CN1340628A - 生物生产类胡萝卜素的改良方法及其所用的生物材料 - Google Patents

生物生产类胡萝卜素的改良方法及其所用的生物材料 Download PDF

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Abstract

生产类胡萝卜素的方法,所述方法包括在诱导选择性(alternative)氧化酶活性降低的条件下对可生产类胡萝卜素的亲代生物体进行处理,对得到的生物体进行培养,并选择类胡萝卜素生产能力增加的生物体。

Description

生物生产类胡萝卜素的改良方法及其所用的生物材料
本发明涉及制备类胡萝卜素的分子生物学和用于制备类胡萝卜素的生物材料。
已知虾青素分布于多种生物体中，例如动物(如火烈鸟和朱缳等鸟类和如虹鳟鱼和鲑鱼等鱼类)，藻类和微生物。据认为虾青素具有较强的针对活性氧类的抗氧化特性，这一特性有望应用于药物以保护活细胞使其免受一些疾病(如癌症)的侵害。另外，从工业应用的角度出发，将虾青素用作着色剂的需求日渐增加，在养鱼(如鲑鱼)业中尤其如此，因为虾青素使动物变成与众不同的桔红色，在市场上更能引起消费者的注意。
已知Phaffia rhodozyma是一种可产生胡萝卜素的酵母菌株，它可以特异性地产生虾青素。与其它产胡萝卜素的酵母，即红酵母属不同的是，Phaffiarhodozyma (P.rhodozyma)可以发酵一些糖类，如D-葡萄糖。从工业应用的角度出发，这是一个重要的特征。最近的分类学研究发现Phaffia rhodozyma具有有性繁殖并且其有性形态(telemorphic state)被命名为Xanthophyllomycesdendrorhous(W.I.Golubev；酵母11，101-110，1995)。已进行了一些菌株改良研究，旨在从P.rhodozyma中获得虾青素超级生产菌株，但近十年来此类研究仅局限于利用常规的诱变法和原生质体融合。最近，Wery等人使用P.rhodozyma开发了一种宿主载体***，其中多拷贝的非-复制型质粒被整合至P.rhodozyma基因组中的核糖体DNA基因座上(Wery等，基因，184，89-97，1997)。据Verdoes等报道，他们进一步改良了载体，得到P.rhodozyma转化子及其3个产胡萝卜素基因，所述基因编码催化香叶基香叶基焦磷酸转变为β-胡萝卜素之反应的酶(国际专利申请WO97/23633)。在不远的将来，基因工程方法对P.rhodozyma菌株改良研究的重要性将会增加，从而突破通过常规方法达到的生产能力。
很多研究人员推测虾青素在P.rhodozyma中可能作为抗氧化剂起作用，因为它是在生长的呼吸期而不是发酵期经刺激而产生的。通常，活性氧类趋于在呼吸期内产生，这是由泛醌库的还原速度和呼吸链下游电子转移之间的电子转移失衡所导致的呼吸链电子溢流引起的。在此推测中，虾青素可能会与活生物体中超氧化物歧化酶所作的那样，淬灭这些活性氧类。
据Schroeder等报道，当刺激产生虾青素时，处于生长后期的Phaffiarhodozyma呼吸链由KCN-敏感型呼吸转变为KCN-抗性呼吸(生物化学杂志，270，18374-18379，1995)。KCN-敏感型呼吸链是常见的电子转移链，其中泛醌库内的电子经由分布于多种生物体中的复合物III转移至复合物IV上。已知此呼吸链受KCN或抗霉素A的抑制。另一方面，KCN-抗性呼吸链分布于植物和真菌中。在此呼吸链中，被称为选择性(alternative)氧化酶(AOX)的线粒体膜蛋白在通过使用氧分子作为受体，将泛醌库内的电子转移至H2O分子的过程中起着主要作用。已知正丙基没食子酸(n-PG)或水杨基羟肟酸(SHAM)可抑制AOX活性。
在鉴定Phaffia rhodozyma中的抗霉素-敏感型虾青素超级生产菌株的研究中，An等人推测这种突变体能产生更多的虾青素以淬灭可能由电子转移链溢流电子所产生的活性氧类(应用环境微生物学，55，116-124，1989)。
本发明是基于下列假定产生的，即在电子转移链处于还原态的条件下，虾青素的生物合成可能被上调。所述还原态可以通过加入特异性抑制剂来诱导，所述抑制剂如抗霉素A，KCN，n-PG或SHAM。所述还原态也可以通过一些能导致电子转移失衡的突变来诱导。
根据本发明，得到了具有SHAM抗性的突变体。与其亲代菌株相比，所述突变体的虾青素生产能力增加了50％。
本发明包括克隆一种基因，所述基因编码Phaffia rhodozyma中的选择性(alternative)氧化酶。本发明还包括在适当宿主生物体，如大肠杆菌或酿酒酵母中表达上述基因，然后进行酶鉴定。可使用如此克隆的基因，通过定点诱变启动子序列或使用反义法来降低适当宿主，如P.rhodozyma中的AOX活性。通过在适当培养条件下，在适当培养基中培养这种转化子可证实它们对胡萝卜素生成的影响。
本发明提供了一种生产类胡萝卜素的新方法，所述方法包括培养一种生物体，其可通过在诱导选择性(alternative)氧化酶活性降低的条件下处理可生产类胡萝卜素的亲代生物体而得到，并选择类胡萝卜素生产能力增加的生物体。本发明方法中所用的生物体可以是借助于改变对选择性(alternative)氧化酶抑制剂的抗性而使类胡萝卜素生产能力增加的突变菌株。所述生物体可以是抗选择性(alternative)氧化酶抑制剂的突变体。根据本发明的方法可以通过使用原生生物界或真菌界的生物体来实现，更优选使用聚球蓝细菌属(Synechococcus)，集胞蓝细菌属(Synechocystis)，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属，其中最优选的生物体是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株。
可用于本发明的选择性(alternative)氧化酶的抑制剂可选自正丙基没食子酸或水杨基羟肟酸。
本发明还提供了建立突变菌株的方法，所述突变菌株相对于亲代生物体而言能生产出水平有所增加的类胡萝卜素，所述方法包括：在降低选择性(alternative)氧化酶活性的条件下培养可生产类胡萝卜素的生物体，并选择类胡萝卜素生产水平比所述亲代生物体高的生物体。所述的降低选择性(alternative)氧化酶活性的条件包括选择性(alternative)氧化酶抑制剂的存在。用于此目的的选择性(alternative)氧化酶抑制剂可选自正丙基没食子酸或水杨基羟肟酸。本发明的突变菌株生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属，其中最优选的生物体是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株。
另一方面，本发明还涉及可通过上述方法得到的，相对于亲代生物体而言能产生水平有所增加的类胡萝卜素的生物体的突变菌株。更具体地，所述突变体的特征在于：它们甚至在含有0.3至0.45mg/ml SHAM的培养基中也能以类似于在不含SHAM的培养基中的生长速率生长。
在本发明的一个实施方案中，提供了SHAM-抗性突变体，这些突变体衍生自Phaffia rhodozyma ATCC96594。已于2000年4月3日将这些SHAM-抗性突变体保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德国)，保藏号分别为DSM13429，DSM13430和DSM13431。
本发明方法中所用的生物体可以是重组生物体，与亲代生物体相比，该重组生物体中的上述选择性(alternative)氧化酶的基因表达经改变后降低了效力。本发明还提供了相对于宿主生物体而言能产生水平有所增加的类胡萝卜素的重组生物体，其特征在于与该宿主生物体相比，该重组生物体中选择性(alternative)氧化酶的基因表达经改变后降低了效力。可借助于选自反义技术，定点诱变，化学诱变等的技术改变这种生物体中选择性(alternative)氧化酶的基因表达。用于此目的的生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属，其中最优选的生物体是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株，尤其是上述的保藏菌株。
本发明还提供了重组DNA序列，该序列编码衍生自能产生类胡萝卜素之生物体的选择性(alternative)氧化酶。重组DNA可得自属于原生生物界或真菌界的生物体，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属，其中最优选的生物体是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomycesdendrorhous的菌株，尤其是上述的保藏菌株。本发明的重组DNA序列可以是由SEQ ID NO：2鉴定的序列，或者是与SEQ ID NO：2的同一性高于55％，更优选高于75％，最优选高于95％的序列。
更具体地，所述重组DNA序列的特征在于(a)它编码具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的所述酶，或(b)它编码所述酶的变体，所述酶变体选自(i)等位基因变体，和(ii)具有一个或多个氨基酸添加，***，缺失和/或取代并具有所述酶活性的酶。上述特别说明的分离的DNA序列可衍生自Phaffiarhodozyma的基因，该DNA序列可选自(i)SEQ ID NO：2所示的DNA序列，(ii)SEQ ID NO：2所示DNA序列的同类编码或等位基因变体，和(iii)SEQ IDNO：2所示DNA序列的衍生物，其中添加，***，缺失和/或取代了一个或多个核苷酸，但仍编码具有所述酶活性的多肽。
本发明还提供了所述重组DNA转化宿主生物体的用途。重组DNA的适当形式可以是载体。通过使用重组DNA得到的重组生物体能降低选择性(alternative)氧化酶的酶活性。被重组DNA转化的宿主生物体可用于改良类胡萝卜素，尤其是虾青素的生产方法。因此，本发明也提供了这种重组生物体。
另外，本发明提供了用生物学方法生产类胡萝卜素的方法，所述方法包括：将上述重组DNA导入适当宿主生物体，并培养所得的重组生物体。因此，本发明的一个方面是生产类胡萝卜素的方法，其特征在于在有利于生产类胡萝卜素的条件下培养上述重组生物体。该方法可用于生物生产虾青素。
图1示出了P.rhodozyma呼吸链的工作模型。
如上所述，很多研究人员推测虾青素在Phaffia rhodozyma中可能作为抗氧化剂起作用，因为它是在生长的需氧呼吸期而不是发酵期经刺激而产生的。通常，活性氧类趋于在该呼吸期内产生，这是由泛醌库的还原速度和呼吸链下游电子转移之间的电子转移失衡所导致的呼吸链电子溢流引起的(图1)。在此推测中，虾青素可能会与超氧化物歧化酶所作的那样，淬灭这些活性氧类。
根据此推测，通过抑制Phaffia rhodozyma中的呼吸链即可过量产生虾青素。实际上，An等人从Phaffia rhodozyma中分离出一些突变体，这些突变体的KCN-敏感型呼吸被阻断，并能产生更多的虾青素(应用环境微生物学，55，116-124，1989)。
另一方面，据Schroeder等报道，当刺激虾青素的生产时，处于生长后期的Phaffia rhodozyma的呼吸链由KCN-敏感型呼吸转变为KCN-抗性呼吸(生物化学杂志，270，18374-18379，1995)。在此上下文中，由选择性(alternative)氧化酶介导的KCN-抗性呼吸可能会对虾青素生产期的呼吸产生更大的影响。抑制选择性(alternative)氧化酶可能会导致虾青素的过量产生。
为了检查特异性抑制呼吸活性对Phaffia rhodozyma的虾青素生产的影响，可以在生长琼脂培养基中加入连续稀释的SHAM(已知SHAM能抑制选择性(alternative)氧化酶)。在研究过程中，出现了几个自发突变体，它们甚至在含有0.3至0.45mg/ml SHAM的培养基中也能显示出类似于在不含SHAM的培养基中的生长活性。令人惊奇的是，这种突变体生产出的虾青素比其亲代高50％。运表明一些导致虾青素过量产生的突变可能通过呼吸链还原态补偿了生长抑制，所述还原态可能是由选择性(alternative)氧化酶活性的降低引起的。
本发明提供了由此分离得到的突变体，该突变体抗0.3至0.45mg/mlSHAM(选择性(alternative)氧化酶的特定抑制剂)。与上文类似，本领域技术人员也易于理解，通过在选择性(alternative)氧化酶之任何一种或多种抑制剂的存在下培养相应生物体，并筛选在所述抑制剂的存在下显示出生长活性和比亲代生物体的虾青素生产能力高的生物体，即可建立能以更高生产能力生产虾青素的突变菌株。通过按实施例2所述，从P.rhodozyma细胞中提取类胡萝卜素并测定虾青素水平即可测定虾青素的生产能力。选择相对于亲代菌株而言能以较高水平生产虾青素的突变菌株的标准可以是：生产能力增加约10％。可在选择性(alternative)氧化酶之抑制剂的压力下再次培养和筛选所得的突变菌株，从而改善生产能力。可在适当培养基中使用所得突变菌株生产虾青素。
为了降低选择性(alternative)氧化酶的活性，基因工程所用的方法在几个方面优于在培养基中加入特定抑制剂，如SHAM的方法。一个优点是经济上的原因，加入所述抑制剂会增加生产成本。在培养基中加入所述抑制剂还有另一个缺点，该缺点体现在从终产品中除去所加抑制剂的纯化步骤中。
另外，本发明提供了分离的重组DNA序列，该序列编码Phaffiarhodozyma中的选择性(alternative)氧化酶。
本发明的所述DNA指的是cDNA和基因组DNA，前者仅含有其5’-和3’-非翻译区的短片段之间侧接的开放阅读框，后者含有其内含子和参与目的基因之表达的调节序列，如其启动子和终止子。
首先，我们使用简并PCR法克隆了含有部分AOX基因的部分基因片段。所述简并PCR是克隆目的基因的方法，其中目的基因的氨基酸序列与得自其它物种的功能相同或相似的已知酶具有较高同源性。通过将氨基酸序列逆翻译成相应的核苷酸(“简并的核苷酸”)来设计在简并PCR中被用作引物的简并引物。在此简并引物中，通常使用的是由A，C，G或T中的任一种组成的混合引物，或在多义密码子处含有肌苷的引物。在本发明中，混合引物被用作简并引物以克隆上述基因。如下文所述，所用PCR条件根据引物和欲克隆的基因的不同而改变。
将经上述简并PCR得到的部分DNA片段标记后用作探针，筛选构建于适当宿主中的噬菌体载体或质粒载体上的基因组文库，从而可从染色体中克隆完整的基因，该基因含有其编码区，其内含子以及其调节区，如启动子或终止子。通常，在文库构建及后续基因操作，如测序，限制性消化，连接等过程中，经常使用大肠杆菌作为宿主菌株，并使用大肠杆菌载体，噬菌体载体，如λ噬菌体载体，或质粒载体，如pUC载体。在本发明中，在λ载体的衍生物λgt11中构建P.rhodozyma的EcoRI基因组文库。在构建文库之前，通过Southern印迹杂交测定***物大小，即必须克隆多长的***物。在本发明中，根据供应商(Boehringer-Mannheim，Mannheim，德国)提供的方法，用一种类固醇半抗原，即地高辛配基(DIG)替代常规的32P标记来标记用作探针的DNA。通过将经DIG-标记的含有目的基因的一部分的DNA片段用作探针，来筛选构建自P.rhodozyma染色体的基因组文库。挑选杂交噬斑用于进一步研究。分离出阳性噬斑之后，将***片段亚克隆至适用于测序的适当质粒载体中。在本发明中，将阳性噬菌体载体中的***片段亚克隆至pOCUS-2载体，该载体可用于构建***了转座子的测序衍生物(Locus Pocus System，Novagene，Madison，美国)。
在本发明中，使用自动化的荧光DNA测序仪，即ALFred***(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和自动循环测序方法，其中在大多数的测序过程中使用的是Taq DNA聚合酶。
测定基因组序列之后，使用编码区的序列克隆相应基因的cDNA。也利用PCR法来克隆cDNA片段。合成PCR引物，其序列等同于开放阅读框(ORF)的5’-和3’-末端序列，其中还添加了一种适当的限制性位点，使用这些PCR引物进行PCR。在本发明中，在PCR克隆cDNA时将cDNA库用作模板。所述cDNA库由通过使用病毒逆转录酶和Taq聚合酶(Clontech制备的CapFinder试剂盒，Palo Alto，美国)，将得自P.rhodozyma的mRNA用作模板而在体外合成的多种cDNA组成。由其序列进一步证实所得的所需cDNA。另外，将所得cDNA片段克隆至在大肠杆菌或酿酒酵母中起作用的表达载体，使其受适当启动子的控制之后，可使用该cDNA证实其酶活性。
为了表达衍生自真核生物的基因，经常使用将cDNA克隆至大肠杆菌或酿酒酵母中的表达载体的方法。这是因为生物体的内含子结构特异性各有不同，不能识别其它物种的内含子序列。实际上，原核生物在其自身的遗传背景中不含内含子结构。甚至在酵母中，酿酒酵母所属的子囊菌纲与P.rhodozyma所属的担子菌纲的遗传背景都有所不同。Wery等证实P.rhodozyma的肌动蛋白基因的内含子结构不能被子囊菌纲的酿酒酵母识别和剪接(酵母，12，641-651，1996)。
据一些其它的研究人员报道，某些类型的基因的内含子结构参与其基因表达的调节(Dabeva，M.D等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，83，5854，1986)。或许，重要的是当目的基因的内含子结构参与其自身基因表达的调节，则在目的基因自我克隆时使用具有其内含子的基因组片段。
为了使用基因工程方法进行菌株改良研究，必须研究其在诸如转录和翻译的事件中的遗传机制。为了研究遗传机制，重要的是测定其上游激活序列(UAS)，即启动子，内含子结构和终止子的基因序列，而不是仅测定其外显子的基因序列。
根据本发明，从P.rhodozyma的基因组DNA中克隆出编码选择性(alternative)氧化酶的基因，测定其基因组序列，该序列含有选择性(alternative)氧化酶(AOX)基因，其中包括其5’-和3’-邻接区以及其内含子结构。
证实酶活性之后，可进行降低选择性(alternative)氧化酶活性的基因修饰研究。
在本发明中，所述多肽序列包括SEQ ID NO：2、其具有AOX活性的片段、及在严谨度条件下与SEQ ID NO：2杂交的多肽序列，所述严谨度足以鉴定针对SEQ ID NO：2之特异性结合，且这类杂交体可编码具有选择性(alternative)氧化酶功能的多肽。例如，可应用以下杂交条件和洗涤条件的任意组合来获得所需特异性结合：
高严谨度杂交：
6X SSC
0.5％ SDS
100μg/ml变性鲑精DNA
50％甲酰胺
于42℃轻柔摇动着保温过夜
高严谨度洗涤：
室温2X SSC，0.5％SDS中洗涤15分钟1次，然后于室温0.1X SSC，0.5％SDS中洗涤15分钟1次。
低严谨度杂交：
6X SSC
0.5％ SDS
100μg/ml变性鲑精DNA
50％甲酰胺
于37℃轻柔摇动着保温过夜
低严谨度洗涤：
室温0.1X SSC，0.5％SDS中洗涤15分钟1次。
中严谨度条件可通过改变上述杂交反应和/或洗涤条件的温度来获得。在本发明中，优选使用高严谨度杂交条件和洗涤条件。
为了用遗传学方法降低基因表达，可使用某些方法。一种方法是反义法。反义法是通过导入人工基因片段来降低目的基因之表达的方法，所述人工基因片段的序列与目的基因的序列互补。这种反义基因片段可以在体内与目的基因的成熟mRNA片段形成复合物，结果可抑制mRNA的有效翻译。为了构建AOX基因的反义RNA，可使用PCR法克隆AOX基因的互补cDNA链。
另一种方法是突变启动子区域。通常，基因由具有各自不同功能的几个部分组成。在真核生物中，与编码核糖体RNA(rRNA)，核内小RNA(snRNA)和转运RNA(tRNA)的基因不同的是，编码相应蛋白质的基因被转录成前信使RNA(pre-mRNA)。尽管RNA聚合酶II(PolII)在此转录事件中起主要作用，但PolII不能缺乏顺式元件和反式-作用的蛋白质因子而单独起始转录，所述顺式元件覆盖含启动子和UAS的上游区域。首先，转录起始复合物识别待表达基因之5’-邻接区中的启动子序列，所述复合物由几个蛋白质基本成分组成。在此事件中，当在一些特定调节(如热休克反应，或对营养饥饿的适应等)下表达基因时，还需要一些其它的参与者。此时，启动子序列附近的5’-上游非翻译区域中需要存在UAS，一些正或负调节蛋白识别并结合该UAS。转录起始复合物与启动子序列结合的强度受启动子附近反式-作用因子结合的影响，这样就能调节转录活性。
通过磷酸化激活转录起始复合物之后，转录起始复合物启动由转录起始位点开始的转录。转录起始复合物的某些部分作为延伸复合物从启动子区域沿该基因3’-方向脱附(该步骤被称为启动子清除事件)，延伸复合物继续转录直至其到达邻接该基因3’-下游区域的终止序列。
为了降低目的基因的表达，经常使用常规化学诱变或基因定点诱变来突变含UAS序列的上述目的基因启动子区域。在此方法中，诱变基因盒，然后将其导入P.rhodozyma，所述基因盒的5’末端含有与目的基因的启动子区域融合的一个报道基因，其3’末端含有目的基因的终止区域。通过检测报道基因活性的差异，可以筛选出有效的突变。通过用具有已突变的启动子区域的重组DNA转化宿主菌株可以得到目的酶的表达有所降低的突变菌株。
可将含有反义AOX基因或AOX基因之突变型启动子的构建体作为载体转移至适当宿主菌株。当使用Phaffia rhodozyma作为宿主菌株时，通过将这类构建体克隆至适当载体即可实现此目的，其中所述载体上含有可在P.rhodozyma中起作用的选择标记。经常将药物抗性基因用作选择标记，所述抗性基因编码的酶能使宿主在存在毒性抗生素时存活。药物抗性基因的一个例子是pGB-Ph9上携带的G418抗性基因(Wery等，基因，184，89-97，1997)。所述质粒可以通过染色体和质粒之间的同源重组整合至Phaffia rhodozyma的染色体上。
至于转化方法，可使用LiAc法和电穿孔法(Wery等，基因，184，89-97，1997)转化P.rhodozyma。
可在适当培养基中培养经基因工程改造的P.rhodozyma并评价其生产虾青素的能力。
下述实施例将参照附图进一步阐明本发明。
实施例
下述实施例中使用的是下列材料和方法：菌株
P.rhodozyma ATCC96594 (根据布达佩斯条约于1998年4月8日重新保藏，保藏号为ATCC 74438)
E.coli Y1090r-：araD139，hsdR(rK -，mK +)，mcrB+，rpsL，supF，trpC12∷Tn10，ΔlacU169，Δlon，F-，λ-，(pMC9)(Clontech)
E.coli DH5α：F-，φ80d，lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，hsd(rK -，mK +)，recA1，endA1，deoR，thi-1，gyrA96，relA1(Toyobo，Osaka，日本)
E.coliγδ供体：Δ(gpt-proA)62，leu，44，ara14，galK2，lacY1，Δ(mcrC-mrr)，(rB -，mB -)，xyl-5，mtl-1，recA13，[F+∷Tn1000(tets)](Novagene)
E.coli γδ受体：F-，araD139，Δ(ara-leu)7696，galE15，galK16，Δ(lac)X74，(Strr)，hsdR2(rK12 -，mK12 +)，mcrA，mcrB1∷Tn5(kanr)(Novagene)
E.coli TOP10：F-，mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，M15，ΔlacX74，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endA1，nupG(Invitrogen，NV Leek，荷兰)载体
λgt11(Clontech)
pCR2.1-TOPO(Invitrogen)
pOCUS-2
pBluescript II SK-(Stratagene)
pGBPh9(Wery等，酵母，12，641-651，1996)培养基
在YPD培养基(DIFCO，Detroit，美国)中常规维持P.rhodozyma菌株。在LB培养基(每升10g细菌用胰蛋白胨(DIFCO)，5g酵母提取物(DIFCO)和5g NaCl)中维持大肠杆菌菌株。在软琼脂(0.7％琼脂；WAKO)中使用NZY培养基(每升5g NaCl，2g MgSO4-7H2O，5g酵母提取物(DIFCO)，10g A型NZ胺(WAKO，Osaka，日本))增殖λ噬菌体。当制备琼脂培养基时，需添加1.5％琼脂(WAKO)。水杨基羟肟酸(SHAM)购自Aldrich(Milwaukee，美国)。方法
分子遗传技术的一般方法根据的是分子克隆：实验室手册，第2版(冷泉港实验室出版社，1989)中的方法。限制性酶和T4 DNA连接酶购自TakaraShuzo(Ohtsu，日本)。
使用QIAGEN基因组试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)根据厂商提供的方法从P.rhodozyma中分离染色体DNA。用自动化的DNA分离***(PI-50，Kurabo有限公司，Osaka，日本)少量制备已转化的大肠杆菌中的质粒DNA。使用QIAGEN柱(QIAGEN)少量制备大肠杆菌转化子中的质粒DNA。使用QIAquick或QIAEX II(QIAGEN)从琼脂糖中分离和纯化DNA片段。
使用Isogen(Nippon Gene，Toyama，日本)用酚法分离P.rhodozyma的总RNA。使用mRNA分离试剂盒(Clontech)从所得总RNA中纯化mRNA。使用CapFinder cDNA构建试剂盒(Clontech)合成cDNA。
使用Gigapack III金包装提取物(Stratagene，La Jolla，美国)进行体外包装。根据厂商提供的方法，通过Wizard λ preps DNA纯化***(Promega，Madison，美国)分离λDNA。
用Perkin Elmer 2400型热循环仪进行聚合酶链反应(PCR)。实施例中描述了每个PCR的条件。PCR引物购自供货商。用自动化的荧光DNA测序仪(ALFred，Pharmacia)进行DNA测序。
DH5α感受态细胞购自Toyobo。除非另有说明，所有化合物均购自WAKO。
实施例1  从P.rhodozyma ATCC 96594中分离SHAM-抗性突变体，SHAMI，SHAM2和SHAM3
为了检查由选择性(alternative)氧化酶介导的KCN-抗性呼吸的抑制作用对P.rhodozyma生长的影响，在YPD-琼脂培养基上的P.rhodozyma培养物中加入SHAM。将SHAM溶解于乙醇中，分别以0.05，0.15，0.30，0.45和0.90mg/ml的终浓度加入YPD-琼脂培养基。经稀释将2×107个细胞/ml P.rhodozyma ATCC96594涂布在这些培养基上。于20℃培养3天之后，计数所产生的菌落。结果，在含-SHAM的YPD琼脂上生长的菌落数几乎与不含SHAM的对照培养基上的相等。但在含-SHAM的培养基上生长的菌落小于对照培养物。表1显示出与对照菌落相比的相对菌落直径。
表1在含-SHAM的YPD琼脂上生长的菌落的相对大小
SHAM  (mg/ml)       0.05   0.15  0.30  0.45  0.90
相对菌落直径(％)    100    70    40    30    12
有趣的是，在含有0.3和0.45mg/ml SHAM的培养基上生长的菌落中，一些菌落显示出与对照菌落相似的大小。这些菌落也显示出比对照菌落更深的色素形成。挑出4个与对照菌落大小相似的菌落，在YPD-琼脂培养基上划线。甚至在不含SHAM的YPD-琼脂培养基上，所有菌落都显示出比对照菌落更深的色素形成。此结果表明这些菌株可能是自发突变体，将它们称为SHAM1，SHAM2，SHAM3和SHAM4。
实施例2  摇瓶发酵抗性突变体SHAM1，SHAM2和SHAM3
为了评价SHAM-抗性突变体SHAM1，SHAM2和SHAM3生产虾青素的能力，在摇瓶中进行发酵。从新鲜制备的琼脂培养物中将这些突变体及其亲代菌株ATCC96594接种于大小为500ml的带挡板摇瓶内的50ml YPD培养基中，使最终的660nm OD值为0.05。于20℃以200r.p.m.进行发酵。以适当的间隔取出3ml肉汤培养基，分析细胞量和虾青素的含量。
将细胞量测定为660nm处的OD值。将1.0ml肉汤置于1.5ml微量离心管中以120℃加热过夜之后称重细胞而测定细胞干重。按下述，用玻璃珠破碎P.rhodozyma细胞，从中提取类胡萝卜素之后，用HPLC法测定P.rhodozyma中的虾青素含量。用蒸馏水将离心1ml肉汤所得的细胞浓缩2倍，在褐色避光试管(13.5mm，11cm)内的细胞悬浮液(0.5ml)中加入10.0g玻璃珠。接着，加入1.5ml丙酮/丁基化羟基甲苯(BHT)/水(45mg BHT溶于450ml丙酮和50ml水中)，然后在水平台式摇床上将试管振荡1小时。提取之后，加入5ml含有适当浓度的胭脂树橙(nacalai tesque，Kyoto，日本)作为内部标准的丙酮/BHT/水。用下列HPLC***(HPLC***的硬件购自Tosoh(Tokyo，日本))分析上清液中的虾青素含量。
HPLC柱：YMC-Pak ODS-A(6mm，150mm(YMC公司，Milford，美国)。
温度：室温
洗脱溶剂：乙腈/甲醇/异丙醇(85/10/5)
注射量：10微升
流速：2.0ml/分钟
检测：471nm的紫外线
结果概述于表2。所有突变体显示出比亲代菌株ATCC96594高50％的虾青素生产能力。由此结果看，这些突变体中可能发生了一些能通过增加虾青素生产能力来补偿选择性(alternative)氧化酶活性的抑制作用的突变。
表2    SHAM-抗性突变体的虾青素生产能力
         虾青素生产能力
(mg/L)      (mg/g-干细胞)        OD@660nm
(小时)     38    72    38     72     38    72
SHAM-1     1.65  4.07  0.179  0.380  24.5  30.6
SHAM-2     2.36  4.43  0.217  0.385  29.5  30.5
SHAM-3     2.87  3.97  0.247  0.381  29.2  29.5
ATCC96594  2.00  2.76  0.164  0.258  27.4  28.7
实施例3从P.rhodozyma中分离mRNA并构建cDNA文库
为了构建P.rhodozyma的cDNA文库，在破碎细胞之后立即通过苯酚提取法分离总RNA，使用mRNA分离试剂盒(Clontech)纯化P.rhodozymaATCC96594菌株的mRNA。
首先，通过离心(1500xg，10分钟)从10ml已在YPD培养基中培养两天的培养物中收集ATCC96594菌株的细胞，用提取缓冲液(含有0.7M KCl的10mM柠檬酸钠/HCl(pH 6.2))将细胞清洗一次。悬浮于2.5ml提取缓冲液中之后，用弗氏压碎匀浆器(Ohtake Works Corp.，Tokyo，日本)以1500kgf/cm2的压力破碎细胞，立即根据厂商特别说明的方法与两倍体积的isogen(Nippon gene)混合。在此步骤中，回收到400微克总RNA。
然后根据厂商特别说明的方法，使用mRNA分离试剂盒(Clontech)纯化总RNA。最终从P.rhodozyma ATCC96594菌株中得到16g mRNA。
为了构建cDNA文库，根据厂商特别说明的方法，使用CapFinder PCRcDNA构建试剂盒(Clontech)。将1微克纯化的mRNA用于第一条链的合成，接着进行PCR扩增。PCR扩增之后，得到1mg cDNA库。
实施例4  从P.rhodozyma中克隆部分AOX(选择性(alternative)氧化酶)基因
为了从P.rhodozyma中克隆部分AOX基因，使用了简并PCR法。下文列出了一些菌种和数据库的登记号，所述菌种的选择性(alternative)氧化酶序列被用于多重序列对比分析(ClustalW，Thompson J.D等，核酸研究，22，4673-4680，1994)。
黑曲霉                       AB016540(DDBJ/GenBank/EMBL)
白色念珠菌                   AF031229(DDBJ/GenBank/EMBL)
Chlamydomonas reinhardtii    AF047832(DDBJ/GenBank/EMBL)
粗糙链孢霉                   Q01355(Swissprot)
稻(Oryza sativa)             AB004813(DDBJ/GenBank/EMBL)
Pichia anomala               Q00912(Swissprot)
Trypanosoma brucei brucei    Q26710(Swissprot)
如表3所示，根据其它物种的已知选择性(alternative)氧化酶基因的共有序列设计和合成两个混合引物的核苷酸序列。
表3    用于克隆AOX基因的引物序列
aox3：AAYGARMGNATGCAYYTNYTNACNTT(有义引物)(SEQ IDNO：3)
aox5：GCYTCYTCYTCNARRTANCCNACRAA(反义引物)(SEQ ID NO：4)
(N＝A，C，G或T；R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C)
使用ExTaq(Takara Shuzo)为DNA聚合酶，实施例1中所得的cDNA库为模板，进行25轮PCR，每轮的条件是：95℃30秒，50℃30秒和72℃15秒，然后对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。回收具有所需长度的PCR带，根据厂商提供的方法用QIAquick(QIAGEN)纯化，然后连接至pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。转化感受态大肠杆菌TOP10之后，选择6个白色菌落，用自动DNA分离***分离质粒。测序后发现3个克隆所具有的序列的推定氨基酸序列类似于已知的选择性(alternative)氧化酶基因。将此分离的cDNA克隆称为pAOX514并用于进一步研究。
实施例5  分离P.rhodozyma的基因组DNA
为了分离P.rhodozyma的基因组DNA，根据厂商特别说明的方法使用QIAGEN基因组试剂盒。
首先，通过离心(1500xg，10分钟)从100ml已在YPD培养基中培养过夜的培养物中收集P.rhodozyma ATCC96594菌株的细胞，用TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris/HCl(pH 8.0))将细胞清洗一次。悬浮于QIAGEN基因组试剂盒中的8ml Yl缓冲液之后，以2mg/ml的浓度加入溶细胞酶(SIGMA，St.Louis，美国)以通过酶促降解破碎细胞，于30℃保温该反应混合物90分钟，然后进行后续的提取步骤。最终得到20微克基因组DNA。
实施例6使用pAOX514为探针进行Southern印迹杂交
进行Southern印迹杂交以克隆含有P.rhodozyma之AOX基因的基因组片段。用EcoRI消化2微克基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行酸和碱处理。通过1小时反转印迹(Joto Rika，Tokyo，日本)将变性的DNA转移至尼龙膜(Hybond N+，Amersham，Buckinghamshire，英国)。通过热处理(80℃，90分钟)固定转移至尼龙膜上的DNA。通过用DIG多引发法(BoehringerMannheim)标记模板DNA(经EcoRI消化的pAOX514)来制备探针。根据厂商特别说明的方法进行杂交。结果观察到5.5至7.0千碱基(kb)的杂交带。
实施例7  克隆含有AOX基因的基因组片段
用EcoRI消化4微克基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。然后，根据厂商特别说明的方法，用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN)回收长度为5.0至7.0kb的DNA。通过16℃过夜，将纯化的DNA连接至0.5微克经EcoRI-消化和CIAP(牛小肠碱性磷酸酶)-处理的λgt11(Clontech)，通过Gigapack III金包装提取物(Stratagene)进行包装。用经包装的提取物感染大肠杆菌Y1090菌株，并与NZY培养基一起铺于LB琼脂培养基上。使用经EcoRI-消化的pAOX514为探针筛选出约6000个噬斑。1个噬斑与经标记的探针杂交。
使用Wizard λ preps DNA纯化***(Promega)制备含有推定的P.rhodozyma AOX基因的λgt11衍生物。用EcoRI消化，结果发现该λgt11衍生物含有6kb EcoRI***物。接着，使用该λgt11衍生物为模板，两个引物aox3和aox5为引物进行PCR。按与实施例4相同的PCR条件进行PCR，结果产生预期的0.3kb带。这表明该λgt11衍生物可能含有推定的P.rhodozymaAOX基因。使用QIAquick(QIAGEN)纯化此λgt11衍生物中的6.0kb EcoRI***片段，然后使用DH5α为宿主菌株将其亚克隆至pOCUS-2载体(Novagen)，产生pOCUSAOX607。
实施例8含有AOX基因之基因组片段的测序
将pOCUSAOX607转移至感受态的γδ供体细胞，用于制备可用于LocusPocus***(Novagen)的测序衍生物。制备测序衍生物的方法由厂商提供。至于测序引物，可合成经Cy5-标记的引物(其序列示于表4)并用于通过使用AutoCycle测序试剂盒(Pharmacia)进行测序。
表4测序AOX基因所用引物的序列
poc1：(Cy5-)AGCTACAACATACGAAAGGG(SEQ ID NO：5)
poc2：(Cy5-)GGGGAACTGAGAGCTCTAAA(SEQ ID NO：6)
测序的结果测出了含有2561个碱基对的核苷酸序列，该段序列是含有P.rhodozyma AOX基因的基因组片段。
编码区位于由10个外显子和9和内含子组成的1206个碱基对内。内含子在整个编码区内都有分布，而无5’或3’偏好。通过使用基因分析软件GENETYX-SV/RC(软件开发有限公司，Tokyo，日本)版本4.0.1，发现开放阅读框由402个氨基酸组成(SEQ ID NO：1)，其序列与其它物种的选择性(alternative)氧化酶的已知氨基酸序列惊人地相似(与黑曲霉的选择性(alternative)氧化酶有51.5％的同一性)。氨基末端的一段疏水氨基酸残基有望形成α-螺旋，这表明该氨基末端区域可能是跨膜结构域或是线粒体的转运肽。PSORTII程序(http：∥psort.nibb.ac.jp：8800/)预测该蛋白质可能是线粒体蛋白，预测值为82.6％。
实施例9  克隆AOX基因的上游区域
使用Genome Walker试剂盒(Clontech)克隆AOX基因的5’-邻接区域，因为pAOX514可能具有足够的长度可以含有AOX基因的启动子。首先，合成PCR引物，其序列示于表5。
表5  克隆AOX基因的5’-邻接区域所用引物的序列
aox13：GTGTCAGAAACCTCAGATCAACAGGC(初始引物)(SEQ IDN0：7)
aox14：CAACAGGCAGTACAGTCAGCAGATTC(嵌套引物)(SEQ IDNO：8)
文库构建方法和PCR条件与厂商特别说明的相同。将实施例5得到的基因组DNA制品用作PCR模板。回收5’末端具有ScaI位点的PCR片段(1.2kb)和5’末端具有DraI位点的PCR片段(3.0kb)，使用大肠杆菌TOP10为宿主菌株，将上述PCR片段克隆至pCR2.1-TOPO。测定上述2个独立实验中的每一个的序列，结果得到被称为pAOXSc702的质粒，该质粒可用于进一步研究。根据pAOXSc702中***片段的序列，合成4个PCR引物，其序列列于表6。
表6  克隆AOX启动子区域所用引物的序列
aox15：GAATTCAACAGGTCAAATGA(有义引物)(SEQ ID NO：9)
aox16：ATCCACCCACGCCTGTTTCC(反义引物)(SEQ ID NO：10)
aox17：GGAAACAGGCGTGGGTGGAT(有义引物)(SEQ ID NO：11)
aox18：GAATTCAGTAAACGCATTAG(反义引物)(SEQ ID NO：12)
PCR条件与实施例4所述的相同，不同之处在于HF聚合酶(Clontech)被用作DNA聚合酶。在aox15和aox16的组合中，扩增出长度为0.7kb的片段。在aox17和aox18的组合中，扩增出长度为0.5kb的片段。将这些片段克隆至pCR2.1-TOPO并转化大肠杆菌TOP10。分别制备6个独立的白色菌落的质粒并进行测序。结果得到***片段的序列彼此相同的预期克隆。在aox15和aox16的组合中，所得克隆被称为pAOX714#1516。在aox17和aox18的组合中，所得克隆被称为pAOX714#1718。测序的结果测出了含有P.rhodozyma AOX基因之启动子区域的pAOX714#1516和pAOX714#1718的序列。测出的含有AOX启动子的序列长度为1406个碱基对。
联合实施例8和9得到的序列，测出该核苷酸序列(3.7kb)含有AOX基因及其启动子和终止子(SEQ ID NO：2)。
实施例10  构建AOX基因的反义质粒
通过PCR法扩增反义基因片段，该片段覆盖了AOX基因的整个结构基因，将该片段克隆至整合载体中，其中反义AOX基因由P.rhodozyma中的AST启动子转录。
表7  反义构建AOX基因所用引物的序列
aox101：GGCCATTATGGCCTCAATTGGTCTGAGACATGC(SEQ IDNO：13)
aox102：GGCCGAGGCGGCCATGTCTCTTGCTAGATGTCT(SEQ IDNO：14)
两个引物aox101和aox102具有不对称的限制性酶SfiI识别序列(GGCCNNNNNGGCC)，但它们的不对称突出序列被设计成不同的序列。这样就可以定向克隆至在其连接序列中具有相同不对称序列的表达载体中。
使用HF聚合酶(Clontech)为Taq聚合酶，实施例3中制备的cDNA为模板，在下列条件下进行PCR：94℃15秒，55℃30秒和72℃45秒共30轮循环。纯化扩增的PCR片段，克隆至pCR2.1-TOPO载体。测序后发现一个克隆具有正确的片段，该克隆被称为pAOX1007#0102。AOX基因之反义片段的序列示于SEQ ID NO：15。
关于驱动反义AOX基因转录的启动子和终止子片段，AST启动子和终止子克隆自实施例5中制备的染色体。
表8  克隆AST启动子和终止子所用引物的序列
ast49：GCGGCCGCACGTACAGACTAAGATCGAC(有义引物)(SEQID NO：16)
ast50：GGCCATAATGGCCATGGAGAAAGTAGGTGGCAA(反义引物)(SEQ ID NO：17)
ast36：CCTGCAGGCCGCCTCGGCCGTTGATTCTTCATATGTTAA(有义引物)(SEQ ID NO：18)
ast37：GGTACCCTGCAGTCGACAAACATGAA(反义引物)(SEQ IDNO：19)
PCR条件如下：94℃15秒，55℃30秒和72℃90秒共25轮循环。在ast49和ast50的组合中，扩增出长度为1.25kb的片段。在ast36和ast37的组合中，扩增出长度为0.3kb的片段。将这些片段克隆至pCR2.1-TOPO并转化大肠杆菌TOP10。分别制备6个独立的白色菌落的质粒并进行测序。结果，选择具有正确AST启动子和终止子序列(EP 1035 206 Al)的克隆进行进一步研究(pUAST407-AST启动子和pAST526#3637-AST终止子)。
接着，通过将NotI+KpnI消化的pAST526#3637和KpnI+SacI消化的pG418Sa330(EP 1 035 206 Al)与NotI和SacI消化的pBluescriptII SK-(Stratagene)连接，使AST终止序列与G418抗性盒融合。将连接混合物转化至感受态的KB822细胞。经过限制性分析，选择一个具有正确结构的克隆(pUAST418)进行进一步研究。
然后，将3.1kb含有核糖体DNA(rDNA)基因座(Wery等，基因，184，89-97，1997)的SacI片段***pUAST418之G418盒的下游。rDNA片段以多拷贝存在于真核生物的染色体中。经由该rDNA片段的整合事件导致所用宿主染色体上的多拷贝整合，这样可以使表达载体上携有的外源基因过量表达。为此，将含有rDNA基因的pGBPh9的SacI片段连接至经SacI消化和细菌碱性磷酸酶处理的pUAST418中。将连接混合物转化至感受态的KB822细胞中。经过限制性分析，选择2个克隆(pURDNA421和pURDNAR421)进行进一步研究，这2个克隆中的rDNA片段以彼此不同的方向***。
随后，将AST启动子***AST终止子的上游以构建能在P.rhodozyma中起作用的表达载体。将pUAST407的1.0kb的Notl-和BglII-片段和pUAST407的0.25kb的BglII和PstI片段与经NotI-和Sse8387I-消化的pURDNA421或pURDNAR421连接。用该连接混合物转化感受态的KB822细胞，对各6个所得菌落进行限制性分析。选择AST启动子正确***的克隆进行进一步研究(pF718和pR718，它们的rDNA片段方向彼此相反)。
最后，通过将pAOX1007#0102的1.2kb SfiI片段***经SfiI消化的pF718或pR718即可完成反义AOX构建体。所得质粒被称为pFAOX828和pRAOX828。
实施例11  用AOX-反义载体转化P.rhodozyma
将AOX反义载体pFAOX828和pRAOX828转化至P.rhodozyma野生型菌株ATCC96594。根据“分子生物学方法”(Johnson等，53，147-153，1996)中所述的方法进行biolistic转化。在YPD培养基中将P.rhodozyma菌株ATCC96594培养至稳定期。离心肉汤之后，用无菌水将细胞浓缩10倍，将200微升细胞悬浮液涂布于含有100微克/ml遗传霉素和0.75M D-甘露糖醇和D-山梨糖醇的YPD培养基上。将5微克质粒包被于1.5mg 0.9微米的金粒上，用作biolistic转化的供体DNA。选择出一个遗传霉素抗性菌落进行进一步的鉴定，该菌落被pFAOX828转化并显示出增加的色素形成，鉴定的内容包括该菌落生产虾青素的能力及其由AOX基因编码的选择性(alternative)氧化酶活性的降低。
实施例12  鉴定衍生自P.rhodozyma ATCC96594的pFAOX828整合体
于20℃，在500ml锥瓶中的50ml YPD培养基中将P.rhodozyma转化子ATCC96594∷pFAOX828及其亲代菌株ATCC96594培养3天，培养所用的种子培养物是于20℃，在试管(直径为21mm)中的10mlYPD培养基中培养3天后的培养物。在接种后的不同时间点，例如24，43和65小时，取出适量培养物肉汤，用于分析其在存在或缺乏KCN时的生长、生产虾青素的能力及其氧摄取活性。24，43和65小时时间点分别对应于其对数生长期后期，稳定中期和稳定晚期。
为了分析生长情况，除了通过将微量离心1ml肉汤所得的细胞置于100℃干燥1天以测定其细胞干重外，还通过使用UV-1200光度计(ShimadzuCorp.，Kyoto，日本)测定660nm处的光密度。
为了分析虾青素和总类胡萝卜素的含量，微量离心1.0ml肉汤后从中收集细胞，通过用玻璃珠破碎从P.rhodozyma细胞中提取类胡萝卜素。提取之后，离心除去破碎的细胞，用HPLC分析残留物中的类胡萝卜素含量。HPLC条件如下：
HPLC柱：Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)
温度：室温
洗脱溶剂：丙酮/己烷(18/82)加1ml/L水
注射量：10微升
流速：2.0ml/分钟
检测：450nm处的紫外光
虾青素参照样品得自F.Hoffmann-La Roche AG(Basel，瑞士)。
为了通过测定存在或缺乏KCN时的氧摄取活性来测定呼吸活性，使用了B-505型DO计和DO探针GU-BM(由Iijima Electronics公司(Aichi，日本)制备)。用0.5M KPB(pH7.4)重新悬浮收集的细胞，然后，在DO分析小室中用2.3ml水稀释200微升该细胞悬浮液。在存在或缺乏0.48mM KCN时通过加入0.2ml 1M葡萄糖来启动测量。
结果概述于表9。
                                                     表9
    菌株     ATCC96594∷PFAOX828              ATCC96594
时间(小时)   24  43   65   24    43   65
 660nm处的OD值   22.75  28.26   27.91   28.75    31.707   31.10
干细胞(mg/ml)   10.8  12.7   12.3   11.6    12.1   11.6
虾青素(mg/g-干细胞)   0.090  0.223   0.240  0.107    0.194   0.211
类胡萝卜素(mg/g-干细胞)   0.218  0.336   0.354  0.213    0.269   0.288
呼吸
-KCN敏感型   11.29  5.84   4.02  16.03    6.13   4.96
-KCN抗性   0.29    0     0  1.48    0.78   0.15
(呼吸活性被表示为nmol O2-摄取/分钟×mg干细胞)
如表9所示，在培养43小时时，反义AOX转化子ATCC96594∷pFAOX828显示出与亲代菌株ATCC96594类似的细胞产量，但在第24小时时显示出较慢的生长。转化子的虾青素和类胡萝卜素含量增加了15％。就其呼吸活性而言，转化子具有与其宿主菌株相似的KCN-敏感型呼吸活性(95％)，但在24小时培养物中，由选择性(alternative)氧化酶介导的KCN-抗性呼吸降低其宿主菌株的20％水平，而在43小时培养物中已完全受损。
此结果表明介导KCN-抗性呼吸的选择性(alternative)氧化酶活性的降低可能至会导致P.rhodozyma中虾青素和类胡萝卜素的过量产生。
                                      序列表<110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG<120>生物生产类胡萝卜素的改良方法及其所用的生物材料<130> 案号 20685<140> -<141> -<150> 00111148.3<151> 2000-05-24<160> 12<170> patentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 401<212> PRT<213> Phaffia rhodozyma<400> 1Met Ser Leu Ala Arg Cys Leu Val Gln Ala Ser Thr Arg Ser Leu1               5                  10                  15Ser Arg Thr Val Arg Pro Ser Tyr Leu Thr Pro Leu Thr Val His
            20                  25                  30Phe Phe Ser Ser Thr Ile Ser Arg Set Cys Ser Arg Ser Tyr Ser
            35                  40                  45Thr Ser Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Asn Gly Gln Gln Ser Thr
            50                  55                  60His His Leu Ala Asp Asn Val Pro Leu Thr Thr Asp Lys Gln Arg
            65                  70                  75His Leu Gln Gly Val Ile Gly Gly Glu Gly Met His Gln His Asp
            80                  85                  90Ala Thr Thr Val Ala His Thr Asp Pro Leu Ala Ser Val Ile Gln
            95                  100                 105Asp Leu Thr Val Pro Thr Asn Gly Ser Trp Val Met His Asn Pro
            110                 115                 120Val Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Asp Ala Val Gln Val Val His Arg
            125                 130                 135Pro Pro Thr Asn Thr Ser Asp Gln Val Ser Thr Lys Leu Val Lys
            140                 145                 150Met Leu Arg Trp Gly Phe Asp Leu Val Ser Asn Tyr Lys His Val
            155                 160                 165Pro Phe Pro Ala Asn His Lys Glu Leu Ser Val Thr Gln Leu Arg
            170                 175                 180Gln Met Gly Cys Leu Leu Ser Pro Asp Gln Trp Met Thr Arg Phe
            185                 190                 195Ile Phe Leu Glu Thr Thr Ala Ala Ile Pro Gly Met Val Gly Gly
            200                 205                 210Leu Leu Arg His Leu Gln Ser Leu Arg Leu Met Arg Arg Asp Gly
            215                 220                 225Gly Trp Ile His Thr Leu Leu Ala Glu Ala Glu Asn Glu Arg Leu
            230                 235                 240His Leu Leu Thr Phe Met Ser Met Ala Asn Pro Pro Leu Trp Phe
            245                 250                 255Arg Ala Leu Ile Leu Gly Ala Gln Gly Val Phe Tyr Asn Leu Phe
            260                 265                 270Phe Ile Thr Tyr Leu Ile Ser Pro Pro Val Ala His Arg Phe Val
            275                 280                 285Ala Cys Leu Glu Glu Glu Ala Val Val Thr Tyr Thr Arg Ile Ile
            290                 295                 300Ser Asp Ile Glu Asn Gly Tyr Val Pro Glu Trp Glu Lys Leu Pro
            305                 310                 315Ala Pro Glu Ile Ala Ile Ser Tyr Trp Arg Leu Pro Pro Asp Ala
            320                 325                 330Thr Phe Leu Asp Thr Leu Arg Ala Ile Arg Ala Asp Glu Ala Thr
            335                 340                 345His Arg Phe Val Asn His Thr Phe Ala Ser Leu Asp Ser Lys Lys
            350                 355                 360Asp Phe Asn Pro Phe Ala Ile Ala Glu Pro Asp Ala Thr Thr Lys
            365                 370                 375Gly Ser Val Tyr Gly Phe Thr Arg Asp Glu Ala Ala Ala Phe Ala
            380                 385                 390Gln Lys Thr Arg Glu Arg Met Ser Gln Thr Asn
            395                 400<210> 2<211> 3724<212>DNA<213> Phaffia  rhodozyma<220><221>外显子<222> (1407)..(1674)<220><221>内含子<222> (1675)..(1769)<220><221>外显子<222> (1770)..(1873)<220><221>内含子<222>(1874)..(1948)<220><221>外显子<222> (1949)..(2155)<220><221>内含子<222>(2156)..(2264)<220><221>外显子<222>(2265)..(2295)<220><221>内含子<222>(2296)..(2372)<220><221>外显子<222>(2373)..(2423)<220><221>内含子<222>(2424)..(2515)<220><221>外显子<222>(2516)..(2645)<220><221>内含子<222>(2646)..(2735)<220><221>外显子<222>(2736)..(2831)<220><221>内含子<222>(2832)..(2914)<220><221>外显子<222>(2915)..(2998)<220><221>内含子<222>(2999)..(3085)<220><221>外显子<222>(3086)..(3206)<220><221>内含子<222>(3207)..(3320)<220><221>外显子<222>(3321)..(3434)<220><221>5′UTR<222>(1295)..(1296)<223>(实验型)<220><221>polyA_位点<222>(3682)..(3683)<223>(实验型)<400>2gaattcaaca ggtcaaatga gaaaggacaa ggtgaagaga tggaaccaga       50agcaatcagc gagagtaaag acgatggttc taaacataca ttgggcacga      100ctcccttgat ccgaggcagg tatacgacca gatacaaaaa caagctgacg      150gtcacggccg aaaataggaa ggagagttgc aacgctcggc taaagaaggt      200ggattcaatc acaacacacg gtcaaggcaa gcatgacata ttgagctttt      250gcttgagtat ctcgcgatca aagtgatgat ggatgcttct aaggatcgtc      300tttatctttc cgccaggaga tgtgcaataa caagagagga agagaaacgt      350aaaggagtgt actcacatgc ccaaaccacc ggcgttggat tcgagaagag      400ctcttcttag gctgtctccg acgccccaat ggcggacgcc caatagtcca      450aacacgatgt acttgccatt ccgaagaagg ttaggaaggt atgggctcga      500agctgctgat tgaccagaca taggacaaga acaaataaag agacaagaaa      550cgacaacgac cgagcagata tctgactaga gaaaaccgtg gcgacgttgc      600aatgtttggg cccgaaaaaa gatgagttgc tttgttttcg agtcgtcctg      650tagccccagc tggggactag ccgctgtcac gaggaaacag gcgtgggtgg      700atgctccacc acatggatgg ttacacacgc cacactgccg cacgctgcgc      750agatataacc cgttcaacac ccgacaacga actggttgac cttccgaggt      800gaccatcaag cttggatgtt cagctgcgat attcagctac gatgatatgt      850atgccgaaca caagtagtaa aatggctcag aaagacacag aagaaacggc      900gttcattact ccgaaagacg agacatcccc gcatgaatct ctggacgata      950aagccaagcg gacggacgga agcccattgg cgatggtcgg ttactaaccc     1000tgctggcttc actgcttggc ctgacttgac tgtctcttcc tcacttgctg     1050tcttgactcg gtcgacggat aactcgccaa acccatcaac acggcagtcc      1100gtttagattt ccgttcccac ctcttcttcg agtttccgtt catgctctac      1150taatgcgttt actgaattca acacaatgtc taattgaatc tgctgactgt      1200actgcctgtt gatctgaggt ttctgacact aacatgactt atcatttggc      1250tgacttataa atagttcgag accaacagct cttaattctg atcctgccta      1300catacatatc tactctttgc tcgaccattg catcaaacca ttgcacgctt      1350ctctccatac tggctatatc acaatacctg ccatatacat tgcccaacta      1400ccaaca atg tct ctt gct aga tgt ctt gtc cag gca tca act      1442cgg tca ctt tcg cgt acc gtt cgg cca tcc tat ctc aca cct     1484cta aca gtt cac ttc ttc tcc tca aca atc tca agg agc tgc     1526tcc agg tca tat tca acg tcg aac acc cgc ctt tca aca tct     1568aat ggt caa caa tca acg cat cat ctt gcg gac aat gtt cct     1610ctc acc acc gac aaa caa agg cac ctt caa ggc gtc atc ggc     1652ggt gag ggc atg cat cag cat g gtccgttctt ctgtcctcta         1694tcatattcgt atcaaaatat ggattagttc ttattcacaa ttctttatct      1744catcaaacat gcttactgtc catag at gca acg acg gta gct cat      1789acg gat ccc tta gct tcc gtc ata caa gat ttg act gtt ccc     1831act aac gga tct tgg gtg atg cat aat ccc gtc tat act cga     1873gtacgtctct gaacgcttcg cttcaattat tcctgcgcta gctacagctc      1923accggtcctt ctccctttct gacag act gag tta gat gct gtt cag     1969gtc gtt cat cgt ccc ccc acc aac acg tcc gac caa gtc tcc     2011acc aag ctt gtc aag atg ctc cga tgg gga ttc gac ctt gtc     2053agc aac tac aaa cat gtt ccc ttt ccc gca aac cac aaa gaa     2095ctc agc gtc act caa ttg cgc caa atg ggc tgt ctt ctc tcg     2137cct gat caa tgg atg acg gttagtatta cttactcttg tcgtcagtat    2185tcatggcaac atattgctca tctagtcaag tgcacacgtc catttcgtct      2235aatttgttac tttttctgaa aattcacag agg ttc atc ttt cta gaa     2282aca aca gct gct a gttcgttcat ccaccaacac aaccattctt          2325gataataccc actttttctt cgatactgat atttatactc aacctag tt      2374cct gga atg gtt ggc ggt ctc ttg cgc cat ctt cag tct ctc     2416cga ctc a gttcgtttca ttctttcttc tcgattgatc atcgttttgg       2463catcatctgt tgataagcat agtccttacg cattcgatct tgattcgttc       2513ag tg cga cgg gat ggt ggt tgg att cac acg ctt ctt gct        2553gaa gct gaa aac gaa cgt ctc cac ctt ctg acg ttc atg agc      2604atg gct aat cca cct ctc tgg ttc cga gct ttg ata ctg gga      2637gct caa gg gtcagccttt tttatcatta ttaatattaa tttctctctc       2685tagacgatca cggaccatgt gctgagaggg tcttcatata tgctttgcag       2735g gtt ttt tat aac ctg ttc ttc ata act tat tta att tcc        2775ccg ccg gtg gct cat cga ttc gtt gcc tgc ctg gag gaa gaa      2817gct gtc gtt act ta gtaagatcga tcgttgcaat catgctcgag          2861tagtctttta gtttgttaat cattcgattg ggattggttt cgtatttcat       2911cag c aca aga att atc agt gat atc gag aac ggc tat gta        2951cct gaa tgg gaa aag ctt ccc gct ccc gag att gct ata tct      2993tac tg gtctgcttga cttcagtcgc acagtttcat ttgtcttgac           3038atgtaaattg ttactgacaa tatgctcaca aatatcacct tcatcag g  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Claims (31)

1.生产类胡萝卜素的方法，所述方法包括处理可生产类胡萝卜素的亲代生物体，以诱导选择性氧化酶活性降低，培养所得到的生物体，并选择类胡萝卜素生产能力增加的生物体。
2.根据权利要求1的方法，其中生物体可以是借助于改变对选择性氧化酶之抑制剂的抗性而使类胡萝卜素生产能力增加的突变菌株。
3.根据权利要求1或2的方法，其中生物体是抗选择性氧化酶之抑制剂的突变体。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属。
5.根据权利要求2至4中任一项的方法，其中所述生物体是Phaffiarhodozyma的菌株。
6.根据权利要求2至5中任一项的方法，其中所述生物体是选自DSM13429，13430和13431的菌株。
7.根据权利要求2至6中任一项的方法，其中所述选择性氧化酶的抑制剂可选自正丙基没食子酸和水杨基羟肟酸。
8.建立突变菌株的方法，所述突变菌株相对于亲代生物体而言能生产出水平有所增加的类胡萝卜素，所述方法包括：在降低选择性氧化酶活性的条件下培养可生产类胡萝卜素的生物体，并选择类胡萝卜素生产水平比所述亲代生物体高的生物体。
9.根据权利要求8的方法，其中降低选择性氧化酶活性的条件包括选择性氧化酶之抑制剂的存在。
10.根据权利要求9的方法，其中所述选择性(alternative)氧化酶之抑制剂选自正丙基没食子酸和水杨基羟肟酸。
11.根据权利要求8至10中任一项的方法，其中所述生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属。
12.根据权利要求8至11中任一项的方法，其中所述生物体是Phaffiarhodozyma的菌株。
13.根据权利要求8至12中任一项的方法，其中所述生物体是选自DSM13429，13430和13431的菌株。
14.一种生物体的突变菌株，其可通过权利要求8至13中任一项所限定的方法得到，其相对于亲代生物体而言能产生水平有所增加的类胡萝卜素。
15.根据权利要求14的突变菌株，其中所述生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属。
16.根据权利要求14或15的突变菌株，其中所述生物体是Phaffiarhodozyma的菌株。
17.根据权利要求1的方法，其中所述生物体是重组生物体，与亲代生物体相比，该重组生物体中的选择性氧化酶的基因表达经改变后降低了效力。
18.根据权利要求17的方法，其中借助于选自反义技术，定点诱变，化学诱变等技术改变这种生物体中选择性氧化酶的基因表达。
19.根据权利要求17或18的方法，其中所述生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属。
20.根据权利要求17至19中的任一项的方法，其中所述生物体是Phaffiarhodozyma的菌株。
21.根据权利要求17至20中任一项的方法，其中所述生物体是选自DSM13429，13430和13431的菌株。
22.相对于宿主生物体而言能产生水平有所增加的类胡萝卜素的重组生物体，其特征在于与宿主生物体相比，该重组生物体中的选择性氧化酶的基因表达经改变后降低了效力。
23.根据权利要求22的重组生物体，其中借助于选自反义技术，定点诱变，化学诱变等技术改变这种生物体中选择性氧化酶的基因表达。
24.根据权利要求22或23的重组生物体，其中所述生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属。
25.根据权利要求22至24中任一项的重组生物体，其中所述生物体是Phaffia rhodozyma的菌株。
26.根据权利要求22至25中任一项的重组生物体，其中所述生物体是选自DSM13429，13430和13431的菌株。
27.重组DNA序列，该序列编码衍生自能产生类胡萝卜素之生物体的选择性氧化酶。
28.根据权利要求27的重组DNA序列，其中所述生物体属于原生生物界或真菌界，更优选为聚球蓝细菌属，集胞蓝细菌属，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，链孢霉属，红酵母属，布拉霉属或须霉属。
29.根据权利要求27或28的重组DNA序列，其中所述生物体是Phaffiarhodozyma的菌株。
30.根据权利要求27至29中任一项的重组DNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO：2鉴定，或与SEQ ID NO：2的同一性高于55％。
31.根据权利要求27至29中任一项的重组DNA序列，其推定的氨基酸序列由SEQ ID NO：1鉴定，或与SEQ ID NO：1的同一性高于51.5％。
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