TWI235764B - Method of extensive culture of antigen-specific cytotoxic T cells - Google Patents

Description

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技術領域 本發明係關於-種對於醫療領域有用之誘導、維持及擴 大培養細胞傷害性T細胞之方法，該細胞傷害性丁細胞為具 有抗原特異性細胞傷害活性者。 背景技術 生物體主要係藉由免疫反應免受異物侵害，免疫系統係 根據以各式各樣細胞及由其所開始作出之可溶性因子所建 冓而成其中身負執行中心任務者為白血球，特別是淋巴 球、。淋巴球分為B淋巴球（以下稱為B細胞）及了淋巴球（以下 %為丁細胞）2種主要之類型，兩者皆可特異性辨識抗原， 並對其作用以防禦生物體。 τ細胞係可次分類為：協助者τ細胞（以下稱為，其具 有CD ( Cluster Designation) 4標記，主要參與抗體產生之辅 助或各種免疫反應之誘導；細胞傷害性τ細胞[丁。；細胞傷 害性T淋巴球（Cyt〇t〇xic T lymph〇cyte)，亦可稱殺手τ細 胞，以下亦以CTL記載之]，具有CD8標記，其主要顯示細 胞傷害活性。CTL最重要之任務係於執行辨認腫瘤細胞或 病毒感染細胞等，並加以破壞、除去之，其並非如B細胞般 針對抗原產生特異性反應之抗體，而是直接辨識標的細胞 膜表面上所存在之主要組織相容性複合物（mhc :於人類中 亦可稱為人類白血球抗原）類別〗分子所結合之標的細胞由 來之抗原（杬原胜肽）後作用。此時，CTL膜表面之τ細胞接 受器（以下稱為TCR)係特異性辨識前述之抗原胜肽及MHC 類別I分子後，判斷抗原胜肽是否來自自身者，或非來自自 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公复了 1235764 A7 -—_____Β7___ 五、發明説明（2 ) 身者。所判斷之標的細胞非來自自身者，經由CTL特異性 破壞、去除之。 近年來’對於如藥劑治療法或放射線治療法之對病患有 /儿重的肉體負擔之治療法的評價已漸漸改變，而對於病患 肉體負擔較輕之免疫治療法則興趣高漲。其中，將針於以 來自正常免疫機能之人類CTL或來自T細胞為目標之抗原具 有特異性反應之CTL於生物體外（ill Vitr0)誘導後，移入患者 之授叉性免疫法的有效性特別引人注目。例如，用於動物 模型之授叉性免疫反應，係顯示其對於病毒之感染及腫瘤 有效之 /口療法[Greenberg，P· D·著，Advances in Immunology， 1992年發行]，另外，經由對於免疫不全患者投予cTL並未 顯示其毒性下，藉由進行急速且持續的排除細胞巨大性病 毒（cytomegalovirus)之特異性cTL反應之重塑[B1〇〇d ,第78 卷，第1373 - 13 80頁（1991)]等，對於來自先天性、後天性及 醫原性之T細胞免疫不全症患者之使用也備受矚目。 此外對於CTL細胞數之維持及增加方面，從利用動物模型 之研究，推測於人類之授受性免疫療法中之有效細胞數可 知，109〜HT個抗原特異性Τ細胞是必要的[Greenberg，p. d· 著，Advances in Immunology，1992年發行]。亦即，在授受 性免疫療法中，其最大之問題所在可說是如何在短時間内 於生物體外得到如此數量之細胞數。 關於CTL之抗原特異性傷害活性之維持及增強方面，誘導 CTL抗原之特異性反料，-般使用對於作為目標之抗原 反覆刺激之方法，然而，此方法雖然可在—時間增加細胞 73215-931112.doc - 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) ----~—__ 1235764 A7 B7 五、發明説明（3 ) " 數’但最終細胞數仍減少，而無法得到必要之細胞數。對 此目前可行之對策，係冷凍保存於反覆進行以抗原刺激之 初期階段中之細胞，亦或是僅冷凍保存一部份利用選殖所 付之具抗原特異性之CTL株後’當其細胞數或抗原特異性 傷害活性經過長期培養而下降時，將冷凍之細胞融解後再 施以反覆抗原刺激。 雖然已有使用小鼠T細胞長期培養以建立T細胞之方法被 發表[Nature，第294卷，第697〜699頁（1981)]，其係一種分 離•株化T細胞之方法，此方法無法將τ細胞增殖至 109〜1〇10個細胞。其次，美國第5,057,423號專利中亦揭示一 種將咼濃度介白素2 ( IL- 2)大量使用於誘導淋巴因子活性化 殺手（LAK)細胞，可於3〜4日間將細胞數增加i 〇〇倍之方 法。若以通常1個細胞增殖***成2個約需24小時之情形觀 之’該方法所揭示之細胞數係為飛躍成長的細胞數。另 外’亦有I试使用相同尚》農度之IL- 2誘導腫瘤浸潤淋巴球 (TIL)之授受性免疫療法[New Engl· j· Med·，第316卷，第 1310〜1321 頁（ 1986) ; New Engl· J. Med·，第 319 卷，第 1676〜1680 頁（ 1988) ; Blood，第 81 卷，第 2093〜21〇1 頁 (19 9 3)]。然而，鈾者係一種針於抗原之非特異性τ細胞之 取得法’後者則僅為為用於活化之多株淋巴球集團而具有 特異性者。此外，上述方法中為同時促進細胞增殖而使用 高濃度之IL-2，則因以高濃度IL-2處理之τ細胞在非乩-2高 濃度存在下受到特異性抗原刺激時，有可能引起細胞凋零 (apaptosis)之報告[Nature，第 353 卷，第 858〜861 頁 73215-931112.doc - β - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1235764 A7 _— _ B7 五、發明説明（4 ) (1991) ; (Eur· j· Immunol·)，第 23卷，第 1552〜156〇 頁 ( 1992)] ’由此可知由上述方法所得之lak細胞或TIL之有 效性尚有問題存在。 另外，在T細胞增殖因子與]χ-2存在下以低濃 X 1 〇4個/ ml)培養T細胞，經過7日之急速增殖，最終可增殖 達細胞數3〜5 X 1〇5個/ml之飽和濃度。然而，亦有報告指 出，一旦達到該飽和濃度，經常有細胞死亡的情形 [Immunological Rev.，第 54卷，第 81 〜1〇9 頁（1981)]。因 此，藉由LAK細胞、TIL及低密度之τ細胞培養方法無論在 實用面上、有用面上都仍存在問題。 其次，關於抗原特異性之CTL方面，亦有來自同系異種之 細胞巨大性病毒（CMV)特異性CTL於生物體外進行5〜12週 培養予以增殖後’使用對於免疫不全患者靜脈投予之授受 性免疫療法（Riddell et al·，Science，257:238〜240，1992)、 自身CMV感染纖維芽細胞與IL_2 [j Immun〇丨〇gy，第146 卷’第2795〜2804頁（1991)]及抗CD3單株抗體（抗CD3 mAb) 與 IL-2 [J· Imm· Methods，第 128 卷，第 189〜201 頁 ( 1990)]，對於CMV特異性CTL株進行分離及大量培養之方 法被報導。然而，此等方法中亦有大問題存在，亦即，得 到lx 109個/ml之抗原特異性CTL須約3個月，期間因患者之 症狀變化而因應對策取得十分困難。 國際公開第96/0 6929號中揭示；^?4法（1^1^(1以1^1^〇11 method)以作為此等問題點之解決方法。此REM法係使含有 抗原特異性CTL及TH之T細胞初期集團在短時間内增殖 -7- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（5 ) 〜 -- (expand)之方法，亦即，其特徵點為可提供將個別丁細胞株 予以增殖之大量τ細胞，然而仍有下列之問題點存在。rem 法中，其係使用抗CD3抗體、IL_2及藉由放射線照射去除其 增殖性之PBMC (末梢血單核細胞）與EB病毒， Epstein-Barr virus)感染細胞，將抗原特異性CTL數予以辦 殖，然而其無法否定EBV轉形b細胞（£]813細胞）混入τ二 胞之危險性（安全性問題），而有其做為回饋者細胞之大量 PBMC (必要之抗原特異性CTL數之至少約4〇倍之為 必要，無法充分滿足已增殖之（:几抗原特異性細胞傷害性 活性，而使用τ細胞株以外之τ細胞集團予以增殖時，則有τ 細胞抗原特異性之傷害活性將與細胞增殖同時下降等問題 點存在。 ' 亦即，過去的抗原特異性CTL製備法中，對於在短時間内 製備充分量之於治療之使用時具有有效之抗原特異性細胞 傷害活性之CTL的所謂授受性免疫療法中必要不可欠缺之 問題仍處於無法解決之現狀。 本發明之目的係提供一種誘導、維持及擴大培養ctl (cytotoxic T lymphocyte)之方法，其中適合使甩於授 义性免疫法且保持高水準抗原特異性之細胞傷害活性者。 發明之揭示 亦即，本發明係關於： [1] 一種誘導細胞傷害性τ細胞之方法，該τ細胞具有抗原 特異性之細胞傷害活性，其包含在由酸性多糖、酸性募 糖、酸性單糖及彼等之鹽類所組成之群中所選出的至少一 -8- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（6 ) 種化合物作為有效成分之存在下，將具有對細胞傷害性τ細 胞之分化能力之前趨細胞，與抗原呈現細胞作培養之步 驟； [2] 根據前述[1 ]所記載之方法，其中之化合物係由岩藻 聚糖、肝素 '藻酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、果酸、 透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡糖、硫酸化岩藻糖 及彼等之鹽類所組成之群中選出的至少一種者； [3] —種維持細胞傷害性T細胞之方法，該τ細胞具有抗原 特異性之細胞傷害活性，其包含在由酸性多糖、酸性寡 糖、酸性單糖及彼等之鹽類所組成之群中所選出的至少一 種化合物作為有效成分之存在下，持續培養細胞傷害性丁細 胞之步驟； [4] 根據前述[3]所記載之方法，其中之化合物係由岩藻 聚糖、肝素、藻酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、果酸、 透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡糖、硫酸化岩藻糖 及彼等之鹽類所組成之群中選出的至少一種者； [5] —種擴大培養細胞傷害性T細胞之方法，該τ細胞具有 抗原特異性之細胞傷告活性，其包含在由酸性多糖、酸性 寡糖、酸性單糖及彼等之鹽類所組成之群中所選出的至少 一種化合物作為有效成分之存在下，培養細胞傷害性丁細胞 之步驟； [6] 根據七述[5]所C载之方法，前述步驟中，更進一步 在CD3抗體存在下培養細胞傷害性τ細胞； [7] 根據前述[5]或[6]所記載之方法，前述步驟中，其中 73215-931112.doc -9 - 1235764 A7 ----— B7 五、發明説明（7 ) 將細胞傷害性T細胞與回饋者細胞一起培養； [8] 根據前述[7]所記載之方法，其中回饋者細胞係為非 病毒感染細胞； [9] 根據‘述[5]〜[8]所記載之方法，其中之化合物係由 岩澡聚糖、肝素、藻酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B '果 酸、透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡糖、硫酸化岩 藻糖及彼等之鹽類所組成之群中選出的至少一種者； [10] —種細胞傷害性τ細胞之回收方法，其係包含一從經 由刖數[1]〜[9]中任一項所記載之方法所得之細胞傷害性τ 細胞含有培養物中，篩選細胞集團之步驟，其中細胞習團 係回里含有具抗原特異性細胞傷害活性之細胞傷害性τ細胞 者； [11] 一種細胞傷害性τ細胞，其係以前述中任一 貝之方法所製備’具有抗原特異性細胞傷害活性者；及 [12] 種治療劑，其係含有以前述[丨丨]所記載之細胞傷 害性T細胞作為有效成分。 圖式之簡要說明 圖1係表示來自籠目昆布（Kjellmaniella

CraSSlf〇lla )之岩藻聚糖之 DEAE-Cellulofine A- 800 管柱 洗脫圖譜。 實施發明之最佳型態 本發明係藉由由酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖及彼等 之鹽颂:斤組成之群中所選出的至少-種化合物，意外發現 CTL之抗原特異性細胞傷害活性之維持或增強能力（以^亦 73215-931112.doc -10- 1235764 A7

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抗原呈現細胞欲於具有抗原呈現能力者上附加抗原胜 肽，可藉由在其表面予以呈現抗原胜肽的方式製備[參考如 文獻· Bednarek Μ· A·等、J. Immunology 147 p4047-4053 (1991)]。另外，具有抗原呈現能之細胞在具有處理 (process)抗原之能力情況下，藉由於該細胞上附加抗原， 使得抗原得以被送入細胞内，已片段化之抗原係呈現於細 胞表面。此外，將抗原胜肽附加於具有抗原呈現能力之細 胞上之情況，所使用之抗原呈現細胞，可使用符合欲誘導 之CTL之HLA限制性（HLA restriction)之抗原胜肽。 再者，本發明中所使用之抗原並無特別之限制，可舉出 如細菌、病毒等外來性抗原，或腫瘤關連抗原（癌抗原）等 之内在性抗原等。 本發明中，抗原呈現細胞以非增殖性者為佳，可藉由進 行如X光等放射線照射，或以絲裂黴素（mitomycin)等藥劑 處理，以使細胞成為非增殖性。 本發明CTL之誘導方法中所使用之培養基並無特別之限 制，可使用將CTL、其前趨細胞及對於抗原呈現細胞之維 持、生長必要之成分混合製備而成眾所皆知之培養基，如 市售之培養基即可。此類培養基除其原本之構成成分外， 亦可含有適當之蛋白質、細胞激素類或其他成分。本發明 中以含有介白素- 2(IL-2)之培養基最為適合。 作為本發明之有效成分使用之酸性多糖係以來自動物、 來自植物、來自微生物、來自藻類及合成之酸性多糖皆可 使用，另外構酸化多糖類，如核酸亦涵蓋於本發明之酸性 73215-931112.doc -12-

1235764 A7 _— —_ B7 五、發明説明（57^ β " 多糖内。 夕來自動物之酸性多糖，可使用如透明質酸或各種硫酸化 多糖，其中硫酸化多糖可使用硫酸軟骨素、硫酸角質素、 硫酸皮膚素、乙醯肝素硫酸、肝素等。另外，本發明中亦 可使用來自海參、海膽、海星等棘皮動物之硫酸化多糖、 來自鯊魚等魚類軟骨之硫酸化多糖。含有硫酸化多糖之海 > 如JP 4-91027號公報中所記載之海參，可以該公報中所 5己載之方法製備硫酸化多糖。 來自植物之酸性多糖可使用如果酸等。 來自微生物之酸性多糖可使用如透明質酸或血黃素 (xanthane) 〇 來自藻類之酸性多糖可使用來自如褐藻類、紅藻類、綠 澡類、藍藻類之酸性多糖。 來自褐藻之酸性多糖可使用如各種硫酸化多糖，如岩藻 聚糖、硫酸化岩藻半乳聚糖、硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚 糖、葡糖酸酸木岩藻聚糖、馬尾藻聚糖（S a r g a s s a n )、 葡糖酸酸甘露半乳聚糖、木岩藻葡糖醛酸聚糖、子囊葉下 珠聚糖（a s c 〇 r f i 1 an )、葡糖醛酸半乳癌藻聚糖、硫酸化 葡糖醛酸岩藻聚糖等。 此外、作為原料之褐藻類可舉出如籠目昆布 (Kjellmaniella crassifolia)、麻昆布（Laminaria japonica )、薯蕷昆布（Kjellmaniella )、穗扇 (Fucus vesiculosus )、水雲（Nemacystus)、沖繩 水雲（Cladosiphon okamuranus )、德帶菜 73215-931112.doc - 13 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（11 ) (Undaria)、黑海布（Ecklonia kurome)、荒布 (Eisenia)、搗布（Ecklonia)、賴索尼亞古萊仙斯 (Lessonia nigreScence)、亞斯科菲萊姆諾得桑姆 (Ascophyllum n〇dosum)、巨藻（Giant kelp)等之 昆布 目 （Laminariales ) 、 長持 莫 目 (Chordariales)、扇形褐藻目（Fucales)之褐藻。 來自褐藻之硫酸化多糖，可製備如來自籠目昆布之岩藻 聚糖，該岩藻聚糖可從含有葡糖酸酸之岩藻聚糖（稱之為υ· 岩藻聚糖）與不含葡糖醛酸之岩藻聚糖（稱之為？_岩藻聚糖） 中分離出來，本發明之有效成分係以使用個別之岩藻聚糖 而得。另外，本發明中亦使用製備來自籠目昆布之硫酸化 岩藻半乳聚糖（以下稱為G-岩藻聚糖）。 U-岩藻聚糖及F-岩藻聚糖係調製來自籠目昆布之岩藻聚 糖後，利用陰離子交換樹指、界面活性劑等分離之。來自 籠目昆布之U-岩藻聚糖及F-岩藻聚糖之存在比例約為1.2， U-岩藻聚糖中含有岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸 等，其硫酸含量約為20%，F-岩藻聚糖中含有岩藻糖與半 乳糖’其硫酸含量約為50%，兩物質分子量皆約為萬卢 右（第18回糖質論文要旨集，第159頁，1996年）。 將從籠目昆布所製備之岩藻聚糖溶液打入deae

Cellul〇fine A_ 800管柱後，利用含有NaCk緩衝液以梯声, 度法可洗脫分離U-岩藻聚糖及F-岩藻聚糖，其例示如圖1 /辰 即圖1係表示U-岩藻聚糖及F-岩藻聚糖分離之圖， β、， 、 ^ 圓甲可吸 收峰為U-岩藻聚糖，後吸收峰則為F-岩藻聚糖。 73215-93l112.doc - 14 ·

I235764 A7 ^-------B7 五、發明説明（η ) 此=來自紅澡之酸性多糖可使用如硫酸化半乳聚糖、 角叉木膠芙諾蘭（fun〇ran)、瓊脂膠等，另外，來自 紅藻之瓊脂類、瓊脂糖亦可於本發明中使用。 立此外/紅藻類可列舉如石花菜（Gelidiun amansii)、 龍鬚菜（Gracilaria)、普提若庫拉低亞卡匹拉歇亞 (Pteroclavia capillacae)等。 來自綠藻之酸性多糖可使用如鼠李聚糖硫酸，其中綠藻 類3舉如藍度（Ulva)、青海苔（Enteromorpha)、傘 海苔（Acetabularia)、小球藻（Chl〇rella)等。此外 本發明中亦可使用來自藍藻等之藍藻類中所得之酸性多 糖。 本發明中雖可將藻酸、果酸、透明質酸直接當作有效成 分之酸性多糖使用，其更進一步亦可使用如附加硫酸基之 合成酸性多糖。該合成酸性多糖可舉如合成硫酸化多糖， 可使用如纖維素、澱粉、甘露聚糖、木聚糖、藻酸、果 膠、果酸、透明質酸、果聚糖、***聚糖、幾丁質、支 鍵;屏又粉、木質型葡聚糖（x y 1 〇 g丨u c a n )、葡聚糖、澱粉等 硫酸化物。更進一步亦可使用如核糖呋喃硫酸 (rib 〇 fur an an sulfate )、木糖呋喃硫酸、蘑菇多糖硫 酸（lentinan sulfate )、卡德蘭硫酸（curdlan s u 1 fa t e )、吡喃甘露糖硫酸、硫酸化澱粉、硫酸化果酸等 之合成硫酸化多糖，或具有棕櫚基之核糖呋喃硫酸等合成 硫酸化烷基多糖。此外，藉由硫酸化多糠更進一步硫酸 化’可製備高硫酸化硫酸化多糖，亦可成為本發明中所使 -15- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 五 、發明説明（ 13 -16- 用之合成酸性多糖。本發 成酸性多糖而使用之。再者^周知之方法製備此等合 聚糖护_ 再者，本發明中亦可使用事售之葡 性多糖之鹽類。 f $外’亦可使用此等之合成酸 或多糖之製備若以周知之方法製備即可，純化物 ^-夂=夕糖含有物等亦可，其中酸性多糖含有以如來自 屌粗：馱f生夕糖部分者為佳’其藻類係以前述之藻類作為 原科者最適於使用。 此外，分解此等酸性多糖所得之低分子化酸性多糖，若 t可維Μ增強細胞傷害性了細胞之抗原特異性之細胞傷 。活性旎力者，即可作為本發明之酸性.多糖使用。 其次，本發明中可使用之酸性寡糖、酸性單糖，若具有 可=持或增強細胞傷害性τ細胞之抗原特異性之細胞傷害活 性能力之酸性募糖、酸性單糖者皆可，無特定之限制，可 使用前述之酸性多糖分解物、合成酸性寡糖及合成酸性單 糖。其中酸性寡糖、酸性單糖以硫酸化寡糖及硫酸化單糖 為例示，此等硫酸化募糖、硫酸化單糖分別以其相對之寡 糖、單糖作為原料，可使用周知之方法硫酸化製備之。再 者，亦可使用其鹽類。另外，本發明中之酸性單糖以硫酸 化岩藻聚糖、硫酸化葡糖、、硫酸化半乳糖、硫酸化木質 糖、硫酸化2 -去氧葡糖、硫酸化甘露糖、硫酸化塔羅糖 (sulfated talose)等之硫酸化單糖為例示。此等硫酸化 單糖亦可以合成法合成之，或分解從天然物中所得之硫酸 化多糖，亦可從該分解物中純化製備之。本發明亦可使用 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂 1235764

乂八他$用方法製備其鹽類。此外，與前述之硫酸化多糖 相同的，可使用進-步硫酸化此等硫酸化募糖及硫酸化單 糖所得之高硫酸化硫酸化寡糖及高硫酸化硫酸化單糖。另 外，本發明中之寡糖之定義係以2-10個範圍之單糖相連而 成糖化s物，夕糖則為i i個以上之單糖相連而成者。 〃他本^明之具有可維持或增強細胞傷害性了細胞之抗原 特異11之細胞傷害活性能力之酸性多糖分解物，可以使用 酵素！f方法，化學方法，物理方法等之周知之方法製備 之，師選具有T維持或增強細胞傷害性τ細胞之抗原特異性 之細胞傷害活性能力之分解物。 再者77解物係以作為分解對象之酸性多糖得之，分解 酸性多糖所得之分子量約1G萬〜糊者為佳，其 之範圍者則更佳。 、本發明中所使用之酸性多糖分解物較佳之製備方法為酸 /刀解法’制酸分解該酸性多糖可製備具有可維持或增強 細胞傷害性T細胞之抗原特異性之細胞傷害活性能力之分解 物。 本發明中使用之酸性多糖之酸性分解條件，若為可生 ^可維持或增強細胞傷害性τ細胞之抗原特異性之細胞: :活性能力分解物（以下亦稱為本發明之分解物）之條, 者’則無特別之限制。 藉由以酸水溶液等溶解或懸浮酸性多糖以進行酸分解反 應’可生成本發明之分解物。再者，#由反應時加埶可縮 短本發明之分解物生成所需之必要時間。 溶解或懸浮酸性多之酸種類無特別之限定，可使用鹽

裝 η

線 73215-931112.doc

1235764 A7 B7 五、發明説明（15 ) 酸、硫酸、硝酸等無機酸，檸檬酸、蟻酸、醋酸、乳酸、 抗壞血酸等之有機酸，或陽離子交換樹指、陽離子交換纖 維、陽離子交換膜等固體酸。 酸濃度雖亦無特定之限制，然以0.0001〜5當量為佳， 0. 01〜1當量左右之濃度更佳適合使用，此外，反應溫度亦 無特定之限制，以0〜200°C為佳，其中20〜130°C之設定為更 佳。 另外，反應時間雖亦無特別之限制，然設定以數秒-數曰 為佳。酸之種類與濃度、反應溫度及反應時間，係根據本 發明中所使用之分解物生成量、分解物之聚合度適當選擇 即可。例如，岩藻聚糖分解物之製造時，使用檸檬酸、乳 酸、蘋果酸等有機酸，酸濃度為數10 mM〜數Μ，加熱溫度 為50〜110°C，較佳為70〜95°C，加熱時間為數分〜24小時之 範圍中適當選擇而為之，即可製備出本發明之分解物。岩 藻聚糖之酸分解物以來自籠目昆布之岩藻聚糖之酸分解物 為例示。 本發明之分解物係以細胞傷害性T細胞之抗原特異性之細 胞傷害活性之維持或增強作用為指標進一步區分，例如酸 分解物可以凝膠過濾法、分子量區分膜之區分法區分分子 量。 凝膠過濾法之例子中，使用Cellulofine GCL-300可製備分 子量超過25000、分子量25000〜10000、分子量10000〜5000、分 子量5000以下等之任意分子量部分，使用CellulofineGCL-25 可將分子量5000以下之部分製備為分子量5000〜3000、分子 量3000〜2000、分子量2000〜1000、分子量1000〜500、分子量 500以下等之任意分子量部分。 73215-931112.doc -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（16 ) 另外，亦可使用超濾膜工業化進行分子量區分。例如使 用雙細胞公司所製造之FE10-FUSO382可進行分子量30000以 下之部分，使用FE-FUS-T653可製備分子量6000以下之部 分，更進一步使用微毫過濾膜則可得分子量500以下之部 分，組合使用此等凝膠過濾法、分子量區分法則可製備任 意之分子量部分。 本發明所能使用之酸性多糖分解物以岩藻聚糖分解物為 例，如式（I)所表示之化合物、式（II)所表示之化合物、式 (III)所表示之化合物為例示，此等化合物係以國際公開第 99/41288號公報、國際公開96/34004號公報、國際公開 00/50464號公報所記載之岩藻聚糖分解物為例示。另外，以 式（I)所表示之化合物作為基本骨架，含有重複該骨架之 岩藻聚糖及寡糖、以式（Π )所表示之化合物作為基本骨 架，含有重複該骨架之岩藻聚糖及寡糖、或以式（ΠΙ )所表 示之化合物作為基本骨架，含有重複該骨架之岩藻聚糖及 寡糖，分別可作為本發明之酸性多糖及酸性募糖使用。此 外，本發明所能使用之酸性多糖分解物，以岩藻聚糖分解 物為例，係以國際公開第9 9 / 4 1 2 8 8號公報、國際公開 9 ό / 3 4 0 0 4號公報、國際公開0 Θ / 5 0 4 ό 4號公報所記載之岩 藻聚糖分解物為例示。 73215-931112.doc - 1 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7

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(式中，R係為OH或〇S〇3H)

式（I)所表示之化合物係前述之F_岩藻聚糖以阿魯若摩那 4 sp. SN- 1009 (Alteromonas sp. SN- 1 0 09 ; (CCRC 〇070)所產生之内切型硫酸化多糖分解酵素（F_岩藻聚糖 特異性分解物）處理，可從其分解物中純化而得，關於該化 合物中之硫酸基含量、部位，則從其分解物中純化任意者 可知。另外該分解物中亦含有式（1)所表示之化合物之聚合 物’可根據不同目的分離、純化之。 式（Π)所表示之化合物係前述之U-岩藻聚糖以黃素菌sp. SA'0〇82 (Flavobacterium sp· SA- 00 8 2 SA-00 82 ; CCRC 910069)所產生之内切型硫酸化多糖分解酵素（u_岩 藻聚糖特異性分解物）處理，可從其分解物中純化而得，關 於j化合物中之硫酸基含量、部位，則從其分解物中純化 任意者可知。另外該分解物中亦含有式（π)所表示之化合物 之承a物’可根據不同目的分離、純化之。 另外’式（I)所表示之化合物則以後面即將提到之式（ιν) 所表示之化合物為例。此外’式（π)所表示之化合物則以後 73215-931112.doc 21 本紙張尺度適财關家標準而規格(21G χ 297公幻 1235764 A7 B7 五、發明説明（彳9 ) 面即將提到之式（VI)所表示之化合物為例。而式（III)所表 示之化合物則以後面即將提到之式（V)所表示之化合物為 例。 前述之G-岩藻聚糖之純化可利用··來自籠目昆布之岩藻 聚糖以阿魯若摩那斯 sp. SN_ 1009 (Alteromonas sp. SN-1009; CCRC 910070)所產生之F-岩藻聚糖分解酵素及黃素菌sp. SA-0082 (Flavobacterium sp. SA-0082; CCRC 910069)所產生之 U-岩藻聚糖 分解酵素分解、去除分解物而得之。 黃素菌sp. SA-0082 (CCRC 910069)亦可產生會特異性分 解G-岩藻聚糖之内切型硫酸化多糖分解酵素（G-岩藻聚糖分 解酵素），藉由將該G-岩藻聚糖分解酵素置於G-岩藻聚糖中 予以反應可調製該G-岩藻聚糖分解物，從該分解物中可因 應目的純化分解物。其中式（III)所表示之化合物即為一 例。關於該化合物中硫酸基之含量、部位可由其分解物中 純化任意者。另外，該分解物中，係含有以式（m)所表示 之化合物為骨架之多量體，其可依目的進行分離、純化。 另外’關於上述各酵素係記載於國際公開第97/26896號 公報’或國際公開第〇〇/50464號公報中。 此外’來自籠目昆布之岩藻聚糖在有機酸存在下，經由 加熱處理可得葡糖醛酸與甘露糖之聚合體，此聚合體亦可 作為本發明之具有細胞傷害性T細胞之抗原特異性細胞傷害 活性之維持或增強能力之酸性多糖使用。再者，經由調整 加熱條件、加熱時間，可製備出任意聚合度之聚合體。 以上本發明中所使用之有效成分，並不限定為具有CTL抗 原特異性之細胞傷害維持或增強作用者，各種酸性多糖、 73215-931112.doc 22 _ 本紙張尺度適用中_家檩準(CNS) Μ規格_ χ 297公董） 1235764

酸性募糖、酸性單糖及/或此等之鹽類皆可使用，其中較佳 者可使用由石澡聚糖、肝素、藻酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟 骨素B、果酸、透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡糖、 硫酸化岩藻糖及彼等之鹽類所組成之群組中選出的至少工 種。另外’本發明中可使用如葡聚糖硫酸鈉、透明質酸、 肝素等適合作為醫藥品使用之酸性多糖。葡聚糖硫酸鈉係 利用 Leuconostoc mesenter〇ides van Tieghem之蔗糖發酵所 產生之葡聚糖之部份分解物硫酸化而得之硫酸化酯之鈉 鹽。 、. 本發明中所使用之酸性多糖、酸性募糖、酸性單糖限定 於具有C TL抗原特異性之細胞傷害維持或增強作用者即 可，可以如鹼金屬鹽、鹼土族金屬鹽、有機鹼等鹽類為例 示。其中可舉如鈉、鉀、約、鎂、銨或乙二醇胺、乙二胺 等鹽類。此等鹽類可由存在於如酸性多糖、酸性募糖、酸 性單糖之酸性基、如存在於岩藻聚糖等之硫酸基或羧基， 以周知之方法變換其鹽得之。其鹽以藥理學上可容許者為 佳。 本發明中作為有效成分使用之酸性多糖、酸性募糖、酸 性單糖及/或此等之鹽類可單獨或2種以上混合使用。再 者，該有效成分之衍生物，如脂肪酸衍生物等之使用，若 可顯示CTL抗原特異性之細胞傷害維持或增強能力者則無 特別之限制。 本發明中具有可分化為CTL之能力之前趨細胞與抗原呈現 細胞一起培養（共培養）後，誘導CTL用之一般性條件係 73215-931112.doc - 23 -

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遵照周知條件[參考如文獻：Bednarek Μ· A.等，j

Immunology 147 p4047_4053 ( 1991)]即可。對於共培養條 件亚無特別之限定，可使用一般之細胞培養中所使用之^ 件’例如可使用37°C，5% C〇2等條件培養。此共培養雖通 常以2-15日實施之，亦可在其間更換新製備之抗原呈現细 胞後進行再刺激。3外，亦可以適當之時間間隔更換新鮮 之培養基。 在進行共培養之培養基中，本發明之有效成分之含量若 可得到預期效果則無特別之限定，以〇 〇〇1〜1〇〇〇 (1^/1111為 佳，〇·〇1〜100 pg/ml則更佳。此外，有效成分以在培養基中 溶解後存在者為佳。 如此誘導之CTL係具有特異性辨識預期抗體之能力，如藉 由其細胞傷害活性，特異性破壞具有該抗原之細胞。此 CTL之細胞傷害活性可以周知的方法評估之。例如可測定 藉由抗原呈現細胞所呈現之胜肽與以放射線物質、螢光物 質等標識之標的細胞相對之傷害性、放射能之吸收之CTL 增殖之抗原特異性增加或由CTL或標的細胞脫離之GM-CSF、INF- τ等之細胞激素量而進行評估。（參照後述之實 施例1 - 1 - ( 3))。此外，藉由以螢光素等標識之抗原胜肽或 複合體之使用亦可直接確認之。在此情況下，使Ctl和已 與CTL抗原特異性抗體結合之第1螢光標記接觸後，再和已 與弟2螢光標記結合之抗原胜肤-MHC複合體接觸，可進行 藉由 FACS (fluorescence-activated cell sorting)分析此雙重 標識細胞之存在。 -24- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7

J用：發明之方法所誘導之CTL，其優越之性 之細胞即使經過長時間維持或予以增殖，仍不會有如= 所硯察之抗原特異性之細胞傷害活性顯著下降之情开 此，利用將誘導後之CTL純種系化，可維持已安定化之且 有細胞傷害活性之淋巴#，例如藉由對於已誘導咖㈠ 抗原、各種細胞激素、抗CD3抗體刺激可使其增殖、= 培養。對於此種CTL·之維持、擴大捭|" ^ , 忙穴埒蚕，適合後面會提 本电明之細胞傷害性T細胞之維持方法、擴大培養方 用。 如此之本發明效果’在利用適當之方法維持或擴 由本發明之方法所誘導之CTL後，可藉由上述所記載： 法測定、確認其細胞傷害活性。 (2)本發明之細胞傷害性τ細胞之維持方法 本發明之細胞傷害性T細胞之維持方法，係維持CTI^^ 原來的抗原特異性之細胞傷害活性之方法，該方法係以於 含有本發明之有效成分之培養基中繼續培養CTL為一大特 ，，因而可持續性的維持含有該細胞之抗原特異性之細 傷害活性。 對於可適用於上述方法之CTLii無特別之限制，可以本發 明之方法維持利用周知之方法所得之CTL抗原特異性之細 胞傷害活性。再者，亦適合使用於根據上述（1)中所記載之 本發明之細胞傷害性τ細胞之誘導方法所得之CTL的維持。 本發明中CTL之繼續培養的一般性條件，依周知之條件 [例如參照文獻：Carter J.等，Immunol〇gy 1986 _ 57(1) 73215-931112.doc - 25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ' ------ 1235764 A7 B7 五、發明説明（23 ) P123- 129]即可。本發明之細胞傷害性τ細胞所使用之培養 基並無特別之限定，例如可使用上述CTL之誘導方法中所 使用之培養基。 本舍明之方法係於培養基中添加上述有效成分而實施。 進行k養之培養基中，本發明之有效成分之含量若可得到 預期之效果者則無特別之限制，以〇 〇〇1〜1〇〇〇 為佳， 〇·〇1〜100 pg/ml則更佳。此外，有效成分以在培養基中溶解 後存在者為佳。另外，前述之有效成分，可使用由岩藻聚 糖^肝素、藻酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、果酸、透 月貝酉夂、石澡聚糖分解物、硫酸化葡糖、硫酸化岩藻糖及 彼等之鹽類所組成之群組中選出的至少丨種。其中可更進一 步於培養基中添加預期細胞激素或其他周知成分，對於本 發明而言，適合使用含有1L-2之培養基。對於培養條件並 热特別之限定，可使用一般之細胞培養中所使用之條件， 例何使用3rc，5%c〇2等條件培養，此外，亦可以 之時間間隔更換新鮮培養基。 、田 =述藉由含有本發明之培養基巾_培養ctl 特異性之細胞傷害活性下降因而可維持CTL。如此所得ς ::之效果’可藉由上述⑴所記載之方法測定、確認利用 發明之方法所維持之#CTL之細胞傷害活性。 该方法所維持之CTL可以周知之擴大培養 增殖之CTL亦可保持特異性之細胞傷害活性。心;L之： 大培養方法，係適合使用後面會提到 大气 培養方法。 # a <CTL擴大 26- 73215-931112.doc 本紙張尺度通财S Η家標準(CNS) A4規格(21GX297公爱_) 1235764 A7 B7 五、發明説明（24 ) (3)本發明之細胞傷害性T細胞之擴大培養方法 藉由細胞傷害性T細胞於適當條件下進行培養，可使其細 胞數增加（擴大培養）。以往開發出不少CTL的擴大培養方 法，亦已知由Riddell等所開發，可在短時間内使CTL增殖效 率佳之REM法，該方法係藉由X光照射，在IL-2、抗CD3單 株抗體之存在下，使用作為非增殖性之PBMC (做為回饋者 細胞使用）及以EBV轉形之B細胞（EBV-B細胞）培養CTL之方 法。然而，該方法之問題點在無法否定其具有EBV- B細胞 混入T細胞之危險性。 本發明細胞傷害性T細胞之擴大培養方法係可在保有原來 抗原特異性之細胞傷害活性下，使該細胞數增加之方法， 該方法之特徵為於本發明之前述有效成分存在下培育（培養） 細胞。 本發明之方法中對可適用之CTL並無限定，可適合使用於 以周知方法所得之CTL，或藉由上述（1)中所記載之本發明 CTL之誘導方法所得之CTL，或藉由上述（2)中所記載之本 發明CTL之維持方法所得之CTL之擴大培養者皆可。另外， 本發明中，CTL之擴大培養的一般性條件係依周知之條件 [例如參照文獻：Uberi J· P.等，Clin· Immunol· Immunophathol· 1994 Mar. 70(3) ρ234-240]即可。 本發明之細胞傷害性Τ細胞之擴大培養方法中，加上前述 有效成分，於更進一步含有抗CD3抗體（較佳為CD3單株抗 體）之培養基中培養CTL較為理想。再者，CTL與適當之回 饋者細胞共培養則更為適合。 73215-931112.doc - 27 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1235764 A7

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1235764 A7 B7 五、發明説明（27 ) 包含CTL誘導方法中所使用之培養基、CTL維持方法中所使 用之培養基或CTL擴大培養方法中所使用之培養基之其他 任意之成分、CTL或回饋者細胞等之培養、生長所必要之 成分及適當之蛋白質、介白素類（以IL-2為佳）、預期之其 他成分所組成。此外，此等含CTL培養劑之培養基可當作 CTL誘導用、維持用或擴大培養用培養基（以下亦稱此等為 CTL用培養基）使用。此等培養基含有任意細胞培養所需之 基本成分與上述之化合物之其他分別對於不同用途之適當 成分。另外，前述CTL培養劑及CTL用培養基可以周知之方 法製造。 藉由使用上述之本發明之CTL之誘導方法、維持方法及擴 大培養方法所得之CTL含有培養物中，通常亦混入協助者T 細胞等CTL以外之細胞。本發明中，從該培養物經離心分 離等回收該培養物中之細胞，可作為本發明之方法所得之 CTL，如可原狀使用之。 再者，更進一步從該培養物中分離富含具有抗原特異性 之細胞傷害活性之CTL的細胞集團（或培養物），可作為以本 發明之方法所得之CTL使用。亦即，本發明中，藉由施予 前述CTL含有培養物之CTL以外的細胞（如協助者T細胞）與 CTL之分離操作，可製備有關於濃縮抗原特異性之細胞傷 害活性之細胞集團以使用。藉由分離如此之前述細胞集 團，所得之抗原特異性之細胞傷害活性之濃縮係過去的 REM法所不及之處。因此，本發明之一實施態樣，係提供 一種細胞傷害性T細胞之回收方法，其包含從以CTL之誘導 73215-931112.doc - 30 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（28 ) 方法、維持方法及擴大培養方法中任一項所得之CTL含有 培養物中篩選富含具有抗原特異性之細胞傷害活性之CTL 的細胞集團之步驟。另外，本發明之CTL回收方法，其一 為所謂篩選具高抗原特異性之細胞傷害活性之CTL細胞集 團所得之方法，廣義而言，亦所謂產生或獲得該CTL細胞 集團之方法。關於該細胞集團之篩選方法並無特別之限 定，例如從利用上述之CTL之誘導方法、維持方法及擴大 培養方法所得之CTL含有培養物中，篩選針對CTL細胞表面 上所表現之細胞表面抗原的抗體，如僅筛選利用與抗CD8 抗體結合之磁性珠或管柱以回收CTL，可得富含CTL之細胞 集團。利用流量血球計數器（flow cytometer)亦可篩選式分 離CTL。此外，從利用本發明之CTL之誘導方法、維持方法 及擴大培養方法所得之CTL含有培養物中，經去除CTL以外 之細胞可得富含CTL之細胞集團。例如為從該培養物中去 除協助者T細胞，利用與如抗CD3抗體、CD4之針對抗體協 助者T細胞表面上所表現之細胞表面抗原之抗體結合之磁性 珠或管柱篩選性回收協助者T細胞以除去之，可得富含CTL 之細胞集團。另外，對於協助者T細胞之除去亦可利用流量 血球計數器。如此所得之富含CTL之細胞集團與從CTL含有 培養物中非選擇性的回收細胞集團比較，其具有較強之細 胞傷害活性，利用本發明之方法所得之CTL係更適合使 用。再者，本發明中富含CTL之細胞集團，包含僅有CTL之 細胞集團。 再者，使用藉由本發明CTL之維持方法及擴大培養方法所 73215-931112.doc - 31 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7

養!?進步進行藉由本發明ctl之維持及擴大捭 :之：如自經由本發明之擴大培養方法所得之ctl:、心 發明…：美： 11由使用該部分進行本方 今又月之擴大培養方法，亦可一 一 丌了進一步獲侍細胞傷害活性高之 卜1^由本發明之擴大培養方法所得之CTL，利用 务明之維持方法亦可維持其細胞傷害活性。 方ΐΙΠΐ供利用上述本發明ctl之誘導方法、維持 方法及擴大培養方法所得之CT卜其CTL皆具有抗原特異性 之細胞傷告活性，擁有即使經過長時間繼續培養或擴大培 養，其細胞傷害活性之下降僅少量之性質。再者，本發； 亦提供含有該CTL作為有效成分mm療劑特別 適合於授受性免疫療法中使用。在授受性免疫療法中，以 如l由對靜脈之投予方式，對病患投予具有適合於患者治 療之抗原特異性細胞傷害活性之CTL。該治療劑係依製藥 領域中週知之方法製備之，例如以藉由本發明之方法製備 之CTL為有效成分，與例如適合於週知之非經口投予之有 機或無機載體、賦形劑、安定劑等混合以製備之。作為該 CTL，特別是經由本發明之CTL擴大培養方法，不使用ebv 感柒細胞所製備之CTL係適合於此目的。此外，治療劑中 之CTL含量、治療劑之投予量、該治療劑相關之各條件可 依週知之授受性免疫療法適當決定之。 以下列舉實施例更加具體說明本發明，但本發明不限定 於此等所記載者。此外，實施例中之％無特別指出者即表 示重量％。 73215-931112.doc - 32 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7

五、發明説明（30 製造例1 將籠目昆布充分乾燥後，以自由粉碎機（奈良機械製作所 製）將20公斤之乾燥物粉碎，以9〇0公升自來水溶解入3公斤 氯化鈉二水合物（日本曹達公司製）後，與2〇公斤之蘢目昆 布粉碎物混合，以水蒸氣吹入方式，在4〇分鐘内將液溫由 12°C昇至90°C，接著於搖晃下以90〜95°C保溫1小時後冷卻 之，可得1100公升之冷卻物。在使用固液分離裝置（衛斯特 法力爾分離器公司製CNA型）進行冷卻物之固液分離，製備 約900公升之固液分離上清液。36〇公升之固液分離上清液 以巨細胞公司製造之FE10-FC-FUS0382 (區分分子量3萬）濃 縮至20公升，接下來加入2〇公升自來水後，再濃縮至2〇公 升，如此反覆操作5次，進行脫鹽處理製備出來自籠目昆布 之萃取液25公升。將該溶液1公升冷凍乾燥可得蘢目昆布由 來之岩藻聚糖乾燥物13公克。 製造例2 取7克製造例1所記載之岩藻聚糖乾燥物，溶解於含有5〇 mM NaCl與10%乙醇之700 ml，20 mM1^ σ坐鹽酸緩衝液（pH 8· 0)中，離心去除不溶物。DEaE- Cellulofine A- 800管柱 (0 11 · 4 cmx 48 cm)(生化學工業公司製）以相同緩衝液平衡 之，將離心上清加入管柱後，以相同緩衝液沖提，利用由 50 mM至1.95 M NaCl之濃度梯度予以洗脫（1質分（fraction) 為250 ml)。以苯酚硫酸法及咔唑硫酸法求出總糖量及糖醛 酸含量，洗脫依序可得43〜49之質分、50〜55之質分、56〜67 之質分之各部分。接著，此等部份以電透析脫鹽後冷凍乾 -33- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（31 ) 燥，分別自43-49之質分製備I部分（340 mg)、50〜55之質分 製備II部分（ 870 mg)、56- 67之質分製備III部分（2.64 g)。圖 1中所表示為籠目昆布由來之岩藻聚糖在DEAE- Cellulofine A- 800管柱之洗脫圖譜。其中縱軸所表示者為咔唑硫酸法之 5 3 0 nm吸光度（圖中實心圓點）、苯盼硫酸法之48 0 nm吸光 度（圖中空心圓點）及導電度（mS/cm :圖中方塊點），橫軸所 表示者為質分之號碼，圖中前吸收峰為U-岩藻聚糖，後吸 收峰為F-岩藻聚糖。 製造例3 (1)將阿魯若摩那斯sp. SN- 1009 (CCRC 910070)接種於2 公升三角瓶，内含分注滅菌之600 ml，由pH 8.2之含有 0.25%葡糖、1.0%蛋白腺、0.05%酵母抽取物之人工海水 (J- Marine Lab oratory公司製）所組成之培養基（120 °C、20分 鐘），以25 °C，26小時培養作為種培養液。將由pH 8.0之含 有1.0%蛋白腺、0.02%酵母抽取物、0.2%後述實施例2-(2) 所記載之硫酸化多糖及0. 01%消泡劑（信越化學工業公司製 KM70)之人工海水所組成之培養基20公升，放入可容納30 公升之發酵瓶以120°C滅菌20分鐘。冷卻後接種上述種培養 液600 ml，以24°C，24小時，每分鐘10公升之通氣量與每分 鐘250轉之搖晃速度之條件培養之。培養終了後，離心培養 液可得菌體及培養上清液，所得之培養上清液以裝有排除 分子量1萬之中空纖維的超過濾機濃縮後，以85%之飽和硫 酸銨鹽析之，所生成之沉澱以離心收集，於含十分之一濃 度之人工海水之20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.2)中充分透 73215-931112.doc - 34 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 _____ B7 五、發明説明（32 ) 析’製備600 ml之選擇性作用於F-岩藻聚糖之F-岩藻聚糖 分解酵素液。 (2) 2公斤乾燥之籠目昆布於裝載直徑1 mjn篩網之碎粉機 (增幸產業公司製）中粉碎，將所得之昆布薄片懸浮於2〇公 升之80%乙醇中，以25。(：搖晃3小時，以濾紙過濾後，充分 清洗殘渣。將所得之殘渣懸浮於含有95它加溫之4〇公升的 50 mM NaCl之20 mM、pH 6· 5磷酸鈉緩衝液中，不時搖晃 同時以95°C 2小時處理以萃取硫酸化多糖。 過濾萃取物中之懸浮物以製備濾液後，過濾殘渣以35公 升之100 mM NaCl清洗，可得濾液。 將兩濾液予以混合後，降溫至3〇度。c，添加3〇〇〇u之藻酸 分解腾（長瀨生化學工業公司製）後，加入4公升乙醇以25它 搖晃2小時。再進行離心，所得之上清液以備有排除分子量 10萬之中空纖維的超過濾機濃縮至4公升後，再以含丨之 乙醇的100 mM NaCl持續過濾至有色性物質消失。 。以離心去除非過濾液中所生之沉澱，將其上清液降溫至5 。(：，以0.5 N鹽酸將PH直調至2· 0後，以離心去除所生成之 蛋白質等之沉澱，所得之上清液迅速Hi N氫氧化納調整pH 值至8.0。 其次，以裝有排除分子量10萬之中空纖維的超過渡機進 行超過濾，於pH 8.0之20 mM NaCl中完全置換溶劑後，再 度調整PH值至8.0,離心後進行冷;東乾燥可製備約％克之硫 酸化多糖。 (3) 將2公斤乾燥之籠目昆布於裝載直私 取執Hi mm篩網之碎粉 73215-931112.doc - 35 _

1235764 A7 ___ _B7 五、發明説明（33 )

機（增幸產業公司製）中粉碎，將所得之昆布薄片懸浮於2〇 公升之80%乙醇中，以25°C搖晃3小時，以濾紙過濾後，充 分清洗殘邊。將所得之殘渣懸浮於含有3〇 ml之上述製造例 3-(1)所製備之F-岩藻聚糖分解酵素、1〇%乙醇、1〇〇 mM

NaCl、50 mM CaCl2及50 mM咪唑之20公升緩衝液（pn 8.2) 中’以25°C搖晃48小時。該懸浮液以網目直徑32 μ m之不繡 鋼金屬網過遽，殘渣以含50 mM之CaCl2i1〇%乙醇清洗。 更進一步將該殘渣懸浮於10公升含5〇 mM CaCl2之10%乙醇 中’經3小時搖晃後以不鏽鋼金屬網過濾、清洗。更進一步 將该殘漬於相同條件下懸浮後，經丨6個小時搖晃，再以直 徑32 μ m之不鏽鋼金屬網過濾、清洗之。 收集如此所得之濾液及洗淨液，以裝有排除分子量3〇〇〇 之中空識維的超過濾機進行超過濾以分離過濾液及非過濾 液。 此過濾液以旋轉蒸發機濃縮至約3公升後，離心可得上清 液。所得之上清液以裝有排除分子量3〇〇之膜的電透析器脫 鹽’於此溶液中添加醋酸鈣使其達〇· 1 Μ，以離心去除所生 成之沉殿。將此上清液加於已事先以5〇 mM醋酸鈣平衡之 DEAE- Cellulofine (樹脂量4公升），以50 mM醋酸鈣及50 mM氯化鈉充分清洗後，以5〇' 〜8〇〇 mM之氯化鈉之梯度 變化予以洗脫。此時之收集量以1管5〇〇 ml進行。分取之部 刀以乙酉夂纖維素酉旨膜電泳法[Analytical Bi〇chenistry、第37 卷’第197-202頁（ 1970)]分析時，以氯化鈉濃度約0.4 Μ所 洗脫之硫酸化多糖（質分63附近）皆相同。 73215-931112.doc β 36 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（34 ) 因此，首先將質分編號63之液體濃縮成150 ml後，添加氯 化鈉使得濃度成為4 Μ後，加入已事先以4 Μ氯化鈉平衡之 苯紛Cellulofine管柱（樹脂量200 ml)(生化學工業公司製）， 再以4M氯化鈉充分清洗。收集非吸附性之硫酸化糖部分， 以裝有排除分子量300之膜的電透析器脫鹽，可得脫鹽液 505 m卜 取40 ml所得之脫鹽液，加入以含10%乙醇之0. 2 Μ氯化鈉 平衡之Celluloflne GCL-90管柱（4.1 cmx87 cm)進行凝膠過 濾，收集係以每質分為9. 2 ml進行之。 針對所有質分，以苯盼硫酸法[Analytical Chemistry，第 28卷，第350頁（ 1956)]進行總糖量之分析。 其結果為：硫酸化糖係因形成單一吸收峰，收集其吸收 峰之中央部分（質分編號63-70)，以裝有排除分子量300之膜 的電透析器脫鹽後，冷凍乾燥可得112 mg之下述式（IV)所表 示之化合物的乾燥物。以下將該化合物稱為7-12SFd-F。 73215-931112.doc ~ 37 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（35 )

(4)於製造例2所配製之III部分（F-岩藻聚糖）之2. 5%水溶 液 80 ml 中，添力口 16 ml之 1M Tris-HCl緩衝液（pH 7· 6)、16 ml之1M CaCl2水溶液、24 ml之4M NaCl水溶液、8 ml之實 施例3-(1)所得之F-岩藻聚糖分解酵素液、176 ml之蒸餾水 後，於30°C加熱3小時。此酵素處理之F-岩藻聚糖溶液以旋 轉蒸發機濃縮至F-岩藻聚糖之最終濃度為2%，再置於蒸餾 水中進行透析操作以配製2%之酵素處理F-岩藻聚糖水溶 液。以HPLC分析此樣品（管柱：SB802· 5，管柱溫度：35 °C，移動相：50 mM NaCl，流速：0. 5 ml/min，檢測：RI ATT= 8)，其結果顯示樣品中之約40%為式（IV)所記載之7-12SFd-F ° 製造例4 (1)將2公斤之乾燥之籠目昆布以裝有孔徑1 mm篩網之碎 粉機粉碎，於20公升之80%乙醇中，以25 °C攪拌3小時後過 -38- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（36 ) 濾、清洗之。將所得之殘渣懸浮於含有50 mM氯化鈣、100 mM氯化鈉、10%之乙醇及1U之製造例3-(1)所配製之阿魯 若摩那斯sp. SN- 1009 (CCRC 910070) F-岩藻聚糖分解酵 素之30 mM，20公升咪唑鹽酸緩衝液（pH 8.2)中，以25°C攪 拌2日，再以孔徑32 μ m之不鏽鋼金屬網進行過濾、清洗。 將所得之殘渣懸浮於含有100 mM之氯化鈉、10%乙醇及4g 藻酸分解臃（長瀨生化學工業製）之40公升磷酸鈉緩衝液（pH 6. 6)中，以25°C攪拌4曰後，離心可得上清液。所得之上清 液中所含藻酸之低分子化合物以裝有排除分子量10萬之中 空纖維的超過濾機進行超過濾濃縮為2公升後，以含10%乙 醇之100 mM氯化納進行溶液交換。於此溶液中添加等量之 400 mM醋酸鈣攪拌後，離心所得上清液進行冰浴，同時以1 N鹽酸調整為pH 2。以離心去除所生成之沉澱，所得之上清 液以1 N氫氧化鈉調整為pH 8.0。此溶液以超過濾濃縮至1 公升後，以100 mM氯化鈉進行溶液交換。以離心去除此時 所生成之沉殿。為去除所得之上清液中之疏水性物質，於 上清液中加入氯化鈉使其濃度成為1 Μ，加入以1 Μ氣化鈉 平衡之3公升苯酚Cellulofine管柱（生化學工業公司製），收 集未吸附性之部分，以超過濾機濃縮此部份後，以20 mM之 氯化鈉溶液進行交換後冷；東乾燥，冷凍乾燥物之重量為 29. 3 g。 (2) 15公斤上述之冷凍乾燥物以400 mM氯化鈉及國際公 開第97/26896號公報記載之黃素菌sp. SA- 0082 (CCRC 910069)培養，將自該培養物所得之内切型硫酸化多糖分解 73215-931112.doc - 39 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（37 ) 酵素（U-岩藻聚糖）溶解於含9U之1.5公升50 mM Tris-HCl緩 衝液中，25°C反應6日後，以蒸發機濃縮為約300 m卜將濃 縮液放入排除分子量3 500之透析管中徹底透析，將透析管 内之殘留液加入以50 mM氯化鈉平衡之4公升DEAE-Cellulofine A- 800管柱，以50 mM氯化鈉充分清洗後，以 50〜650 mM氯化鈉之濃度梯度進行洗脫，相同管柱再以650 mM氯化鈉充分予以洗脫。洗脫部份中以650 mM氯化鈉洗脫 者作為硫酸化岩藻半乳聚糖部分收集之，以排除分子量10 萬之超過濾機濃縮後，以10 mM之氯化鈉置換溶液，可得 0. 85 g冷凍乾燥之硫酸化岩藻半乳聚糖冷凍乾燥物。所得之 硫酸化岩藻半乳聚糖（G-岩藻聚糖）係含有構成糖為半乳糖 及岩藻聚糖者，其莫耳比約為2 : 1。 (3)為產生G-岩藻聚糖分解酵素，將黃素菌sp. SA- 0082 (CCRC 910069)接種於，pH 7.5内含0.1%葡糖、1.0%蛋白 腺、0.05%酵母萃取物之人工海水（J-Marine Laboratory公 司製）所組成之培養基600 ml (經120°C、20分鐘殺菌），以 24°C，23小時培養作為種培養液。將由含0. 2%之以實施例 4- ( 1)之方法配製之籠目昆布由來之岩藻聚糖部分、2. 0% 蛋白腺、0· 01%之酵母萃取物及0· 01%之消泡劑（KM70，信 越化學工業製）之人工海水（pH 7. 5)所組成之20公升培.養基 放入可容納30公升之發酵瓶中，以120°C殺菌20分鐘。冷卻 後接種上述之600 ml種培養液，以24°C，23小時，每分鐘10 公升通氣量與每分鐘125轉之攪拌速度之條件培養，培養終 了’離心培養液可得囷體。 73215-931112.doc - 40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（38 )

將所得之菌體懸浮於含1200 ml之0,4 Μ氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0)中，以超音波破碎後，離心可得菌 體抽出液。所得之菌體抽出液於相同缓衝液中充分透析， 離心可得上清液。於所得之上清液中添加硫銨使最終濃度 達90%飽和，以離心收集所生成之沉澱。將所得之沉澱溶 解於含150 ml之50 mM氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0) 中，以相同緩衝液充分透析、離心。將所得之上清液 加入以相同緩衝液平衡之500 ml DEAE-sepharose FF (Amasham Phamarcia公司製）管柱，以相同緩衝液清洗後， 以50 mM至600 mM氯化鈉之濃度梯度進行洗脫，並收集活 性部分。

所得之活性部份以含0. 1 Μ氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝 液（pH 8.0)充分透析，再加入以相同緩衝液平衡之100 ml之 DEAE- Cellulofine A- 800 (生化學工業公司製）管柱，以相 同緩衝液清洗後，再以0. 1 Μ至0.4 Μ之氯化鈉濃度梯度予 以洗脫，並收集活性部分。添加氯化鈉使所得之活性部分 成為4 Μ，加入以含4 Μ氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0) 平衡化之20 ml苯基Cellulofine (生化學工業公司製）管 柱，以相同緩衝液清洗後，再以4 Μ至1 Μ之氯化鈉濃度梯 度予以洗脫後，再以含1 Μ氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0)充分洗脫，並收集活性部分。添加氯化鈉使所得 之活性部分成為3 Μ，加入以含3 Μ氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液 （pH 8.0)平 衡化之 10 ml 苯基 Cellulofine (生化學 工業公司製）管柱，以相同緩衝液清洗後，再以3 Μ至0. 5 Μ 73215-931112.doc * 41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（39 ) 之氯化鈉濃度梯度予以洗脫後，再以含0. 5 Μ氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0)充分洗脫，並收集活性部分。 如此所得之純化酵素作為G-岩藻聚糖分解酵素使用。 (4) 以上述純化之G-岩藻聚糖分解酵素作用製造例4- (2) 記載之G-岩藻聚糖，以配製低分子化合物。亦即，將1.94 g之G-岩藻聚糖溶解於含0.2 Μ氯化鈉之25 mM Tris-HCl緩 衝液（pH 8.0)後，加入186 m U之G-岩藻聚糖分解酵素，以 25 °C反應6日。反應液以蒸發機濃縮至80 ml，再以 CellulofineGCL- 1000 (生化學工業公司製）管柱（4 cmx 90 cm) 進行分子量區分。收集分子量15,000以下之部分作為G-岩 藻聚糖酵素消化物部分。 (5) 上述之G-岩藻聚糖消化物以蒸發機濃縮至500 ml後， 以電透析裝置脫鹽後，加入已事先以含10 mM氯化鈉之10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8· 0)平衡之1公升之DEAE-Cellulofine A- 800 (生化學工業公司製）管柱，以相同緩衝 液清洗後，再以10 mM至900 mM之氯化鈉濃度梯度予以洗 脫，洗脫部份以每61 ml收集，再藉由苯酚硫酸法分別測定 其含糖量。因以270 mM附近之氣化鈉所洗脫之部分係形成 含糖量之吸收峰，故將其收集作為270 mM洗脫部分（B)。 此外，關於上述之270 mM诜脫部分（B)，係添加水以使 其達到與含150 mM氯化鈉之10 mM咪唑鹽酸緩衝液（pH 8.0) 相同之導電率，再加入已事先以含150 mM氯化鈉之10 mM 咪唑鹽酸緩衝液（pH 8· 0)平衡之200 ml DEAE- Cellulofine A- 800 (生化學工業公司製）管柱，以相同緩衝液清洗後， 73215-931112.doc - 42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 __ B7 五、發明説明（40 ) 再以150 mM至300 mM之氯化鈉濃度梯度予以洗脫，洗脫部 份以每12 ml收集，再藉由苯酚硫酸法分別測定其含糖量。 收集以自160 mM至1 80 mM附近之氯化鈉洗脫之部分，以 speed back (SAVANT Instruments Inc·)濃縮至2 ml後，加入 已事先以10%乙醇平衡之200 ml CellulofineGCL-25 (生化學 工業公司製）管柱，以相.同溶液予以洗脫。洗脫部份以每2 ml收集，再藉由苯酚硫酸法分別測定其含糖量。收集含糖 量所形成之吸收峰作為（D)。 上述之（D)以電透析裝置脫鹽後冷凍乾燥後，分析其糖組 成及質量。另外，藉由定法以重水置換後以NMR分析進行 結構解析。 (D)之物性 分子量；1358 1H-NMR (D20) δ ； 5.19 (1H5 D, J=4.3 Hz, Fl-l-H), 4.93 (1H, D, J=3.7 Hz5F2-1 -H)，4.62 (1H，與HOD 重複，Gl-l-H)，4.59 (1H，與HOD 重複， G2-1-H)，4.54 (1H，d-d，J=10.6, 2.7 Hz，F1-3-H)，4.46 (1H，d， J=7.6Hz，G3-l-H)，4.46(lH，m，F2-3-H)，4.41(lH，br-s，G2-4·Η)，4.41 (1H，d，J=7.6 Hz，G4-1-H)，4·37 (1H，q，J=6.4 Hz， F2-5-H)，4.27 (1H，m，G2-3-H)，4.24 (1H，br-s，G3-4-H)，4.21 (lH，m，G3-3-H)，4.19(lH，m，G4-3-H)，4.15(lH，br-s，G4-4-H)，4.13(lH，q，J=6.7Hz，Fl-5-H)，4.09(lH，d，J=2.7Hz，FL· 4-H)，4·04 (1H，d，J=2.8 Hz，F2-4-H)，3.98 (1H，m，G2-6-H)， 3·96 (1H，d-d，J=10.6, 4.3 Hz，F1-2-H)，3.93 (1H，m，G3-6-H)， -43- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（41 ) 3·88 (1H，br-s，G1-4-H)，3.86 (1H，m，G2-5-H)，3.81 (1H，m， G2-6-H)，3.81 (1H5 m，F2-2-H)，3.80 (1H，m5 G3-5-H)，3.80 (1H，m，G3-6-H)，3·66 (1H，m，G1-3-H)，3.65 (1H，m，G2-2-H)， 3.64(lH，m，Gl-6-H)，3.64(lH，m，G4-6-H)，3.61(lH，m，G4-5-H)，3.58 (1H，m，G1-2-H)，3.56 (1H，m，G1-6-H)，3.56 (1H， m，G4-6-H)，3.55 (1H，m，G4-2-H)，3·54 (1H，m，G1-5-H)， 3·54 (1H，m，G3-2-H)，1.20 (3H，d，J=6.7, F1-6-H)，1·14 (3H， d，J=6.4, F2-6-H) 糖組成L -岩藻糖：D -半乳糖=2 : 4 (莫耳比） 硫酸基5分子 另外，iH-NMR中吸收拳之歸屬編號如下式（V )。以下將 該化合物稱為6 - 5 S F d - G。 Ο Λ C 3

F 2 F 1 G 1 m 製造例5 將120 g製造例3- ( 2)所配製之硫酸化多糖懸浮於含20 mM 氯化鈣、300 mM氯化鈉、10%乙醇及10U之製造例3-( 1)所 73215-931112.doc ~ 44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 _________ B7 五、發明説明（42 ) 配製之F-岩藻聚糖分解酵素之8公升2〇 mM咪唑鹽酸緩衝液 (pH 7. 5)中，以25°C搖晃3曰後，以裝有排除分子量1〇萬之 中空纖維的超過濾裝置，一邊添加上述緩衝液一邊進行超 過渡。 於超過濾液内添加製造例4_(2)所記載之U -岩藻聚糖分解 酵素’以25 °C搖晃2日後，以裝有排除分子量i 〇萬之中空 纖維之超過濾裝置，一邊添加水以進行超過濾。 收集濾、液後，以蒸發機濃縮至丨· 5公升後，利用脫鹽裝置 完全脫鹽後，再加入已事先以含3〇 mM氯化鈉之5 mM咪唑 鹽酸緩衝液（pH6·5)平衡之3公升DEAE-CellulofineA-800 (生化學工業公司製）管柱，以6公升之相同缓衝液清洗後， 再以30 mM至500 mM之氣化鈉濃度梯度予以洗脫，洗脫中 所需要之液量為48公升，洗脫液以每180 ml收集，再藉由苯 盼硫酸法分別測定其含糖量。另外，亦可同時測定其232 nm吸收度。因以130㈤“至17〇 mM氯化鈉所洗脫之部分係形 成單一吸收峰，故收集之以脫鹽裝置脫鹽後，進行冷康乾 燥可得5.85 g之募糖。該寡糖經質量分析，其分子量 1128，經由NMR分析可確認為下述式（VI)所表示之化合 物，以下稱該化合物為6-2SFd-U。 73215-931112.doc - 45 -

1235764 A7 B7 五、發明説明（43 )

製造例6 (1) 將200 mg D-(+)-葡糖（1.1 mmol)溶解於10 ml之吡啶中， 在室溫下添加 1.05 g (6.6 mmol)之 Pyridine Sulfer Trioxide Complex (Pyr · S03 :東京化成）後，置於室溫婁文分鐘，60°C 下攪拌1小時。以水稀釋反應液後，以飽和氫氧化鋇水溶液 調整pH至中性後減壓乾燥。所得之濃縮物再度添加水後再 減壓乾燥之，並重複此操作1次。於所得之濃縮物中添加少 量水，並離心去除硫酸鋇之沉澱，將所得之上清液加入陽 離子交換管柱[Amberlite IRA- 120 (Na+)(organo)]。其結果 為：將所得之管柱未結合部分減壓濃縮可配製700 mg之硫 酸化D-( + )-葡糖鈉鹽。 (2) 將500 mg (3.05 mmol)之L-岩藻糖溶解於10 ml之说°定 中，在室溫下添加 2.33 g (14.6 mmol)之Pyridine Sulfer Trioxide Complex (Pyr · S〇3 :東京化成）後，置於室溫數分鐘，60°C 下攪拌1小時。以下以與製造例6- ( 1)相同之操作，可得硫 73215-931112.doc - 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（44 ) 酸化岩藻糖納鹽。 實施例1保持抗原特異性細胞傷害活性之CTL的繼續培養 方法 實施例1 - 1 (1) PBMC之分離及保存 自保有HLA-A24或Α2· 1之人類健康捐贈者實施成分採血 後’以 PBS( ·)稀釋 2 倍，堆積（stacking)於 Ficoll-paque (Pharmacia公司製）上後，以500 g離心20分鐘。以吸管回收 中間層之末梢血單核細胞（PBMC)並加以清洗。將所採取之 PBMC懸浮於由 90% FCS (JHR Biosciences公司製）/10% 二 甲亞减（Sigma公司製）所組成之保存液，保存於液態氮中。 CTL誘導時再將此等保存之PBMC於37°C水浴中急速溶解， 以含 10 μ g/ml DNase ( Calbiochem 公司製）之 RPMI1640 培養 基（Bio Whittaker公司製）清洗後，以錐藍（trypan blue)-染 色法計算出活細胞數以供各實驗使用。 (2) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 抗流感病毒記憶（influenza virus memory) CTL之誘導係 以改變一部份之Bednarek等人之方法（Bednarek Μ· A. et al· (1991) J· Immunology. 147 4047-4053)實施之。亦即，將 實施例1- 1-( 1)所配製之PBMS懸浮於含5%人類AB型血清、 0· 1 mM非必須胺基酸、1 mM丙酮酸納、2 mM L-glutamine (皆由 Bio Whittaker公司製）、10 mM HEPES (Nakaraitesuku公 司製）、1%鏈黴素盤尼西林（GIBCO BRL公司製）之RPMI1640 培養基（Bio Whittaker公司製）（以下簡稱為5HRPMI)中，使 73215-931112.doc · 47 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（45 ) 其成為4x 106 cells/ml後，於24孔細胞培養盤（Falcon公司製） 中以每孔1 ml撥種，於5%之C02濕式培育箱37°C培育1. 5小 時，分離附著於塑膠板之單核細胞。接著，以RPMI1640培 養基回收非附著性之細胞，作為反應者細胞（r e s ρ ο n d e r c e 11)於冰上保存之。於所分離之單核細胞中，添加0. 5 ml 之含有作為抗原之5 μ g/ ml流感病毒蛋白質由來之抗原決定 胜肽[序列表之序列編號：1所記載之核蛋白甴來之HLA A24結合性胜肽（FluNPA24) RFYIQMCTEL或序列表之序歹 編號：2所記載之基質蛋白由來之HLA A2. 1結合性胜肽 (FluMPA2.1) GILGFVFTL]，及 1 pg/ml 之 /3 2 微球蛋白 (microglobulin，Sukuripusu公司製）之 5HRPMI，於室溫中培 育2小時後，以X光照射（5500R)以作為抗原呈現細胞。自各 孔吸取除去胜肽液後，以RPMI1640培養基清洗各孔，將冰 上保存之反應者細胞懸浮於5HRPMI中使其成為l-2x 106 cells/ ml，以每孔1 ml添加於抗原呈現細胞上（此時，添加使 其樣品最終濃度為10 μ g/ ml)。對照組中設定為未添加樣品 之族群。樣品係使用製造例1所配製之籠目昆布由來之岩藻 聚糖。培養孤於5% C02中37 °C培養。於培養開始後第2 曰，於各孔中添加1 ml含60U/ml IL-2 (鹽野義製藥公司製） 與10 μ g/ ml之與最初時添加之樣品相同之樣品之5HRPMI (對照組僅含IL- 2)，此外在第5曰時，去除一半培養上清液 後，添加1 ml之相同IL- 2及含有樣品培養基（對照組僅含IL-2)。第7日時，以與上述之相同方法配製抗原呈現細胞後， 將1週所培養之反應者細胞懸浮於5HRPMI使其成為l-2x 106 73215-931112.doc ~ 48 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（46 ) cells/ml，以每孔1 ml添力σ於與上述相同配製之抗原呈現細 胞上，進行再刺激（此時，添加使其樣品最終濃度為10 μ g/ ml，對照組貝不添加）。再刺激後第2曰，於各孔中添力σ 1 ml之含60U/ml之IL-2及10 pg/ml樣品之5HRPMI (對照組 僅含IL-2)，再過5日，將培養上清液去除一半後，於各孔 中添加1 ml與去除前相同内容物之培養基，在持續培養2曰 後進行CTL誘導。 (3) CTL細胞傷害活性之測定 實施例1- 1-( 2)所配製之誘導開始後第14日之CTL的細胞 傷害活性係以利用Calcein-AM之細胞傷害活性測定法 (Rudolf Lichtenfels et al. J. immunological methods 172 (1994) 227-239)進行評估。 與抗原決定胜肽共培養1夜，或將在抗原決定胜肽未存在 下培養之HLA-A24或Α2· 1保持EBV轉形B細胞（TISI或 221A2· 1)懸浮在含 5% FCS ( JRH Biosciences 公司製）之 RPMI1640培養基中使其成為lxl06cells/ml，添加Calcein-AM (Dotaito公司製）使其最終濃度為25 μΜ，於37°C培養1 小時。細胞於不含Calcein-AM之培養基中清洗後與20倍量 之K562細胞混合以作為Calcein標識之標的細胞。再者， K562細胞係用於排除經由混入反應者細胞中之NK細胞之非 特異性傷害活性。 以實施例1- 1-( 2)所配製之記憶CTL作為效應細胞 (effector cell)，以 5HRPMI梯度稀釋為 lx 105 cells/ml 至 9x 106 cells/ml後，以每孔100 μ 1加入96孔細胞培養盤，並於每 73215-931112.doc ~ 49 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 _B7 五、發明説明（47 ) " 孔再添加ΙΟΟμΙ之以lxlO5 cells/ml配製之Calcein標識之標的 細胞。加入上述細胞懸浮液之平板以400 g離心1分鐘後，置 於3 7°c之濕式C02培育箱培育4小時。 4小時後自各孔採取1 〇〇 μ 1培養上清液，利用螢光平板讀 取器（485 nm/ 538 nm)測定培養上清液中所放出之Calcein 量。特異性細胞傷害活性依下式1計算。 [式1] 特異性細胞傷害活性（％)= [(各孔之測定值-最小釋放量）/(最大釋放量_最小釋放量）]χ1〇〇 上式中最小釋放量係僅含標的細胞及K562細胞之孔的 Calcein釋放量，表示來自標的細胞之Calcein自然釋放量。 此外’最大釋放量係表示於標的細胞添加界面活性劑 TritonX-1〇〇 (Nakaraitesuku公司製）後，將細胞完全破壞之 際的Calcein釋放量。其結果為：誘導不久後，特異性細胞 傷害活性雖被誘導，但與藉由誘導時樣品添加之有無，並 無細胞傷害活性之差別。 (4) CTL之繼續培養 以貝^例1 - 1 - ( 2)所配製並以實施例1 _ 1 _( 3)確認其抗原決 定胜肽之特異性細胞傷害活性之CTL，以5HRPMI清洗後， 於含30U/ml IL-2之5HRPMI令進一步繼續培養10_14日。此 吟，對於CTL誘導時所添加之樣品群組，係以相同濃度之 與CTL誘導時相同之樣品添加於培養基。另外，誘導ctl時 未添加樣品之對照組係仍不添加樣品繼續培養。期間完全 不再補充經由胜肽之刺激，每2-3日去除培養上清液後，各 73215-931112.doc - 50 本紙張尺度適财_冢料(CNS) M規格_χ297公幻---- 1235764 A7 B7 五、發明説明（48 ) 添加1 ml與去除前相同組成之培養基，繼續培養後，以與 實施例1- 1-( 3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活 性，其測定結果如表1所示。再者，表中之E/ T比係標的細 胞數（T)對效應細胞細胞數（E)之比，胜肽添加係意味著對 標的細胞有無添加胜肽。 表1 胜肽 樣品 樣品添加 胜肽 細胞傷害活性(％) CTL IL-2 添加 E/T比 誘導時 培養時 1 3 10 FluMPA2.1 對照 - - _ N.T. N.T. 0 - - + N.T. N.T. 0 E/T比 ·.········· .............. 0.7 2.2 7 籠目昆布由 + + - 0 0 0 80.6 來岩藻聚糖 + + + 22.9 52.7 FluNPA24 E/T比 1 3 10 對照 - - - 0 0 11.8 - - + 5.7 21 65.1 籠目昆布由 立差農聚糖 (Ν·Τ·表示無法評估

其結果為，CTL誘導時與繼續培養時的兩階段所添加之樣 品族群中，即使在10- 14日的繼續培養後，仍雄持其高活 性。然而’另一方面，未添加之籠目昆布由來之岩藻聚糖 之族群（對照組）中，無論是CTL誘導中或繼續培養中，其活 性皆明顯下降。 、 如此顯示，藉由CTl誘導時與繼續培養時添加籠目昆布由 732l5-93lH2.doc 51 - 1235764 A7 B7 五、發明説明（49 ) 來之岩藻聚糖，繼續培養時未添加藉由胜月太等之刺激，則 可保持抗原特異性細胞傷害活性之狀態的CTL之繼續培 養。 實施例1 - 2 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 以與貫施例1-1·( 1)相同之方法進行pBMC之分離，並使 用保存中之PBMC，以與實施例^-(2)相同之方法進行抗 流感病毒記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加作為樣 口口之以製造例1所配製之籠目昆布由來之岩藻聚糖、製造例 2所配製之III部分（F-岩藻聚糖）與„部分（u_岩藻聚糖）、製 造例3所配製之7-USFd-F分別使其最終濃度達1〇 gg/mi， 對照組則設定為未添加樣品之族群。 如此所配製之誘導開始後第14aCTL之細胞傷害活性以實 施例1-1-(3)之相同方法評估。其結果為，誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 根據不同之樣品並無細胞傷害活性之差別。 (2) CTL之繼續培養 以實施例1-2-(1)所配製之CTL，並以實施例卜κ(4)相同 之方法進-步繼績培養1〇]4日。此時，於培養基中添加以 實施例導時所添加之樣品使其最終濃度分 別達1〇 pg/ml以作為樣品。此外，CTL誘導時未添加樣品之 對照組則仍不添加樣品繼續培養。繼續培養後，以與實施 例1- 1-(3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性，: 結果如表2所示。 、 73215-931112.doc -52- 1235764 、發明説明（ 胜肽 樣品 F1uMPA2.1 添加 CTL IL-2 培養時 胜月太 添加 傷害活性^ E/T比

蘢目昆布由 ····$.爱..藻聚糖.................................. 、岩藻聚糖 U、岩藻聚糖 --------------.···..··.“ ........................... 7'l2SFd-F + + + + + 3 10 ίο • 4.6 5.0 13.1 + 11.0 23.4 47.9 - 5.9 4.9 12.3 + 53.3 86.0 100.9 - 2.1 2.4 7.2 + 41.1 66.8 82.8 - 1.6 4.1 9.2 + 46.3 75.2 92.3 0.3 2.2 11.7 + 12.0 37.9 60.7 其結果為，〇 τ 了綠 品族群中，Aδ時與繼續培養時的兩階段所添加之樣 热响哪_個族君琴，gp /由务 後，仍維持复古年^ 群即使在10-14日的繼續培養 群（對昭纟且）中、,。然而，另一方面，未添加樣品之族 明L下、、降 ㈣是gtl料時或繼續培料，其活性皆 明顯下降。 如此顯示 來之W取播糟由CTL料時與繼續培養時添加籠目昆布由 木I石深聚糖、]P_忠贫 刺激，比1户 嘁來糖，u•岩藻聚糖或7-12SFd-F等之 刺激，s可在保持抗原特里 CTL之繼續培養。 H田肊傷害活性之狀態下進行 實施例1 - 3 (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例1 - 1 - ( 1)記載之方、、土 ^ r; ^ ^ 戰之方去所分離、保存中之 PBMC，亚以與貫施例1-1-(2)相同之 I法進行抗流感病毒 73215-931112.doc -53- Ϊ235764

五、發明説明（51 記憶CTL之誘導。㈣’於培養基中添加作為樣品2L M.w_ 肝素（商品名Ardeparin sodium; CELSUS lab〇Rat〇ries mc 公司製）、非膨潤性藻酸（和光純藥公司製）、膨潤性藻酸（和 光純藥公司製）、製造例6_⑴所配製之硫酸化葡糖納鹽、 硫酸軟骨素A鈉（生化學工業公司製）使其最終濃度達⑺ μ對照組則設定為未添加樣品之族群。抗原胜肽則使 用 FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14aCTL之細胞傷害活性以實 施m].(3)之相时法評估。其結果為：料不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 根據不同之樣品並無細胞傷害活性之差別。 (2) CTL之繼績培養 實施例1-3-⑴所配製之CTL以實施例卜卜⑷相同之方 法’進-步繼續培養1()_14日。此時’於培養基中添加以實 施例中CTL誘導時所添加之樣品使其最終濃度分別 達H) M/mm作為樣品。此外，CTL料時未添加樣品 照組則仍不添加樣品繼續培#。繼續培養後，以與實 1-1-(3)相同之方法敎CTL之特異性細胞傷害活性，其社

果如表3所示。 'Q 73215-931112.doc

1235764 A7 B7 五、發明説明（52 ) 表3 樣品 樣品添加 胜肽 添加 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 IL-2 培養時 1 E/T比 3 10 對照 - - - 17.4 26.5 35.2 - - + 28.0 43.8 63.7 L.M.W.肝素 + + - 11.7 14.2 + + + 49.0 71.7 非膨潤性藻酸 + + - 12.9 24.8 14.0 + + + 28.1 52.7 77.1 膨潤性藻酸 + + - 12.5 26.5 22.2 + + + 39.8 75.3 86.9 硫酸化岩藻聚糖 + + 14.3 27.8 21.0 + + + 34.0 67.8 92.1 硫酸軟骨素A + + - 21.1 + + + 75.5 其結果為：CTL誘導時與繼續培養時的兩階段所添加之樣 品族群中，無論哪一個族群，即使繼續培養後，仍維持其 高活性。然而，CTL誘導時及培養時未添加樣品之族群（對 照組）中，無論是CTL誘導時或繼續培養時，其活性皆明顯 下降。 如此顯示，藉由CTL誘導時與繼續培養時添加與岩藻聚糖 相同之硫酸化多糖的肝素、硫酸軟骨素A鈉，而非添加胜肽 等之刺激，仍可在保持抗原特異性細胞傷害活性之狀態下 進行CTL之繼續培養。亦即，岩藻聚糖以外之硫酸化多糖 亦具有相同之活性。再者，由除硫酸化多糖以外，硫酸化 單糖之硫酸化葡糖鈉鹽亦具有與岩藻聚糖相同之活性可 73215-931112.doc ~ 55 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（53 知，硫酸化之糖之大小與其所具有維持細胞傷害活性之效 果並無關連。另-方面，由非硫酸化糖之非膨潤性藻酸及 膨潤性藻酸，亦顯示其具有與岩藻聚糖相同之活性可知， 上述之活性並非硫酸化之糖所特有，只要是酸性糖，其糖 之種類對於細胞傷害活性維持效果之表現並無影響。 實施例1 - 4 9 (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例⑴記載之方法所分離、保存中之 PBMC’並以與實施例相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加作為樣品之果酸 (Nakaraitesuku公司製）、製造例6_ (2)戶斤西己製之硫酸化岩藻 糖鈉鹽、硫酸軟骨素B納（生化學工業公司製）使其最終濃度 達1〇 μ*卜對肖組則設定為未添加樣品之師。抗原胜 肽則使用FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14aCTL之細胞傷害活性以實 施例H-(3)之相同方法評估。其結果為，誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 根據不同之樣品並無細胞傷害活性之差別。 (2) CTL之繼續培養 實：例!-4-⑴所配製之CTL以實施例W，相同之方 法，進一步繼續培養1〇-14日。此時，於培養基令添加以實 :例“-⑴中CTL誘導時所添加之樣品使其最終濃度分別 達…一卜此外，CTL誘導時未添加樣品之對照Μ仍不 添加樣品繼續培養。繼續培養後’以與實施例 73215-931112.doc 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（54 同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性，其結果如表4 示。 叮 表4 樣品添加

其結果為，CTL誘導時與繼續培養時的兩階段所添加之樣 口口私群中，热論哪一個族群，即使繼續培養後，仍維持其 0 〇 0.8 (Ν·Τ·表示:1 ： ί-赴一60.7 高活性。然而，CTL誘導時及繼續培養時夫 ’ 貪吋禾添加樣品之族 群（對照組）中，其活性皆明顯下降。 如此顯示，硫酸化多糖之硫酸軟骨素3鈉，硫酸化單糖之 硫酸化岩藻糖鈉鹽、酸性多糖之果酸皆 ' 活性之效果。 …維持細胞傷害 實施例1 - 5 (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例1- 1- ( 1)記載之方法 厅刀離、保在Φ之 PBMC，並以與實施例ί - 1-(2)相同之方 仔r之 决進行抗流感病毒 73215-931112.doc - 57 -

1235764 A7 B7 五、發明説明（55 ) 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中完全不添加如上述之 樣品，抗原胜肽則使用FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14曰CTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。 (2) CTL之繼續培養 實施例1 - 5- ( 1)所配製之CTL以實施例1 - 1 - ( 4)相同之方 法，進一步繼續培養10-14日。此時，於培養基中添加以製 造例1所配製之籠目昆布由來之岩藻聚糖、製造例2所配製 之III部分（F-岩藻聚糖）與II部分（U-岩藻聚糖）、L.M.W.肝 素（商品名 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 公司製）、果酸（Nakaraitesuku公司製）、非膨潤性藻酸（和光 純藥公司製）、膨潤性藻酸（和光純藥公司製）、製造例6- ( 1) 所配製之硫酸化葡糖鈉鹽、製造例6- ( 2)所配製之硫酸化岩 藻糖鈉鹽、硫酸軟骨素B鈉（生化學工業公司製）使其最終濃 度分別達10 μ g/ml以作為樣品。繼續培養後，以與實施例 1- 1- ( 3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性，其結 果如表5與6所示。 73215-931112.doc ~ 58 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7

1235764 五、發明説明（57 ) 仍維持其高活性。然而，繼續培養 照組）中，其活性皆明顯下降。 外加樣品之族群（對 扣此顯示 ，稽田繼續培養時 糖、F-岩藻聚糖、υ-岩藻聚糖目：布由來之岩藻聚 (Nakaraitesuku公司製）、非膨潤 ..W.肝素、果酸 化葡糖納鹽、硫酸化岩藻糖納鹽、：==酸， 加胜肽等之刺㉟，仍可在保持抗原特異性：胞：：添 狀態下進行CTL之繼續培養。亦即，藉由僅於繼 添加酸性糖’即可繼續培養保持特異性細胞傷宝活性:養守 實施例1 - 6 " (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例1 - 1 ·( 1)記藝之古 V ; °匕戰之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例η.⑺相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加製造例丨所配製之 籠目昆布由來之岩藻聚糖、製造例2所配製之川部分（17_岩 潘♦糖）與II部分（U-岩澡聚糖）使其最終濃度達丨〇 μ g/ ml , 對照組則没定為未添加樣品之族群。抗原胜肽則使用 FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14曰CTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 根據不同之樣品並無細胞傷害活性之差別。 (2) CTL之繼續培養 實施例1 - 6- ( 1)所配製之CTL以實施例1 - 1 - ( 4)相同之方 -60- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 五、發明説明（58 法，進-步繼續培養10，曰。此時，設 達10 yg/ml之製造例1-6 八、，.、，辰又刀別 品之添加族群與未^ /.,)几誘"^所添加相同之樣 ^之對萨紐目f / “、、17矢群。此外，^几誘導時未添加樣 實施例Η-⑺相同之^ ^續培養。繼續培養後，以與 性，其結果如表^ 測定CTL之特異性細胞傷害活 表7 — 力匕口添加 胜月太 + + + + + — 4.6 11.0 E/丁比 10 5.0 23.4 30 13.1 47.9 5.9 4.9 12.3 53.3 86.0 100.9 0 0 4.5 —46.0 78.5 98.7 2.1 2.4 7.2 41.5 66.8 82.8 0 0 3.2 37.6 ........................................... 63.5 86.3 1.6 4.1 9.2 46.3 75.2 92.3 0 0 4.5 43.5 71.9 91.1 CTL IL-2 添加 _ 誘導瞎 + 立矣。古 對照 F-岩藻聚备 + + „ 一 N〜内、六；^ τ ，叫m塍項 培養後，仍維持其高活性，與繼續培養時樣品之添加與否 無^ °另一方面，CTL誘導時及培養時未添加此等樣品（籠 目民布由來之岩藻聚糖）之族群（對照組）中，纟活性皆明顯 下降。 如此顯示，於CTL誘導時添加籠目昆布由來之岩藻聚糖等 61 73215-931112.doc 本紙張尺度適财國國冢&(CNS) A4規格(210X297公 1235764 A7 B7 五、發明説明（59 ) ' ------ =糖，即使繼續培養時未再添加之情況下，亦非添加胜 狀等之刺激，仍可在保持抗原特異性細胞傷害活性之狀能 下進行CTL之繼續培養。 〜 從以上之結果可知，藉由CTL之誘導時與繼續培養時添加 酉文性糖，在長期保持CTL之特異性細胞傷害活性知狀態 y，可繼續培養CTL。再者，無論在^誘導時或繼續培養 時僅添加酸性/糖，在長期保持CTL之特異性細胞傷害活性 知狀態下，可繼續培養CTL。 貫施例2保持特異性細胞傷害活性之CTL的擴大培養 貫施例2- 1 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例丨-丨^】）相同之方法進行抗流感病毒 圮憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加製造例丨所配製之 蘢目昆布由來之岩藻聚糖使其最終濃度達1〇 μ§/ιη1作為樣 品，另外’亦設定為未添加樣品之族群。 如此所配製之誘導開始後第14日CTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 (2) CTL之擴大培養 實施例2-1-(1)所配製之(：几以51110^1清洗後，配製為5>< 104 cells/ml。另一方面，以與實施例ΐ-ΐ-(ι)相同方法採取 之HLA-A24及Α2· 1非保持allogenic PBMC以X光照射 -62- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（60 ) (3300R)，再以培養基清洗後配製成5xl〇6ceUs/ml。將此等 CTL (2.5X104 cells)與 all〇genic pBMC (1.25xl〇7 cells)懸浮 於10 ml之5HRPMI中，進一步添加最終濃度為5〇 ng/ml之抗 CD3抗體（Yansen合作公司製）後，加入12·5 cm2之燒瓶 (Falcon公司製），置入3?。〇之濕式c〇2培育箱中培養14曰。 此時，分別設定於培養基中添加籠目昆布由來之岩藻聚糖 使其最終濃度達10 μ g/ ml以作為樣品之族群與未添加之族 群。期間完全不添加藉由胜肽之刺激，培養開始第1日添加 最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始後第4曰以 後，每2-3日去除一半上清液後，於各瓶中添加5 ml之含6〇 U/ml IL-2之5HRPMI。此時，於樣品添加族群之培養基中 添加同濃度之籠目昆布由來之岩藻聚糖。擴大培養開始 後，苐14曰以與貫施例1 - 1 - ( 3)相同之方法測定ctl之特異 性細胞傷害活性，其結果如表8所示。擴大增值率（X倍率） 係以擴大培養後之細胞數除以擴大培養前之細胞數求得。 表8 胜肽 樣品 樣品添加 擴大 增殖率 胜肽 添加 細胞傷害活性(％) ET比 1 3 1 n in CTL 擴大 誘導時培養時 FluMPA2.1 對照 - x494 - 2.5 1.2 2.0 8.4 - ><494 + 5.2 14.7 38.8 70.3 籠目昆布 + + x513 _ 1.6 3.2 5.4 7.8 由來岩藻 + + x513 + 22.2 47.4 87.0 108.3 聚糖 + - x694 - 2.5 3.2 7.2 18.5 + - x694 + 21.0 44.7 84.2 102.8 - + χ488 - 2.1 2.2 5.8 7.8 - + x488 + 10.5 26.4 62.3 83.8 73215-931112.doc _ 63 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 發明説明（61

FluNPA24 對照 嘴I目昆布 由來岩藻 聚糖 + + + + + + + + X316 Χ316 Χ360 Χ360 Χ338 Χ338 ><448 Χ448 13.0 7.3 22.7 50.8 + + 0 0 35.7 76.7 4.8 9.4 48.6 85.1 2.9 0 26.7 76.2 Ν.Τ. N.T. N.T. N.T. N.T· N.T· N.T. (N.T.表示無法評估。） 其結果為，CTL誘導時與擴大培養時添加籠目昆布由來 岩蒸聚糖之族群中，CTL即使在14日的擴大培養後，亦保= 特異性高細胞傷害活性。另—方面，ctl誘導時及擴大培 養時未添加籠目昆布由來之岩藻聚糖族群中，#活性則明 顯下降H CTL誘導時未添加籠目昆布由來之岩薄聚 糖，藉由抗CD3抗體作擴大培養時，添加籠目昆布由來之 岩藻聚糖之料’及CTL誘導時添加籠目昆布由來之岩藻 水糖，擴大培養時未添加者，亦可以長期保持高細胞傷害 活性之狀怨擴大培養CT卜亦即，藉由至少於導時或 擴大培養時任-者添加籠目良布由來之岩蕩聚糖，可以長 期保持高細胞傷害活性之狀態擴大培養CTL。 實施例2- 2 (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例^^(1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例⑺相同之方法進行抗流感病毒 ，憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加製造例配製之 i目％布由來之岩澡聚糖、製造例2所配製之m部分（f_岩 之 73215-931112.doc ____ - 64 - i紙張尺度適财賴家鮮(CNS) A4^|(21GX297公㈤--- 1235764 A7 B7

/辰度達10 μ g/ml作 族群，抗原胜肽則 藻聚糖）、II部分（u-岩藻聚糖）使其最終 為樣品’另外，亦設定為未添加樣品之 使用 FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第W日CTL之細胞傷害活性以實 施例1-1-(3)之相同方法評估。其結果為，誘導不久後，= 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 (2) CTL之擴大培養 實施例2-2- ( 1)所配製之CTL以與實施例1-(2)相同之方 法進行CTL之擴大培養。此時，分別設定於培養基中添加 與實施例2-2-(1)中CTL誘導之際所添加之樣品相同之樣品 使其最終濃度達1 〇 μ g/ ml以作為樣品之族群與誘導時完全 未添加之族群。期間完全不添加藉由胜肽之刺激，培養開 始弟1曰添加最終濃度為120 U/ ml之IL- 2，進一步培養開始 後第4曰以後，每2- 3曰去除一半上清液後，於各瓶中添加5 1111之含6〇11/1111化-2及1〇0§/1111樣品之5111^%1。然而，未 添加樣品之族群中，即使在更換培養基之際，亦不進行樣 品之添加。擴大培養開始後，第日以與實施例1_ 1- ( 3)相 同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性，其結果如表9所 示0 73215-931112.doc - 65 - ------- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 、發明説明（ 表9 63 ) 樣品 樣品添加 擴大 胜肽 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 增殖率 添加 E/T比 10 對照 - * X332 - 3.1 - • X332 + 59.7 籠目昆布岩藻 + + X388 - 2.4 聚糖 + + X388 + 85.2 F-岩藻聚糖 + + X340 - 2.1 + + X340 + 77.7 U-岩藻聚糖 + + X290 - 1.2 + + X290 + 81.6 其結果為：CTL誘導時與擴大培養時添加樣品族群中， CTL即使在14日的擴大培養後，亦保持特異性高細胞傷害活 性。另一方面，無論是CTL誘導時或擴大培養時皆未添加 此等樣品之族群中，其活性則明顯下降。亦即，藉由於 CTL誘導時或擴大培養時添加岩藻聚糖，可以長期保持高 細胞傷害活性之狀態擴大培養CTL，與岩藻聚糖之構造、 種類無關。 實施例2 - 3 (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例1- 1- ( 1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例1- 1-(2)相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加作為樣品之製造 例3所配製之7- 12SFd-F使其最終濃度達10 pg/ml，亦設定 為未添加樣品之族群，抗原胜肽則使用FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14日CTL之細胞傷害活性以實 73215-931112.doc - 66 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 五、發明説明（64 加例1-1· (3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被料，但料時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 (2) CTL之擴大培養 、實施例2_3-(1)所配製之CTL以與實施例2-^(2)相同之方 法進fT CTL之擴大培養。此時’分別設定於培養基中添加 與實，例2-3•⑴中CTL誘導之際所添加之樣品相同之樣品 使其最終濃度達10 pg/ml以作為樣品之族群與誘導時完全 未，加之族群。期間完全不添加藉由胜肽之㈣，培養開 始々第1日添加最終濃度為12〇 u/mkIL_2，步培養開始 後第4曰以後，每2·3曰去除_半上清液後’於各瓶中添加5 如之含60 U/ml IL_2及7_12SFd_F 1〇㈣鮒之施簡。然 而，未添加樣品之族群中，即使在更換培養基之際，亦不 進行樣品之添加。擴大培養開始後，第14日以與實施例^ 1-(3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活 丨 〆、'、、口衣 如表10所示。 表1 0 樣品添加

CTL 誘導時 培養時

7-12SFd-F --------------〇7.0___^3 7 其結果為：CTL誘導時與擴大培養時添加 中，CTL即使在14日的擴大培養後，亦保持特異性高細 73215-931112.doc -67- 1235764 A7 B7 五、發明説明（65 ) 害活性。另一方面，無論是CTL誘導時或擴大培養時皆未 添加此等樣品之族群中，其活性則明顯下降。亦即，藉由 於CTL誘導時及擴大培養時添加不只如岩藻聚糖之高分子 硫酸多糖，即使像F-岩藻聚糖之構成單位的7-12SFd-F如此 分子量小之硫酸化糖，亦可以長期保持高細胞傷害活性之 狀態擴大培養CTL·。 實施例2-4 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例1- 1-( 1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例1- 1-(2)相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加作為樣品之L.M.W. 肝素（商品名 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC. 公司製）、果酸（Nakaraitesuku公司製）、非膨潤性藻酸（和光 純藥公司製）、膨潤性藻酸（和光純藥公司製）、製造例6- ( 1) 所配製之硫酸化葡糖鈉鹽、製造例6- ( 2)所配製之硫酸化岩 藻糖鈉鹽、硫酸軟骨素A鈉（生化學工業公司製）使其最終濃 度分別達10 μ g/ ml，亦設定為未添加樣品之族群，抗原胜 肽則使用FluNPA24。 如此所配製之誘導開始後第14曰CTL之細胞傷害活性以實 施例1- 1- ( 3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 根據不同之樣品並無細胞傷害活性之差別。 (2) CTL之擴大培養 實施例2-4-( 1)所配製之CTL以與實施例2- 1-( 2)相同之方 73215-931112.doc - 68 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（66 ) 法進行CTL之擴大培養。此時，分別設定於培養基中添加 與實施例2- 4- ( 1)中CTL誘導之際所添加之樣品相同之樣品 使其最終濃度達10 μ g/ ml以作為樣品之族群，與誘導時完 全未添加之族群。期間完全不添加藉由胜肽之刺激，培養 開始第1曰添加最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開 始後第4日以後，每2- 3日去除一半上清液後，於各瓶中添 加 5 ml 之含 60 U/ml IL-2 及 10 pg/ml 樣品之 5HRPMI。然 而，未添加樣品之族群中，即使在更換培養基之際，亦不 進行樣品之添加。擴大培養開始後，第14日以與實施例1-1 - ( 3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性，其結果 如表11所示。 表1 1 樣品 樣品添加 擴大 胜肽 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 增殖率 添加 3 E/T比 10 對照 - - X274 - 17.0 32.2 .- - X274 + 44.2 66.0 L.M.W。肝素 + + X240 - 5.2 19.6 + + X240 + 56.4 92.9 果酸 + + X160 - 11.6 7.3 + + X160 + 47.0 69.8 非膨潤性藻酸 + + X220 - 26.2 26.8 + + X220 + 63.5 81.4 膨潤性藻酸 + + X176 - 14.3 21.3 + + X176 + 65.0 101.6 硫酸化葡糖 + + 、 X220 - 10.3 25.6 + + X220 + 62.3 127.4 硫酸化岩藻糖 + + X240 - 23.3 + + X240 + 70.2 硫酸軟骨素A + + X280 _ 0 2.3 + + X280 + 56.7 89.0 硫酸軟骨素B + + X178 - 1.0 10.7 + + X178 + 57.8 98.2 73215-931112.doc - 69 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7

73215-931112.doc ----- - B7 五、發明説明（67 其結果為：CTL誘導時與擴大培養時添加樣品族群中，在 14日的擴大培養後，皆保持特異性高細胞傷害活性。另一 方面，無論是CTL誘導日丰式捵| w、，丄 、， 方V吟或擴大培蚕時皆未添加此等樣品 之族群中，其活性則明顯下降。 # ，貝卜I牛 亦即，措由於CTL誘導時 與擴大培養時添加酸性糖，可以長期保持高細胞傷害活性 之狀態擴大培養CTL，與糖之種類、修飾等無關。 實施例2-5 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例w•⑴記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例η_⑺相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時’於培養基中完全不添加如上述實 施例所使用之樣品，抗原胜肽則使用FluMpA2.丄。 如此所配製之誘導開始後第14aCTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。 (2) CTL之擴大培養 實施例2-5-(1)所配製之〇：1^以實施例2_1-(2)相同之方 法y進行CTL之擴大培養。此時，分別設定於培養基中添 加樣品使其最終濃度達1〇 μ g/ml與誘導時完全未添加之族 群。期間完全不添加藉由胜肽之刺激，培養開始第丨日添加 最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始後第4曰以 後，每2- 3日去除一半上清液後，於各瓶中添加5 ml之含6〇 11/1111化-2及1〇42/1111樣品之5111^%1。然而，未添加樣品之 族群中，即使在更換培養基之際，亦不進行樣品之添加。 木八係使用製造例2所配製之ΠI部分（F -岩藻聚糖）。擴大培 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1235764

養開始後，第14日以與訾始加，^ 、只方也例1 - 1 - ( 3)相同之方法測定CTL 之特異性細胞傷害活性，其結果如表12

其結果為：擴大培養時禾山~ _ ’ —. 了 "』、、加F-石澡聚糖之族群CTL中，在 14曰的擴大培養後，亦保姓 丌保持特異性咼細胞傷害活性。另一 方面，無論是CTL誘導時哎楯* 土立盖卩士比土二 、， 了及擴大培養時皆未添加此等樣品 之方矢群中’其活性則明顯T [J久 _y. 〇 、 β π員下降。亦即，即使僅在擴大培養 日$而非自誘導開始時，添加 一 τ 外加F-石澡聚糖，亦可以長期保 高細胞傷害活性之狀態擴大培養CTL。 實施例2- 6 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例^-(1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例：^-⑺相方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。&時，於培養基中完全不添加如上述； %例所使用之樣品，抗原胜肽則使用FluMpA2 . J。 如此所配製之誘導開始後第丨4日CTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。 貝 (2) CTL之擴大培養 實施例2-6-( 1)所配製之CTL以實施例2- ^(2)相同之方 法，進行CTL之擴大培養。此時，分別設定添加樣品使其 73215-931112.doc -71 -

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（69 ) 最終濃度達10 μ g/ml之族群，與完全未添加之族群。期間 完全不添加藉由胜肽之刺激，培養開始第1日添加最終濃度 為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始後第4曰以後，每2-3曰 去除一半上清液後，於各瓶中添加5 ml之含60 U/ml IL-2及 10 pg/ml樣品之5HRPMI。然而，未添加樣品之族群中，即 使在更換培養基之際，亦不進行樣品之添加。樣品係使用 製造例1所配製之籠目昆布由來之岩藻聚糖、製造例2所配 製之II部分（U-岩藻聚糖）、製造例3所配製之7-123?(1-尸、 L.M.W.肝素（商品名 Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC·公司製）、果酸（Nakaraitesuku公司製）、非膨潤性藻酸 (和光純藥公司製）、膨潤性藻酸（和光純藥公司製）、製造 例6- ( 1)所配製之硫酸化葡糖鈉鹽、製造例6- (2)所配製之 硫酸化岩藻糖鈉鹽、硫酸軟骨素A鈉（生化學工業公司製）、 硫酸軟骨素B鈉（生化學工業公司製）。擴大培養開始後，第 14曰以與實施例1- 1- (3)相同之方法測定CTL之特異性細胞 傷害活性，其結果如表13、14所示。 73215-931112.doc - 72 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（71 ) 無論是CTL誘導時或擴大培養時皆未添加此等樣品之族群 中，其活性則明顯下降。亦即，即使僅在擴大培養時而非 自誘導開始時，添加酸性糖，亦可以長期保持高細胞傷害 活性之狀態擴大培養CTL。 實施例2-7 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例1 - 1 - ( 1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例1- 1-(2)相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加樣品使其最終濃 度達10 μ g/ ml，另外，亦設定為未添加樣品之族群。樣品 係使用製造例1所配製之籠目昆布由來之岩藻聚糖、製造例 2所配製之III部分（F-岩藻聚糖）、II部分（U-岩藻聚糖）、製 造例3所配製之7- 12SFd-F、L.M. W.肝素（商品名Ardeparin sodium; CELSUS LABORATORIES INC·公司製），抗原胜肽 則使用 FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14日CTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 (2) CTL·之擴大培養 實施例2-7-( 1)所配製之CTL以實施例2- 1-( 2)相同之方 法，進行CTL之擴大培養。此時，分別設定添加與實施例2-7- ( 1)中CTL誘導之際所添加之樣品相同之樣品之族群，與 自誘導開始及完全未添加樣品之族群。期間完全不添加藉 73215-931112.doc - 74 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764

由胜肽之刺激，培養開始第丨日添加 IL_2,進-步培養開始後第4日^ 度為12GU/ml之 清液後’於各瓶中添加5ml之含6〇υ/叫曰去除-半上 品之賺吣。然而，未添加樣品d2及1〇一樣 養基之際，亦不進行樣品之添加^’即使在更換培 ，相同之方法测定饥之特異性細胞傷 吾活性’其結果如表15所示。 表1 5 才篆品 樣品添加 擴大 胜肤 添加 細胞傷害活性 CTL 誘導時 擴大 培養時 增殖率 1 E/T比 3 10 30 對照 - - X393 - 1.5 1.0 3.1 5.9 - 喊 X393 + 3.6 15.7 36.7 60.2 籠目昆布i系 + + x31〇 2.5 3.8 0 2.0 岩藻聚糖 + + X310 + 15.1 30.9 76.7 77.9 + - xl66 - 5.6 2.4 5.9 12.2 + - xl66 + 15.3 30.2 65.2 88.3 F-岩藻聚 + + x278 - 1.5 1.2 4.4 1.3 + + x31〇 + 9.2 21.2 41.9 65.4 + - xl75 - 2.2 0.8 1.2 2.4 + - xl75 + 6.7 16.3 47.3 74.4 U-岩藻聚糖^ + + x214 — 祕 3.4 + + x214 十 66.7 + - xl73 _ 7.1 8.9 8.8 11.5 + - xl73 + 10.6 23.2 46.0 77.0 7-12SFd-F + + x258 - 0 0 0 1.6 + + x258 十 9.4 23.4 44.2 82.1 + - X283 - 6.7 6.5 9.3 9.8 + - x283 + 14.0 34.6 50.4 83.5 L.M.W.肝素 + + x243 縛 5.6 2.5 1.1 0.9 + + x243 + 16.3 22.7 43.9 72.8 + - x253 5.2 4.5 6.6 7.0 + - x253 十 12.5 26.9 57.8 83.7 -75- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7

具、、果為：於誘導時與 群，或僅於CTL誘導時添加 ^養―兩方添加樣品之族 培養後，皆保持特里性令έ 、樣σ〇之族群，在14日的擴大 。丁付共性向細 是CTL誘導時戋擴大 σ /舌性。另一方面，無論 f τ ^你大培蚕時 ^ 聚糖之族群中’其活性則明顯下：：：目昆布由來之岩藻 酸性糖，即可以長期保 + '、即，誘導時若添加 CTL，盥_大谇| : 、呵、、，田胞傷害活性之狀態擴大培養 二： 酸性糖之添加與否無關連。 错由以上之纟士耍可λ· # 者或兩方比: 〇,猎由CTL誘導時或擴大培養時任一 者或兩方s添加酸性糖， 狀態擴大培養CTL。 ^㈣保持心胞傷害活性之 實施例3與REM法之比較及與贿法之 實施例3-1 (1)抗流感病毒記憶Ctl之誘導 使用以與實施例⑴記載之方法所分離、保存中之 四’亚以與實施例相同之方法進行抗流感病毒 ，憶CTL之誘導。&時，力培養基中㉟加製造例（所配製之 蘢目昆布由來之岩藻聚糖使其最終濃度達i〇 pg/mi作為樣 。口，另外，亦设定為未添加樣品之族群。抗原胜肽則使用 FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第、14日CTl之細胞傷害活性以實 施例1-1-(3)之相同方法評估。 (2) CTL之擴大培養 實施例3-1-(1)所配製之（：7^以51^]?組清洗後，配製為5>< 104cells/ml。另一方面，以X光照射以與實施例相 73215-931112.doc - 76 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 _ _ B7 五、發明説明（74 ) _ ~" - 同方法採取之HLA-A24及Α2· 1非保持all〇genic pBMC (3300R)，再以培養基清洗後配製成5xl〇6cells/ml。將此等 CTL (2.5x1 〇4 cells)與 ailogenic PBMC (ΐ 25χ1〇7 —⑷懸浮 於10 ml之5HRPMI中，再進一步加入最終濃度5〇 ng/ml之抗 CD3抗體（Yansen合作公司製）後放入12·5 cm2之燒瓶（Falc〇n 么司‘）’置入3 7 C之濕式C Ο2培育箱中培養14日。此時， 分別設定於培養基中添加製造例1所配製之籠目昆布由來之 岩藻聚糖使其最終濃度達10 μ g/ml以作為樣品之族群，與 未添加之族群。期間完全不添加藉由胜肽之刺激，培養開 始第1日添加最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始 後第4曰以後，每2- 3曰去除一半上清液後，於各瓶中添加5 ml之含60 U/ml IL-2之5HRPMI。此時，於樣品添加族群之 培養基中添加製造例1所配製之籠目昆布由來之岩藻聚糖使 其敢終、/辰度達10 μ g/ ml。擴大培養開始後，第14曰以與實 施例1 - 1 - ( 3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性， 其結果如表16所示。 另一方面，利用REM法之擴大培養則如以下般實施之。 以 X 光照射 HLA-A24 及 Α2· 1 非保持 allogenic PBMC ( 3300R)，再以培養基清洗後配製成5><i〇6 ceiis/mb此外， 將Epstein-Barr Virus感染人類B細胞株（EBV-B細胞）以X光 照射（8000R) ’再以培養基清洗後配製成1X 1 〇6 cells / ml。將 實施例 3-1-(1)所配製之 CTL (2· 5 X 104 cells)與 allogenic PBMC ( 1 · 25x 107 cells)、EBV- B 細胞（2· 5x 106 cells)懸浮於 10 ml之5HRPMI中，再進一步加入最終濃度50 ng/ml之抗 -77- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（75 ) CD3抗體（Yansen合作公司製）後，放入12.5 cm2之燒瓶 (Falcon公司製），置入37°C之濕式C02培育箱中培養14曰。 此時，分別設定於培養基中添加製造例1所配製之籠目昆布 由來之岩藻聚糖使其最終濃度達10 μ g/ml以作為樣品之族 群，與未添加之族群。除EBV- B細胞以外，與上述相同配 製之燒瓶亦以與上述相同培養之。期間完全不添加藉由胜 肽之刺激，培養開始第1曰添加最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始後第4日以後，每2- 3日去除一半上清液 後，於各瓶中添加5 ml之含60 U/ml IL-2之5HRPMI。此 時，於樣品添加族群之培養基中添加製造例1所配製之籠目 昆布由來之岩藻聚糖使其最終濃度達10 μ g/ml。擴大培養 開始後，第14日以與實施例1- 1-( 3)相同之方法測定CTL之 特異性細胞傷害活性，其結果如表17所示。 表1 6 樣品 樣品添加 EBV-B 細胞 添加 擴大 增殖率 胜肽 添加 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 3 E/T比 10 30 對照 - - X494 - 1.2 2.0 8.4 - - - X494 + 14.7 38.8 70.3 籠目昆布由來 - + - X694 - 2.2 5.8 7.8 岩藻聚糖 - + - x694 + 26.4 62.3 83.8 + - - x488 - 3.2 7.2 18.5 + - - x488 + 44.7 84.2 102.6 + + - x513 - 3.2 5.4 7.6 + + - x513 + 47.4 87.0 108.3 73215-931112.doc - 78 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（76 ) 表1 7 才篆品 樣品添加 EBV-B 細胞 添加 擴大 增殖率 胜肽 添加 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 3 E/T比 10 30 對照 - - - X494 - 1.2 2.0 8.4 - - - X494 + 14.7 38.8 70.3 REM法 - - + X713 - 0 0 4.8 - - + X713 + 27.5 68.4 94.9 REM籠目昆布 - + + x656 - 0.8 0.8 0 由來岩藻聚糖 - + + x656 + 35.2 74.1 102.8 + - + x662 - 1.1 1.8 6.2 + - + x662 + 72.7 95.3 92.8 + + + x638 - 0 1.5 4.8 + + + x638 + 65.0 88.5 98.6 其結果為：在未添加籠目昆布由來之岩藻聚糖下誘導之 CTL (未添加CTL誘導劑），以REM法擴大培養情況下可維 持其高鈿胞傷害活性。然而，未使用EB V- B細胞之以REM 法所進行之擴大培養中，其細胞傷害活性明顯下降。 另一方面，只要於CTL誘導時與擴大培養時兩方或任一方 事先添加籠目昆布由來之岩藻聚糖，即使未添加EBV- B細 胞，其14日之大量培養後亦可維持其非常高之CTL細胞傷害 活性。再者，根據本發明之擴大培養後之抗原特異性細胞 傷害活性與REM法相較下則為較高。 另外，以REM法擴大培養之情況下，先建立擴大培養， 只要於CTL誘導開始事先添加具本發明方法之CTL活性維持 效果的化合物之一的籠目昆布由來之岩藻聚糖，再藉由以 習知技術誘導之CTL細胞，僅利用REM法擴大培養即可維持 其高細胞傷害活性。 73215-931112.doc ~ 79 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 77 1235764 五、發明説明（ 擴：：養::本：明,，添加具CTL活性維持效果之化合物以 要，;蚕方法中，利用REM法所必須之Εβν·Β細胞為非必 REM法,避使用聊1細胞之危險性。再者，可維持較 方、、二之CTL活性，由此可知，本發明之CTL細胞之擴大 方法係較REM法更安全之優異方法。 :者，只要本發明所使用之化合物導入纖法即可進一 養維持高活性之CTL。，亦即’本發明所使用之化 於所有的CTL之擴大培養方法皆適用，藉由於各種 ⑽擴大方”使用本發明中被使用之化合物，可特= 的長期維持兩細胞傷害活性之狀態。 實施例3-2 " (1) 抗流感病毒記憶Ctl之誘導 使用以與只施例卜L⑴記载之方法所分離、保存中之 ’並以與實施例Η·(2)相同之方法進行抗流感病毒 =:CTL之誘^。此時，於培養基中添加透明質酸使其最 、、、/辰度達10 μ§/ηιΗφ為樣品，另外，亦設定為未添加樣品 之族群。 ^如此·所配製之誘導開始後第14日CTL之細胞傷害活性以實 施例1 1 (3)之相同方法評估。抗原胜肽則使用FluMPA2. 1。 (2) CTL之擴大培養 貝^例3·2·(丨）所配製之CTL以與實施例3- 1-(2)同樣進行 擴大:養此4，分別設定於培養基中添加透明質酸使其 最、/辰度達1 〇 μ g/ ml以作為樣品之族群，與未添加之族 群°期間元全不添加藉由胜肽之刺激，培養開始第1日添加 73215-931112.doc -80- >X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（78 ) 最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始後第4曰以 後，每2- 3日去除一半上清液後，於各瓶中添加5 ml之含60 U/ml IL-2之5HRPMI。此時，於樣品添加族群之培養基中 添加透明質酸使其最終濃度達10 μ g/ml。擴大培養開始 後，第14曰以與實施例1- 1-( 3)相同之方法測定CTL之特異 性細胞傷害活性，其結果如表1 8所示。 表1 8 樣·品 樣品添加 EBV-B 細胞 添加 擴大 增殖率 胜肽 添加 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 E/T比 10 對照 - - - x392 - 6.2 - - - X392 + 10.6 透明質酸 + + - X335 - 2.3 + + - X335 + 60.0 REM法 - - + X427 - 11.5 - - + X427 + 52.8 REM 法+ + + + X587 - 8.1 透明質酸 + + + X587 + 95.5

其結果為：在未添加透明質酸下誘導之CTL (未添加CTL 活性維持試劑），以REM法擴大培養情況下可維持其高細胞 傷害活性。然而，未使用EB V- B細胞之以REM法所進行之 擴大培養中，其細胞傷害活性明顯下降。 另一方面，只要於CTL誘導時與擴大培養時兩方事先添加 透明質酸，即使未添加EBV- B細胞，其14日之大量培養後 亦可維持其非常高之CTL細胞傷害活性。再者，根據本發 明之擴大培養後之標的特異性細胞傷害活性與REM法相較 下則為較高。 另外，以REM法擴大培養之情況下，先建立擴大培養， 73215-931112.doc - 81 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764

”要於CTL誘‘開始事先添加具本發明方法之。丁[活性維持 效果的化合物之一的透明質酸，再藉由以習知技術誘導之 CTL細胞，僅利用REM法擴大培養即可維持其高細胞傷害活 性。 亦即，根據本發明之CTL擴大培養方法中，利用REM法所 必須之EB V- B細胞為非必要，可迴避使用EB v_ B細胞之危 險性。再者，可維持較REM法高之CTL·活性，由此可知，本 务明之CTL細胞之擴大方法係較REm法更安全之優異方法。 再者，只要將透明質酸導入REM法即可進一步擴大培養 維持高活性之CTL，本發明所使用之化合物對於所有的CTL 之擴大培養方法皆適用，藉由於各種CTL擴大方法中使用 本發明中被使用之化合物，可以特異性的長期維持高細胞 傷害活性之狀態進行CTL之擴大培養。 實施例4使用透明質酸之特異性細胞傷害活性保持CTLi 擴大培養 實施例4- 1 (1)抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例υ記載之方法所分離、保存中之 PBMC，亚以與實施例丨_丨、])相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，添加透明質酸（Calbi〇chem&司製） 使其最終濃度達1〇 μ g/ml，另外，亦設定為未添加樣品之 族群。抗原胜肽則使用FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14曰CTL之細胞傷害活性以實 施例1-1-(3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 73215-931112.doc - 82 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764

異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 … (2) CTL之擴大培養 貫施例肛1^1)所配製之CTL以與實施例2-1-(2)同樣之方 法，進仃CTL之擴大培養。此時，分別設定於培養基中添 ^與實施例^^(1)之CTL誘導之際所添加之透明質酸使其 最終濃度達1G pg/ml以作為樣品之族群，肖自誘導開始完 全未添加透明質酉曼之族冑。期間完全不添加藉由胜肤之刺 激，培養開始第1日添加最終濃度為12〇⑴如之江」，進一 步培養開始後第4日以後，每2·3日去除_半上清液後，於 各瓶中添加5 ml之含60 u/ml IL-2之及1〇 pg/mi透明質酸之 5HRPMI。此時，於樣品添加族群之培養基中添加透明質酸 使其最終濃度達10 μ§/ϊη1。然而，未添加樣品之族群中， 即使在更換培養基之際，亦不進行樣品之添加。擴大培養 開始後，第14日以與實施例:^-(3)相同之方法測定CTL之 特異性細胞傷害活性，其結果如表19所示。

13.1 17.0 90.8 1Q5.6 其結果為：CTL誘導時及擴大培^ 表1 9 73215-931112.doc - 83 -

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五、發明説明（81 中’在14日的擴大培養後，亦保持牲 .^ 什符特異性咼細胞傷害活 性。另一方面，無論是CTL誘導時哎^ ^ 叮丁必擴大培養時皆未沢 樣品之族群中，其活性則明顯下降。 外刀口 |牛亦即，CTL誘導時乃 擴大培養時添加透肅，可特異性的長期保持 害活性之狀態進行CTL之擴大培養。 另 實施例4-2 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施例i-hU)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，並以與實施例1- 1-(2)相同之方法進行抗流感病毒 記憶CTL之誘導。此時，於培養基中添加透明質酸使其最 終濃度達10 μ g/ml作為樣品，另外，亦設定為未添加樣I 之族群。抗原胜肽則使用FluMPA2. 1。 如此所配製之誘導開始後第14日CTL之細胞傷害活性以實 施例1- 1- ( 3)之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 (2) CTL之擴大培養

實施例4-2-(1)所配製之CTL以與實施例2-1-(2)同樣之方 法，進行CTL之擴大培養。此時，完全不添加實施例 之CTL誘導之際所添加之透明質酸。期間完全不添加藉由胜 肽之刺激，培養開始第1日添加最終濃度為12〇 u/ml之IL-2’進一步培養開始後第4日以後，每2-3曰去除一半上清液 後，於各瓶中添加5 ml之含60 U/ml IL-2之5HRPMI。擴大培 養開始後，第1 4曰以與實施例1-1-(3)相同之方法測定CTL -84- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7 __B7 五、發明説明（82 ) 之特異性細胞傷害活性，其結果如表2〇所示。 表20 樣品 樣品添加 擴大增 殖率 胜肽添 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 加 1 E/T比 3 10 30 對照 - - X480 - 0 0 0.4 6.8 * - X480 + 4 11.2 29.3 59.7 透明質酸 + + X423 - 0 0 1.9 14.3 + + X423 + 7.2 23.3 59.6 85.1 + - X393 - 3.0 1.4 4.7 9.3 + - X393 + 9.9 22.1 47.7 78.0 其結果為·僅於C T L誘導時添加透明質酸之族群中，即使 在擴大培養時未添加透明質酸，在14日的擴大培養後，亦 保持特異性局細胞傷害活性。另一方面，無論是CTL誘導 時或擴大培養時皆未添加透明質酸之族群中，其活性則明 顯下降。亦即，僅於CTL誘導時添加透明質酸，即可特異 性的長期保持高細胞傷害活性之狀態進行CTL之擴大培 養。 貫施例5保持腫瘤關連抗原特異性細胞傷害活性之ctl之 擴大培養 實施例5- 1 (1)腫瘤關連抗原（MAGE3)特異性CTL之誘導 使用以與實施例1-1-(1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC ’進行腫瘤關連抗原（MAGE3)特異性CTL之誘導。腫 瘤關連抗原（MAGE3)特異性CTL之誘導係使用改變一部份 之 Plebanski 等之方法（Eur. J. Immunol ( 1994) 25; 1783_ -85- 73215-931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（83 ) 1787)實施之。亦即，將實施例1- 1-( 1)所配製之PBMS懸浮 於含5%人類AB型血清、0. 1 mM非必須胺基酸、1 mM丙 酮酸鈉、2 mM L-glutamine (皆由 Bio Whittaker 公司製）、 10mM HEPES(Nakaraitesuku公司製）、1%鏈黴素盤尼西林 (GIBCO BRL公司製）之RPMI 1640培養基（Bio Whittaker 公 司製）（以下簡稱為5HRPMI)中，使其成為2-4x 107 cells/ml 後分成一半。一半量作為反應者細胞置於冰上保存，另一 半量用作抗原呈現細胞，添加等量含作為抗原胜肽之80 μ g/ ml黑色素瘤（melanoma)抗原MAGE3由來抗原表現胜肽 (序列表之序列編號：3所記載之黑色素瘤抗原MAGE3由來 HLA Α2.1結合性胜肽FLWGPRALV)及6 pg/ml之冷2微球蛋 白（microgolobulin，Sukuripusu 公司製）之 5HRPMI，置於 5% <302濕式培育箱内，37°C培育2小時。接著再以5HRPMI清 洗，與置於冰上保存之反應者細胞混合後，配製為2x 106 cells/ml。添加IL- 7及KLH使其最終濃度分另達25 ng/ml、5 μ g/ml，以每孑匕2 ml加入24孑L細胞培養盤（Falcon公司製）， 此時，於培養基中添加L. M· W·肝素（生化學工業公司製）或 透明質酸（Calbiochem公司製）使其最終濃度達10 pg/ml作為 樣品，另外，亦設定未添加樣品之族群為對照組。培養盤 置於5% C02中以37。(：培養。 培養開始後第4日去除一半上清液後，於各孔中添加1 ml 含60 U/ml IL-2與10 pg/ml L.M. W·肝素或透明質酸之 5HRPMI (對照組中僅含il- 2)。 第7曰時以與上述相同方法配製抗原呈現細胞後，以X光 73215-931112.doc - gg . 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（84 ) 照射（ 5500R)，再配製為4xl06cells/m卜將經1週培養之反 應者細胞懸浮於5HRPMI中使其成為2x 106 cells/ml，再與已 配製之抗原呈現細胞等量混合後，以每孔1 ml加入24孔細 胞培養盤，進一步添加最終濃度為25 ng/ ml之IL- 7進行再刺 激。此時，添加L· M. W·肝素或透明質酸使其最終濃度達1 〇 μ g/ml (對照組則不添加）。再刺激後第1日，於各孔中添加 1 ml含60 U/ml IL-2與10 pg/ml L.M. W.肝素或透明質酸之 5HRPMI (對照組中僅含IL- 2)，第3曰時去除一半培養上清 液後，分別添加1 ml與去除前相同内容之培養基。以j週i 次進行相同之再刺激，總共實施4次以誘導CTL。 (2) CTL細胞傷害活性之測定 實施例5- 1-(1)所配製之CTL誘導開始後第35曰的ctl之 特異性細胞傷害活性，以與實施例1- 1- ( 3)相同之方法測定 之。然而’此時使用在與抗原決定部位胜肽共培養1夜，或 在非抗原決定部位胜肽存在下所培養之HL A- A2 · 1保持eb V 轉形B細胞（細胞名221 Α2· 1)作為標的細胞。 其結果為·誘導不久後’特異性細胞傷害活性雖被誘 導，但誘導時L· M. W·肝素或透明質酸添加的添加與否，對 於細胞傷害活性並無差別。 (3) CTL之擴大培養 使用實施例5-1-(1)所配製之CTL，以與實施例2-1-(2)同 樣之方法’進行CTL之擴大培養。此時，分別設定添加與 κ例5- 1- (1)之CTL誘導之際所添加之l· μ· w·肝素或透明 質酸使其最終濃度達10 eg/ml以作為樣品之族群，與自誘 73215-931112.doc - 87 -

1235764 A7 B7 五、發明説明（85 ) 導開始完全未添加透明質酸之族群。期間完全不添加藉由 胜肽之刺激，培養開始第1日添加最終濃度為120 U/ml之IL-2，進一步培養開始後第4日以後，每2- 3日去除一半上清液 後，於各瓶中添加5 ml之含60 U/ ml IL- 2之及10 μ g/ ml L. M. W.肝素或透明質酸之5HRPMI。然而，未添加樣品之 族群中，即使在更換培養基之際，亦不進行樣品之添加。 擴大培養開始後，第14日以與實施例1- 1- ( 3)相同之方法測 定CTL之特異性細胞傷害活性，其結果如表2 1所示。 表2 1 樣品 樣品添加 擴大增 胜肽添 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 殖率 加 E/T比 2 6 對照 - - X237 - 0 0 - - X237 + 29.8 56 E/T比 3 9 L.M.W.肝素 + + X433 擊 2.6 3.7 + + X433 + 65.3 104.8 E/T比 2 6 透明質酸 + + X217 3.6 0 + + X217 + 50.3 67.7 其結果為：CTL誘導時及擴大培養時添加L.M.W.肝素或 透明質酸之族群中，CTL在14曰的擴大培養後，亦保持特異 性高細胞傷害活性。另一方面，無論是CTL誘導時或擴大 培養時皆未添加樣品之族群中，其活性則明顯下降。亦 即，即使在腫瘤關連抗原（MAGE3) CTL擴大培養時，藉由 CTL誘導時及擴大培養時添加L.M. W.肝素或透明質酸，可 73215-931112.doc - 88 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7

在特異性的長期保持高細胞傷害活性之狀態下進行匚丁1之 擴大培養。 實施例5 - 2 (1) 腫瘤關連抗原（MARTI)特異性CTL之誘導 使用以與實施例1-1-(1)記載之方法所分離、保存中之 PBMC，以與實施例^^(^相同之方法進行腫瘤關連抗原 (MARTI)特異性CTL之誘導。使用黑色素瘤抗原Marti* 來抗原表現胜肽（序列表之序列編號：4所記載之黑色素瘤 抗原MARTI由來HLA Α2· 1結合性胜肽AAGIGILTV)作為抗 原胜肽。此時，添加籠目昆布由來之岩藻聚糖或透明質酸 (Calbiochem公司製）使其最終濃度達1〇 gg/w作為樣品另 外，亦設定未添加樣品之族群為對照組。 如此所配製之誘導開始後不久的CTL之細胞傷害活性以實 施例1 - 1 - ( 3)之相同方法評估。然而，此時使用在非抗原決 定部位胜肽存在下所培養之HLA-Α2· 1保持EBV轉形B細胞 (細胞名221A2. 1)、在2夜1〇〇 u/ml INF- r存在下所培養之 HLA-Α2· 1載癌細胞株（細胞名624; HLA-Α2· 1非保持 M ART 1表現細胞）作為標的細胞。 其結果為：誘導不久後，特異性細胞傷害活性雖被誘 導，但誘導時樣品添加之有無，對於細胞傷害活性並無差 別。 (2) CTL之擴大培養 使用實施例5-2-( 1)所配製之ctl，以與實施例2- 1-( 2)同 樣之方法，進行CTL之擴大培養。此時，分別設定於培養 73215-931112.doc _ gg _ 本紙張尺度適财酬冢料(CNS) A4規格(Γ1()χ 297公董) 1235764五、發明説明（87 A7 B7

基中添加與實施例5_2_(1)之CTL誘導之際所添加之蘢目曰 布由來之岩藻聚糖或透明質酸使其達1〇 μβ/ηι1以作為= 之族群，與自誘導開始完全未添加樣品之族群。期間完二 不添加藉由胜肽之刺激，培養開始第1日添加最終濃产: 12〇 U/ml之IL·2，進—步培養開始後第4日以後，每2 3曰去 除一半上清液後，於各瓶中添加5ml之含6〇u/mi江'2之及 1〇 μ#籠目昆布由來之岩藻聚糖或透明質酸之卿謝。 然而’未添加樣品之族群中，即使在更換培養基之卜亦 不進行樣品之添加。擴大培養開始後，第14曰以與；施例 1-1-(3)相同之方法测定C7X之特異性 果如表22所示。 -I田胞傷害活性，其結 73215-931112.doc - 90 -

1235764 A7 B7 五、發明説明（88 ) 表22 樣品 樣品添加 擴大 增殖率 胜肽 添加 標的 細胞傷害活性(％) CTL 誘導時 擴大 培養時 細胞 2 E/T比 7 20 對照 - - X287 - 221A2.1 0 3.8 4.1 - - X287 + 221A2.1 8.1 27.5 43.5 - - X287 - 888mel 32.5 44.8 43.7 - - X287 - 624mel 27.4 55.8 81.6 E/T比 2 6 17 籠目昆布 + + X240 - 221A2.1 0 0 0 由來岩藻 + + X240 + 221A2.1 28.8 63.2 84.0 聚糖 + + X240 - 888mel 8.2 22.4 19.2 + + X240 .- 624mel 40.7 78.5 92.2 E/T比 2 6 17 透明質酸 + + X217 - 221A2.1 0 0 0 + + X217 + 221A2.1 9.1 52.8 74.4 + + X217 - 888mel 0 0 0 + + X217 - 624mel 29.6 73.8 90.6 其結果為：CTL誘導時及擴大培養時添加籠目昆布由來之 岩藻聚糖或透明質酸之族群中，CTL在14日的擴大培養後， 亦保持特異性高細胞傷害活性。另一方面，無論是CTL誘 導時或擴大培養時皆未添加樣品之族群中，其活性則明顯 下降。此外，關於腫瘤細胞株相對之特異性細胞傷害活 性，CTL誘導時及擴大培養時添加籠目昆布由來之岩藻聚 糖或透明質酸之族群中，CTL即使在14日的擴大培養後，亦 保持特異性高細胞傷害活性。亦即，即使在腫瘤關連抗原 73215-931112.doc - 91 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1235764

(MARTI) CTL擴大培養時，#φ(：：ΤΙ^導時及擴大培 添加籠目昆布由來之岩藻聚糖或透明質酸，可在:性守 長期保持高細胞傷害活性之狀態下進行之擴大谇、勺 貫施例6藉由抗體結合磁性珠之細胞師選 $ < 貫施例6- 1 (1) 抗流感病毒記憶CTL之誘導 使用以與實施m].⑴記載之方法所分離、保存中之 =c，並以與實施例^卜⑺相同之方法進行抗流感病毒 π己憶CTL之料。此時’於培養基中添加籠目昆布由來之 =蒸聚糖使其最終濃度達Ι0μ§/Π11作為樣S，另夕卜，亦設 定為未添加籠目昆布由來之岩藻聚糖之族群。 如此所配製之誘導開始後第14日CTL之細胞傷害活性以實 施例1-1-⑺之相同方法評估。其結果為：誘導不久後，特 異性細胞傷害活性雖被誘導，但誘導時樣品添加之有無， 對於細胞傷害活性並無差別。 (2) CTL之擴大培養 使用實施例6_i•⑴所配製之CTL，以與實施例-⑺同 樣之方法進行CTL之擴大培養。此時，分別設定於培養 基中添加籠目昆布由來之岩藻聚糖使其最終濃度達ι〇 μ g/jnl以作為樣品之族群，與、未添加之族群。期間完全不添 力藉由胜肤之刺激，培養開始帛工日添加最終濃度為1 、/之IL 2，進一步培養開始後第4日以後，每日去除 半上，月液後’於各瓶中添加5 ml含6〇 之 5HRPMI。此時’於樣品添加族群之培養基中添加籠目昆布 73215-931112.doc

X 297公釐） 1235764 A7 B7 五、發明説明（90 ) 由來之岩藻聚糖使其最終濃度達10 μ g/m卜擴大培養開始 後，第14曰以與實施例1- 1-( 3)相同之方法測定CTL之特異 性細胞傷害活性。 (3)藉由抗體結合磁性珠之細胞篩選 以實施例6- 1 - (2)所配製之擴大培養後的CTL以冰浴後之 2% FBS/PBS清洗後，於相同之緩衝液中配製為1 X 107 cells/ml，於此等細胞懸浮液中，添加1 50 μ 1相當於1 X 107 cells細胞之Dynabeads Μ-450 CD4 (抗體CD4結合磁性珠， Dainaru公司製），其中Dynabeads M-450 CD4以已事先冰浴 之2% FBS /PBS清洗。含珠之細胞懸浮液於4°C緩慢搖晃培 育30分鐘，於裝入培育後之細胞懸浮液的試管中加入冰冷 之2% FBS/PBS，使用Dynabeads用磁石台（Dainaru公司製） 去除珠與珠結合細胞。如此所得之抗CD4抗體結合珠非結 合細胞集團及篩選前之細胞集團可以流量血球計數器確認 其CD8+細胞之含有率。其結果如表23所示。再以實施例1-1- ( 3)相同之方法測定CTL之特異性細胞傷害活性，其結果 如表24所示。 73215-931112.doc ~ 93 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（91 ) 表23 樣品 樣品添加 EBV-B CDB+細胞含有率(％) CTL誘導時 擴大培養時 細胞添加 篩選前 篩選後 對照組 - - - 18.1 88.0 嘴1目昆布由 來岩藤聚糖 + + - 32.5 97.2 REM 法+ 嘴1目昆布由 來岩藻聚糖 + + + 55.8 97.3 表24 樣品 樣品添加 EBV-B 添加 細胞傷害活性(％) CTL 擴大 細胞添加 胜肽 (E/T 比=30) 誘導時 培養時 選擇前 選擇後 對照組 - - - 10.4 9.4 - - - + 24.0 21.1 説目昆布由 + + - - 7.6 8.4 來岩藻聚糖 + + - + 41.8 75.3 REM 法+ + .+ + - 4.2 6.7 籠目昆布由 來岩藻聚糖 + + + + 87.8 88.2 其結果為·· CTL誘導時及擴大培養時添加籠目昆布由來之 岩藻聚糖或透明質酸之族群中，藉由以抗體結合珠篩選細 胞，其細胞傷害活性變得更高。另外，藉由REM法擴大培 養CTL後，即使以抗體結合珠篩選細胞，其細胞傷害活性 也不變。再者，藉由REM法與籠目昆布由來之岩藻聚糖添 加之併用條件下擴大培養後，以抗體結合珠_選細胞，可 發現其細胞傷害活性變為更高。 序列表 序列編號1 :係為基於流感病毒由來之核蛋白所設計之 HLA A24結合性胜肽。 73215-931112.doc - 94 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（92 ) 序列編號2 :係為基於流感病毒由來之基質蛋白所設計之 HLA A2.1結合性胜肽。 序列編號3 ··係為基於黑色素瘤抗原MAGE3由來之HLA A2. 1結合性胜肽所設計之胜肽。 序列編號4 :係為基於黑色素瘤抗原MARTI由來之HLA A2. 1結合性胜肽所設計之胜肽。 產業上之利用可能性 根據本發明，提供誘導、維持及擴大培養CTL之方法，其 中CTL係以高水準保持其抗原特異性細胞傷害活性者，該 方法對於需要大量CTL之授受性免疫療法等之細胞醫療領 域極為有用，另外，以該方法所配製之CTL係以安全之方 法配製，可作為安全性極高之醫藥使用。 73215-931112.doc - 95 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（（1)) 序列表 <110〉寶酒造股份有限公司 <120>抗原特異性殺手T淋巴球之擴大方法 <130> 01-056-TW <150> JP 2000-247072 <151〉 2000-08-16 <160> 4 <210〉 1 <211〉 10 <212> PRT <213〉人造序列 <220〉 <223〉基於流感病毒由來之核蛋白所設計之胜肽 <400> 1

Arg Phe Tyl lie Gin Met Cys Thr Glu Leu 5 10 <210> 2 <211〉 9 <212〉PRT <213>人造序歹丨J <220> <223>基於流感病毒由來之核蛋白所設計之胜肽 <400> 2

Gly lie Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 73215-931112.doc · 1 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1235764 A7 B7 五、發明説明（（2)) 5 <210> 3 <211〉 9 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223〉基於黑色素瘤抗原MAGE3由來之HLA A2.1結合胜肽所 設計之胜肱 <400> 3

Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 5 <210〉 4 <211> 9 <212〉PRT <213>人造序歹丨J <220> <223>基於黑色素瘤抗原MARTI由來之HLA A2.1結合胜肽所 設計之胜肱 <400> 4

Ala Ala Gly lie Gly lie Leu Thr Val 5 73215-931112.doc ~ 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8

   1235764 -------— ’ 六、申請專利範園 二細胞傷害性T細胞之方法，該τ細胞具有抗原特 J ^胞傷害活性4包含在由酸性多糖、酸 糖、酸性單糖及彼等之鹽類所組成之群中所選出的至少 -：化合物作為有效成分之存在下，將對細胞傷害性τ ::::之分化能力之前趨細胞，與抗原呈現細胞作培 2. 請專利範圍第1項之方法，其中該化合物係由岩 你來 肝素、藻酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素Β、果 酉二透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡糖、硫酸化 石澡糖及彼等之鹽類所組成之群中選出的至少一種者。 3. 一種維持細胞傷害性τ細胞之方法，該Τ細胞具有抗原特 異性之細胞傷害活性，其包含在由酸性多糖、酸性寡 糖、酸性單糖及彼等之鹽類所組成之群中所選出的至少 種化σ物作為有效成分之存在了，持續培養細胞傷害 性Τ細胞之步驟。 ° 4· H中請專利範圍第3項之方法，其中該化合物係由岩 =♦糖、肝素、藻酸、硫酸軟骨素Α、硫酸軟骨素Β、果 酉二:透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡*、硫酸化 岩澡糖及彼等之鹽類所組成之群中選出的至少一種者。 5· 一種擴大培養細胞傷害性τ細胞之方法，該τ細胞具有抗 ^特異性之細胞傷害活性，其包含在由酸性多糖、酸性 募糖、酸性單糖及彼等之鹽類所組成之群中所選出的至 ^種化合物作為有效成分之存在下，培養細胞傷害性 丁細胞之步驟。 73215-931112.doc _ 本紙張尺度適财國國家標準(CNS) A4規格_χ297公幻

   1235764 --~一—.— 六、申請專利範圍 6·根據申請專利範圍第$苜 .,^ 止 祀国弟5項之方法，前述步騍中，更進一 v在CD3抗體存在下士立表細 7拍城士 σ養、、，田胞傷害性T細胞0 .才又據申請專利範圍第5項或第6項之方法，前述步驟中， 其中將細胞傷害性了細胞與回饋者細胞一起语養。 8·根據中請專利範圍第7項之方法，纟中㈣者細胞係為 非病毒感染細胞。 9·，據申請專利範圍第5項之方法，其中之化合物係由岩 澡聚糖、肝素、藻酸、硫酸敕骨素A、硫酸軟骨素B、果 酉夂、透明質酸、岩藻聚糖分解物、硫酸化葡糠、硫酸化 岩藻糖及彼等之鹽類所組成之群中選出的至少一種者。 10.-種細胞傷害性丁細胞之回收方法，其係包含從經由申 請專利範圍第1項至第9項中咎—TS ^ 、〒任一項之方法所侍之細胞傷 害性T細胞含有培養物中，筛選細胞集團之步驟，其中 該細胞集團係高量含有具抗原特異性細胞傷害活性之細 胞傷害性T細胞者。 -2 - 73215.931112.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1235764 申請曰期 ^ . ^ . f ^ 案 號 090120130 類 別 (以上各欄由本局填註） Α4 C4 中文說明書替換本(93年11月） 專利説明書 抗原特異性之細胞傷害性T細胞擴大培養方法 METHODOF EXTENSIVE CULTUREOF ANTIGEN-英 文 SPECIFIC CYTOTOXIC T CELLS 中 文 姓 名 國 1·佐川裕章 2·出野美津子 3·加藤郁之進 1-3均曰本 HIROAKI SAGAWA MITSUKO IDENO IKUNOSHIN KATO 發明 人 住、居所 1 ·曰本國滋贺縣草津市西涉川二丁目6 - 3 2 2·曰本國京都府京都市右京區太秦乾町28番地7 3·曰本國京都府宇治市南陵町1-1-150 裝 姓 名 (名稱） 國 籍 日商寶生物股份有限公司 TAKARA BIO INC. 曰本 線 申請人 住、居所 (事務所) 代表人 姓 名 曰本國滋贺縣大津市瀨田三丁目4番1號 加藤郁之進 KATO, IKUNOSHIN 73215-93111: _doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)