CN111518216B - 多肽、含有多肽的组合物及其在肿瘤免疫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多肽组合物、其包括衍生于选自eEF2、HSP105、MCL‑1、MUC1、PSF1和Survivin中的一种或多种的肽段以及一种分离的融合多肽，其包含共价连接的、衍生于选自eEF2、HSP105、MCL‑1、MUC1、PSF1和Survivin中的两种或两种以上的肽段。本发明提供的多肽和多肽组合物免疫源性高，能够有效地诱导DC成熟，与DC孵育后能够显著刺激T细胞的增殖和IFN‑γ的分泌进而提高T细胞的杀伤力，并且不会诱导DC发生细胞凋亡，也不会诱导DC的免疫抑制性受体表达上调，具有非常优异的免疫细胞治疗潜力和潜在的抗肿瘤效果。

Description

多肽、含有多肽的组合物及其在肿瘤免疫中的应用
技术领域
本发明涉及医学免疫学领域，具体地涉及一种多肽、含有多肽的组合物及其在肿瘤疫苗中的应用。
背景技术
树突状细胞(Dendritic Cells,DC)因其具有启动和调控天然免疫和获得性免疫的能力，被认为是一类独特的免疫细胞。DC自身在肿瘤的免疫监控中起到了非常关键的作用。在正常环境下，DC通常维持在一种未成熟的且未激活的状态，直到其被暴露于较佳的免疫刺激下，如炎症细胞因子、微生物因子或内源警报素(Nie,Y.et al.(2016)Alarmins andantitumor immunity.Clin.Ther.38,1042–1053)。一旦被激活，DC将迅速成熟并对抗原进行加工，并通过其表面的主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)分子将加工后的抗原呈递到T细胞。尽管所有的DC都是专门的抗原呈递细胞(Antigen-Presenting Cell，APC)，特定的DC亚群具有特定的抗原加工机制并分别擅长于激活CD4+或CD8+体细胞。经典的常规DC大体上被分为两个亚群，即CD1c+DC和CD141+DC。CD1c+DC是迁移型的DC，主要被认为激活CD4+T细胞。而CD141+DC主要是常驻***的细胞，具有更强的抗原交叉呈递能力并主要负责CD8+T细胞的激活。DC还通过“变装”(cross-dressing)这一过程将抗原转移给常驻***的DC(Allan,R.S.et al.(2006)Migratory dendritic cellstransfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population forefficient CTL priming.Immunity 25,153–162；Carbone,F.R.et al.(2004)Transfer ofantigen between migrating and lymph node-resident DCs in peripheral T-celltolerance and immunity.Trends Immunol.25,655–658)，或从外泌体(exosome)、被感染的APC或凋亡细胞获取抗原(Pitt,J.M.et al.(2016)Dendritic cell-derived exosomesfor cancer therapy.J.Clin.Invest.126,1224–1232；Thery,C.et al.(2002)Indirectactivation of naive CD4+T cells by dendritic cell-derivedexosomes.Nat.Immunol.3,1156–1162)，以此进一步扩大了免疫应答的范围。
肿瘤免疫治疗现在已经成为一种及具吸引力的癌症治疗模式，在外科手术、放疗和化疗之外被认为是第四种癌症治疗方式。肿瘤疫苗被认为是一种积极的肿瘤免疫治疗方式，能够激活免疫***，通过用衍生自肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的多肽、重组TAA蛋白、编码TAA的病毒载体或负载TAA的DC靶向肿瘤细胞上表达的TAA进而选择性地摧毁肿瘤细胞。积极的肿瘤免疫治疗包括以下几种策略：基因治疗、修饰的肿瘤全细胞免疫、基于DC的疫苗和肿瘤相关抗原衍生多肽疫苗。靶向肿瘤抗原的DC疫苗一直都是免疫治疗中的重要分支，其目的在于提升病人自己的对抗其自身体内肿瘤的免疫应答。此外，基于细胞的治疗由于其毒性风险低，并且在抗癌机制中具有潜在激活T细胞以外的其他免疫调节细胞如NK细胞而获得特别的需求。二十世纪九十年代的临床前研究首次引入了使用自体骨髓来源的DC作为一种可行的疫苗选项(Porgador,A.and Gilboa,E.(1995)Bonemarrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restricted peptide arepotent inducers of cytotoxic T lymphocytes.J.Exp.Med.182,255–260)。肿瘤疫苗根据其作用又进一步分为预防型疫苗和治疗型疫苗。预防型肿瘤疫苗的设计目的在于从健康的个体中去除致癌的风险因子，进而预防癌症的产生和发展，降低癌症的治病率和死亡率；或针对症状前的癌症携带者进行早期诊断和治疗，或针对隐秘肿瘤损伤的幸存者的复发和转移进行预防。另一方面，治疗型疫苗的设计目的在于清除疾病的病因，其活性主要依赖于抗原特异性CD8+T细胞形成细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lympocytes，CTLs)对肿瘤细胞产生杀伤。理想地，治疗型肿瘤疫苗应该不仅能够激活初始T细胞，还应该能够调节已经存在的记忆T细胞，即诱导非保护性的CD8+T细胞成为健康的、能形成效应CTL的健康的CD8+T细胞。过去二十年评价肿瘤疫苗治疗效果的临床研究确定了需要由疫苗引起的CD8+T细胞相关的抗癌特性包括：1)TCR或T细胞与多肽-MHC复合物具有高亲和性；2)高表达颗粒酶和穿孔素(Appay,V.,Douek,D.C.,and Price,D.A.(2008).CD8+T cell efficacy invaccination and disease.Nat.Med.14,623–628)；3)表达细胞表面分子允许T细胞进入肿瘤(如CXCR3)(Mullins,D.W.,Sheasley,S.L.,Ream,R.M.,Bullock,T.N.,Fu,Y.X.,andEngelhard,V.H.(2003).Route of immunization with peptide-pulsed dendriticcells controls the distribution of memory and effector T cells in lymphoidtissues and determines the pattern of regional tumor control.J.Exp.Med.198,1023–1034)并在肿瘤内持续存在(如CD103(Le Floc’h,A.,Jalil,A.,Vergnon,I.,Le MauxChansac,B.,Lazar,V.,Bismuth,G.,Chouaib,S.,and Mami-Chouaib,F.(2007).Alpha Ebeta 7integrin interaction with E-cadherin promotes antitumor CTL activity bytriggering lytic granule polarization and exocytosis.J.Exp.Med.204,559–570.)和CD49a(Sandoval,F.,Terme,M.,Nizard,M.,Badoual,C.,Bureau,M.F.,Freyburger,L.,Clement,O.,Marcheteau,E.,Gey,A.,Fraisse,G.,et al.(2013).Mucosal imprinting ofvaccine-induced CD8+T cells is crucial to inhibit the growth of mucosaltumors.Sci.Transl.Med.5,72ra20.)以及4)高表达共刺激分子(如CD137(Wilcox,R.A.,Flies,D.B.,Zhu,G.,Johnson,A.J.,Tamada,K.,Chapoval,A.I.,Strome,S.E.,Pease,L.R.,and Chen,L.(2002).Provision of antigen and CD137 signaling breaksimmunological ignorance,promoting regression of poorlyimmunogenictumors.J.Clin.Invest.109,651–659.))或地表达抑制分子(如CTLA-4(Peggs,K.S.,Quezada,S.A.,Chambers,C.A.,Korman,A.J.,and Allison,J.P.(2009).Blockade ofCTLA-4on both effector and regulatory T cell compartments contributes to theantitumor activity of anti-CTLA-4antibodies.J.Exp.Med.206,1717–1725)或PD-1(Freeman,G.J.,Wherry,E.J.,Ahmed,R.,and Sharpe,A.H.(2006).Reinvigoratingexhausted HIV-specific T cells via PD-1-PD-1ligand blockade.J.Exp.Med.203,2223–2227.))。
对于基于DC的肿瘤疫苗，当前大多数临床试验中仍然采用自体全肿瘤裂解液来负载DC，具体操作为将来自病人的自身的肿瘤组织通过多次循环冻融进行裂解，以裂解液对DC细胞进行脉冲。冻融循环会诱导产生肿瘤细胞坏死，但冻融诱导的肿瘤细胞坏死并不具有免疫源性，甚至会抑制Toll样受体(TLR)诱导的DC细胞成熟及正常功能(Hatfeld P,Merrick AE,West E,O’Donnell D,Selby P,Vile R,et al.Optimization of dendriticcell loading with tumor cell lysates for cancer immunotherapy.J Immunother(2008)31(7):620–32)。并且病人的肿瘤组织并非总是容易获得。肿瘤细胞裂解液，纯化的肿瘤相关抗原和肿瘤衍生mRNA也被证明可以用作负载DC的抗原来源。肿瘤细胞裂解液能够提供多种抗原供DC加载，并能诱导CD4+和CD8+T细胞应答和赋予DC不同的损伤相关分子模式(Damage-Associated Molecular Patterns，DAMP)以确保DC的成熟，但也会向DC提供免疫调节型细胞因子，诱导DC细胞发生耐受转化(Guida M,Pisconte S,ColucciG.Metastatic melanoma:the new era of targeted therapy.Expert Opin TherTargets(2012)；16Suppl 2:S61-70)；纯化的肿瘤相关抗原加载DC能够激活抗原特异性T细胞应答，并诱导CD4+和CD8+T细胞应答，但单次使用的不同的抗原种类数量有限。肿瘤衍生mRNA可以转入肿瘤相关抗原和共刺激分子，保证I型MHC的抗原呈递，并且不需要交叉呈递(Robbins PF,Morgan RA,Feldman SA,Yang JC,Sherry RM,Dudley ME,Wunderlich JR,Nahvi AV,Helman LJ,Mackall CL,et al.Tumor regression in patients withmetastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineeredlymphocytesreactive with NY-ESO-1.J Clin Oncol(2011)；29:917-24)，但不能诱导DC细胞成熟，也不能诱导有效的CD4+免疫应答，同时单次使用的不同的抗原种类数量也有限。
另一类常用的手段为使用短肽(通常长度在9-10aa)负载DC。然而在近年也已经发现，9-10aa的短肽用于肿瘤疫苗中负载DC在临床试验中也面遇到限制(Rosenberg SA,Sherry RM,Morton KE,Scharfman WJ,Yang JC,Topalian SL,Royal RE,Kammula U,Restifo NP,Hughes MS,Schwartzentruber D,Berman DM,Schwarz SL,Ngo LT,Mavroukakis SA,White DE,Steinberg SM.Tumor progression can occur despite theinduction of very high levels of self/tumor antigen-specific CD8+T cells inpatients with melanoma.J Immunol.(2005)Nov 1；175(9):6169-76.)。导致这一现象产生的一个可能的原因是缺少CD4+T细胞的辅助，而CD4+T细胞已知对于效应CTL和长期的CD8+记忆T细胞的产生是必需的(Janssen EM,Droin NM,et al.CD4+T-cell help controlsCD8+T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced celldeath.Nature.2005Mar 3；434(7029):88-93.；Filipazzi P,Pilla L,et al.Limitedinduction of tumor cross-reactive T cells without a measurable clinicalbenefit in early melanoma patients vaccinated with human leukocyte antigenclass I-modified peptides.Clin Cancer Res.(2012)Dec 1；18(23):6485-96.)。此外，短肽易于降解，免疫源性较低，需要多次给药，对于DC的成熟诱导效果有限，还可能诱发耐受性，并且其免疫应答可能是瞬时的和/或低水平的(Berzofsky JA,et al.Progress onnew vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer.J ClinInvest.(2004)Jun；113(11):1515-25.)。因此目前还亟需更优的、激活免疫应答时效更长并且免疫反应水平更高的基于DC的肿瘤疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服目前基于DC的肿瘤疫苗中使用短肽负载DC的做法在临床中遇到限制，产生的效应CTL与CD8+记忆T细胞数量不高，并且短肽易于降解，免疫源性较低，需要多次给药，还可能诱发耐受性，并且其免疫应答瞬时的和/或低水平、体内和体外效果不佳这一技术问题，提供了一种多肽和多肽组合物及其在肿瘤免疫中的应用。本发明提供的多肽和多肽组合物免疫源性高，能够有效地诱导DC成熟，与DC孵育后能够显著刺激T细胞的增殖和IFN-γ的分泌进而提高T细胞的杀伤力，并且不会诱导DC发生细胞凋亡，也不会诱导DC的免疫抑制性受体表达上调，具有非常优异的免疫细胞治疗潜力和潜在的抗肿瘤效果。
本发明一方面提供了一种多肽组合物，所述多肽组合物包括衍生于选自eEF2、HSP105、MCL-1、MUC1、PSF1和Survivin中的一种或多种的肽段。
在一优选实施方案中，所述衍生于PSF1的肽段为SEQ ID NO.1所示，或为SEQ IDNO.1的变体序列，其与SEQ ID NO.1具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述衍生于eEF2的肽段为SEQ ID NO.2所示，或为SEQIDNO.2的变体序列，其与SEQ ID NO.2具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述衍生于MCL-1的肽段为SEQ ID NO.3所示，或为SEQ IDNO.3的变体序列，其与SEQ ID NO.3具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述衍生于HSP105的肽段为SEQ ID NO.4所示，或为SEQ IDNO.4的变体序列，其与SEQ ID NO.4具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述衍生于MUC-1的肽段为SEQ ID NO.5所示，或为SEQ IDNO.5的变体序列，其与SEQ ID NO.5具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述衍生于Survivin的肽段为SEQ ID NO.6所示，或为SEQID NO.6的变体序列，其与SEQ ID NO.6具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包括衍生于PSF1、eEF2和MCL-1的肽段。优选地，所述衍生于PSF1的肽段为SEQ ID NO.1所示，或为SEQ ID NO.1的变体序列，其与SEQID NO.1具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于eEF2的肽段为SEQ ID NO.2所示，或为SEQ ID NO.2的变体序列，其与SEQ ID NO.2具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于MCL-1的肽段为SEQ ID NO.3所示，或为SEQ ID NO.3的变体序列，其与SEQ ID NO.3具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包括衍生于HSP105、MUC-1和Survivin的肽段。优选地，所述衍生于HSP105的肽段为SEQ ID NO.4所示，或为SEQ ID NO.4的变体序列，其与SEQ ID NO.具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于MUC-1的肽段为SEQ ID NO.5所示，或为SEQ ID NO.5的变体序列，其与SEQ ID NO.5具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于Survivin的肽段为SEQ ID NO.6所示，或为SEQ ID NO.6的变体序列，其与SEQ ID NO.6具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子和/或HLA II型分子。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子中的HLA-A02亚型分子。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子中的HLA-A03亚型分子。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子中的HLA-A11亚型分子。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物结合HLA I型分子中的HLA-A24亚型分子。
在另一优选实施方案中，所述多肽组合物还可以包括免疫增强剂。优选地，所述免疫增强剂包括选自polyIC︰IL、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、铝盐、氢氧化铝纳米颗粒、***素E2、α干扰素和HB100-108多肽中的一种或多种。
本发明另一方面提供了一种分离的融合多肽，其包含共价连接的、衍生于选自eEF2、HSP105、MCL-1、MUC1、PSF1和Survivin中的两种或两种以上的肽段。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含共价连接的、衍生于选自eEF2、HSP105、MCL-1、MUC1、PSF1和Survivin中的3种的肽段。
在一优选实施方案中，所述肽段之间直接共价连接。
在一优选实施方案中，所述肽段之间通过接头共价连接；优选地，所述接头选自(GS4)3、Furin2A肽和双精氨酸(RR)中的一种或多种；更优选地，所述接头为双精氨酸。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽还包含共价连接的免疫增强剂多肽；优选地，所述免疫增强剂多肽为选自衍生自***素E2的多肽、衍生自α干扰素的多肽和HB100-108肽中的一种或多种，更优选地，为HB100-108肽；优选地，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端、C端或任意两个所述肽段之间。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含共价连接的、衍生于PSF1、eEF2和MCL-1的肽段。优选地，所述衍生于PSF1的肽段为SEQ ID NO.1所示，或为SEQ ID NO.1的变体序列，其与SEQ ID NO.1具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于eEF2的肽段为SEQ ID NO.2所示，或为SEQ ID NO.2的变体序列，其与SEQ IDNO.2具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于MCL-1的肽段为SEQ ID NO.3所示，或为SEQ ID NO.3的变体序列，其与SEQ ID NO.3具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示的肽段共价连接形成的多肽。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQID NO.1所示的肽段、RR接头、SEQ ID NO.2所示的肽段、RR接头和SEQ ID NO.3所示的肽段，其序列如SEQ ID NO.8所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽还包含免疫增强剂多肽；优选地，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.8所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽通过RR接头与SEQ ID NO.8所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.9所示。
在另一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含共价连接的、衍生于HSP105、MUC-1和Survivin的肽段。优选地，所述衍生于HSP105的肽段为SEQ ID NO.4所示，或为SEQID NO.4的变体序列，其与SEQ ID NO.4具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于MUC-1的肽段为SEQ ID NO.5所示，或为SEQ ID NO.5的变体序列，其与SEQ ID NO.5具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于Survivin的肽段为SEQ ID NO.6所示，或为SEQ ID NO.6的变体序列，其与SEQ ID NO.6具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的肽段共价连接形成的多肽。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQID NO.4所示的肽段、RR接头、SEQ ID NO.5所示的肽段、RR接头和SEQ ID NO.6所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.10所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽还包含免疫增强剂多肽；优选地，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.10所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽通过RR接头与SEQ ID NO.10所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.11所示。
在另一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含共价连接的、衍生于PSF1、MCL-1和HSP105的肽段。优选地，所述衍生于PSF1的肽段为SEQ ID NO.1所示，或为SEQ ID NO.1的变体序列，其与SEQ ID NO.1具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于MCL-1的肽段为SEQ ID NO.3所示，或为SEQ ID NO.3的变体序列，其与SEQID NO.3具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于HSP105的肽段为SEQ ID NO.4所示，或为SEQ ID NO.4的变体序列，其与SEQ ID NO.4具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的肽段共价连接形成的多肽。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQID NO.1所示的肽段、RR接头、SEQ ID NO.3所示的肽段、RR接头和SEQ ID NO.4所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.12所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽还包含免疫增强剂多肽；优选地，所述HB100-108肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.12所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽通过RR接头与SEQ ID NO.12所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.13所示。
在另一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含共价连接的、衍生于eEF2、MUC-1和Survivin的肽段。优选地，所述衍生于eEF2的肽段为SEQ ID NO.2所示，或为SEQ IDNO.2的变体序列，其与SEQ ID NO.2具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于MUC-1的肽段为SEQ ID NO.5所示，或为SEQ ID NO.5的变体序列，其与SEQ ID NO.5具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性；优选地，所述衍生于Survivin的肽段为SEQ ID NO.6所示，或为SEQ ID NO.6的变体序列，其与SEQ ID NO.6具有至少77％的同一性，优选地具有至少88％的同一性。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽包含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的肽段共价连接形成的多肽。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQID NO.2所示的肽段、RR接头、SEQ ID NO.5所示的肽段、RR接头和SEQ ID NO.6所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.14所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽还包含免疫增强剂多肽；优选地，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.14所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽通过RR接头与SEQ ID NO.14所示的肽段共价连接。优选地，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
在一优选实施方案中，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明另一方面提供了一种分离的核酸，其编码前述分离的融合多肽。
在一优选实施方案中，所述分离的核酸为单链DNA或双链DNA，优选地为双链DNA。
在一优选实施方案中，所述分离的核酸为未经修饰的或经过化学修饰的RNA。
在一优选实施方案中，所述经过化学修饰的RNA上的化学修饰包括核糖环修饰，磷酸二酯键骨架修饰和碱基修饰。优选地，所述核糖环修饰修饰为2’-氧烷基修饰和2’-F修饰修饰。优选地，所述磷酸二酯键骨架修饰为锁核酸(LNA)修饰。优选地，所述碱基修饰为4-硫脲嘧啶修饰、2-硫脲嘧啶修饰和C-连接的伪尿嘧啶修饰。
在一优选实施方案中，所述经过化学修饰的RNA包含一种或多种上述化学修饰。
本发明另一方面提供了一种免疫多肽组合物，其包含前述分离的融合多肽和免疫增强剂。
在一优选实施方案中，所述免疫增强剂包括选自polyIC︰IL、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、铝盐、氢氧化铝纳米颗粒、***素E2、α干扰素和HB100-108肽中的一种或多种；优选地，为HB100-108肽。
本发明另一方面提供了一种免疫调节剂，其包含前述多肽组合物、分离的融合多肽、分离的核酸和免疫多肽组合物中的一种或多种。
本发明另一方面提供了一种多肽疫苗，其包含：a)前述多肽组合物、分离的融合多肽、分离的核酸和免疫多肽组合物中的一种或多种和b)药学上可接受的载体。
在一优选实施方案中，所述多肽疫苗还进一步包含佐剂。优选地，所述佐剂选自优选地，所述佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、***素E2、α干扰素、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、水包油乳液、油包水乳液、纳米乳液、微粒递送***、脂质体、微球、生物可降解微球、斑块病毒体、蛋白脂质体、蛋白酶体、免疫刺激复合体(ISCOMs、ISCOMATRIX)、微颗粒、纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合微米/纳米颗粒、聚合薄片状底物颗粒(PLSP)、微颗粒树脂、纳米脂质体聚合凝胶(nanolipogel)、合成的/生物可降解的及生物相容性半合成或天然聚合物或树枝状聚合物(如PLG、PLGA、PLA、聚己酸内酯、硅聚合物、聚酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯苄基三甲基氯化铵、聚苯乙烯二乙烯基苯树脂、聚磷腈、聚-[二-(羧基乙酰苯氧基)磷腈(PCPP)、聚-(甲基丙烯酸甲酯)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸及衍生物、壳聚糖及其衍生物、多糖、δ菊粉多糖、糖脂(合成的或天然的)、脂多糖、一种或多种聚阳离子化合物(如聚氨基酸、聚-(γ-谷氨酸)、聚-精氨酸-HCl、聚-L-赖氨酸、多肽、生物高聚物)、阳离子二甲基二(十八烷基)铵(DDA)、α-半乳糖苷神经酰胺及其衍生物、古细菌脂质及衍生物、内酰胺、gallen、甘油酯、磷脂和螺旋体中的一种或多种。
本发明另一方面提供了一种抗原负载的、活化的抗原呈递细胞的制备方法，包括用前述免疫调节剂和/或多肽疫苗接触所述抗原呈递细胞。
在一优选实施方案中，所述抗原呈递细胞是淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、干细胞或其任意组合，优选地，是选自单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中的任一种或多种。优选地，所述抗原呈递细胞群是自体的或同种异体的。
在一优选实施方案中，所述抗原呈递细胞为树突状细胞，所述接触为孵育。
在一优选实施方案中，所述孵育的时间为2-10小时，优选地为3-8小时，更优选地为3-6小时，如6小时。
在一优选实施方案中，所述免疫调节剂和/或多肽疫苗与所述抗原呈递细胞的用量比为(10-120μg/106个细胞)，优选地为20-90μg/106个细胞)，更优选地为20-40μg/106个细胞，如40μg/106个细胞。
在一优选实施方案中，所述孵育的温度为为37℃。
在一优选实施方案中，所述孵育的CO2浓度为5％。
本发明另一方面提供了一种肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包含前述制备方法制得的抗原呈递细胞。
在一优选实施方案中，所述肿瘤疫苗还包括前述免疫调节剂。
在一优选实施方案中，所述肿瘤疫苗还包括药学上可接受的载体和/或佐剂。优选地，所述佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、水包油乳液、油包水乳液、纳米乳液、微粒递送***、脂质体、微球、生物可降解微球、斑块病毒体、蛋白脂质体、蛋白酶体、免疫刺激复合体(ISCOMs、ISCOMATRIX)、微颗粒、纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合微米/纳米颗粒、聚合薄片状底物颗粒(PLSP)、微颗粒树脂、纳米脂质体聚合凝胶(nanolipogel)、合成的/生物可降解的及生物相容性半合成或天然聚合物或树枝状聚合物(如PLG、PLGA、PLA、聚己酸内酯、硅聚合物、聚酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯苄基三甲基氯化铵、聚苯乙烯二乙烯基苯树脂、聚磷腈、聚-[二-(羧基乙酰苯氧基)磷腈(PCPP)、聚-(甲基丙烯酸甲酯)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸及衍生物、壳聚糖及其衍生物、多糖、δ菊粉多糖、糖脂(合成的或天然的)、脂多糖、一种或多种聚阳离子化合物(如聚氨基酸、聚-(γ-谷氨酸)、聚-精氨酸-HCl、聚-L-赖氨酸、多肽、生物高聚物)、阳离子二甲基二(十八烷基)铵(DDA)、α-半乳糖苷神经酰胺及其衍生物、古细菌脂质及衍生物、内酰胺、gallen、甘油酯、磷脂和螺旋体中的一种或多种。
本发明另一方面提供了一种激活免疫效应细胞的方法，包括用经过前述多肽组合物、分离的融合多肽、分离的核酸、免疫多肽组合物、免疫调节剂、多肽疫苗和肿瘤疫苗中的一种或多种处理过的抗原呈递细胞接触所述免疫效应细胞。
在一优选实施方案中，所述抗原呈递细胞为树突状细胞(DC)。
在一优选实施方案中，所述免疫效应细胞为T细胞。
在一优选实施方案中，所述处理为孵育；优选地，所述孵育的温度为37℃；优选地，所述孵育的CO2浓度为5％；优选地所述孵育的时间为3-6小时，更优选地为6小时。
在一优选实施方案中，所述接触为共培养。优选地，所述共培养的温度为37℃；优选地，所述共培养的CO2浓度为5％；优选地，所述共培养的时间为12-96小时，更优选地为96小时；优选地，所述共培养中所述抗原呈递细胞与所述免疫效应细胞的比例为1︰1-1︰5，更优选地，为1︰5。
本发明另一方面提供了前述多肽组合物、分离的融合多肽、分离的核酸、免疫多肽组合物、免疫调节剂、多肽疫苗和肿瘤疫苗中的一种或多种在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
本发明另一方面提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括对癌症患者施用前述肽组合物、分离的融合多肽、免疫多肽组合物、免疫调节剂、多肽疫苗和肿瘤疫苗中的一种或多种。
在一优选实施方案中，所述癌症为其癌细胞异常表达eEF2、HSP105、MCL-1、MUC1、PSF1和Survivin中的一种或多种的癌症。优选地，所述癌症包括选自腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌/***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌和***癌中的一种和多种。
本发明前述的多肽组合物、分离的融合多肽、分离的核酸、免疫多肽组合物和免疫调节剂可以通过本领域常规的方法获得，如通过常规的化学合成法或基因工程方法制备得到。
本发明的积极效果在于，本发明提供的多肽和多肽组合物免疫源性高，能够有效地诱导DC成熟，与DC孵育后能够显著刺激T细胞的增殖和IFN-γ的分泌进而提高T细胞的杀伤力，并且不会诱导DC发生细胞凋亡，也不会诱导DC的免疫抑制性受体表达上调，具有非常优异的免疫细胞治疗潜力和潜在的抗肿瘤效果。
附图说明
图1：本发明所用多肽构建体的结构示意图。上图和下图分别表示本发明所使用的不包含与包含免疫增强剂多肽的多肽构建体的示意结构。
图2：多肽组合物1、MPC1和HB100-108-MPC1对DC聚集效应的影响。
图3：多肽组合物2、MPC2和HB100-108-MPC2对DC聚集效应的影响。
图4：DC对不同浓度的MPC1孵育3小时后的吸收水平。
图5：DC对不同浓度的HB100-108-MPC1孵育3小时后的吸收水平。
图6：DC对不同浓度的MPC1孵育6小时后的吸收水平。
图7：DC对不同浓度的HB100-108-MPC1孵育6小时后的吸收水平。
图8A：DC分别与MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后的吸收水平的流式细胞计数检测峰图。
图8B：DC分别与MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后的吸收水平的流式细胞计数检测定量结果。
图9A：DC分别与MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后的吸收水平的流式细胞计数检测峰图。
图9B：DC分别与MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后的吸收水平的流式细胞计数检测定量结果。
图10A：DC与MPC3孵育3小时后的吸收水平的流式细胞检测峰图。
图10B：DC与不同浓度HB100-108-MPC3孵育3小时与6小时后的吸收水平的流式细胞计数检测峰图。
图11：DC与不同浓度的MPC4或HB100-108-MPC4分别孵育6小时后的吸收水平的流式细胞计数检测峰图。
图12：DC与不同浓度的HB100-108-MPC1孵育后的PI-Annexin凋亡双染的流式细胞计数检测结果图。
图13A：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CCR7阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图13B：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CCR7阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图14A：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CCR7阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图14B：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CCR7阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图15：DC分别与HB100-108-MPC3孵育后CCR7阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图16A：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CD80阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图16B：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CD80阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图17A：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CD80阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图17B：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CD80阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图18A：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CD86阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图18B：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CD86阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图19A：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CD86阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图19B：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CD86阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图20A：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CD40阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图20B：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后CD40阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图21A：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CD40阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图21B：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后CD40阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图22A：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后HLA-ABC阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图22B：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后HLA-ABC阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图23A：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后HLA-DR阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图23B：DC分别与多肽组合物1、MPC1、MPC1+HB100-108肽和HB100-108-MPC1孵育后HLA-DR阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图24A：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后HLA-ABC阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图24B：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后HLA-ABC阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图25A：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后HLA-DR阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图25B：DC分别与多肽组合物2、MPC2、MPC2+HB100-108肽和HB100-108-MPC2孵育后HLA-DR阳性细胞流式细胞计数检测定量结果图。
图26：DC分别于MPC3和HB100-108-MPC3孵育后HLA-ABC阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图27：DC分别于MPC3和HB100-108-MPC3孵育后HLA-DR阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图28：DC分别于MPC4和HB100-108-MPC4孵育后HLA-ABC阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图29：DC分别于MPC4和HB100-108-MPC4孵育后HLA-DR阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图30A：DC经过maturation cocktail(IFN-γ、poly(I:C)、R848)处理后分别与不同浓度的MPC1或HB100-108-MPC1孵育后IL-6分泌水平的定量检测结果。
图30B：DC经过maturation cocktail(IFN-γ、poly(I:C)、R848)处理后分别与不同浓度的MPC1或HB100-108-MPC1孵育后TNF-α分泌水平的定量检测结果。
图31A：DC经过maturation cocktail(IFN-γ、poly(I:C)、R848)处理后分别与不同浓度的MPC2或HB100-108-MPC2孵育后IL-6分泌水平的定量检测结果。
图31B：DC经过maturation cocktail(IFN-γ、poly(I:C)、R848)处理后分别与不同浓度的MPC2或HB100-108-MPC2孵育后TNF-α分泌水平的定量检测结果。
图32A：分别用MPC1和HB100-108-MPC1处理的DC对T细胞增殖促进效果的CFSE法检测结果。
图32B：分别用MPC2和HB100-108-MPC2处理的DC对T细胞增殖促进效果的CFSE法检测结果。
图33A：分别用MPC1和HB100-108-MPC1处理的DC与T细胞共培养后的T细胞IFN-γ分泌水平的定量检测结果。
图33B：分别用MPC2和HB100-108-MPC2处理的DC与T细胞共培养后的T细胞IFN-γ分泌水平的定量检测结果。
图34A：HB100-108-MPC1处理的DC的PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图34B：HB100-108-MPC2处理的DC的PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
图34C：HB100-108-MPC4和MPC4分别处理的DC的PD-L1阳性细胞流式细胞计数检测峰图。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。非如下另行定义，否则本文中的术语按照本领域通常所用的方式使用。
在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”和复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非标准的氨基酸来进行的修饰。多肽可来自天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”，是指被肿瘤细胞特异性表达或被肿瘤细胞以与相同组织种类的非肿瘤细胞相比较高频率或密度表达的抗原。肿瘤相关抗原可以是正常不被宿主表达的抗原；它们可经突变、截短、错误折叠、或正常被宿主表达的分子的其他方式异常显现；它们可与正常表达的分子相同但以异常高水平表达；或它们可以在异常的情况或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是，例如，蛋白或蛋白片段、复杂碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其他生物分子的组合。
术语“疫苗”是指用于施用至哺乳动物的免疫原性组合物，其用于在哺乳动物中引发针对特定抗原的免疫反应。疫苗典型地含有相似于或衍生自该免疫反应的目标的试剂(已知为“抗原”或“免疫原”)，该目标诸如造成疾病的微生物或肿瘤细胞。意图用于肿瘤诸如癌症的治疗的疫苗，典型地含有衍生自目标肿瘤上所发现的TAA且能够引发对目标肿瘤上的TAA的免疫原性的抗原。
术语“免疫增强剂”，如本文所使用，意指一种物质，当它与免疫原混合时能够比免疫原单独存在时诱发更强的免疫应答。例如，一种免疫增强剂能够提高免疫源性，并提供优异的免疫应答。又例如，一种免疫增强剂能够通过提高巨噬细胞和其他抗原呈递细胞上的共刺激因子的表达来起作用。
术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性”和“恶性”指或描述在哺乳动物中典型地是特征为不受控制的细胞生长的生理病症。癌症的实例包括但不限于上皮癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、***、卵巢癌、肝癌(诸如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介导的乳腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑色素瘤、***癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、血癌(包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM))、各种类型的头颈癌(包括但不限于鳞状细胞癌)、以及粘液性起源的癌症(诸如粘液性卵巢癌)、胆管癌(肝)以及肾***状癌。在某些实施例中，该血癌选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、以及慢性骨髓性白血病。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，或含有两个R的接头。
术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是指能够表达主要组织相容性复合物(MHC)I型或II型的一类细胞，能够通过MHC结合抗原肽形成MHC-抗原肽复合物并进一步结合T细胞表面的受体进而激活T细胞的一类细胞，包括但不限于树突状细胞(dendritic cell,DC)、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、Langerhans细胞。
术语“抗原负载的APC”包括已暴露于抗原并被抗原活化的APC。例如，APC可以在体外(例如在有抗原存在的培养期间)负载抗原。APC也可以通过暴露于抗原而在体内被负载。“抗原负载的APC”通常以两种方式之一制备：(1)被称为抗原肽的小片段直接“脉冲”到APC的外部与MHC分子结合；(2)APC与多肽大片段、完全蛋白质或蛋白质颗粒孵育，然后多肽大片段、完全蛋白质或蛋白质颗粒由APC摄取。这些多肽大片段或蛋白质分子通过APC被消化成小的肽段，并且最终被运输并呈递在APC表面上。此外，还可以通过将编码抗原的多核苷酸导入细胞中来产生负载抗原的APC。
术语“变体”是指通过氨基酸的***、缺失或保守取代，氨基酸序列发生变化但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以指具有与参照多肽的序列基本相同的氨基酸序列的多肽。参照多肽具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如亲水性、带点区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中本认为通常涉及微小的改变。这些微小的改变可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。
高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)是一种在哺乳动物体内高度保守的蛋白质，可转移到细胞核以调节基因表达并在细胞损伤和炎症过程中释放。HMGB1由两个DNA结合基序组成：A框和B框以及C尾。研究发现HMGB1的第91-108位氨基酸所对应的位于B框内的HP91短肽可以促进DC的成熟与活化、诱导IL-6和IL-12等促炎性细胞因子的分泌和触发Th1细胞的极化。Sanez R.和他的团队证明，HP91可以通过增强细胞和体液免疫反应在体内发挥佐剂作用。进一步研究表明HP91的免疫刺激功能区位于C端，位于HMGB1的第100-108位氨基酸。本发明中我们将HMGB1的第100-108位氨基酸对应的短肽命名为HB100-108。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所实用流式细胞仪购自Beckman-Coult，型号：NaviosTM Flow Cytometer；
本发明实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
本发明实施例所述的“过夜”指8小时或8小时以上。
本发明实施例所使用的衍生自PSF1、eEF2、MCL-1、HSP105、MUC-1、Survivin和HB100-108的多肽序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6和7所示，以下分别简称为PSF1肽、eEF2肽、MCL-1肽、HSP105肽、MUC-1肽、Survivin肽和HB100-108肽。其中HB100-108肽作为免疫增强剂多肽被使用。含有SEQ ID NO.1、2和3的多肽组合物以下称为多肽组合物1；含有SEQ IDNO.4、5和6的多肽组合物以下称为多肽组合物2。
SEQ ID NO.1(PSF1)：YLYDRLLRI；
SEQ ID NO.2(eEF2)：LILDPIFKV；
SEQ ID NO.3(MCL-1)：AVLPLLELV；
SEQ ID NO.4(HSP105)：RLMNDMTAV；
SEQ ID NO.5(MUC-1)：SLAPPVHNV；
SEQ ID NO.6(Survivin)：LTLGEFLKL；
SEQ ID NO.7(HB100-108)：SAFFLFCSE。
本发明实施例所使用的融合的多肽所代表的多肽构建体(multiple peptideconstruct,MPC)的示意图如图1所示，两个示意图分别表示本发明所使用的不包含与包含免疫增强剂多肽的多肽构建体的示意结构，其具体序列分别如SEQ ID NO.8、9、10、11、12、13、14和15所示，以上序列分别包括以下组成部分(自N端到C端)：SEQ ID NO.1-RR-SEQ IDNO.2-RR-SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7-RR-SEQ ID NO.1-RR-SEQ ID NO.2-RR-SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4-RR-SEQ ID NO.5-RR-SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7-RR-SEQ ID NO.4-RR-SEQID NO.5-RR-SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1-RR-SEQ ID NO.3-RR-SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7-RR-SEQ ID NO.1-RR-SEQ ID NO.3-RR-SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2-RR-SEQ ID NO.5-RR-SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7-RR-SEQ ID NO.2-RR-SEQ ID NO.5-RR-SEQ ID NO.6，以上多肽构建体依次分别命名为MPC1、HB100-108-MPC1、MPC2、HB100-108-MPC2、MPC3、HB100-108-MPC3、MPC4和HB100-108-MPC4。
上述PSF1肽、eEF2肽、MCL-1肽、HSP105肽、MUC-1肽、Survivin肽和HB100-108肽，以及多肽构建体MPC1、HB100-108-MPC1、MPC2、HB100-108-MPC2、MPC3、HB100-108-MPC3、MPC4和HB100-108-MPC4由上海淘普生物科技有限公司合成。各多肽构建体的荧光染料标记在多肽构建体合成完成以后通过本领域常规的方法进行。
本发明实施例中DC均使用含有无血清AIM-V培养基培养。
本发明实施例中所用血液来源的供体受试者均为健康成年人。
实施例1PBMC细胞和树突状细胞(DC)的分离
PBMC细胞的分离按以下步骤进行：
1、从供体受试者的血液中抽取200～400μL用白细胞分析仪测定白细胞浓度。
2、20℃水浴预热Ficoll，时间在20分钟以上。
3、根据测定的白细胞浓度，用PBS将每个血样稀释至白细胞浓度为5～9×109/L，稀释倍数根据情况计算。
4、Ficoll分离
按体积比血样︰Ficoll＝4︰3的比例计算Ficoll的用量，将稀释好的血样沿着离心管壁匀速缓慢加入Ficoll中，完成后轻持离心管，放入离心机中。将离心机转速调为800g，时间25min，升速调为1g/s，降速调为0，开始离心。
5、收获白细胞
上一步离心结束后，轻轻取出离心管，观察分层是否均匀，有无异常。将离心管转移至超净工作台中，首先吸取血浆层，弃掉，再用移液枪头轻轻吸取白膜层，收集至新离心管中，加入生理盐水洗涤，体积为白细胞量体积3倍，放入离心机中。将离心机转速调为400g，升降速为9g/s，离心10min。
6、洗涤白细胞
上一步离心结束后，观察上清液是否澄清，如较澄清，可倾倒弃去上清，再次加入生理盐水，混匀后再次离心，转速与时间同上。如上清液较浑浊，则吸取上清至一个新的离心管继续离心，转速与时间同细胞沉淀。
7、收获白细胞
弃去离心管中的上清液，将2份细胞沉淀合并，计数，加入AIM-V培养液，并按6×107/mL铺入培养瓶中贴壁4h，或过夜，。
8、收集T细胞
PBMC贴壁后，收集仍然悬浮的存在于细胞悬液中的细胞至离心管中，1200rpm，离心5min，弃去上层培养基，再加入一定体积的生理盐水洗涤，取样计数并离心，获得的即为T细胞，可根据需要进行后续实验或冻存；
9、T细胞冻存(可选)
根据步骤8收获的T细胞总数，加入计算好的冻存液，按2×107/mL，1mL/支冻存。
DC的分离按以下步骤进行：
D0：PBMC加入不含血清的AIM-V培养基，贴壁2h，将悬浮细胞与贴壁细胞分离；悬浮细胞计数，取106细胞送检HLA-A分型；贴壁细胞继续使用不含血清的AIM-V培养基培养，添加GM-CSF至终浓度50ng/mL和IL-4至终浓度1000U/mL；
D3&D5：贴壁细胞半量换液，补加GM-CSF和IL-4至终浓度50ng/mL和IL-4至终浓度1000U/mL；
D6：收集未贴壁的细胞，不使用EDTA或胰酶；
收集的DCs按以下实施例中的实验组与对照组的设置与不同的多肽构建体或多肽组合物进行孵育后进行相应的检测。
实施例2DC聚集效应的检测
1)取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液；
2)将铺有DC的孔分为7组，分别为DC对照、DC+多肽组合物1、DC+MPC1、DC+HB100-108-MPC1、DC+多肽组合物2、DC+MPC2和DC+HB100-108-MPC2，每组3个平行副孔，向各实验组中分别加入各自相应的多肽组合物或多肽构建体(MPC)，其中多肽组合物1和2的终浓度均为60μg/mL(多肽组合物中的每种多肽的浓度为20μg/mL)，所有多肽构建体(MPC1、HB100-108-MPC1、MPC2、HB100-108-MPC2)的终浓度均为40μg/mL，37℃5％CO2孵育6小时；
3)PBS洗涤细胞，各组均挑选3个副孔中的一个显微镜明场下观察，结果如图2和图3所示。
图2显示，包含PSF1肽、eEF2肽和MCL-1肽的多肽组合物1与DC孵育后，对DC细胞的聚集仅有微弱的提高；与MPC1孵育后的DC(DC+MPC1组)同DC对照相比聚集成团的细胞明显增多；与HB100-108-MPC1孵育后的DC(DC+HB100-108-MPC1组)同DC对照相比细胞聚集成团的现象非常明显，且与DC+MPC1组中的细胞聚集相比聚集成的细胞团更大。图3显示的结果与图2类似，图3显示包含HSP105肽、MUC1肽和Survivin肽的多肽组合物2与DC孵育后，对DC细胞的聚集也仅有微弱的提高；与MPC2孵育后的DC(DC+MPC2组)同DC对照相比聚集成团的细胞明显增多；与HB100-108-MPC2孵育后的DC(DC+HB100-108-MPC2)同DC对照相比细胞聚集成团的现象非常明显，且与DC+MPC2组中的细胞聚集相比聚集成的细胞团更大。
根据已有的文献报道，DC的聚集与其成熟相关(Delemarre FG,Hoogeveen PG,DeHaan-Meulman M,Simons PJ,Drexhage HA.Homotypic cluster formation of dendriticcells,a close correlate of their state of maturation.Defects in thebiobreeding diabetes-prone rat.J Leukoc Biol.2001Mar；69(3):373-80.)，以上结果表明，与本发明的包含或不包含作为免疫增强剂的HB100-108肽的多肽构建体孵育后，会诱导DC产生明显的聚集效应，并且包含HB100-108肽的多肽构建体所诱导的DC聚集的效应更加明显，说明本发明的多肽构建体能够显著促进DC成熟。
实施例3多肽构建体的DC吸收水平的荧光显微镜检测
1)取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液；
2)分别向不同的孔中加入10μg、20μg、40μg和80μg的FITC标记的不同多肽构建体(MPC1和HB100-108-MPC1)，37℃5％CO2分别孵育3小时、6小时，荧光显微镜下观察DC对于多肽构建体的吸收水平。
结果如图4-图7所示。图4-图7分别显示DC对不同浓度的MPC1和HB100-108-MPC1在孵育3h、6h后的吸收水平。图4、6分别为DC对于不同浓度的MPC1在孵育3h、6h后的吸收水平。图4、6显示，孵育6h后DC对MPC1的吸收水平明显高于孵育3h。图5、7分别为DC对于不同浓度的HB100-108-MPC1在孵育3h、6h后的吸收水平。与DC对MPC1的吸收类似，孵育6h后DC对HB100-108-MPC1的吸收水平明显高于孵育3h，。
通过图4-图5、图6-图7两两对比，可以发现在多肽构建体的浓度相同且孵育时长相同的前提下，DC对HB100-108-MPC1的吸收水平明显高于对MPC1的吸收水平，表明HB100-108肽的存在能够进一步提升DC对本发明多肽构建体的吸收。
此外，在孵育相同时长的前提下，多肽构建体的浓度越高，DC对其的吸收水平也相应提升，在图4-图7中均反映出这一趋势。
综上，图4-图7表明DC能够有效吸收本发明的多肽构建体，其吸收水平在6小时显著高于3小时，且多肽构建体的浓度的提高有助于DC对其的吸收。同时免疫增强剂多肽HB100-108的存在能够有效地促进DC对所述多肽构建体的吸收。
实施例4多肽构建体MPC1、HB100-108-MPC1、MPC2与HB100-108-MPC2的DC吸收水平的流式细胞仪检测
1)取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液；
2)分别向不同的孔中加入40μg MPC1、40μg MPC1+30μg HB100-108肽、40μg HB100-108-MPC1、40μg MPC2、40μg MPC2+30μg HB100-108肽及40μg HB100-108-MPC2，MPC1、HB100-108-MPC1、MPC2和HB100-108-MPC2均为FITC标记，37℃5％CO2孵育6小时后通过流式细胞仪检测FITC+细胞。
结果如图8A、图8B、图9A和图9B所示。
图8A和图8B显示DC与FITC标记的MPC1、MPC1+HB100-108肽与HB100-108-MPC1孵育后的FITC+细胞比例的变化。图8A显示DC与MPC1孵育后，FITC+细胞比例明显增加；DC与MPC1和HB100-108肽的混合物孵育后FITC+细胞比例与同MPC1孵育后相比进一步增加；而DC与HB100-108-MPC1孵育后FITC+细胞比例上升程度最高，明显高于前两者。图8B显示DC与FITC标记的MPC1、MPC1+HB100-108肽与HB100-108-MPC1孵育后的细胞荧光强度值，三次实验结果的平均值与图10A显示的趋势一致。
图9A和图9B显示DC与FITC标记的MPC2、MPC2+HB100-108肽与HB100-108-MPC2孵育后的FITC+细胞比例的变化，结果显示的趋势与图8A与图8B类似。图9A显示DC与MPC2孵育后，FITC+细胞比例明显增加；DC与MPC2和HB100-108肽的混合物孵育后FITC+细胞比例与同MPC2孵育后相比进一步增加；而DC与HB100-108-MPC2孵育后FITC+细胞比例上升程度最高，明显高于前两者。图9B显示DC与FITC标记的MPC2、MPC2+HB100-108肽与HB100-108-MPC2孵育后的细胞荧光强度值，三次实验结果的平均值与图9A显示的趋势一致。
图8A、8B、9A和9B的结果显示，本发明的多肽构建体能够有效地被DC所吸收，且当HB100-108肽以共价连接或非共价连接的形式存在的时候能够进一步提高DC对所述多肽构建体的吸收水平。
实施例5多肽构建体MPC3、HB100-108-MPC3、MPC4与HB100-108-MPC4的DC吸收水平的流式细胞仪检测
1)取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液；
2)分别向不同的孔中加入40μg MPC3、20μg HB100-108-MPC3、40μgHB100-108-MPC3、20μg MPC4、20μg HB100-108-MPC4、30μg MPC4、30μg HB100-108-MPC4、40μg MPC4和40μg HB100-108-MPC4，MPC3、HB100-108-MPC3、MPC4和HB100-108-MPC4均为FITC标记，加入MPC3和HB100-108-MPC3的孔在37℃5％CO2分别孵育3小时和6小时，加入MPC4和HB100-108-MPC4的孔在37℃5％CO2孵育6小时，孵育后通过流式细胞仪检测FITC+细胞。
结果如图10A、10B和11所示。图10A显示MPC3与DC孵育3小时后，FITC+细胞的比例达到47.0％，与DC对照相比有了明显的提升；MPC3与DC孵育6小时后，FITC+细胞的比例达到82.4％，比孵育3小时后又有了进一步显著的提升；图10B显示，20μg HB100-108-MPC3与DC孵育3小时后FITC+细胞的比例达到88.7％，与DC对照相比有了很大的提升；当孵育6小时后FITC+细胞的比例达到94.4％，在孵育3小时的基础上又有了进一步的提升；当HB100-108-MPC3的用量提高到40μg时，DC与HB100-108-MPC3孵育3小时和6小时后FITC+细胞的比例相较于用量为20μg时同样孵育时长后FITC+细胞的比例又有了进一步的提高，分别达到93.4％和98.1％。并且在相同剂量与相同孵育时间的情况下，HB100-108-MPC3孔中FITC+细胞的比例显著高于MPC3孔的细胞。
图11显示了不同剂量的MPC4与HB100-108-MPC4与DC孵育6小时后的FITC+细胞的比例。图11左栏显示20μg、30μg和40μg的MPC4与DC孵育6小时后，FITC+细胞的比例分别达到28.9％、51.2％和76.3％，与对照DC相比有显著的提升；图11右栏显示20μg、30μg和40μg的HB100-108-MPC4与DC孵育6小时后，FITC+细胞的比例分别达到98.9％、99.6％和99.7％，与MPC4孵育的细胞相比有了进一步较大的提升，已接近100％，并且当使用HB100-108-MPC4与DC进行孵育时，20μg的剂量下FITC+细胞的比例即已经非常高，接近100％。
图10A、10B与图11的结果表明，与前述MPC1、MPC2、HB100-108-MPC1及HB100-108-MPC2与DC孵育的结果类似，MPC3、MPC4、HB100-108-MPC3和HB100-108-MPC4均能够被DC高效吸收，吸收水平在一定范围内呈剂量依赖性，并且HB100-108的存在能够进一步提高DC对于多肽构建体吸收的水平。
实施例6多肽构建体对DC凋亡诱导的检测
通过PI和Annexin V-FITC双染色检测本发明多肽构建体是否会诱导DC产生细胞凋亡。
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，；分别向不同的孔中分别加入0μg、10μg、20μg和40μg的HB100-108-MPC1，37℃5％CO2孵育6小时，用AIM-V洗涤2次，培养过夜，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物货号：KGA105-KGA108)说明书中的操作进行PI和Annexin-FITC凋亡双染色，结果通过流式细胞仪进行检测。
结果如图12所示。结果显示，对于多肽构建体加样量为0μg、10μg、20μg和40μg的DC，所有4个象限的细胞比例均基本相同，其中代表活细胞的左下象限(Q4)中的细胞比例，加入0μg、10μg、20μg和40μg HB100-108-MPC1的四孔均在98％左右，；而代表晚期凋亡与早期凋亡的右上象限(Q2)和右下象限(Q3)的细胞比例，加入0μg、10μg、20μg和40μg HB100-108-MPC1的四孔均在1％左右。
以上结果表明，本发明多肽构建体加入与不加入时DC的状态相同，即本发明多肽构建体的加入不会诱导DC凋亡。
实施例7多肽构建体及多肽组合物对DC的趋化因子受体CCR7表达水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，；向不同的孔中分别加入60μg的多肽组合物1(PSF1肽、eEF2肽和MCL-1肽的剂量各自均为20μg)、60μg的多肽组合物2(HSP105肽、MUC-1肽和Survivin肽的剂量各自均为20μg)、40μg的MPC1、40μg的MPC2、40μg的MPC1+30μg的HB100-108肽、40μg的MPC2+30μg的HB100-108肽、40μg的HB100-108-MPC1、40μg的HB100-108-MPC2和40μg的HB100-108-MPC3，37℃5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％FBS(购自Gibco)的PBS洗涤后与FITC标记的CCR7抗体(购自BD)与同型对照抗体(鼠源IgG)避光孵育30分钟，再次用含有5％FBS的PBS洗涤后流式细胞仪检测FITC+细胞，结果如图13-15所示。
图13A显示DC与多肽组合物1孵育后，FITC+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC1孵育后FITC+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC1+HB100-108肽或HB100-108-MPC1孵育后，FITC+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC1组比MPC1+HB100-108组FITC+细胞的比例也明显更高。图13B为图13A中的实验重复3次、每次实验每组样品重复3个副孔后定量的平均值，与图13A结果一致。图13表明MPC1能够显著提高DC的CCR7表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高CCR7的表达水平。
图14A与图13A的结果类似，显示DC与多肽组合物2孵育后FITC+细胞的比例变化不明显；与MPC2+HB100-108肽或HB100-108-MPC2孵育后，FITC+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC2组比MPC2+HB100-108组FITC+细胞的比例也明显更高。图14B为图14A中的实验重复三次后定量的平均值，与图14A结果一致。图14表明MPC2能够显著提高DC的CCR7表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高CCR7的表达水平。
图15显示DC与HB100-108-MPC3孵育后FITC+细胞的比例。DC与HB100-108-MPC3孵育后FITC+细胞的比例与DC对照相比明显升高，表明HB100-108-MPC3能够显著提高DC的CCR7表达水平。
图13-15说明，本发明的多肽构建体能够显著提高DC的CCR7表达水平，并且在有免疫增强剂多肽存在的情况下CCR7的表达水平能显著更高。当接受到感染或危险信号时，DC通常被认为会离开外周组织，在此过程中，DC开始成熟且CCR7的表达水平升高(Chan,V.W.,S.Kothakota,M.C.Rohan,L.Panganiban-Lustan,J.P.Gardner,M.S.Wachowicz,J.A.Winter,L.T.Williams.1999.Secondary lymphoid-tissue chemokine(SLC)ischemotactic for mature dendritic cells.Blood 93:3610-3616；Dieu,M.C.,B.Vanbervliet,A.Vicari,J.M.Bridon,E.Oldham,S.Ait-Yahia,F.Briere,A.Zlotnik,S.Lebecque,C.Caux.1998.Selective recruitment of immature and mature dendriticcells by distinct chemokines expressed in different anatomicsites.J.Exp.Med.188:373-386；Sallusto,F.,P.Schaerli,P.Loetscher,C.Schaniel,D.Lenig,C.R.Mackay,S.Qin,A.Lanzavecchia.1998.Rapid and coordinated switch inchemokine receptor expression during dendritic cellmaturation.Eur.J.Immunol.28:2760-2769.)。因此CCR7表达水平的提升提示了DC的成熟。并且DC进入到***中的T细胞区域与进行抗原呈递的归巢(homing)的过程依赖于CCR7于其配体CCL19和CCL21，因此DC的CCR7表达水平的提升显示DC归巢的潜力有明显的增强。
实施例8多肽构建体及多肽组合物对DC成熟相关的共刺激分子的表达水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，；向不同的孔中分别加入60μg的多肽组合物1(PSF1肽、eEF2肽和MCL-1肽的剂量各自均为20μg)、60μg的多肽组合物2(HSP105肽、MUC-1肽和Survivin肽的剂量各自均为20μg)、40μg的MPC1、40μg的MPC2、40μg的MPC1+30μg的HB100-108肽、40μg的MPC2+30μg的HB100-108肽、40μg的HB100-108-MPC1和40μg的HB100-108-MPC2，37℃5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％FBS(购自Gibco)的PBS洗涤后，各组细胞分别与FITC标记的CD80抗体、APC标记的CD86抗体与Alexa Fluor 700(AF700)标记的CD40抗体(均购自BD)避光孵育30分钟，同型对照抗体(鼠源IgG)孵育作为对照，孵育后再次用含有5％FBS的PBS洗涤后流式细胞仪检测FITC+细胞，结果如图16-21所示。
图16A显示DC与多肽组合物1孵育后，FITC+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC1孵育后FITC+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC1+HB100-108肽或HB100-108-MPC1孵育后，FITC+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC1组比MPC1+HB100-108组FITC+细胞的比例也明显更高。图16B为图16A中的实验重复三次后定量的平均值，与图16A结果一致。图16表明MPC1能够显著提高DC的CD80表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高CD80的表达水平。
图17A显示DC与多肽组合物2孵育后，FITC+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC2孵育后FITC+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC2+HB100-108肽或HB100-108-MPC2孵育后，FITC+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC2组比MPC2+HB100-108组FITC+细胞的比例也明显更高。图17B为图17A中的实验重复三次后定量的平均值，与图17A结果一致。图17表明MPC2能够显著提高DC的CD80表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高CD80的表达水平。
图18A显示DC与多肽组合物1孵育后，APC+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC1孵育后APC+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC1+HB100-108肽或HB100-108-MPC1孵育后，APC+细胞的比例有了明显的提升。图18B为图18A中的实验重复三次后定量的平均值，与图18A结果一致。图18表明MPC1在HB100-108肽存在(共价或非共价连接)或不存在时都能够显著提高DC的CD86表达水平。
图19A显示DC与多肽组合物2孵育后，APC+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC2孵育后APC+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC2+HB100-108肽或HB100-108-MPC2孵育后，APC+细胞的比例有了明显的提升。图19B为图19A中的实验重复三次后定量的平均值，与图19A结果一致。图19表明MPC2在HB100-108肽存在(共价或非共价连接)或不存在时都能够显著提高DC的CD86表达水平。
图20A显示DC与多肽组合物1孵育后，AF700+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC1孵育后AF700+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC1+HB100-108肽或HB100-108-MPC1孵育后，AF700+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC1组比MPC1+HB100-108组AF700+细胞的比例也明显更高。图20B为图20A中的实验重复三次后定量的平均值，与图20A结果一致。图20表明MPC1能够显著提高DC的CD40表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高CD40的表达水平。
图21A显示DC与多肽组合物2孵育后，AF700+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC2孵育后AF700+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC2+HB100-108肽或HB100-108-MPC2孵育后，AF700+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC2组比MPC2+HB100-108组AF700+细胞的比例也明显更高。图21B为图21A中的实验重复三次后定量的平均值，与图21A结果一致。图21表明MPC2能够显著提高DC的CD40表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高CD40的表达水平。
图16-21的结果说明，DC与本发明多肽构建体孵育后DC的CD80、CD86和CD40的表达水平显著提高。CD80、CD86和CD40均为与DC成熟与激活相关的共刺激分子，CD80、CD86和CD40的表达上升表明本发明多肽构建体能够明显提升DC的成熟。
实施例9多肽构建体及多肽组合物对DC的I型及II型HLA表达水平的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，；向不同的孔中分别加入60μg的多肽组合物1(PSF1肽、eEF2肽和MCL-1肽的剂量各自均为20μg)、60μg的多肽组合物2(HSP105肽、MUC-1肽和Survivin肽的剂量各自均为20μg)、40μg的MPC1、40μg的MPC2、40μg的MPC1+30μg的HB100-108肽、40μg的MPC2+30μg的HB100-108肽、40μg的HB100-108-MPC1、40μg的HB100-108-MPC2、40μg的MPC3、40μg的HB100-108-MPC3、40μg的MPC4和40μg的HB100-108-MPC4，37℃5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，然后培养过夜，消化DC，用含有5％v/vFBS(购自Gibco)的PBS洗涤后，各组细胞分别与PE-标记的HLA-ABC抗体或PE-标记的HLA-DR抗体避光孵育30分钟，同型对照抗体(鼠源IgG)孵育作为对照，孵育后再次用含有5％FBS的PBS洗涤后流式细胞仪检测PE+细胞。结果如图22-29所示。
图22A显示不同组的DC表面的HLA-ABC的表达水平。DC与多肽组合物1孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC1孵育后PE+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC1+HB100-108肽或HB100-108-MPC1孵育后，PE+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC1组比MPC1+HB100-108组PE+细胞的比例也更高。图22B为图22A中的实验重复三次后定量的平均值，与图22A结果一致。图22A和22B表明MPC1能够显著提高DC的HLA-ABC表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高HLA-ABC的表达水平。
图23A显示不同组的DC表面的HLA-DR的表达水平。DC与多肽组合物1孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC1孵育后PE+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC1+HB100-108肽或HB100-108-MPC1孵育后，PE+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC1组比MPC1+HB100-108组PE+细胞的比例也明显提高。图23B为图23A中的实验重复三次后定量的平均值，与图23A结果一致。图23A和23B表明MPC1能够显著提高DC的HLA-DR表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高HLA-DR的表达水平。
图24A显示不同组的DC表面的HLA-ABC的表达水平。DC与多肽组合物2孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC2孵育后PE+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC2+HB100-108肽或HB100-108-MPC2孵育后，PE+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC2组比MPC2+HB100-108组PE+细胞的比例也更高。图24B为图24A中的实验重复三次后定量的平均值，与图24A结果一致。图24A和24B表明MPC2能够显著提高DC的HLA-ABC表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高HLA-ABC的表达水平。
图25A显示不同组的DC表面的HLA-DR的表达水平。DC与多肽组合物2孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比变化不明显；DC与MPC2孵育后PE+细胞的比例有一定的提升；而当DC与MPC2+HB100-108肽或HB100-108-MPC2孵育后，PE+细胞的比例有了明显的提升，且HB100-108-MPC2组比MPC2+HB100-108组PE+细胞的比例也明显提高。图25B为图25A中的实验重复三次后定量的平均值，与图25A结果一致。图25A和25B表明MPC2能够显著提高DC的HLA-DR表达水平，并且当HB100-108肽存在的情况下(共价连接或非共价连接)能够更进一步提高HLA-DR的表达水平。
图26显示不同组的DC表面的HLA-ABC的表达水平。DC与MPC3或HB100-108-MPC3孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比均有了明显提升，表明MPC3能够显著提高DC的HLA-ABC的表达水平。
图27显示不同组的DC表面的HLA-DR的表达水平。DC与MPC3或HB100-108-MPC3孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比均有了明显提升，并且与HB100-108-MPC3孵育后的PE+细胞的比例较与MPC3孵育后的比例明显更高，表明MPC3能够显著提高DC的HLA-DR的表达水平，并且当与HB100-108肽相连接的情况下对HLA-DR的表达水平提升更高。
图28显示不同组的DC表面的HLA-ABC的表达水平。DC与MPC4或HB100-108-MPC4孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比均有了明显提升，分别从42.6％提升至69.5％和77.7％，表明MPC4能够显著提高DC的HLA-ABC的表达水平，并且当与HB100-108肽相连接的情况下对HLA-ABC的表达水平提升更高。
图29显示不同组的DC表面的HLA-DR的表达水平。DC与MPC4或HB100-108-MPC4孵育后，PE+细胞的比例与DC对照相比均有了明显提升，分别从12.2％提升至32.6％和69.2％，表明MPC4能够显著提高DC的HLA-ABC的表达水平，并且当与HB100-108肽相连接的情况下对HLA-ABC的表达水平提升更高。
图22-29表明DC与本发明多肽构建体与DC孵育后能够明显提高DC细胞上的HLA-I型与II型分子的表达水平。HLA-I型与II型分子表达水平的升高与DC的成熟相关，图22-29的结果表明本发明的多肽构建体能够显著地促进DC的成熟。
实施例10多肽构建体对DC细胞因子分泌的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入20μg的MPC1、20μg的MPC2、40μg的MPC1、40μg的MPC2、20μg的HB100-108-MPC1、20μg的HB100-108-MPC2、40μg的HB100-108-MPC1和40μg的HB100-108-MPC2，37℃5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤，向各孔中加入IFN-γ、poly(I:C)和R848，使其终浓度分别为100IU/mL、30μg/mL和5μg/mL，同时保留加入IFN-γ、poly(I:C)和R848孵育刺激但不加入多肽构建体的DC对照孔，继续培养24小时后用CBA试剂盒(购自BD)通过流式细胞仪检测培养基上清中的细胞因子IL-6和TNF-α的分泌水平，重复上述操作3次，每个样品每次3个复孔，结果如图30-31所示。
图30A显示，加入20μg的MPC1与DC孵育后，IL-6的分泌水平与DC对照组相比变化不明显；加入40μg的MPC1与DC孵育后，IL-6的分泌水平与DC对照组与20μg MPC1组相比有了显著的提升，浓度达到超过1000pg/mL；当加入20μg的HB100-108-MPC1与DC孵育后，IL-6的分泌水平有了进一步显著的提升，超过1500pg/mL；当加入40μg的HB100-108-MPC1与DC孵育后，IL-6的分泌水平略低于20μg HB100-108-MPC1组，仍明显高于20μg和40μg MPC1组。
图30B显示，加入20μg的MPC1与DC孵育后，TNF-α的分泌水平与DC对照组相比变化不明显；加入40μg的MPC1与DC孵育后，TNF-α的分泌水平与DC对照组与20μg MPC1组相比有了显著的提升，浓度达到400pg/mL；当加入20μg的HB100-108-MPC1与DC孵育后，TNF-α的分泌水平有了进一步显著的提升，超过500pg/mL；当加入40μg的HB100-108-MPC1与DC孵育后，TNF-α的分泌水平低于20μg HB100-108-MPC1组，仍高于20μg和40μg MPC1组，超过400pg/mL。
图31A显示，加入20μg的MPC2与DC孵育后，IL-6的分泌水平与DC对照组相比变化不大；加入40μg的MPC2与DC孵育后，IL-6的分泌水平与DC对照组与20μg MPC2组相比有了显著的提升，浓度达到900pg/mL；当加入20μg的HB100-108-MPC2与DC孵育后，IL-6的分泌水平有了进一步显著的提升，达到1400pg/mL；当加入40μg的HB100-108-MPC2与DC孵育后，IL-6的分泌水平低于20μg HB100-108-MPC2组，仍明显高于20μg和40μg MPC2组，达到约1200pg/mL。
图31B显示，加入20μg的MPC2与DC孵育后，TNF-α的分泌水平与DC对照组相比略有提升；加入40μg的MPC2与DC孵育后，TNF-α的分泌水平与DC对照组与20μg MPC2组相比有了显著的提升，浓度接近500pg/mL；当加入20μg的HB100-108-MPC2与DC孵育后，TNF-α的分泌水平有了进一步显著的提升，超过600pg/mL；当加入40μg的HB100-108-MPC2与DC孵育后，TNF-α的分泌水平与20μg HB100-108-MPC2组相当，仍高于20μg和40μg MPC2组，约600pg/mL。
综上，图30-31的结果表明，本发明的多肽构建体与DC孵育后能够明显提升细胞因子IL-6和TNF-α的分泌水平。IFN-γ、poly(I:C)和R848能够刺激DC成熟并分泌包括IL-6和TNF-α在内的促炎症因子。本发明多肽构建体的加入能够显著提升IL-6和TNF-α的分泌水平，表明本发明的多肽构建体能够有效促进DC成熟。
实施例11多肽构建体处理的DC对T细胞的增殖与IFN-γ分泌的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，向不同的孔中分别加入40μg的MPC1、40μg的MPC2、40μg的HB100-108-MPC1和40μg的HB100-108-MPC2，37℃5％CO2孵育6小时后用PBS洗涤。向各孔中加入IFN-γ、poly(I:C)和R848，使其终浓度分别为100IU/mL、30μg/mL和5μg/mL，继续培养24小时后，收集各组DC细胞并计数，按照1×106/mL细胞密度重新铺24孔板，每孔1mL。
采用CFSE法检测T细胞的增殖。CFSE(购自Scelleck中国)用DMSO溶解至50μM作为母液保存，使用前用PBS稀释至5μM。PBMC细胞与稀释后的CFSE在37℃孵育10-15分钟后，加入含有10％FBS的AIM-V培养基至初始体积的10倍终止反应，离心去上清，将获得的T细胞加入上述各含有DC的孔内，每孔中DC与T细胞的比例均为1︰5，设置一组T细胞不与DC共培养作为未刺激对照，共培养96小时，然后分别收集T细胞和上清液，流式细胞计数检测CFSE+T细胞数量，并用CBA试剂盒(购自BD)检测上清液中的IFN-γ的浓度。IFN-γ的浓度检测通过3次重复实验进行，每次实验中的每组样品平行设置3个复孔。结果如图32-33所示。
图32A显示，未刺激T细胞组未发现有明显增殖；与未经多肽构建体处理的DC共培养后，T细胞有低水平的增殖，增值的T细胞的比例为10.2％；与经过MPC1处理的DC共培养后，T细胞的增殖水平有了显著的提高，增殖的T细胞的比例达到41.3％；与经过HB100-108-MPC1处理的DC共培养后，T细胞的增殖水平有了进一步的显著提升，增殖的T细胞的比例为53.1％。
图32B显示，未刺激T细胞组未发现有明显增殖；与未经多肽构建体处理的DC共培养后，T细胞有低水平的增殖，增值的T细胞的比例为5.59％；与经过MPC2处理的DC共培养后，T细胞的增殖水平有了显著的提高，增殖的T细胞的比例达到33.3％；与经过HB100-108-MPC2处理的DC共培养后，T细胞的增殖水平有了进一步的显著提升，增殖的T细胞的比例为44.2％。
图33A显示，与未刺激T细胞组上清中IFN-γ的浓度相比，未经多肽构建体处理的DC与T细胞共培养后(T细胞+DC组)上清中IFN-γ的浓度有了一定提升，达到1000pg/mL左右；与经过MPC1处理的DC共培养后(T细胞+DC+MPC1组)，T细胞上清中IFN-γ的浓度与T细胞+DC组上清中的IFN-γ的浓度相比有了明显提升，超过2000pg/mL；与经过HB100-108-MPC1处理的DC共培养后(T细胞+DC+HB100-108-MPC1组)，T细胞上清中IFN-γ的浓度与其他组的上清中IFN-γ的浓度相比有了非常显著的提升，达到接近5000pg/mL。
图33B显示，与未刺激T细胞组上清中IFN-γ的浓度相比，未经多肽构建体处理的DC与T细胞共培养后(T细胞+DC组)上清中IFN-γ的浓度有了一定提升，接近1000pg/mL；与经过MPC2处理的DC共培养后(T细胞+DC+MPC2组)，T细胞上清中IFN-γ的浓度与T细胞+DC组上清中的IFN-γ的浓度相比有了明显提升，超过1500pg/mL；与经过HB100-108-MPC2处理的DC共培养后(T细胞+DC+HB100-108-MPC2组)，T细胞上清中IFN-γ的浓度与其他组的上清中IFN-γ的浓度相比有了非常显著的提升，达到接近3000pg/mL。
图32-33的结果表明，本发明多肽构建体能够显著地提高DC对T细胞的刺激并促进其增殖，同时经过本发明多肽构建体处理的DC能够显著提高T细胞分泌IFN-γ的水平。
实施例12多肽构建体对DC表面免疫抑制性分子受体表达的影响
取实施例1分离的DC铺24孔板，每孔加入1mL细胞密度为1×106/mL的DC悬液，；分别向不同的孔中加入40μg的HB100-108-MPC1、40μg的HB100-108-MPC2、40μg的MPC4和40μg的HB100-108-MPC4，预留不加入多肽构建体的DC作为不同组的DC对照，孵育6小时，用含有5％v/vFBS的PBS洗涤3次后加入新鲜培养基培养过夜，消化并收集DC，PBS洗涤2次后，HB100-108-MPC1组DC分别用靶向PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4的用荧光基团标记的单克隆抗体染色；HB100-108-MPC2组DC也分别用靶向PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4的用荧光基团标记的单克隆抗体染色；MPC4组DC和HB100-108-MPC4组DC用靶向PD-L1的用荧光基团标记的单克隆抗体染色(以上靶向PD-L1的抗体用PE标记，购自BD；靶向PD-L2、HVEM和ILT4的单克隆抗体分别用FITC、APC和PE标记，购自北京义翘神州生物技术有限公司，抗体使用浓度根据说明书指示确定)，各组分别设置同型对照组(同型对照抗体为常规鼠源IgG)，4℃避光孵育30分钟，再次用含有5％v/vFBS的PBS洗涤3次，通过流式细胞计数检测PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4阳性细胞的比例。结果如图34A-34C所示。
图34A显示，经过HB100-108-MPC1处理的DC中的PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4阳性细胞比例与对照组DC相比没有明显区别。
图34B显示，经过HB100-108-MPC2处理的DC中的PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4阳性细胞比例与对照组DC相比没有明显区别。
图34C显示，经过MPC4处理或HB100-108-MPC4处理的DC中的PD-L1阳性细胞的比例分别为2.8％和3.6％，与DC对照组中2.6％的阳性细胞比例相比没有明显区别。
PD-L1、PD-L2、HVEM和ILT4为免疫抑制性分子受体，与其T细胞上相应配体结合会抑制T细胞的激活和增殖。图34的结果表明，本发明多肽构建体没有增加DC的免疫抑制性分子受体的表达水平，因此经过本发明多肽构建体处理的DC不会潜在地对T细胞产生抑制作用。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
上海细胞治疗研究院
<120> 多肽、含有多肽的组合物及其在肿瘤免疫中的应用
<130> 200531
<150> CN 201910107321.4
<151> 2019-02-02
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (66)

1.一种分离的融合多肽，其特征在于，其从N端到C端依次包含共价连接的选自以下任一组的肽段：(1)衍生于PSF1的肽段、衍生于eEF2的肽段和衍生于MCL-1的肽段、(2)衍生于HSP105的肽段、衍生于MUC-1的肽段和衍生于Survivin的肽段、(3)衍生于PSF1的肽段、衍生于MCL-1的肽段和衍生于HSP105的肽段，和(4)衍生于eEF2的肽段、衍生于MUC-1的肽段和衍生于Survivin的肽段，其中，
所述衍生于PSF1的肽段为SEQ ID NO.1所示，
所述衍生于eEF2的肽段为SEQ ID NO.2所示，
所述衍生于MCL-1的肽段为SEQ ID NO.3所示，
所述衍生于HSP105的肽段为SEQ ID NO.4所示，
所述衍生于MUC-1的肽段为SEQ ID NO.5所示，
所述衍生于Survivin的肽段为SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述分离的融合多肽，其特征在于，所述肽段之间直接共价连接或通过接头共价连接。
3.根据权利要求2所述多肽组合物，其特征在于，所述接头选自(GS4)3、Furin2A肽和双精氨酸中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述多肽组合物，其特征在于，所述接头为双精氨酸。
5.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQ ID NO.1所示的肽段、双精氨酸接头、SEQ ID NO.2所示的肽段、双精氨酸接头和SEQ ID NO.3所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求5所述分离的融合多肽，其特征在于，其还包含免疫增强剂多肽，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求6所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.8所示的肽段共价连接。
8.根据权利要求7所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽通过双精氨酸接头与SEQ ID NO.8所示的肽段共价连接。
9.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.9所示。
10.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQ ID NO.4所示的肽段、双精氨酸接头、SEQ ID NO.5所示的肽段、双精氨酸接头和SEQ ID NO.6所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.10所示。
11.根据权利要求10所述分离的融合多肽，其特征在于，其还包含免疫增强剂多肽，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
12.根据权利要求11所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.10所示的肽段共价连接。
13.根据权利要求12所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽通过双精氨酸接头与SEQ ID NO.10所示的肽段共价连接。
14.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.11所示。
15.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQ ID NO.1所示的肽段、双精氨酸接头、SEQ ID NO.3所示的肽段、双精氨酸接头和SEQ ID NO.4所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.12所示。
16.根据权利要求15所述分离的融合多肽，其特征在于，其还包含免疫增强剂多肽，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
17.根据权利要求16所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.12所示的肽段共价连接。
18.根据权利要求17所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽通过双精氨酸接头与SEQ ID NO.12所示的肽段共价连接。
19.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.13所示。
20.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽从N端到C端依次包含共价连接的SEQ ID NO.2所示的肽段、双精氨酸接头、SEQ ID NO.5所示的肽段、双精氨酸接头和SEQ ID NO.6所示的肽段，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.14所示。
21.根据权利要求20所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽还包含免疫增强剂多肽，所述免疫增强剂多肽为HB100-108肽，其序列如SEQ ID NO.7所示。
22.根据权利要求21所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽位于所述分离的融合多肽的N端，与SEQ ID NO.14所示的肽段共价连接。
23.根据权利要求22所述分离的融合多肽，其特征在于，所述免疫增强剂多肽通过双精氨酸接头与SEQ ID NO.14所示的肽段共价连接。
24.根据权利要求4所述分离的融合多肽，其特征在于，所述分离的融合多肽的序列如SEQ ID NO.15所示。
25.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1-24中任一项所述分离的融合多肽。
26.根据权利要求25所述分离的核酸，其特征在于，其为未经修饰的或经过化学修饰的RNA。
27.根据权利要求26所述分离的核酸，其特征在于，所述经过化学修饰的RNA上的化学修饰选自核糖环修饰，磷酸二酯键骨架修饰和碱基修饰。
28.根据权利要求27所述分离的核酸，其特征在于，所述核糖环修饰修饰为2’-氧烷基修饰和2’-F修饰修饰。
29.根据权利要求27所述分离的核酸，其特征在于，所述磷酸二酯键骨架修饰为锁核酸修饰。
30.根据权利要求27所述分离的核酸，其特征在于，所述碱基修饰为4-硫脲嘧啶修饰、2-硫脲嘧啶修饰和C-连接的伪尿嘧啶修饰。
31.一种免疫多肽组合物，其特征在于，其包含权利要求1-24中任一项所述分离的融合多肽和免疫增强剂。
32.根据权利要求31所述的免疫多肽组合物，其特征在于，所述免疫增强剂包括选自polyIC︰IL、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、铝盐、氢氧化铝纳米颗粒、***素E2、α干扰素和HB100-108肽中的一种或多种。
33.根据权利要求32所述的免疫多肽组合物，其特征在于，所述免疫增强剂为HB100-108肽。
34.根据权利要求33所述的免疫多肽组合物，其特征在于，所述HB100-108肽的序列为SEQID NO.7所示。
35.一种免疫调节剂，其特征在于，其包含权利要求1-24中任一项所述分离的融合多肽、权利要求25-30中任一项所述分离的核酸和权利要求31-34中任一项所述免疫多肽组合物中的一种或多种。
36.一种多肽疫苗，其特征在于，其包含a)权利要求1-24中任一项所述分离的融合多肽、权利要求25-30中任一项所述分离的核酸和权利要求31-34中任一项所述免疫多肽组合物中的一种或多种和b)药学上可接受的载体。
37.根据权利要求36所述多肽疫苗，其特征在于，所述多肽疫苗还进一步包含佐剂。
38.一种抗原负载的、活化的抗原呈递细胞的制备方法，其特征在于，包括用权利要求35所述免疫调节剂和/或选自权利要求36和37中任一项所述多肽疫苗接触所述抗原呈递细胞。
39.根据权利要求38所述制备方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞是淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、干细胞或其任意组合。
40.根据权利要求39所述制备方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞是选自单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中的任一种或多种。
41.根据权利要求38所述制备方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞是自体的或同种异体的。
42.根据权利要求38所述制备方法，其特征在于，所述接触为孵育。
43.根据权利要求42所述制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为2-10小时。
44.根据权利要求42所述制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为3-8小时。
45.根据权利要求42所述制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为3-6小时。
46.根据权利要求38所述制备方法，其特征在于，所述免疫调节剂和/或多肽疫苗与所述抗原呈递细胞的用量比为10-120μg/106个细胞。
47.根据权利要求46所述制备方法，其特征在于，所述免疫调节剂和/或多肽疫苗与所述抗原呈递细胞的用量比为20-90μg/106个细胞。
48.根据权利要求47所述制备方法，其特征在于，所述免疫调节剂和/或多肽疫苗与所述抗原呈递细胞的用量比为20-40μg/106个细胞。
49.根据权利要求42所述制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃。
50.根据权利要求42所述制备方法，其特征在于，所述孵育的CO2浓度为5％。
51.一种肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗包含通过权利要求38-50中任一项所述制备方法制得的抗原呈递细胞。
52.根据权利要求51所述肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗还包括权利要求35所述免疫调节剂。
53.根据权利要求51所述肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗还包括药学上可接受的载体和/或佐剂。
54.一种制备激活的免疫效应细胞的方法，其特征在于，其包括用经过权利要求1-24中任一项所述分离的融合多肽、权利要求25-30中任一项所述分离的核酸、权利要求31-34中任一项所述免疫多肽组合物、权利要求35所述免疫调节剂、权利要求36或37所述多肽疫苗和权利要求51-53中任一项所述肿瘤疫苗中的一种或多种处理过的抗原呈递细胞接触所述免疫效应细胞。
55.根据权利要求54所述方法，其特征在于，所述抗原呈递细胞为树突状细胞。
56.根据权利要求54所述方法，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。
57.根据权利要求54所述方法，其特征在于，所述处理为孵育。
58.根据权利要求47所述方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃。
59.根据权利要求47所述方法，其特征在于，所述孵育的CO2浓度为5％。
60.根据权利要求47所述方法，其特征在于，所述孵育的时间为3-6小时。
61.根据权利要求54所述方法，其特征在于，所述接触为共培养。
62.根据权利要求61所述方法，其特征在于，所述共培养的温度为37℃。
63.根据权利要求61所述方法，其特征在于，所述共培养的CO2浓度为5％。
64.根据权利要求61所述方法，其特征在于，所述共培养的时间为12-96小时。
65.根据权利要求61所述方法，其特征在于，所述共培养中所述抗原呈递细胞与所述免疫效应细胞的比例为1︰1-1︰5。
66.根据权利要求65所述方法，其特征在于，所述共培养中所述抗原呈递细胞与所述免疫效应细胞的比例为1︰5。
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