醯基心絲氨酸鴻國專利DE-A·麵7002) 之發酵液中進-步得到:3 N.乙酿基心絲氨酸 【發明内容】 ㈣糾製造顧甘峨賴胺基酸 【實施方式】 物一種⑴適於發酵製造璃酸甘油酸醋族胺基酸及其衍生 菌ί(在該起始菌株·中可將yflk_基因產物之活 寻物之活性提昇至較該起始菌株更高)製 仔之微生物囷株可達成前一個目的。 產物ϊϊϊγγ ’ #細納之總潍提糾(由於該細胞内之基因 同祕因產物之活性亦提高，因此每個細胞yfik Π源基因之賴亦提高’即使該基因產物之比活性保持不變。 與與Ιϋί腸ΐ菌基因組序列之-部分(布勒特納等人，1997，科 ;=====基=f ί r譯讀架構並編碼 某因赫之蛋白f截至目别為止，仍不可能對yfik i搜尋(GCG^力ί。對於具有序列同源性之蛋白質所作之資料 庫搜(麵康辛套裝健之FASTA演算法個電腦小組， I 3 3Ώ 1^〇2119756骑卑叫申，卞 、 中文說明書替換頁(96年10月) 办年丨玥相修(更)正替换頁 ，迪遜，威斯康辛)迄無]|當結論，蓋因所顯僅係功能同樣不 詳=白質之相似性。對尋求yfik基因產物可能活性之唯一線索可 在艾勒欣等人所著，（生物科學趨勢，1999，24 : 133_135)中發現。 該^巧之諸位作者提出一種應可描繪出胺基酸外流蛋白質所屬蛋 白質族特性之結構動機。因該脆弱共識主旨（動機)亦發生在Yfik 蛋白，中，後者可成為胺基酸之外流糸統。但精於此項技術者絕 1可能由此獲得有關該Yflk蛋白質具體胺基酸基(受)質之結論。 if產物對磷酸甘油酸醋族胺基酸之製造具有極大貢獻 5 一，值得料的事’尤其因為大腸桿g内顧甘油_旨族胺基 "IL蛋白質(例如：YdeD基因產物)之特性業經加以描述(達斯 Ϊ ί ^分子微生物’繼，36 : 11G1_1112)及第二個系統之存在 岐，卿’基因產触沖13.如產物之間 美因ί 及序列識別第2號之序列業將yflk基因及Yflk ΐ利用特性分別加以描述。在本發明之範圍内， (GLG)，A㈣=i(GCG麵料套裝軟體’基因電腦小組 斯康之分析中，凡序列相同性超過现之 Υ同源基因。尤其序列相同性超過7〇%者更是屬 辛套% _τ演算法gcg威斯康 同；ΐϊΓ蛋白f。尤其相娜超過冒i更 能變=巧種==之；基=偶基_，尤其功 利用分子生物學之標準技術，可製得秦基因產物活性較起 中文說明書 756號真利申铬宏 替換頁(99年6月） ^ Ml 7¾朗正替換頁 始菌株咼之本發明微生淞 物f則上是凡具有磷酸甘油酸酯族胺基酸生 物口成途L之任何微生物，可用重 此類微生物可以是真菌、用培養。 群之細g為佳，。其f以真細菌中系統發育 更佳。 腸内杯囷科之微生物較佳，尤以大腸桿菌種 yfik ΐϊ加严基因之表現’可增加本發明微生物内 基因二複製數及/或增；二^^，見子:二，加，生ΐ内沖k 卿之表現至少等於；。魏意謂最好 用此項技術者f知之方法可增加微生物内yfik基因之 d體=丨Ί之田可將yflk基因植人每個細胞具有多重複製之 !腸桿菌之pUC19、_22、pacyci84) 至該微生物内。變通性地，亦可將yfik基因 μ等夕重複製整5在微生物之染色體内。 韻广整合性質體或經由同系重組之整合作用等ί知 糸統(例如：漢彌頓等人，1989，細菌學報，171:4617 4612)。 w ίΐίΐ—ίΐ子控制之下將—yflk基因植人質體載體内以 數之方式為佳。尤以將一yflk基因植入一 PACYC衍 ，[例. PACYC184-LH(依據布達佩斯條約，寄存於德國微生 物及培養細胞收集公司，勃朗希威格，德國，1995年8月18曰， =號DSM10172 ’以及寄存於台灣食品工業發展研究所，2〇〇〇年 月16日’編唬CCRC 940323)]内而增加大腸桿菌内複製數更佳。 基因之天紐動子及操縱基随可时表現f體 之 基因之控制區。 “但，yfik号因之表現，尤其亦可藉助於其他啟動子予以增加。 適當動子系統，例如：gapA基因之組成性（}^1)11啟動子或 大腸桿菌内可誘導之lac、tac、trc、lambda、ara或tet啟動子乃精 於此項技術者所習知者(麥克瑞德斯，1996，微生物評論6〇 : 13 !?'0 9756號專利中請案 中文說明書替換頁(96年10月） 健習场柄在上或染色體上。 512-538)。該等結構- 藉含有轉譯起始子訊號，例如.e d 結合部位或基因起始密碼子之特別序=義蛋白體 依照”密碼刊it”細絲有密解#碼子、 例 具有前述修飾作用之微生物菌株係本發明ς適二具體實施 舉例5之’利用涵盍全部y^k基因夕姓n朴 之yfik基因 之質^此本發明之另一内容係一包括一具有一啟動子 〇 ： ^ ^®(W〇 97/15673)]^ 酸生產過剩义::=自>:，生物菌株製備具有高度胺基 胱氨酸代謝侧之反^=。，盍因該質财減低微生物内半 胱氨體，體包括：一用作半 因。 】即忭用之逍傳因子及一具有一啟動子之yfik基 穿透體送λ微生物中係使用一種普通轉化方法(電 之純株__wy=於，隨後針對帶質體 法，之另一内容係若干製備本發明微生物菌株之方 糸將本發明之-種質體引進一起㈣株内。藉助於本發 丄 ΐί之ίίΐ二酸甘油酸酯族胺基酸之工作係依照 酸之=本内用以製造_甘油酸醋族胺基 器内係以連續培養、分除。該微生物菌株在發酵 法中適、糖醇類或有機酸類為佳。在本發明之方 乂：以使糊糖、乳糖或甘油作為碳源則更佳。β之方 r> 1 乂，加人奴源之方式以能確保發酵過程中碳源之含1你拉/* 圍内更佳。 、 . 至io公升範 若用ΐϊϋϊίίί二ΐ合氨、錄鹽或蛋白質水解產物。 連續;量加2 “士在發酵過程中氮源係在規律時段中 f他可添加之培養基添加劑是：元素碟知 ^之S鹽類及微量(亦即微莫耳濃度财銦、-結鐘、 _:培養異基亮中氨另=:=^^^ 大豆用之複合營麵是：料萃取液、玉米裝、 更佳。 ^^^佳 ，尤以30至37°c 係藉施為佳。將氧送入發酵器内 在發酵過程中，發酵培養基之酸度值以5 〇至8 $為佳，尤以 T 1唆奶簡6號專利申諸索 . 中文說明書替換頁(96年10月）

牦年丨〇月/曰化，，戍K 酸度值7.〇更佳。若需依k本發明製絲氨酸時，以 酸度值為5.5至6.5最佳。 製造L-半胱氨酸及L-半胱氨酸衍生物時，在發酵過程中需要 將硫源加入。此處以使用硫酸鹽或硫代硫酸鹽為佳。 生長階段過後，依照所述方法發酵之微生物以分批或進給-分 批方式，高效率地將磷酸甘油酸酯族胺基酸分泌至培養基内，二 時10至150小時。 土 茲藉下列諸實驗例將本發明作進一步說明。 實驗例1 : yfik基因之複製(無性繁殖） 藉助於聚合酶之連鎖反應將來自大腸桿菌菌株w311〇之yfik 基因放大。所用特定引子係低聚核苷酸#企_加：（序列編號第3號） 5*-GGA ATT CAT TAA TGA TCC ΑΤΑ ACC CCA AAC CTA XC-3f 及yfik-rev :(序列編號第4號） 5'-GCC TTA ATT AAG TAG CAA GTT ACT AAG CGG AAG-3' u 用限制酶Asnl及PacI將所得DNS碎片加以消化，藉助於 月曰糖凝膝電泳將其加以純化並分離出來(奇亞奎克凝夥萃取器、 亞根，希爾頓，D)。無性繁殖工作之實施係藉助於與二 切成之载體pACYCm-cysEX-GAPDH連接，其過程在歐洲專 EP0885—962A1中曾經詳細述及。該載體含有—巧淑基因 L-半胱氨酸及其3, ’ gapA基因之組成性GADpH啟動子 反饋抑制作用，該cysES基因編碼一絲氨酸乙醯基轉 哕 序以適當紐將yfik基目置於GAPDH啟動子之下游，俾^ 自該處引發。所得載體定名為pG13且以概略圖方式圖示於圖 133〇增92_細，丨 _ —_—_ 中文說明書替換頁("年6月神⑸权減頁 内。隨後藉轉化ΛίΜΐ票篇1菌株讲封·!分·及^用四環素選擇適當轉 株而將結構加以驗證。該細菌菌株大腸桿菌w3U〇/pG13係寄 DSMZ (德國微生物及培養細胞收集公司，D_38142勃朗希威格）， 編號DSM 15059，依據布達佩斯條約，以及寄存在台灣食品工’ 發展研究所，編號BCRC 940431，且係用作下列諸實驗例中用^ 製造磷酸甘油酸酯胺基酸之產體菌株。用以說明yfik基因增加 現效果所選之比較性菌株是w3i10/pACYC184_cysEX，該^ 樣在歐洲專利ΕΡ〇885962Α1中亦料細述及，但與pG13相: 該菌株不含GAPDH啟動子-yfik序列。 貫驗例2 .產體菌株前培養菌種（物） 使用20毫升LB培養基（1〇公克/公升腺、5公克/公升酵母 取物、10公克/公升食鹽），其中另外含有15毫克/公升四 與菌株 w311〇/pG13 或 w311〇/pACYC184-cysEX 接種，並於二轉 速150轉/分鐘之振動器内，在3〇ΐ溫度下加以保溫。七之 將全部混合物移入1〇〇亳升SM1培養基内（12公克/公升 3公克/公升KH2P04 ; 5公克/公升_4)2S〇4 ; 〇·3公克/公 MgS04x7H20 ; 0.015 公克/公升 CaCl2x2H2〇 ; 〇 〇〇2 公克/公 FeS〇4><7H2〇 ; 1 公克/公升 Ν%檸檬酸χ2Η 〇 ;〇 .1 5 ^ 0,5 ^ .5 么克/公升 NasBO3，0.7 公克/公升 c〇cl2x6H2〇 ; 〇 25 公

CuS04x5H20 ; 1.6 公克/ 公升動12><4112〇 ; 〇 3 公克/ 公 ^外=充以5公克/公升葡萄糖，〇 5毫克/公升維生 ^ 及15笔克/么升四環素。於溫度30°C及轉速150轉/分鐘之 情況下繼續實施保溫17小時。 κ驗例3 . 〇-乙酿基_L-絲氨酸之發酵製造 所用發酵器係-勃朗生物科技公司（麥爾松根 B福Μ儀器，該儀器最大培養物容量為2公升。用實^^中 1330199 處之光密度約為3)將含有9⑻毫升 广養基，補充以15公克/公升葡萄糖、〇1公克" 么升酵母萃取物、0.5亳克/公升維生素B1及15亳克/公升 十=酵器加以接種。在發_程中，將溫度調節至耽，並 之速率將消毒之壓縮空氣通入培養物内並以雇轉/分鐘ΐ 氧飽和度降至50%之後，為保持5〇%氧飽和度[藉 定1 77鐘情况下校準至1〇〇%飽和度之氧分壓⑽2)探針測 控繼置將轉速增加至轉/分鐘。當發酵器内葡 =含I已自初始之！5公克/公升降至約5至1G公克/公升時，立 P將56%遭度之葡萄糖溶液計量加入，以6至12亳升/小時之 流速實施進給，並將發酵器内之葡萄糖濃度保持在〇 5至1〇公克/ 公升二葡萄糖係利用YSI(黃泉，俄亥俄，美國)公司製造之葡萄糖 分析器測定。發酵時間為28小時，之後將試樣取出並藉離心作用 ，細胞移除。以流速〇.5亳升/公鐘於一 LUNA 5微米^”幻柱(芬 諾^奈克斯公司’ P?夏芬堡’德國)上，藉逆相高壓流體色譜法將 所得^養物上清液加以分析。所用溶析(洗脫)液係經稀釋之磷酸 (0.1毫^濃磷酸/公升）。表丨所示係所得培養物上清液内主要代謝 產物含量。該等產物為〇-乙醯基_L-絲氨酸及N_乙醯基_L-絲氨酸， s亥N-乙醢基-L-絲|酸係在中性或鹼性情況下由〇_乙酿基_L_絲氨 酸之同分異構作用而增量製得。 表1 菌 株 胺基酸含量(公克/公升） 〇-乙醒基-L-絲氣酸N-乙酿基-L-絲氨酸 W3110/pAC YC184-cysEX W3110/pGl 3(cysEx-yfik) _ 1.8 1.5 7.4 3.0 實驗例4 : N-乙醯基-L-絲氨酸之發酵製造 UJU199 同，作"路ί基'L'絲氨酸之製造方法與實驗例2及3所述者完全相 ‘酸時之酸度值係調節至7.0°如此容易使0-乙醯基-L-絲 τ :户刀/、化為N-乙酿基·[-絲氨酸且所得主要產物係N_乙醯基 -L_絲氰酸。發酵時間為48小時。 表2 菌 株 胺基酸含量(公克/公升） --------- N-乙醯基-L-絲氨酸 W311〇/pACYC184-cysEX 5.8 W311 〇/pGl 3(cvsEx-yfik) 9.2

實驗例5 : L-半胱氨酸及l—半胱氨酸衍生物

L-半胱氨酸之製造方法與實驗例2及3所述者完全相同，但 發，時之酸度值係調節至7.〇且進給硫代硫酸鹽。後者係於兩小時 之後’以30%濃度之硫代硫酸納、流速為3亳升/小時進給。發酵 時間為48小時。L-半胱氨酸之製造係利用蓋唐德分析法(蓋唐犄， (1967) ’生物化學學報，104，627_633)以量熱方式加以監控。此^處 必須納入考量的是：該分析法不能將L_半胱氨酸與歐洲專利Ep 0885962A1中所述L-半胱氨酸及丙酮酸之縮合產物(2_曱基四氫嗟 σ坐-2,4-二敌g复)間加以區別。在該分析法中，用二硫蘇糖醇(dtt) 稀溶液，在酸度值為8.0之情況下，經由還原作用，同樣地可將藉 氧化作用由L-半胱氨酸製得之LL-胱氨酸檢定為L_半胱氨酸；曰 15 1330199 表3 菌 株 胺基酸含量(公克/公升） L-半胱氨酸+衍生物 W3110/p AC YC184-cysEX 4.6 W3110/pG13(cysEX-yfik) 7.5 1330199 序列表 <110>電化工業聯合公司 <12〇>微生物菌株與其製造方法及用途 <130> yfiK <140> <141> <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 750 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (110) .. (694) <400> 1 gatccataac cccaaaccta tcgaaaatat cgaatctaga atataaaaac attcattttt 60 ttaaatgttc cgtgtcgggt actgtctacc aaaacagagg agataacaa gtg aca ccg 118

Val Thr Pro 1 acc ctt tta agt get ttt tgg act tac acc ctg att acc get atg aeg 166

Thr Leu Leu ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu lie Thr Ala Met Thr 5 10 15 cca gga ccg aac aat att etc gcc ctt age tet get aeg teg cat gga 214

Pro Gly Pro Asn Asn lie Leu Ala Leu ser ser Ala Thr ser His Gly 20 25 30 35 17 1330199 ttt cgt caa agt acc cgc gtg ctg gca ggg atg agt ctg gga ttt ttg 262

Phe Arg Gin ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met ser Leu Gly Phe Leu 40 45 50 att gtg atg tta ctg tgt gcg ggc att tea ttt tea ctg gca gtg att 310 lie Val Met Leu Leu Cys Ala Gly lie ser Phe ser Leu Ala Val lie 55 60 65 gac ccg gca gcg gta cac ett ttg agt tgg gcg ggg gcg gca tat att 358

Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu ser Trp Ala Gly Ala Ala Tyr lie 70 75 80 gtc tgg ctg gcg tgg aaa ate gcc acc age cca aca aag gaa gac gga 406

Val Trp Leu Ala Trp Lys lie Ala Thr ser Pro Thr Lys Glu Asp Gly 85 90 95 ett cag gca aaa cca ate age ttt tgg gcc age ttt get ttg cag ttt 454

Leu Gin Ala Lys Pro lie ser Phe Trp Ala ser Phe Ala Leu Gin Phe 100 105 110 115 gtg aac gtc aaa ate att ttg tac ggt gtt aeg gca ctg teg aeg ttt 502

Val Asn Val Lys lie lie Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu ser Thr Phe 120 125 130 gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta age tgg gta gtt ggc gtc age gtt 550

Val Leu Pro Gin Thr Gin Ala Leu ser Trp Val Val Gly Val ser Val

135 140 145 ttg ctg gcg atg att ggg aeg ttt ggc aat gtg tgc tgg gcg ctg gcg 598

Leu Leu Ala Met lie Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp Ala Leu Ala 150 155 160 ggg cat ctg ttt cag ega ttg ttt cgc cag tat ggt cgc cag tta aat 646

Gly His Leu Phe Gin Arg Leu Phe Arg Gin Tyr Gly Arg Gin Leu Asn 165 170 175 ate gtg ett gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta cgc att ttc tat 694 lie Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg lie Phe Tyr 180 185 190 195 18 1330199

taacgaaaaa aagcggaaga ggtcgccctc ttccgcttag taacttgcta cttaag 750 <210> 2 <211> 195 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2

Val Thr Pro Thr Leu Leu ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu lie Thr 15 10 15

Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn lie Leu Ala Leu ser ser Ala Thr 20 25 30 ser His Gly Phe Arg Gin ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met ser Leu 35 40 45

Gly Phe Leu lie Val Met Leu Leu Cys Ala Gly lie ser Phe ser Leu 50 55 60

Ala Val lie Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu ser Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80

Ala Tyr lie Val Trp Leu Ala Trp Lys lie Ala Thr ser Pro Thr Lys 85 90 95

Glu Asp Gly Leu Gin Ala Lys Pro lie ser Phe Trp Ala ser Phe Ala 100 105 110

Leu Gin Phe Val Asn Val Lys lie lie Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu 115 120 125 ser Thr Phe Val Leu Pro Gin Thr Gin Ala Leu ser Trp Val Val Gly 130 135 140

Val ser Val Leu Leu Ala Met lie Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp 145 150 155 160 19 Ι33Ό199

Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gin Arg Leu Phe Arg Gin Tyr Gly Arg 165 170 175 Gin Leu Asn lie Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg 180 185 190 lie Phe Tyr 195

<210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 3 ggaattcatt aatgatccat aaccccaaac ctatc 35 <210> 4 <211> 33 e

<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 4 33 gccttaatta agtagcaagt tactaagcgg aag 20 Ι33Ό199 【圖式簡單說明】 第一圖：pG13載體(基因）圖。所示者，為定名為pG13之載體、 基因 cysEX、yfik、gapA。 【主要元件符號說明】

Claims (1)

1. 中文t請專#: &利申請案_

   :<ί年〜月7曰修(更}正本 -種基因改造之大腸桿_株，該·適用於〇乙臨基切氨酸队 乙酿基-L-絲氨酸、L·半胱氨酸或LL_胱氨酸之發酵製造，且包含將一絲 氨酸〇-乙酿基轉移酶編碼之cysE對偶基因’ L_半胱氨酸對該絲氨酸〇_乙 醒基轉移酶有降低之反饋抑制_，該菌株可由―大腸桿菌起始菌株製 得’其特徵為’包含-具有序列識別第喷⑽⑽嫩υ之序列的娜 基因或-具有與序列_第丨號之序财超過95%之相離（丨編办）之 序列的yfik同源基因。 2.如請求則之大腸桿菌菌株，其中利用適當之啟動子或轉譯訊號可增加 該yfik基因之複製數目或增加該yfik基因之表現。 3·如請求項2之大腸桿菌菌株，其中該啟動子係選自一個以下族群：gapA 基因之組成性GAPDH啟動子，可誘導之lac、tac、加、lambda、咖、及 tet啟動子。 4. 如凊求項1之大腸桿菌菌株，其中yflk*因產物之增加之表現係基於 pACYC衍生物中yflk基因之複製數目之增加。 5. —種質體，其包含一具有序列識別第丨號之序列之yfik基因或一具有與序 列識別第1號之序列有超過95%之相同性之序列的丫趾同源基因，且具有 一選自由gapA基因之組成性GAPDH啟動子、可誘導之丨ac、tac、trc、lambda 、ara、及tet啟動子所組成之群組的啟動子、以及一用於半胱氨酸代謝作 1330199 肖之去調節作用切SE對偶基_遺傳因子，該遺_子將'絲氨酸〇· 乙醯基轉㈣編碼，L_半胱紐對縣氨⑧·乙縣轉轉有降低之反 饋抑制作用。 '6.―细以製備如請求項1至4中任—項之大腸桿關株之方法，其包含將 一如請求項5之質體引人—场桿g起始菌株内。 7. -種用以製備〇·乙酿基心絲氨酸之方法，其包含在發酵作用中使用—如 ^ 料項1至4中任一項之大腸桿菌菌株及將製得之胺基酸自發酵混合物 内移除。 8·如請求項7項之方法，其中該大腸桿__為連續培養物、作為分批 培養物或作為進給·分批培養物在一發酵器内生長。 9.如請求項7或8之，其中在發酵過針連續計量加人_碳源及—氣源 之至少一者。 长項9之m中綱之碳源係糖類、糖醇類或有機酸類。 比㈣求都之方法，其中該碳源細―方式計量加人以確保在發酵過 私中發酵器内之碳源含量維持在Gi㈣公克/公升範圍内。 12·如請求項9嫌’_、氨、峨蛋白質水解物。 13.如請求卿嫩，州_嶋跑錄況下進行。 2 1330199 14·/㈣綱·叫⑽㈣法，梅蝴相中使用一如 清求項1至4中任一項之大腸桿菌菌株及將製得之胺基酸自發酵混合物 内移除。 立月长項14項之方法，其中該大腸桿菌菌株作為連續培養物、作為分批 培養物或作為進給-分批培養物在—發酵器内生長。 16. 如請求項Μ或丨5之方法，其中在發酵過程中連續計量加人—碳源及一氣 源之至少一者。 17. 如叫求項16之方法，其中所用之碳_糖類、糖醇類或有機酸類。 18. 如請求之絲，其巾該碳称H切量力认，以雜在發酵過 知中發酵器内之碳源含量維持在Ο β5〇公克/公升範圍内。 質水解物。 19.如請求項16之方法，其中所用氮源係氨、銨鹽或蛋白 2〇.如請求項Μ或丨5之方法，其巾發酵侧係在需氧生長情況下進行。 21·—種用以製備L-半胱氨酸之方法’其包含在發酵作用中使用一如請求項i 至4中任一項之大腸桿菌函株及將製得之胺基酸自發酵混合物内移除。 22_如請求項21項之方法，其中該大腸桿菌菌株作為連續培養物、作為分批 培養物或作為進給-分批培養物在一發酵器内生長。 23.如請求項21或22之方法，其中在發酵過程中連續計量加入一碳源及一氮 1330199 源之至少一者。 2今如請求項23之方法’其中所用之碳源係糖類、糖醇類或有機酸類。 25.如請求項23之方法’其中該碳源係、以-方式計量加人，以確保在發酵過 程中發酵器内之碳源含量維持在0.1至50公克/公升範圍内。 26_如請求項23之方法，其中所用氮源係氨、銨鹽或蛋白質水解物。 27.如請求項21或22之方法’其中發酵作用係在需氧生長情況下進行。 认-種用以製備LL-胱氨酸之方法，其包含在發酵作用中使用一如請求項【 至4中任-項之大腸桿菌菌株及將製得之胺基酸自發酵混合物内移除。 29.如請求項28項之綠，其中該大腸桿gg_為連續培養物、作為分批 培養物或作為進給-分批培養物在一發酵器内生長。 3〇·如請求或29之方法，其中在發酵過程中連續計量加人—碳源及一氮 源之至少一者。 31.如請求項30之方法，其中所用之碳源係糖類、糖醇類或有機酸類。 议如請求項30之方法’其找碳源係以一方式計量加入，以確保在發酵過 程中發酵器内之碳源含量維持在(^至刈公克/公升範圍内。 33·如請求獅之方法，其中所職轉氨、_或蛋白質水解物。 34.如請求或29之方法’其中發酵作祕在需氧生長情況下進行。 4