TWI248466B

TWI248466B - Process for producing carotenoids

Info

Publication number: TWI248466B
Application number: TW090112095A
Authority: TW
Inventors: Tatkuo Hoshino; Kazuyuki Ojima; Yutaka Setoguchi
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-21
Publication date: 2006-02-01
Also published as: DE60115757T2; DE60115757D1; ID30360A; ES2254285T3; MXPA01005121A; AU4604301A; NO20012552L; KR20010107680A; ATE312928T1; CN100376674C; US20030049720A1; AU784237B2; CN1340628A; CA2346620A1; EP1158051A1; US6696293B2; BR0102104A; NO20012552D0; EP1158051B1; JP2002253266A

Description

1248466 A7 1 B7 五、發明說明（1 ) 發明範_ 本發月係關於製造類胡蘿蔔素的分子生物學，以及對发有用的生物物質。〃發明背景、良a素刀佈在各式各樣的生物中，像是動物（例如鳥類^像是紅鶴和朱鷺，以及魚類，像是虹缚魚和鼓魚），讓類和微生物。亦承認蝦青素具有對抗活性氧物種的強抗氧化性質，預期可應用在藥學用途上，保護活細胞免於-些疾病，像是癌症。此外，從工業應用的觀點來看，特別是在諸如鈇魚之類的養殖魚業上，對於做爲著色劑之蝦青素的需求正持續增加，因爲蝦青素賦與動物特殊的橘紅色，並在市場上引起消費者的興趣。已知紅酶法菲亞酵母（Phaffia rh〇d〇zyma)是產生胡蘿蔔素的酵母菌品系，其特別產生蝦青素。與其他產生胡蘿蔔素的酵母菌，紅酵母屬（Rh〇d〇t〇rula)不同，紅酶法菲亞酵母可使一些諸如D-葡萄糖之類的糖類發酵。從工業應用的觀點來看，這是一個很重要的特徵。在最近的分類學研究中，揭露了紅酶法菲芎酵母的有性周期，並將其遠距刺激變形的狀態命名爲枝狀葉黃素黴（Xanth〇phyll〇myces dendr〇rh〇us)(W.I· Golubev; Yeast 11，1〇卜 no, 1995)。已經進行一些從紅酶法菲亞酵母中獲得蝦青素之超高生產者的品系改良研究，但在最近十年中，這類努力已經受到使用傳統的突變生成作用和原生質體融合之方法的限制。最近’ Wery等人發展出使用紅酶法菲亞酵母的宿主載體系 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先閱讀背面之注意事項§寫本頁} 本

評---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（2 ) 統，其中以多副本之方式，使用不可-複製的質體，在核糖體DNA之處整合到紅酶法菲亞酵母的基因組上（”61^等人，Gene，184，89- 97，1997)。而 Verdoes 等人報告了更多改良的載體，獲得紅酶法菲亞酵母的轉化物，以及其三個產生胡蘿I]素的基因’其編碼催化從焦鱗酸槐牛兒基桅牛兒酯至々-胡蘿蔔素之反應的酵素（國際專利公告 W097/23633)。在不久的將來，將增加遣傳工程方法對紅酶法菲亞酵母之品系改良研究的重要性，突破由傳統方法所能達到的生產力。許多研究者已經推測蝦青素可能在紅酶法菲亞酵母中扮演杬氧化劑的角色，因爲在生長的呼吸階段而非發酵階段中刺激其產生。通常，在呼吸階段易於產生活性氧物種，是在呼吸鏈中電子溢流的結果，這是由於在泛醌池之還原速度和在呼吸鏈下游之電子傳遞之間的電子傳遞不平衡而引起。在這類推測中，蝦青素可能中止這類活性氧物種，就像超氧物歧化酶在活生物中所進行的。

Schroeder等人報告了紅酶法菲亞酵母的呼吸鏈，在生長的晚期’從KCN-敏感‘性的呼吸轉換爲KCN_耐受性的呼吸，此時刺激蝦青素 18379，1995)。KCN-敏感性的呼吸鏈是共同的電子傳遞鏈，其中將在泛醌池中的電子，經由分佈在各種生物中的複合物III傳遞至複合物IV。已知藉著KCN*抗霉素A抑制汶呼及鏈。另一方面，KCN-耐受性的呼吸鏈分佈在植物和眞菌中。在該呼吸鏈中，稱爲交替氧化酶（Α〇χ)的粒線 -5- 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ------r--評---------線. (請先閱讀背面之注意事項>€1|寫本頁) 太 1248466 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3 ) 體膜蛋白質，藉著使用氧分子作爲接受者，扮演將在泛醌池中之電子傳遞至H2〇分子的重要角色。已知由沒食子酸正-丙酯（n-PG)或水楊基羥肟酸（SHAM)抑制Α〇χ之活性。丄在何生自紅酶法菲亞酵母之蝦青素的抗霉素·敏感性超回生產者之特徵研咒中，入11等人推測這類突變種產生多很多的蝦青素，中止活性氧物種，#可能由來自電子傳遞鍵之電子溢流所產生（Αρρ1· Env· Micr〇bi〇1，55, n6_m 1989) 〇 ’ ，以在還原狀態下之電子傳遞鏈的條件下，可能向上調節蝦青素的生物合成的假定爲基礎，創造本發明。可藉著加入特定的抑制劑，像是抗霉素A、KCN、η_ρ(^^ sham，而誘導這類還原狀態。亦可藉著一些將導致電子傳遞不平衡的突變作用，誘導這類狀態。根據本發明，獲得賦與對SHAM之耐受性的突變種。這類突變種獲得比其親代品系高5〇%的蝦青素生產力。 ^發明涉及基因選殖，其編碼得自紅酶法菲亞酵母的交替氧化酶。本發明亦涉及由於這類基因在適當宿主生物中，像是大腸桿菌或酒酵母菌中表現之結果的酵素特徵。可使用如此選殖之基因，藉著在適當宿主中，像是紅菲亞酵母中，使用啓動基因序列的指定-位置之突變生成作用，或反義方法，P争低AOX之活性。並可藉著在適當的培養基中’在適當的培養的條件下，培養這類轉化物，證實其對胡蘿蔔素生成作用的影響。發明概要 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項ί寫本頁) 寫太 1248466 A7 B7 五、發明說明（4 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製本發明提供產製類胡蘿蔔素的新穎方法，其包括培養可藉著在引起交替氧化酶活性降低的條件下，處理可產生類胡蘿蔔素I親代生物而獲得的生物，並選擇提高其類胡蘿蔔素生產力的生物。在本發明之方法中使用的生物，可以是藉著幫助改變其對交替氧化酶抑制劑之耐受性，而提高其類胡蘿蔔素生產力的突變種品系。可藉著使用屬於原生生物或眞菌界的生物，實行根據本發明之方法，更佳的是賽内奇球菌屬（SyneCh〇coccus)、赛内奇囊球菌屬 (Synechocystis)、血液球菌屬（Haeniat0C0CCUS)、多納利菌屬（Dunaliella)、法菲亞酵母菌屬（phaffia)、葉黃素徽屬 (Xanthophyllomyces)、鏈孢黴屬（Neur〇sp〇ra)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、布拉黴屬（Blakeslea)或藻狀菌屬 (PhyC〇myces)，其中最佳的生物可以是紅酶法菲亞枝狀葉黃素黴的品系。本發明可使用之交替氧化酶抑制劑，可選自包括沒食子酸正-丙醋和水楊基幾肋酸。本發明亦提供建立突變種品系之方法，其相對於親代生物，能夠產生提高含章的類胡蘿蔔素，該方法包括在降低交替氧化酶活性的條件下，培養可產生類胡蘿蔔素之生物’並選擇能夠以比該親代生物更高的程度產生類胡蘿菌素的生物。降低交替氧化酶活性的條件，可包括交替氧化酶抑制劑的存在。爲了此一目的，交替氧化酶抑制劑可選自包括沒食子酸正-丙酯和水楊基羥肘酸。本發明之突變種品系的生物，可屬於原生生物或眞菌界，更佳的是赛内 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 太評---------線 -J. 卜紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1248466 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 奇球菌屬、賽内奇囊球菌屬、血液球菌屬、多納利菌屬、法菲亞酵母菌屬、葉黃素黴屬、鏈孢黴屬、紅酵母屬、布拉黴屬或藻狀菌屬，其中最佳的生物可以是紅酶法菲亞酵母和枝狀葉黃素黴的品系。另一方面，本發明亦關於能夠以‘相對於其親代生物，以提高之含量產製類胡蘿蔔素之生物的突變種品系，其可藉著上述的方法而獲得。更特定而言，該突變種之特徵在於即使培養基含有0.3至0.45毫克/毫升的SHAM，其可以類似在不含SHAM之培養基中的生長速率生長。如同在本發明的一個具體實施例中，提供SHAM-耐受性的突變種，其衍生自紅酶法菲亞酵母ATCC96594。在2000 年4月3日，將這類SHAM-耐受性突變種分別以DSM 13429、DSM 13430 和 DSM 13431 存放於 DSMZ (Deutsche Sammlung der Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb，D- 38124 Braunschweig，Germany)中。在本發明之方法中使用的生物，可以是重組的生物，改變其交替氧化酶的基因表現，以便與親代生物相比較，降低其效力。本發明更爽供能夠以相對於宿主生物，以提高之含量產製類胡蘿蔔素的重組生物，其特徵在於改變其交替氧化酶的基因表現，以便與宿主生物相比較，降低其效力。這類生物可藉著選自反義技術、指定-位置之突變生成作用、化學突變生成作用等等技術的幫助，改變交替氧化酶的基因表現。爲了此一目的，該生物可屬於原生生物或眞菌界，更佳的是赛内奇球菌屬、赛内奇囊球菌屬、血 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

------!---評---------線I 1248466 A7 B7 五、發明說明（6 多納利菌屬、法菲亞酵母菌屬、葉黃素黴屬、〇 C 、、、上酵母屬、布拉黴屬或藻狀菌屬，其中最佳的 :物可以疋紅酶法菲亞酵母和枝狀葉黃素黴的品系-特別是上文提及的存放物。本發月亦&供重組的DNA序列，、編碼衍生自可產生類胡蘿蔔素之生物的父替氧化酶。該重組的dna可獲自屬於原生生物或眞菌界的生物，更佳的是赛内奇球菌屬、赛内奇囊^菌屬、血液球菌屬、多納利菌屬、法菲亞酵母菌屬、葉黃素黴f、鏈孢黴屬、紅酵母屬、布拉黴屬或藻狀菌屬，其中取佳的生物可以是紅酶法菲亞酵母和枝狀葉黃素黴的品系-特別是上文提及的存放物。可藉著序列識別2號確認根。據本發明之重組DNA序列，或與序列識別2號具有冋方；55 /〇 ,更佳的是鬲於75%，最佳的是高於％%同一性者。更特定而言，該重組的DNA序列其特徵在於（勾其編碼之酵素具有在序列識別i號中描述的胺基酸序列；或（b)其編碼該酵素之變體，選自（i)對偶基因變體和（ϋ)具有一或多個胺基酸添加、***：刪除及/或取代，並具有陳述之酵素活性的酵素。上文提及之特別指定分離的DNa序列，可以是衍生自紅酶法菲亞酵母之基因，並分離自（i)以序列識別2號代表的DNA序列，（ii)以序列識別2號代表之DNa序列的同類編碼（isocoding)或對偶基因變體，（丨⑴以序列識別2號代表之DNA序列的衍生物，帶有一或多個核嘗酸（群）的添加、***、刪除及/或取代作用，並編碼具有該酵素 -9 - 度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項3寫本頁) 訏---------線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466

經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製五、發明說明（7 ) 活性的多肽。本發明亦提供使用該重組DNA來轉化宿主生物。重组舰的便利形式可以是載體。藉著使用重組舰而獲得的重組生物，能夠降低交替氧化酶的酵素活性。以該重組 DNA轉化的宿主生物，可用來改良類胡蘿蔔素的生產方法，特別是蝦青素。因此，本發明亦提供這類重組生物。此外，本發明亦提供類胡蘿蔔素之生物產製的方法，其包括將上述的重組DNA導入適當的載體生物中，並培養^ 此而獲得的重組生物。因此，產製類胡蘿蔔素的方法，其特徵在於在可傳導產生類胡蘿蔔素的條件下培養上述的重組生物，亦爲本發明的一方面。可將該方法應用在蝦青素的生物產製上。圖式簡單説明圖1敘述在紅酶法菲亞酵母中呼吸鏈的工作模式。發明詳細説明如同上述，許多研究者已經推測蝦青素在紅酶法菲亞酵母中扮演抗氧化劑的角色，因爲在生長的呼吸階段而非發酵階段中刺激其產生。‘通常，在呼吸階段易於產生活性氧物種，是在呼吸鏈中電子溢流的結果，這是由於在泛醌池之還原速度和在呼吸鏈下游之電子傳遞之間的電子傳遞不平衡而引起（圖1)。在這類推測中，蝦青素可能中止這類活性氧物種，就像超氧物歧化酶所做的。以此推測爲基礎，在紅酶法菲亞酵母中藉著抑制呼吸，可能實現蝦青素的過度產生。事實上，入11等人分離阻斷其 _____-10- _ ^氏張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f )~ --—^ (請先閱讀背面之注意事項寫本頁> -n I 1^1 n n · .1 1 an n n 4 *1 1248466 A7 B7 五、發明說明（8 ) KCN-敏感性呼吸的突變種，且其從紅酶法菲亞酵母中產生多很多的蝦青素（Appl. Env· Microbiol，55, 1 16-124, 1989)。另一方面，如同Schroeder等人報告的，紅酶法菲亞酵母的呼吸鏈’在生長的晚期從KCN-敏感性呼吸轉變爲KCN· 耐受性呼吸，此時刺激蝦青素的產生（j. Bi〇i. chem.，270, 18374- 18379, 1995)。關於此點，KCN_耐受性呼吸，其由夂替氧化酶碉節，將在蝦青素產生期間對呼吸有更多的影響。交替氧化酶的抑制，將導致蝦青素的過度產生。爲了檢查呼吸活性之特定抑制作用，在紅酶法菲亞酵母中對蝦青素產生的影響，以連續稀釋之濃度WSHAM，已知其抑制交替氧化酶，加至生長瓊脂培養基中。在本研究的過私中，數個自然的突變種，即使是在0 3至0·45毫克/ 耄升SHAM的存在下，仍顯示類似在不含SHAM之培養基的生長活性。驚人的發現這類突變種產生比其親代高5〇%的蝦青素。這代表某些導致蝦青素過度產生的突變，可藉著呼吸鏈的還原狀態，補充生長抑制，其將由交替氧化^活性的降低而引起。因此，本發明提供經過分離的突變種，其抵抗〇3至〇45 毫克^毫升交替氧化酶的特定抑制劑，sham。與上文相同，熟諳此藝者迅速的瞭解，可藉著在任何_或多個交扶氧化酶之抑制劑的存在下，培養適當的生物，並藉著篩i 在孩抑制劑（群）的存在下顯示出生長活性，以及比親代生物更高之蝦青素生產力的生物，來建立能夠以較高之生產力產生蝦青素的突變種品系。可藉著從紅酶法菲亞酵母之 L_—_— _ _ 11 _ 本紙張尺度適用中國國豕標4 (UW)A4規袼（21〇 x 297公爱 1248466 A7 Β7 五、發明說明（9 ) 細胞中萃取類胡蘿蔔素，並按照在實例2中舉例説明的，測量蝦青素含量，來判定蝦青素的生產力。生產力增加大約10%，將是選擇能夠以比親代品系更高之程度產生蝦青素之突變種品系的可能基準。可使用在交替氧化酶抑制劑之壓力下再度-培養和篩選如此獲得的突變種品系，以便改吾生產力。可將如此獲得的突變種品系，應用於在適當培養基中產製蝦青素。田爲了降低X替氧化酶的活性，使用遺傳工程的方法比在培養基中加入特定抑制劑，像是SHAM的方法具有數個優點。這些優點之一是經濟上的理由。加入這類抑制劑將增加產製的成本。且在培養基中加入這類抑制劑，在純化步驟中，從終產物中移除加入的抑制劑方面有其他的缺點。此外，本發明提供經過分離的重組DNA序列，其編碼得自紅酶法菲亞酵母之交替氧化酶。本發明之DNA可意指cDNA，其僅含有位在其5，·至3,-未轉譯區中短片段之間側面的開放編閱架構，還有基因組 DNA，其含有它的***序列和調節序列，像是其啓動基因和終止轉綠之序列，其涉及感興趣之基因的表現。首先’我們藉著使用簡併PCr方法，選殖含有一部份 AOX基因的部份基因片段。該簡併pCR是選殖感興趣基因的万法，該感興趣基因與得自其他物種之具有相同或類似匕々已知酵素’具有高度的胺基酸序列同種性。藉著相對應核苷酸（"簡併的”）之胺基酸序列的逆轉譯作用，設計在簡併PCR中用來作爲引子的簡併引子。在這類簡併引子 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 許---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國宕煙淮^ ____ -12 - Μ / X 10 i\ 格規 1/ n \. w \

I 1248466 A7 B7 五、發明說明（10 中，通常使用由任何A、C、MT所組成的混合引子，或在雙關性密碼處含有肌誓的引子。在本發明中，使用混合引子作“併引子’來選殖上述的基因。所使用的pcR條件是依據引子和待選殖之基因’按照下文的描述同的。 . 可藉著篩選以噬菌體載體或質體載體在適當之宿主中建構的基因組庫，藉著使用經由上述之簡併心而獲得的部份DNA片段，並在將其標示之後作爲探針，從染色體中選殖含有其密碼區，與其插人序列及其調節區，像是戌動芙因或終止轉綠之序列的完整基因。在建構庫和後續：遺‘ 操作’像是足序、限制消化、連接及其類似者時，通常使用大腸桿菌作爲宿主品系，並使用大腸桿菌載體、嗟菌體載體’像是^菌體載體，或f體載體，像是puc載體。在本發明中，心載體之衍生物，Agtnf，建構紅酶法耜亞酵母的EcoRI基因組庫。在建構庫之前，藉著南方墨點雜交作用判定插人物的尺寸，必須選殖多長的***物：在本發明中，依據由供應者準備的草案（B〇ehHng仏 Mannheim，Mannheim, 9ermany)，以毛地黃毒芬（dig)，一種類固醇附著素來代替傳統的32p標記，標示用來作爲探針的DNA。藉著使用以DIG標示之DNA片段，其具有一部份感興趣的基因作爲探針，篩選從紅酶法菲亞酵母之染色^ 中建構的基因組庫。在分離陽性的斑點之後，將***物= 段繼代選殖到適當的質體載體中，其可便利的用於定序。在本發明中，可將在陽性噬菌體載體中的***物片段繼代 (請先閱讀背面之注意事項

訂· 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製

1248466 A7 B7 五、發明說明（11 ) 選殖到pOCUS-2載體内，使用它來建構轉因子-***定序衍生物（Locus Pocus System, Novagene，Madison，U.S.A.)。在本發明中，與自動循環定序草案一起使用自動螢光 DNA定序器，ALFred系統（Pharmacia，Uppsala Sweden)，其中在大部份定序的案例中使用Taq DNA聚合酶。在判定基因組序列之後，使用密碼區的序列來選殖相對應基因的cDNA。亦開發PCR方法來選殖cDNA片段。利用加入適當的限制位置，合成其序列與在開放編閱架構（ORF) 之5’-至3f•末端之序列相同的PCR引子，並使用那些PCR引子進行PCR。在本發明中，在以PCR選殖cDNA時使用 cDNA池作爲模板。該cDNA池由各種cDNA物種所組成，其在活體外藉著病毒的逆轉錄酶和Taq聚合酶（由Clontech， Palo Alto，U.S.A.製造的CapFinder套組）合成，藉著使用獲自紅酶法菲亞酵母之mRNA作爲模板。可在其序列中證實如此獲得感興趣的cDNA。此外，可使用如此獲得的 cDNA，在將該cDNA片段選殖到在大腸桿菌或酒酵母菌中，在適當之啓動基因下發揮功能的表現載體内之後，證實其酵素活性。 k 欲表現衍生自眞核生物的基因，通常使用其中在大腸桿菌或酒酵母菌中，將該cDNA選殖到表現載體内的程序。這由於***序列結構之專一性隨著生物改變，且在其他的物種中不能認出該***序列的事實所引起。事實上，原核生物在其自己的遺傳背景中，不具有***序列結構。即使是在酵母菌中，在屬於子囊菌綱（Ascomycetes)的酒酵母菌 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7

五、發明說明（12 ) 與屬於擔子菌綱（Basidiomycetes)的紅酶法菲亞酵母之間的遺傳背景仍是不同的。Wery等人顯示得自紅酶法菲亞酵母之肌動蛋白基因的***序列結構’不能由子囊菌綱之酵母菌’酒酵母菌認出，亦不能與其接合（Yeast，12, 641_651 1996) 〇、，一些其他的研究者報告了一些種類基因之***序列結構涉及其基因表現的調節（Dabeva，M D·等人，Pr〇c. Natl. Aead ScHS.A· 83, 5854, 1986)。在感興趣基因之自我-選殖的案例中，使用具有其***序列之基因組片段可能是重要的使其***序列結構得以涉及它自己之基因表現的調節0 欲應用遺傳工程的方法來進行品系改良研究，結果必須研九其遺傳機制，像是轉錄和轉譯作用。不僅對其表現序列’判定其上游激活序列（UAS)、啓動基因、***序列結構和終止轉綠之序列的遺傳序列亦是很重要的，以便研究遺傳機制。根據本發明，從紅酶法菲亞酵母的基因組dna中選殖編碼交替氧化酶的基因，·並判定其含有交替氧化酶（Α〇χ)基因，包括其5，_和3，_相鄰區，以及其***序列結構的基因組序列。在證實酵素活性之後，可使用基因修改研究，以便降低交替氧化酶之活性。在本發明中，多肽序列包括序列識別2號及其具有Α〇Χ 活性之片段，且該多肽序列在足以確認與序列識別2號之 _ -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 B7 五、發明說明（13) (請先閱讀背面之注意事項v 專一結合的嚴格條件下，與序列識別2號雜交，而其雜化物編碼具有交替氧化酶之功能的多肽。例如，可使用下列雜交和沖洗條件的任何組合，來完成需要的專一性結合：高嚴格度的雜交:

6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺在42°C下培養過夜，並溫和的擺動。高嚴格度的沖洗· 以2X SSC，0.5% SDS在室溫下沖洗一次15分鐘，接著以 0.1X SSC，0.5% SDS在室溫下沖洗另一次15分鐘。低嚴格度的雜交:

6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺在37°C下培養過夜，多溫和的擺動。低嚴格度的沖洗: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以0.1X SSC，0.5% SDS在室溫下沖洗一次15分鐘。可藉著改變進行雜交反應的溫度及/或上述的沖洗條件，獲得中等嚴格度的條件。在本發明中，最好是使用高嚴格度的雜交和沖洗條件。欲利用遺傳方法降低基因表現，可開發一些方法。這類 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1248466 A7 B7 五、發明說明（14) (請先閱讀背面之注意事項Η 方法之一是反-義法。反-義法是藉著導入人造的基因片段，降低感興趣之基因表現的方法，該人造基因片段的序列是與感興趣基因互補的。且這類反-義基因片段將在活體内與目標基因之成熟的mRNA片段形成複合物，結果抑制從該mRNA中的有效轉譯。爲了建構AOX基因之反-義 RNA，可使用PCR方法，選殖ΑΟχ基因的互補cDNA股。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其他方法是啓動基因區的突變作用。通常，基因由數個部份組成，彼此具有不同的功能。在眞核生物中，編碼相對應之蛋白質，轉綠成早熟信使RNA (前-mRNA)的基因，與核糖體RNA ( rRNA)、小形核RNA ( snRNA)和轉移RNa (tRNA)的基因不同。雖然rnA聚合酶II (PolII)在該轉錄事件中扮演重要的角色，但PolII不能沒有涵蓋上游區的順式 -元件而單獨開始轉錄作用，該上游區含有啓動基因和 UAS，以及反式-作用的蛋白質因子。首先，轉錄開始複合物由數個基本的蛋白質組份所組成，其認得在待表現之基因-相鄰區中的啓動基因序列。在該事件中，在某些特定的凋節之下，像是熱休克反應，或適應營養饑餓等等，表現基因的案例中，需睪一些額外的參與者。在這類情況下，需要有UAS出現在啓動基因序列周園的5、未轉錄上游區中，而一些陽性或陰性的調節蛋白質認出並與UAs結合。轉綠開始複合物對啓動基因序列的結合強度，受到在啓動基因周圍反式-作用因子之結合作用的影響，且夠調節轉綠活性。 ' 在藉著磷酸化作用激活轉綠開始複合物之後，轉錄開始 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) 1248466 A7 B7 五、發明說明（15) (請先閱讀背面之注意事項Η 複合物從轉錄開始位置發動轉綠作用。某些部份的轉錄開始複合物以延長複合物之形式，從啓動基因區中分離，至基因之3，-方向（將該步驟稱爲啓動基因清除事件），且延長複合物繼續轉錄，直到其到達位在該基因之3, _相鄰下游區的終止轉綠序列爲止。 . 欲降低感興趣之基因的表現，通常使用藉著傳統的化學突變生成作用或遺傳之指定_位置之突變生成作用，使含有上述之UAS序列之目標基因的啓動基因區發生突變的作用。在忒方法中，使含有報告者基因的基因卡匣發生突 ’交，该報告者基因在其5’ -末端與衍生自感興趣基因之啓動基因區融合，而在其3，-末端與得自感興趣基因之終止轉錄序列區融合，然後將其導入紅酶法菲亞酵母内。可藉著以具有這類經過突變之啓動基因區的重組DNA轉化宿主品系，獲得其中可能降低感興趣之酵素表現的突變種品系。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可將堵如含有反·義AOX基因或AOX基因之突變啓動基因的載體之類的構築體，轉移感染到適當的宿主品系内。在使用紅酶法菲亞酵母作爲宿主品系的案例中，了解將這類構築體選殖到適當的載‘體内，該載體藏匿有在紅酶法菲亞酵母中具有功能的可選擇標記。通常使用編碼能夠使宿主在毒性抗生素的存在下存活之酵素的藥物抗藥性基因，作爲可選擇標記。藏匿在pGB-Ph9中的G418抗藥性基因 (Wery等人，Gene，184, 89-97, 1997)，是藥物抗藥性基因的貫例。可經由在染色體和質體之間的同種重組作用，將這類質體整合到紅酶法菲亞酵母的染色體上。 •18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1248466 A7 _B7_ 五、發明説明（16 ) 至於轉化方法，LiAc法和電穿透作用法（Wery等人，184, 89_ 97, 1997)，適用於轉化紅酶法菲亞酵母。可在適當的培養基中培養這類以遺傳方式設計的紅酶法菲亞酵母，並評估其蝦青素的生產力。利用下述的實例，藉著參考附圖，進一步解釋本發明。實例在下述的實例中，使用下列的材料和方法：品系紅酶法菲亞酵母ATCC 96594 (遵照布達佩斯條約，於 1998年4月8日，以登錄編號ATCC 74438再存放）大腸桿菌 Υ1090Γ : araD139, hsdR (rk+，mk+)，mcrB+，rpsL， supF，trpC12::的 TnlO，AlacU169，A lon，F，λ ，（ pMC9) (Clontech) 大腸桿菌 DH5 從：F·，（j)80d，lacZ AM15，A(lacZYA-argF) U169，hsd(rk+，mk+)，recAl，endAl，deoR，thi-1，gyrA96, relAl (Toyobo，Osaka，Japan) 大腸桿菌 rd 捐贈者：A (gpt-proA)62, leu，44，aral4, galK2，lacYl，A(mcrC-mrr)，（rB-，mB )，xyl-5，mtl-1， recA13, [F+ : : Tnl000( tets) ] (Novagene) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 大腸桿菌 rd 接受者：F、araD139，A (ara-leu) 7696, galE15，galK16，A(lac)X74，（Strr)，hsdR2(rK12-，mK12+)， mcrA, mcrB 1: : Tn5(kanr) (Novagene) 大腸桿菌 TOPIO: F，mcrA，A(mrr-hsdRMS-mcrBC)，（|)80, M15，AlacX74，recAl，deoR，araD139，（ara-leu)7697，galU， -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1248466 A7 B7 五、發明說明（17) galK，rpsL(Strr)，endAl，nupG(Invitrogen，NV Leek，the Netherlands) 載體 λ gt 11 ( Clontech) pCR2.1-TOPO (Invitrogen) pOCUS-2 pBluescript II SK-( Stratagene) pGBPh9 (Wery等人，Yeast，12, 641-651，1996) 培養基例行的將紅酶法菲亞酵母維持在YPD培養基的瓊脂盤 (DIFCO, Detroit，USA)上。將大腸桿菌維持在LB培養基（10 克細菌-胰蛋白酶水解產生的酶（trypton) ( DIFCO)，5克酵母萃取物（DIFCO)和5克NaCl每公升）上。爲了在軟瓊脂 (0.7%瓊脂；WAKO)上繁殖；I噬菌體，使用NZY培養基（5 克 NaCn，2克 MgS04-7 H20，5 克酵母萃取物（DIFCO)，10 克NZ胺A型（WAKO，Osaka，Japan)每公升）。在製備瓊脂培養基時，補充1.5%瓊脂（WAKO)。水楊基羥肘酸（SHAM) 購自 Aldrich(Milwaukee，U.S.A.)。方法分子遺傳學技術的共同方法，係根據在Molecular cloning: a Laboratory Manual，第 2版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中的方法。限制酵素和T4 DNA連接酶購自 Takara Shuzo(Japan) 〇藉著使用 QIAGEN基因組套組（QIAGEN，Hilden，Germany)， •20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（18) 依據製造者提供的草案，進行從紅酶法菲亞酵母中分離染色體DNA。利用自動的DNA分離系統（Pl-50, Kurabo, Co, Ltd·，Osaka，Japan)，進行從經過轉化之大腸桿菌中，質體 DNA的迷你-製備作用。藉著使用QIAGEN管柱 (QIAGEN)，進行從大腸桿菌轉化物中，質體〇ΝΑ的迷你-製備作用。藉著使用QIAquick或QIAEX II ( QIAGEN)，從瓊脂糖中分離和純化DNA片段。利用酚方法，藉著使用Isogen(Nippon Gene，Toyama， Japan)，進行從紅酶法菲亞酵母中分離總rnA。藉著使用 mRNA分離套組（Clontech)，從如此獲得的總RNA中純化 mRNA。藉著使用 CapFinder cDNA建構套組（Clontech)，合成 cDNA。藉著使用 Gigapack III金包裝萃取（Stratagene，La Jolla， U.S.A.)，進行在活體外的包裝。藉著wizard Λ製備DNA純化系統（Promega，Madison，U.S.A·)，依據製造者準備的草案，進行；I DNA的分離。利用Perkin Elmer 2400型的熱循環器，進行聚合酶連鎖反應（PCR)。在實例中分別描述每個PCR條件。PCR引子係購自供應商。利用自動的螢光DNA定序器（ALFred， Pharmacia)進行 DNA定序。 DH5從的合格細胞，購自Toyobo。除非另行陳述，所有的化學物質均購自WAKO。實例1 :從紅酶法菲亞酵母ATCC96594中分離SHAM-耐受性突變種 SHAM1、SHAM2和 SHAM3 _-21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----Γ--訂---------線I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) •丨|玄寫太 1248466 A7 B7 五、發明說明（19) 爲了檢查由交替氧化酶調節的KCN-耐受性呼吸之抑制作用對紅酶法菲亞酵母的影響，進行在YPD-瓊脂培養基中加入SHAM，來培養紅酶法菲亞酵母。將SHAM溶解於乙醇中，並分別以0.05、0.15、0.30、0.45和0.90毫克/毫升之終濃度，加至YPD-瓊脂培養基中。在這些培養基中，在稀釋之後，散播2xl07個細胞/毫升的紅酶法菲亞酵母ATCC96594。在20°C下培養三天之後，計算產生的菌落。結果，在含有 SHAM之YPD瓊脂上生長的菌落數目，與在不含SHAM之對照組培養基上的幾乎相同。但是，生長在含有SHAM之培養基上的菌落尺寸，比對照組培養物更小。表1顯示對於對照組菌落的相對菌落直徑。表1生長在含有SHAM之YPD瓊脂上的菌落之相對尺寸 SHAM(毫克 / 毫升） 0.05 0.15 0.30 0.45 0.90 相對菌落直徑（％) 100 70 40 30 12 有趣的是，在生長在含有0.3和0.45毫克/毫升SHAM之培養基上的菌落之中，一些菌落顯示出類似對照組菌落的尺寸。這類菌落亦顯示出比對照組菌落更深的染色。挑選出四個顯示出類似對照組‘菌落尺寸之尺寸的菌落，並在YPD-瓊脂培養基上劃條紋。所有的菌落顯示比對照組菌落更深的染色，即使是在不含SHAM的YPD-瓊脂培養基上。從該結果，暗示這些品系可能是自然的突變種，並命名爲 SHAM1、SHAM2、SHAM3和 SHAM4 〇實例2 ··耐受性突變種SHAM1、SHAM2和SHAM3的燒瓶發 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂： •線“ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 -— ____B7 五、發明説明（20 欲評估SHAM·耐受性突變種SHAM1、纽鹰2和sham3 的蝦青素生產力，進行在振盪燒瓶中的發酵作用。將這些突變種及其親代品系ATCC96594，從新近製備的瓊脂-培養基接種到尺寸500毫升之折流燒瓶中的5〇亳升YpD培養基中’至在660毫微米處的最終〇d値爲〇·〇5。在2(rc下以2〇〇 r.p.m.進行發酵。以適當之間隔，取回3亳升肉湯，並分析細胞產量和蝦青素内含量。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以在600 φ微米處之〇d値來測量細胞產量。按乾細胞重’其係精著在1.5¾升微量離心管中，在加熱至12〇 °c過夜之後’稱取衍生自1.0毫升肉湯的細胞重量來測量的。利用HPLC法，在藉著如下以玻璃小珠使起破裂，從紅酶法菲亞酵母的細胞中萃取類胡蘿蔔素之後，測量紅酶法菲亞酵母的蝦青素内含量。利用蒸餾水份，將在離心之後獲自 1毫升肉湯的細胞濃縮兩倍，並將1〇·〇克的玻璃小珠加至在以标色遮蔽之試管（13 · 5毫米，11公分）中的細胞懸浮液中。接著，加入1.5毫升丙酮/ 丁基化羥基甲苯（βηΤ) /水 (在450毫升丙酮和50毫升水中的45毫克ΒΗΤ)，然後以水平的桌上型振盪器振盪一小時。在萃取之後，加入作爲内部標準物的5毫升丙酮/ΒΗΤ/含有適當濃度之胭脂樹橙 (nacalai tesque，Kyoto，Japan)的水。利用下列的 HPLC 系統 (HPLC系統的硬體，購自Tosoh( Tokyo, Japan))，分析上清液之蝦青素内含量。 HPLC 管柱；YMC-Pak ODS-A(6 毫米，150 毫米（YMC，Inc·， -23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1248466 A7 B7 五、發明說明（21 )

Milford，U.S.A.) 〇溫度：室溫洗脱液：乙腈/甲醇/異丙醇（85/10/5) 注射體積；10微升流速；2.0毫升/分鐘 ‘

檢測；以471毫微米之UV 在表2中概述結果。所有的突變種均顯示比親代品系 ATCC96594高50%的蝦青素生產力。從該結果中，在這些突變種中可能出現的一些突變，藉著增加蝦青素的產生，補償交替氧化酶活性的抑制作用。表2 SHAM·耐受性突變種的蝦|素生產力 _蝦青素生產力___ (毫克/公升） (毫克/克-乾細胞)00^660¾¾^ (小時） 38 72 38 72 38 72 SHAM-1 1.65 4.07 0.179 0.380 24.5 30.6 SHAM-2 2.36 4.43 0.217 0.385 29.5 30.5 SHAM-3 2.87 3.9Ί 0.247 0.381 29.2 29.5 ATCC96594 2.00 2.76 0.164 0.258 21A 28.7 實例3 :從紅酶法菲亞酵母中分離mRNA，並建構cDNA庫欲建構紅酶法菲亞酵母的cDNA庫，在打破細胞之後馬上藉著驗萃取法分離總mRNA，並藉著使用mRNA分離套組 (Clontech)純化得自紅酶法菲亞酵母ATCC96594品系的 mRNA 〇 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項9寫本頁)

訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 ____B7_ 五、發明説明（22 ) 首先，藉著離心（15〇〇 X g，10分鐘）從10毫升在YPD培養基中的兩-天-培養物中，收獲ATCC96594品系的細胞，並以萃取緩衝溶液（1〇 mM擰檬酸鈉/HC1 (pH 6.2)，含有0.7 M KC1)沖洗一次。在懸浮於2.5毫升萃取緩衝溶液中之後，藉著法式擠壓均質器（Ohtake Works Corp·，Tokyo, Japan)，以1500公斤力/平方公分將細胞打破，並根據製造者指定的方法，立刻與兩倍體積的isogen (Nippon gene)混合。在此步驟中，回收400微克的總RNA。然後根據製造者指定的方法，藉著使用mRN A分離套組 (Clontech)純化總RNA。最後，從紅酶法菲亞酵母 ATCC96594品系中，獲得16克的mRNA。欲建構cDNA庫，根據製造者指定的方法，使用CapFinder PCR cDNA建構套組（Clontech)。將1微克經過純化的mRNA 應用在第一股的合成上，接著是PCR擴大作用。在藉著 PCR擴大之後，獲得1毫克的cDNA池。實例4 :從紅酶法菲亞酵母中選殖部份的AOX (交替氧化酶）基因經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 欲從紅酶法菲亞酵母中選殖部份的AOX基因，開發簡併的PCR方法。爲了多重排列分析（ClustalW，Thompson J.D·，等人，Nucleic Acids Research，22，4673-4680，1994)，使用其交替氧化酶之序列的物種和資料庫之登錄編號如下。黑麴菌（Aspergillus niger) AB016540 (DDBJ/GenBank/EMBL) 白色念珠菌（Candida albicans) AF031229 (DDBJ/GenBank/EMBL) 瑞哈帝厚膜單孢菌（Chlamydomonas reinhardtii) -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1248466 A7 B7 五、發明說明（23) AF047832 (DDBJ/GenBank/EMBL) 格瑞西美格納波斯菌（Magnaporthe grisea) AB005144 (DDBJ/GenBank/EMBL) 粗糖鏈孢黴(Neurospora crassa) Q01355 (Swissprot) 沙帝伐稻黴（Oryza sativa) AB004813 (DDBJ/GenBank/EMBL) 無形畢赤酵母(Pichia anomala) Q00912 (Swissprot) 布氏錐蟲(Trypanosomabruceibrucei) Q26710 (Swissprot) 按照在表3中所示，以得自其他物種之已知交替氧化酶基因的共同序列爲基礎，設計並合成兩個混合引子的核苷酸序列。表3 在選殖AOX基因時所使用之引子的序列 aox3; AAYGARMGNATGCAYYTNYTNACNTT (有意義引子） (序列識別3號） aox5; GCYTCYTCYTCNARRTANCCNACRAA (反義引子）（序列識別4號） (N=A，C，G或 T ; R=A或 G，Y=C或 T，M=A或 C) 在藉著使用ExTaq ( T.akara Shuzo)作爲DNA聚合酶，並使用在實例1中獲得的cDNA池作爲模板，進行95°C 30秒，50°C 30秒和72°C 15秒25次循環的PCR反應之後，將反應混合物應用於瓊脂糖凝膠電泳上。回收具有想要長度的PCR譜帶，並根據製造者的方法，藉著QIAquick ( QIAGEN)純化之，然後與pCR2.1-T0P0 (Invitrogen)連接。在轉化合格的大腸桿菌TOP 10之後，選擇白色的菌落，並利用自動的 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1248466 B7___ 五、發明說明（24 ) DNA分離系統分離質體。由於定序的結果，發現3個純種系所具有之序列，其推衍的胺基酸序列類似已知的交替氧化酶基因。將該經過分離的cDNA純種系命名爲 pAOX514，並用來進一步研究。

實例5 :從紅酶法菲亞晚屋·中分雜基因組DNA 欲從紅酶法菲亞酵母中分離基因組DNA，根據製造者指定的方法，使用QIAGEN基因組套組。首先，藉著離心（1500 X g，分鐘）從毫升在YPD培養基中過夜的培養物中’收獲紅酶法菲亞酵母ATCC96594 品系的細胞，並以TE緩衝溶液（1〇 niM Tris/HCl (pH 8.0)，含有1 mM EDTA)沖洗一次。在懸浮於8毫升QIAGEN基因組套組的Y1緩衝溶液中之後，以2毫克/毫升之濃度加入溶解酶（lyticase)(SIGMA，St· Louis，U.S.A·)，藉著酵素的降解作用打破細胞，並在30°C下培養該反應混合物90分鐘，然後進行至下一個萃取步驟。最後，獲得20微克的基因組 DNA。實例6 :藉著使用PAOX5 14作爲探針的南方墨點雜交作用進行南方墨點雜交作.用，選殖含有得自紅酶法菲亞酵母之AOX基因的基因組片段。藉著EcoRI消化2微克的基因組 DNA，並接受瓊脂糖凝膠電泳，接著是酸和鹼的處理。藉著使用 transblot (Joto Rika，Tokyo, Japan) —小時，將變性的 DNA移至尼龍膜（Hybond N+，Amersham，Buckinghamshire， U.K.)上。藉著熱處理（80°C，90分鐘）將移至尼龍膜上的 DNA固定。藉著以DIG多重裝填（multipriming)法（Βοθΐι- α- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 B7 五、發明說明（25 ) ringer Mannheim)標示模板 dNA( EcoRI-消化的 pA0X5 } 4)，來製備探針。利用製造者指定的方法進行雜交作用。結果，在從5.5至7.0千個鹼基（kb)的範圍内可看見雜交譜帶。重例7 :選殖含有AOX基因的基因組片段藉著EcoRI消化4微克的基因組dnA，並接受瓊脂糖凝膠電泳。然後根據製造者指定的方法，藉著qIAEx 11凝膠萃取套組（QIAGEN)回收其長度範圍在5 〇至7 〇肋的DNAs。在16°C下，將經過純化的DNA與0.5微克以EcoRI-消化，並以CIAP (牛腸鹼性磷酸酶處理之λ gtll (ci〇ntech)連接過夜’並藉著Gigapage III金包裝萃取（stratagene)包裝。將經過包裝的萃取物感染到大腸桿菌Y1 〇9〇品系中，並將 NZY培養基倒在LB瓊脂培養基上覆蓋之。藉著使用EcoRI-消化過的pAOX514作爲探針，篩選大約6000個斑點。一個斑點與經過標示的探針雜交。藉著使用WizardA製備DNA純化系統（promega)，製備含有得自紅酶法菲亞酵母之假定AOX基因的；I gtl 1衍生物。藉著EcoRI消化的結果，其顯示該几gti 1衍生物含有6 kb EcoRI***序列。接著·，藉著使用該几gtl 1衍生物作爲模板，並使用兩個引子aox3和aox5作爲引子，來進行pcr。在與實例4中描述相同的PCR條見下，PCR的結果，產生預測的0·3 kb之譜帶。這暗示該λ gtl 1衍生物可能含有得自紅酶法菲亞酵母的假定AOX基因。藉著使用QjAqUick (QIAHEN)純化在該λ gtll衍生物中的6.0 kb之***EcoRI片段，並接受繼代選殖到pOCUS-2載體（No-vagen)内，藉著 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -1 n ·ϋ ·ϋ l— n I 一 δτ I I I ϋ I I —Bi I » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 B7 五、發明說明（26) 使用DH5從作爲宿主品系，並產生p〇CUSAOX607。實例8 :含有AOX基因之基因組片段的定序將pOCUS AOX607轉移至合格的r β捐贈者細胞内，並用來製備定序衍生物，其可用於Locus Pocus系統（Novagen)。製備定序衍生物的方法，係依據製造者提供的草案。合成作爲定序引子的Cy5-標示之引子，其序列列舉於表4中，並藉著使用自動循環定序套組（Pharmacia)，用來進行定序。 ( 表4 用來定序AOX基因的引子序列 pocl; (Cy5-) AGCTACAACATACGAAAGGG (序列識別 5號） poc2; ( Cy5-) GGGGAACTGAGAGCTCTAAA (序列識別 6號）由於定序的結果，判定包括2561個鹼基對之基因組片段的核嘗酸序列含有得自紅酶法菲亞酵母的AOX基因。在1206個鹼基對中的密碼區，由10個表現序列和9個*** 序列所組成。***序列分散在整個密碼區中，並不偏愛5’ 或3’。藉著使用遺傳分析軟體，GENETYX-SV/RC (Software Development Co·，Ltd·，Tokyo，Japan)4.0.1 版，發現開放編閱架構由402個胺基酸（序列識別1號）組成，其序列顯著的類似得自其他物種之交替氧化酶的已知胺基酸序列（與得自黑麴菌之交替氧化酶有51.5°/◦的同一性）。在胺基終端之忌水性胺基酸殘基的伸展，預期它形成α -螺旋結構，代表該胺基終端區可能是膜連結功能部位，或粒線體的過渡肽。PSORTII 程式(http: //psort.nibb.ac.jp: 8800/) -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -1---r---訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 B7 五、發明說明（27) 以82.6%之預測値，預測該蛋白質可能是粒線體蛋白質。實例9 :選殖AOX基因的上游區 (請先閱讀背面之注意事項Η 藉著使用基因組步行者套組（Clontech)，進行AOX基因之5’-相鄰區的選殖，因爲似乎pA0X5 14可能不具有足以含有AOX基因之啓動基因的長度。首先，合成在表5中顯示其序列的PCR引子。表5 在選殖AOX基因之5’ -相鄰區時所使用的引子序列 aoxl3; GTGTCAGAAACCTCAGATCAACAGGC (主要引子） (序列識別7號） aoxl4; CAACAGGCAGTACAGTCAGCAGATTC (巢式引子） (序列識別8號）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製庫選殖之草案和PCR條件與製造者指定的那些相同。使用在實例5中獲得的基因組DNA製品作爲PCR模板。回收在 5f _末端具有Seal位置（1.2 kb)，並在5’ -末端具有Dral位置 (3.0 kb)的PCR片段，並藉著使用大腸桿菌TOP 10作爲宿主品系，選殖到PCR2.1-TOPO内。由於定序得自兩種構築體之每2個獨立純種系的#果，證實選殖AOX基因的5,-相鄰區。將在上述的實驗中，藉著Seal構築體而獲得的純種系命名爲pAOXSc702，並用在進一步的研究中。以在 pAOXAc702中之***片段的序歹ij基礎，合成在表6中列舉其序列的4個PCR引子。表6 在選殖AOX啓動基因區時所使用的引子序列 -30-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格7210 X 297公爱T 1248466 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（28) aoxl5; GAATTCAACAGGTCAAATGA (有意義引子）（序列識別9號） aoxl6; ATCCACCCACGCCTGTTTCC (反義引子）（序歹J 識另 10號） aoxl7; GGAAACAGGCGTGGGTGGAT (有意義引子）（序列識別11號） aoxl8; GAATTCAGTAAACGCATTAG (反義引子）（序列識別12號） PCR條件與在實例4中所示的相同，除了使用HF聚合酶 (Clontech)作爲DNA聚合酶以外。以aox 15和aox 16之組合，擴大具有0.7 kb之長度的片段。以aox 17和aox 18之組合，擴大具有〇·5 kb之長度的片段。將這些片段選殖到 PCR2.1-TOPO内，並轉化大腸桿菌TOP10。分別從6個獨立的白色菌落製備質體，並使其接受定序。結果，獲得預期的純種系，其***片段的序列是彼此相同的。將以aox 15 和aox 16之組合獲得的純種系命名爲pAOX714# 1516。將以 aox 17和aox 18之組合獲得的純種系命名爲pAOX714 # 1718。由於定序的結果，判定pAOX714 # 1516*pAOX714 # 1718之序列，含有得自紅酶法菲亞酵母之AOX基因的啓動基因區。經過判定含有AOX啓動基因之序列的長度爲 1406個驗基對。混合在實例8和9中獲得的序列，判定該核：y：酸序列（3.7 kb)含有AOX基因及其啓動基因和終止轉錄之序列（序列識別2號）。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

K ^7 . -ϋ· ·ϋ ·ϋ 1 Lr n mmmmmm ^ ^ I I a^i Mmmt ^^1 aHU I A7 1248466 B7 _ 五、發明說明（29 ) 實例10 :建構AOX基因的反義質體藉著PCR方法擴大涵蓋AOX基因之整個結構基因的反義基因片段，然後選殖到整合載體内，其中藉著在紅酶法菲亞酵母中的AST啓動基因轉錄反義AOX基因。表7 ^ 在反義建構AOX基因時所使用的引子序列 aoxlOl; GGCCATTATGGCCTCAATTGGTCTGAGACATGC (序列識別13號） aoxl02; GGCCGAGGCGGCCATGTCTCTTGCTAGATGTCT (序列識別14號）兩個引子，aoxlOl和102對限制酵素Sfil (GGCCNNNNNGGCC) 具有不對稱的認知序列，但設計其不對稱的殘留序列將是不同的。這可能得以定向選殖至在其連接序列處具有相同不對稱之序列的表現載體内。藉著使用HF聚合酶（Clontech)作爲Taq聚合酶，並使用在實例3中製備的cDNA作爲模板，在如下的條件下進行 PCR: 94°C 15 秒，55°C 30秒，和 72°C 45 秒，30次循環。純化經過擴大的PCR片段，並選殖到pCR2.1-TOPO載體内。由於定序的結果，顯示一個純種系具有正確的片段，並將該純種系稱爲pAOX 1007 #0102。在序列識別15號中列舉AOX基因之反義片段的序歹J。至於駕馭反義AOX基因轉綠的啓動基因和終止轉錄序列的片段，可從在實例5中製備之染色體中選殖AST啓動基因和終止轉綠之序列。 ___-32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 ----- 寫本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 B7 五、發明說明（30 ) 表8 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 選殖AST啓動基因和終止轉錄序列時所使用的引子序列 ast49; GCGGCCGCACGTACAGACTAAGATCGAC (有意義引子）（序列識別16號） ast50; GGCCATAATGGCCATGGAGAAAGTAGGTGGCAA (反義引子）（序列識別17號） ast36; CTGCAGGCCGCCTCGGCCGTTGATTCTTCATATGTTAA (有意義引子）（序列識別18號） ast37; GGTACCCTGCAGTCGACAAACATGAA (反義引子） (序列識別19號） PCR條件如下；94°C 15秒，55°C 30秒和72°C 90秒，25次循環。以ast49和ast50之組合，擴大具有1.25 kb之長度的片段。ast36和ast37之組合，擴大具有0.3 kb之長度的片段。將這些片段選殖到PCR2.1-TOPO内，並轉化大腸桿菌 TOP10。分別從6個獨立的白色菌落製備質體，並使其接受定序。結果，選出具有正確AST啓動基因和終止轉錄序列 (歐洲專利1 035 206 A1號）之序列的純種系，以供進一步的研究（對於AST啓動棊因而言爲pUAST407，對AST終止轉錄之序列而言爲pAST526 #3637)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製接下來，藉著使Notl-加ΚρηΙ-消化之pAST526 #3637和 ΚρηΙ-加 SacI-消化之pG418Sa330 (歐洲專利 1 035 206 Α1 號）與 Notl-和 SacI-消化之 pBluescriptl I SK- ( Stratagene)連接，將AST終止轉綠的序列與G41 8抗藥性卡g融合。將該連接混合物轉化至合格的KB822細胞内。由於限制分析的結 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公董) 1248466 A7 B7

五、發明說明（31 ) 果’選出一個具有正確結構的純種系（pUAST418)，以件進一步的研究。然後將含有核糖體DNA ( rDNA)位點（Wery等人，Gene 184, 89- 97, 1997)的 3.1 kb之 SacI片段***pUAST418之 G418 卡匣的下游。rDNA片段以多重副本出現在眞核生物的染色體上。經由rDNA片段的整合事件，導致在所使用之宿主的染色體上整合多重副本，並得以過度表現藏匿在表現載體中的外來基因。爲了此一目的，將得自含有rDNA& 因之pGBPh9的SacI片段’與以SacI-消化並以細菌驗性鱗酸酶-處理的pUAST418連接。將連接混合物轉化至合格的 KB822細胞中。由於限制分析的結果，選出兩個純種系，其中以彼此不同的方位將rDNA片段***，以供進一步的研究（PURDNA421 和 pURDNAR421)。接著，將AST啓動基因***AST終止轉綠之序列的上游，以便建構在紅酶法菲亞酵母中具有功能的表現載體。將卩11人8丁4〇7的1.〇1<:1)之^^〇1:1-和6§111-片段，和01入8丁4〇7的 0·25 kb之 Bglll-和 PstI-片段，與以 Notl-和 Sse8387I-消化的 pURDNA421或pURDN/^R421連接。藉著以連接混合物轉化合格的KB822細胞，並使6個所得的菌落分別接受限制分析。選出具有正確***A S T啓動基因的純種系，以供進^ 步的研究（pF 718和pR718具有彼此相反之方位的rDNA片段）。最後，藉著將pAOX1007#0102的1.2 kb之Sfil片段***以 Sfil-消化的pF718或pR718内，完成反義Α〇χ構築體。將所 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項3寫本頁) 訂---------j 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248466 A7 _ B7__ 五、發明說明（32 ) 得的質體命名爲PFAOX828和pRAOX828。 (請先閱讀背面之注意事項ί寫本頁) 實例11 :以AOX-反義載體轉化紅酶法菲亞酵母將AOX-反義載體，pFAOX828和pRAOX828轉化至紅酶法菲亞酵母野外型品系，ATCC96594内。根據在Methods in Molecular Biology( Johnson 等人，53; 147- 153，1996)中描述的方法，進行生物列舉（Biolistic)轉化作用。在YPD培養基中培養紅酶法菲亞酵母品系ATCC96594至穩定相。在離心肉湯之後，利用蒸餾水份，將細胞濃縮10倍，並將200微升細胞懸浮液散播在含有100微克/毫升選擇試劑和0.75M D-甘露糖醇和D_山梨糖醇的YPD培養基上。將5微克質體塗覆在1.5毫克的0.9微米金顆粒上，並用來作爲生物列舉轉化作用的捐贈者DNAs。選出一個以pFAOX828轉化，並顯示出增加染色的選擇試劑耐受性菌落，就其蝦青素生產力及其降低由AOX基因編碼之交替氧化酶活性的觀點，進一步定出特徵。實例12 :定出衍生自紅酶法菲亞酵母，ATCC96594之 PFAOX828整合體的特徵經濟部智慧財產局員工消費合作社印製藉著使用其在試管（車徑21毫米）中，在10毫升YPD培養基中生長3天的種子培養物，將紅酶法菲亞酵母轉化物， ATCC96594二 pFAOX828，連同其親代品系 ATCC96594 — 起，在20°C下，在500毫升錐形燒瓶中，培養在50毫升YPD 培養基中3天。在不同的時間點，例如在接種之後24、43 和65小時時，取回適當體積的培養肉湯，並用來分析其生長、蝦青素之生產力，以及在KCN的存在或缺乏之下，其 -35- i紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐了 1248466 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（33 ) 氧攝取的活性。該24、43和65小時-時間點，分別相當於其生長的晚對數-相、中·穩定相和晚期穩定相。關於生長的分析，藉著使用UV- 1200光度計（Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)測量在660毫微米處的光密度，此外，藉著在100°C下，弄乾在微量離心之後衍生自1毫升肉湯的細胞一天，判定其乾細胞質量。關於蝦青素和總類胡蘿蔔素之内含量的分析，在微量離心之後，從1.0毫升肉湯中收獲細胞，並用來進行藉著以玻璃小珠打破，從紅酶法菲亞酵母的細胞中萃取類胡蘿蔔素的作用。在萃取之後，藉著離心移除打破的細胞，並利用 HPLC對殘餘物進行類胡蘿蔔素内含量的分析。所使用的 HPLC條件如下： HPLC 管柱；Chrompack Lichrosorb si-60 (4·6 毫米，250 毫米）溫度：室溫洗脱液：乙腈/己烷（1 8/ 82)在洗脱液中加入1毫升/公升的水注射體積；10微升流速；2.0毫升/分鐘 .

檢測；以450毫微米之UV 從 F. Hoffmann-La Roche AG(Basel，Switzerland)獲得蝦青素的參考試樣。爲了在KCN的存在或缺乏之下，藉著測量氧攝取活性來判定呼吸活性，使用由 Iijima Electronics Corporation ( Aichi， Japan)製造的DO計量器B- 505型和DO探針GU-BM。以0.5 — -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） • is n ·ϋ I .^1 I Ί— I «1 I ϋ (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· 線· 1248466 A7 B7 五、發明說明（34 ) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) Μ KPB (pH 7.4)使收獲的細胞再懸浮。然後，在DO分析的小室中，以2.3毫升的水稀釋200微升該細胞懸浮液。藉著在0.48 mM KCN的存在或缺乏之下，加入0.2毫升1 Μ葡萄糖開始測量。在表9中概述其結果。表9 品系 ATCC96594:: pFAOX828 ATCC96594 時間（小時） 24 43 65 24 43 65 在660毫微米處之OD 22.75 28.26 27.91 28.75 31.707 31.10 乾細胞(毫克/毫升） 10.8 12.7 12.3 11.6 12.1 11.6 蝦青素(毫克/克-乾細胞） 0.090 0.223 0.240 0.107 0.194 0.211 類胡蘿蔔素(毫克/克-乾細胞） 0.218 0.336 0.354 0.213 0.269 0.288 呼吸 -KCN敏感性 11.29 5.84 4.02 16.03 6.13 4.96 -KCN耐受性 0.29 0 0 1.48 0.78 0.15 (以毫微莫耳〇2-攝取/‘分鐘X毫克-乾細胞，表示呼吸的活性）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如同在表9中所示，反義ΑΟΧ轉化物ATCC96594'· PFAOX828，在培養43小時時，顯示出類似親代品系 ATCC96594的細胞產量，雖然其在24小時處顯示較慢的生長。轉化物的蝦青素和類胡蘿蔔素内含量增加了 15%。從其呼吸活性的觀點來看，轉化物對其宿主品系具有類似的 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7

1248466 五、發明說明（35 ) fCN-敏感性呼吸活性（95%)，但在24小時時，降低由交替，化酶調節之KCN-耐受性呼吸，至其宿主品系的2〇%含量，並在培養的43小時時完全損害。從該結果中，指出降低調節KCN-耐受性呼吸的交替氧化酶活性，可能導致在紅酶法菲亞酵母中過度產生蝦青素和類胡蘿蔔素。 μ (請先閱讀背面之注意事項ί寫本頁) 寫太訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -38-

1本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公tT 1248466 A7B7 五、發明說明（36 ) 序列-覽表 <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG<12〇>類胡蘿葡素之生物產製的改良及其生物物質 <130> Case 20685 <140> -<141> - <150> 00111148.3 <151> 2000-05-24 <160> 12 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211〉 401 ' <212>蛋白質 <213>紅酶法菲亞碚母 <400> 1 Met Ser Leu Ala Arg Cys Leu Val Gin Ala Ser Thr Arg Ser Leu 1 5 10 15

Ser Arg Thr Val Arg Pro Ser Tyr Leu Thr Pro Leu Thr Val His 20 25 30

Phe Phe Ser Ser Thr lie Ser Arg 35 r e s r - y T r e s g r A r e , s s y o c 4 r e 5 s 4

Thr Ser Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Asn Gly Gin Gin Ser Thr 50 55 60

His His Leu Ala

Asp 65

Asn * Va1 Pro Leu

Thr 7 0

Thr Asp Lys Gin

Arg 7 5

His Leu Gin Gly Val lie Gly Gly Glu Gly Met His Gin His Asp 80 " 85 90

Ala Thr Thr Val (請先閱讀背面之注意事項裝--- 寫本頁) 訂·

A 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Ala 95

His Thr Asp Pro

Leu 100

Ala Ser Val lie

Gin 105

Asp Leu The Val

Pro 110

Thr Asn Gly Ser

Trp 115

Val Met His Asn

Pro 120

Val Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Asp Ala Val Gin Val Val His Arg 125 130 135

Pro Pro Thr Asn Thr Ser Asp Gin Val Ser Thr Lys Leu Val Lys 140 145 150

Met Leu Arg Trp Gly Phe Asp Leu Val Ser As n Tyr Lys His Val 155 160 165

Pro Phe Pro Ala Asn His L.ys Glu Leu Ser Val Thr Gin Leu Arg 170 175 180 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1248466 A7B7 五、發明說明（37) Gin Met Gly Cys Leu Leu Ser Pro Asp Gin Trp Met Thr Arg Phe 185 190 195 lie Phe Leu Glu Thr Thr Ala Ala lie Pro Gly Met Val Gly Gly 200 205 210 Leu Leu Arg His Leu Gin Ser Leu Arg Leu Met Arg Arg Asp Gly 215 · 220 225 Gly Trp lie His Thr Leu Leu Ala Glu Ala Glu Asn Glu Arg Leu 230 235 240 His Leu Leu Thr Phe Met Ser Met Ala Asn Pro Pro Leu Trp Phe 245 250 255 Arg Ala Leu lie Leu Gly Ala Gin Gly Val Phe Tyr Asn Leu Phe 260 265 270 Phe lie Thr Tyr Leu lie Ser Pro Pro Val Ala His Arg Phe Val 275 280 285 Ala Cys Leu Glu Glu Glu Ala Val Val Thr Tyr Thr Arg lie lie 290 295 300 Ser Asp lie Glu Asn Gly Tyr Val Pro Glu Trp Glu Lys Leu Pro 305 310 315 Ala Pro Glu lie Ala lie Ser Tyr Trp Arg Leu Pro Pro Asp Ala 320 325 330 Thr Phe Leu Asp Thr Leu Arg Ala lie Arg Ala Asp Glu Ala Thr 335 340 345 His Arg Phe Val Asn His Thr Phe Ala Ser Leu Asp Ser Ly.s Lys 350 - 355 - 360 Asp Phe Asn Pro Phe Ala lie Ala Glu Pro Asp Ala Thr Thr Lys 365 370、 375 Gly Ser Val Tyr Gly Phe* Thr Arg Asp Glu Ala Ala Ala Phe Ala 380 385 390 Gin Lys Thr Arg Glu Arg Met Ser Gin Thr Asn 395 400 (請先閱讀背面之注意事項

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 2 <211> 37 2 4, <212> DNA<213>紅酶法菲亞酵母 <220><221>表現序列 <222> (1 4 07) . . (1 67 4) <220><221>***序列 <222> (1 67 5) . . (17 69) <220><221>表現序列 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1248466 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（38) <222〉（1 7 7 0) .. (1 8 7 3) <220><221>***序列 <222〉（ 1 8 7 4)··( 1 94 8) <220> | ^ ， < 2 2 1 >表現序列 <222〉（1 94 9) ·· (215 5) <220> <221>***序列 <222> (2 1 5 6) . . (22 64) <220> < 2 2 1 >表現序列 <222〉（2265) ·, ( 22 95) <220><22 1>***序列 <222〉（22 96) ·· ( 2372 ) <220> <221>表現序列 <222〉（2373) ·· (24 23) <220> <221>***序列 <222〉（2424) ·. (2515) <220><221〉表現序列 <222> (2516)..(2645) <220> <221>***岸列 <222〉（2 64 6) .. (2735) <220>< 2 2 1 >表現序列 <222〉（27 3 6) .· (28 31) <220> <221〉***序列 ‘ <222〉（2832) ·. (2914). <220><221>表現序歹ij <222> (2 915) . . (2 998) <220> < 2 2 1 >***序列 <222〉（2 999) .. (308 5) <220> <221>表現序列 <222〉（308 6) ·· (3206) <220> <221>***序列 <222〉（3207) .. (3320) -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

訂·· 1248466 A7 B7 五、發明說明（39) <220> ^ t < 2 2 1 >表現序列 <222> (3321)..(3434) <220>

<221> 51UTR <222> (12 95) . . (12 96) <223> (EXPERIMENTAL) <220> _ _ <221>聚八_位置 <222> ( 3 682) . . ( 3 68 3) <223> (EXPERIMENTAL) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 2 gaattcaaca ggtcaaatga gaaaggacaa ggt gaagaga t ggaaccaga 50 agcaatcage gagagt aaag aegat ggtt c taaacataca 11 gggeaega 100 ctcccttgat ccgaggcagg t at acgacca gatacaaaaa caagctgacg 150 gt ca eggeeg aaaataggaa ggagagttgc aaeget egge taaagaaggt 200 gga 11 caa t c acaacacacg gt caaggcaa gcatgacata ttgagettt t 250 gettgagtat ctcgcgatca aagtgatgat ggatgettet aaggat cgt c 300 tttatctttc cgccaggaga tgtgcaataa caagagagga agagaaacgt 350 aaaggagtgt act cacatgc ccaaaccacc ggcgt t ggat t egagaagag 400 ctcttcttag getgtctccg acgccccaat ggcggacgcc caat agt cca 450 aacacgatgt acttgccatt ccgaagaagg ttaggaaggt atgggctcga- 500 agetgetgat tgaccagaca taggacaaga acaaataaag agacaagaaa 550 cgacaacgac egageagata tctgactaga gaaaaccgtg gegaegttgc 600 aatgtttggg cccgaaaaaa gatgagttgc tttgttttcg agtcgtcctg 650 t agccccagc t ggggact ag ccgctgt cac gaggaaacag gcgtgggtgg 700 atgetccacc a ca t gga t gg ttacacacgc cacactgeeg cacgctgege 750 agatataacc cgttcaacac ccgacaacga actggt tgac ct t ccgaggt 800 gaccatcaag ct tggatgtt cagctgcgat attcagctac gatgatatgt 850 at gccgaaca caagtagt aa aatggctcag aaagacacag aagaaacggc 900 gttcat tact ccgaaagacg agacatcccc gcatgaatct ctggacgata 950 aagccaagcg gaeggaegga agcccattgg egat ggt egg ttactaaccc 1000 t getgget tc actgettgge ctgacttgac tgtctcttcc teaettgetg 1050 tettgactcg gt egaegga t aactcgccaa acccat caac aeggeagt cc 1100 gt 11 aga 111 ccgttcccac ctcttctteg agtttccgtt catgctctac 1150 taatgcgt 11 actgaattca acacaatgtc taattgaatc tgctgactgt 1200 -42- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1248466 A7 B7 五、發明說明（40 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 actgcctgtt gatctgaggt ttctgacact aacatgactt atcatttggc 1250 tgacttataa a tagttcgag accaacagct cttaattctg atcctgccta 1300 catacatatc tactctttgc tcgaccattg catcaaacca ttgcacgctt 1350 ctctccatac tggctatatc acaatacctg ccatatacat tgcccaacta 1400 ccaaca a t g t c t ctt get aga t gt ctt gtc cag gca tea act 1442 egg tea ctt teg cgt acc g11 egg cca bee tat etc aca cct 1484 eta aca gtt cac ttc ttc tee tea aca ate tea agg age tgc 1526 tee agg tea tat tea aeg teg aac acc ege ctt tea aca tet 1568 aat gg t caa ca a tea aeg cat cat ctt geg g a c aat g 11 cct 1610 etc acc acc ga c a a a caa agg cac ctt caa ggc gtc ate ggc 1652 ggt gag ggc atg cat cag cat g gtccgttctt ctgtcctct’a 16 9 4 tcatattegt atcaaaatat gga11agt.tc ttattcacaa ttctttatct 17 4 4 catcaaacat gettactgte catag at gca aeg aeg gta get cat 1789 aeg gat ccc 11 a get tee gtc at a caa gat ttg act gt t ccc 18 31 act aac gga tet tgg gtg atg cat aat ccc gtc tat act ega 1873 gtacgtctct gaaegetteg cttcaattat tcctgcgcta getacagctc 1923 accggtcctt ctccctttet gacag act gag tta gat get gtt cag 1969 gtc gtt cat cgt ccc ccc acc aac aeg tee gac caa gtc tee 2011 acc aag ctt gtc aag atg etc ega tgg gga ttc gac ctt gtc 2053 age aac tac aaa cat gtt.ccc ttt ccc gca aac cac aaa gaa 2095 etc age gtc act caa ttg ege caa atg ggc tgt ctt etc teg 2137 cct gat caa tgg atg aeg .gttagtatta cttactcttg tegteagtat 2185 tcatggcaac atattgetea tetagtcaag tgcacacgtc catttcgtct 2 2 3 5 aatttgttac tttttctgaa aattcacag agg ttc ate ttt eta gaa 2282 aca aca get get a gttcgtteat ccaccaacac aaccattett 2325 gataataccc act11ttett egatact gat atttatactc aacctag 11 2 3 7 4 cct gga atg gtt ggc ggt etc ttg ege cat ctt cag tet etc 2416 ega etc a gttcgtttca ttetttettc tegattgatc ategttttgg 2463 catcatctgt tgataageat agtccttacg cattcgatct tgattcgttc 2513 ag tg ega egg gat ggt ggt tgg a t; t cac aeg ctt ctt get 2 5 5 3 gaa get gaa aac gaa cgt etc cac ctt ctg aeg ttc atg age 2604 -43- 請先閱讀背面之注項 I裝頁訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1248466 A7B7 五、發明說明（41 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 atg get aat cca cct etc tgg ttc ega get ttg ata ctg gga 2 6 3 7 get caa gg gtcagccttt tttatcatta ttaatattaa tttctctctc 2685 tagaegatea cggaccatgt getgagaggg tettcatata tgctttgcag 2735 g g11 ttt tat a a c ctg .ttc ttc a t a act tat 11 a a 11 tee 277 5 ccg ccg gtg get cat ega ttc g11 gee tgc ctg gag gaa gaa 2817 get gtc g11 act t a gtaagatega tcgttgcaat catget egag 28 61 tagtetttta gtttgttaat cattcgattg gga11ggt11 cgtatttcat 2 911 cag c a ca aga a 11 ate agt gat ate gag aac ggc tat gt a 2 951 cct gaa tgg gaa aag ct t ccc get ccc gag att get at a tet 2 993 tac tg gt ctget tga cttcagtcgc acagttteat ttgtcttgac 3 0 3 8 atgtaaattg ttactgacaa tatgetcaca aatatcacct teatcag g 3086 ega,. c 11 cct ccc gat get acc ttt ttg ga c a ca ctg ega gee 3128 ate ega gca gat gag gee act cat ega ttc gtg aat cac aca 3170 ttt gee age ctg gac tet aag aaa gac ttc aat cca 3206 gttegtatag accttccaaa ccctaactgc gegtcctega ctgaaactta 3 2 5 6 tagattgat c aaatctcaaa ccttcattcg cctgtcattc atetctgttt 3 3 0 6 cgaaatcaca taag ttt geg ata gee gag cca gac gee act act 3350 aaa ggc teg gta tat ggt ttc aca egg gac gag gee gee gee 3392 ttc get cag aag aeg aga gaa ege atg tet cag acc aat tga 3434 tattcatccc taattgtcct atactctttc tettetteat gtttgattct 3484 ct gt act a 11 11 ct ggcggt ttgtatagtt ttatgggtca agttcggttt 3 5 3 4 tcttttttgg ttgttcttct ctttcccata ttgaataaaa teegtetatg 3584 ttttccttga tettgatteg gatega11gt cactcctcac tcctctctcc 3 6 3 4 tcattcatct actctacctc agtettatat gggttatgtc gcttccttct 3684 caaatgacat acgcaaactc agtatttgag aacattgtga 3724 <210> 3 <211> 2 6 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：簡併PCR引子（有意義引子） <4 00> 3 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背面之注意事項寫本頁 I訂 1248466 A7 B7 五、發明說明（42 ) aaygarmgna tgcayytnyt nacntt 26 <2 10> 4 <211> 26 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明簡併PCR引子（反義引子） <400> 4 gcytcytcyt cnarrtancc nacraa 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明定序引子（5’核省:酸以c y5-標示） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 5 agctacaaca tacgaaaggg 20 <210> 6 . <211> 20 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明定序引子（5*核棼酸以Cy5-標示） <400> β ggggaactga gagctctaaa 20 ϋ 1.— 1 n n e§9 ·ϋ 11 1_1 I i·— ϋ I 0 <210> Ί <211> 26 <212> DNA <213>人造的序列經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <22 3> 人造t序列的説明：基因組步行PCR引子（主要引子） <400> 7 gt gt cagaaa cct cagat ca a caggc <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：基因組步行PCR引子（巢式^子） -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 26 1248466 A7 B7 五、發明說明（43 ) <40〇> 8 caacaggcag tacagtcagc a g a 11 c <210> 9 <2 1 1> 20 <212> DNA <213>人造的序列 <220> < 2 6 223> 明：PCR引子，用來選殖啓動基因區 <400> 9 gaattcaaca ggtcaaatga <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的説明： (反義引子） <400> 1〇 atccacccac gcctgtttcc PCR引子，用來選殖啓動基因區 20 -------·——！#裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA < 2 1 3 >人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：PCR引子，用來選殖啓動基因區 (有意義引子） -、 α <400> 11 ggaaacaggc gtgggtggat 20 I _ϋ n >l· l l > MB 裡一經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <2 10> 12 <211> 20 <2 12> DNA < 2 1 3 >人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：PCR引子，用來選殖啓動基因區 (反義引子） ° <4 00> 12 gaa 11 cagt a aacgcattag <210> 13 <211> 33 <212> DNA < 2 1 3 >人造的序列 -46 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 20 1248466 A7 B7 五、發明說明（44 ) <220> <223> (VI序義 1丨:PCR引子，用來建構反義AOX基因 <400> 13 ggccattatg gcctcaa11g gt ctgagaca t gc 33

<210> 14 <211> 33 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> &造義序引％説明：PCR引子’用來建構反義Α〇χ基因 <400> 14 ggccgaggcg gccatgtctc ttgctagatg tct 33 <210> 15 <211> 1232 <212> DNA<213>紅酶法菲亞酵經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 15 ggccattatg gcct caat tg gtetgagaca tgcgttctct cgtcttctga 50 gcgaaggcgg cggcctcgtc ccgtgtgaaa ccatataccg agee111 agt 100 agt ggcgt ct ggctcggcta t cgcaaat gg attgaagtct ttettagagt 150 ccaggct ggc aaatgtgtga tteaegaatc gatgagtggc ctcatctgct 〆 200 cggatggctc gcagtgtgtc caaaaaggt a gcategggag gaagt cgcca 250 gtaagatata gcaatctegg gagegggaag cttttcccat tcaggt acat 300 agccgttctc gatatcactg ataattcttg tgtaagtaac gacagcttct 350 tcctccaggc aggcaacgaa tegatgagee accggcgggg aaattaaata 4 00 agttatgaag aacaggttat aaaaaacccc ttgagctccc agtatcaaag 4 50 ctcggaacca gagagg t gga ttagccatgc tcatgaacgt cagaaggt gg 500 agacg11 cgt tttcagcttc agcaagaagc gtgtgaatee aaccaccatc 550 ccgtcgcatg agteggagag actgaagatg gcgcaagaga ccgccaacca 600 ttccaggaat ageagetgt t gtttctagaa agatgaacct cgtcatccat 650 t ga t caggcg agagaagaca gcccatt tgg cgcaattgag tgaegetgag 700 ttctttgtgg 111 gcgggaa agggaaca tg tttgtagttg ctgacaaggt 7 50 cgaatcccca teggageate ttgacaagct tggtggagac t tggt egga c 8 00 gtgttggtgg ggggacga tg aacgacctga acagcatcta actcagttcg 8 50 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公t )

1248466 A7 B7 五、發明說明（45 ) agtat agacg aatcttgtat tcatgctgat 111gt cggtg gaccattaga cagct cc11 g ataggatggc gacat ct age ggattatgea gaeggaaget gcatgccctc gtgagaggaa tgt tgaaagg agattgttga egaaeggtac aagagacatg tcacccaaga teegttagtg ggaacagt ca 900 aagggatccg tatgagctac cgtcgttgca 950 accgccgatg acgcct tgaa ggt gee 111 g 1000 cattgtccgc aagatgatgc gt t ga 11 g11 1050 cgggt gt t eg aegttgaata tgacctggag 1100 ggagaagaag tga.actgtta gaggtgtgag 1150 gcgaaagtga ccgagttgat gcctggacaa 1200 gccgcct egg cc 1232 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213>人造的序列 <220> ’、<223>人造序列的説明：PCR引子，用來選殖AST啓動基因 (有意義引子） - <400> 16 gcggccgcac gtacagacta agategae 28 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

<210> 17 <211> 33 <212> DNA<213>人造的序列 _ <220>人造序列的説明：PCR引子，用來選殖AST啓動基因 (反義引子）、 <4 00> 17 ggccataatg gccatggaga aagt aggtgg caa 33

*. -ϋ .^1 n -1 n n ^ > > n ϋ ϋ ·ϋ n I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213>人造的序列 <220> '<223>人造序列的説明：PCR引子，用來選殖AST終止轉綠之序列 (有意義引子） <400> 18 cctgcaggggcc gcctcggccg ttgattette atatgttaa <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 39 1248466 A7 B7 五、發明說明（46) <223> 説明^ pcR引子，用來選殖AST終止轉錄之序列 <4 00> 19 ggtaccctgc agtcgacaaa catgaa 2 6 ____k (請先閱讀背面之注意事項再求寫本頁)

tr-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

Α8 Β8 C8 D8 1248働丨胸5號專利申請案中文申清專利車色圍替換本^94年8月）申請專利範圍 1· 一種產製具增進類胡蘿蔔素生產力之微生物的方法，其包括： ⑷選擇可產生類胡蘿蔔素之親代微生物，且其包含編碼具有父替氧化酶（ΑΟΧ)活性之多肽之聚核茌酸序列，其中該聚核％•酉夂序列係選自由SEQ ID N〇:2、SEQ ID Ν〇 2之片段及與SEQ ID Ν0··2之互補物在下述條件下進行雜交之聚核苷酸所組成之群組：雜交條件 6Χ SSC 0.5% SDS 1 〇〇微克/亳升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺在42°C下培養過夜；以2X SSC，0.5% SDS在室溫下沖洗一次15分鐘，接著以0.1X SSC ’ 0.5% SDS在室溫下沖洗另一次 15分鐘； (b) 在親代微生物中改變該聚核答酸序列以形成一突變微生物’該突變具有相較於親代微生物降低之Αοχ酵素活性；及 (c) 選擇突變微生物，其中該突變微生物相較於親代微生物可產生至少多10〇/〇的類胡蘿蔔素。 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該改變步驟包括選自於該微生物導入產生對微生物中該聚核荅酸互補之反義股的質體及指定-位置突變生成作用之技術。 70747-940803.doc 本紙張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(21〇χ 297公釐） 1248466 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該親代微生物係原生生物或真菌。 4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中該親代微生物係選自由賽内奇球菌屬（Synechococcus)、賽内奇囊球菌屬 (Synechocystis)、血液球菌屬（Haematococcus)、多納利菌屬（Dunaliella)、法菲亞酵母菌屬（Phaffia)、葉黃素黴屬（Xanthophyllomyces)、鏈孢黴屬（Neurospora)、紅酵母屬（Rhodorula)、布拉黴屬（Blakeslea)及藻狀菌屬 (Phycomyces)所組成之一員。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該親代微生物係紅酶法菲亞酵母（Phaffia rhodozyma)之品系。 6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該親代微生物係選自由DSM 13429、13430和13431品系所組成之群組。 7 _ —種具增進颠胡蘿蔔素生產力之突變微生物，其係得自一親代類胡蘿8素生產力之微生物，其中該親代微生物包含編碼具有交替氧化酶(AOX)活性之多肽之聚核:y：酸序列，其中該聚核誓酸序列係選自由SEQ ID ΝΟ:2、ID NO:2之片段及與SEQ ID NO:2之互補物在下述條件下進行雜父之聚核芬酸所組成之群組. 雜交條件 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%曱醯胺 -2- 70747-940803.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1248466 as Β8 C8 D8 六、申請專利範圍在42°C下培養過夜；以2X SSC，0.5% SDS在室溫下沖洗一次15分鐘，接著以 0.1X SSC，0.5% SDS在室溫下沖洗另一次15分鐘；其中突變體之AOX酵素活性相較於親代微生物係降低的，且該突變體可產製相較於親代微生物至少多10%的類胡蘿蔔素。 70747-940803.doc - 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)