TW588110B

TW588110B - Polypeptide having alpha-isomaltosyl-transferring enzyme activity

Info

Publication number: TW588110B
Application number: TW090128473A
Authority: TW
Inventors: Michio Kubota; Kazuhiko Maruta; Takuo Yamamoto; Shigeharu Fukuda
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2004-05-21
Also published as: KR20020082843A; DE60128944T2; ATE364692T1; JPWO2002040659A1; EP1335020B1; JP4238028B2; EP1335020A1; US7098013B2; DE60128944D1; EP1335020A4; KR100877278B1; US20040121431A1; WO2002040659A1

Description

588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _____ B7五、發明説明（1 ) 本發明係有關具有可以自做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1 ，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度3以上之糖質，生成具有環{ — 6丨一 α - D -吡喃葡糖基—（1~>3) - a — D — D比喃葡糖基一（1 — 6) -α - D -吡喃葡糖基一（1 — 3) — a— D -吡喃葡糖基 -（1 —)構造之環狀四糖的酶活性，並且具有序列表中序列1及2所示胺基酸序列，或此種胺基酸序列中1或複數個胺基酸缺失，取代，或附加之胺基酸序列的多肽與其用途者。更詳而言係有關具有可以自做爲非還原末端的結合樣式具有α 一 1 ，6 -葡萄糖基結合，做爲此種還原末端以外的結合樣式具有α - 1 ，4 -葡萄糖結合之葡萄糖聚合度3以上之糖質，生成具有環{-6丨一α-D-吡喃葡糖基一（1 — 3) - α — D -吡喃葡糖基一（1->6 )—α - D —吡喃葡糖基—（1->3) — a — D —吡喃葡糖基-（1 ^ )構造之環狀四糖的酶活性，並且具有序列表中序列1及2所示胺基酸序列，或此種胺基酸序列中1 或複數個胺基酸缺失，取代，或附加之胺基酸序列的多肽 ’可編碼該多肽的D N A，含可編碼該多肽的D Ν Α與可自主複製之載體所成之可複製之重組D N A，將該重組 DNA導入適當之DNA所成轉形體，該多肽之製造方法 ’以及具有上述特定構造之糖質與其用途者。以葡萄糖爲構成糖之糖質係習知者有例如以澱粉爲原料所製造之部份分解物之直鏈澱粉，澱粉糊精，麥芽糖糊本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -4 - 588110 A7 B7 五、發明説明（2 ) 精，麥芽寡糖，異麥芽寡糖等。此等糖質係通常在分子兩端分別具有非還原末端與還原末端，具有還原性係爲人所知。通常澱粉部份分解物時係每單位固態物之還原力強者係通常分子小，低粘度且甜味強，但由於其反應性高，例如極易胺基酸或蛋白質等具有胺基之物質引起胺基羰基反應，產生褐變或惡臭，極易引起其品質劣化等缺點亦爲人所知。爲改善此缺點。爲改善此缺點，以往均希望在不改變還原性糖質之構成糖的葡萄糖下，減低或消滅其還原力。例如 Journal of American Chemical Society 第 7 1 卷， 3 5 3 〜3 5 8 頁（1 9 4 9 )所揭示，有使 macerans· 直鏈澱粉作用於澱粉，以生成6、7或8葡萄糖分子結合於α - 1，4 一葡萄糖基的α —，石一或r —環狀糊精之方法爲人所知。如今已有工業規模自澱粉生產此等環狀糊精，此等環狀糊精還以其所具有非還原性，無味性，包含能力等特性被利用於各種用途。又，如本案申請人所申請專利日本特開平7 — 1 4 3 8 7 6號公報，特開平7 -2 1 3 2 8 3號公報等揭示，使非還原性精質生成酶及海藻糖游離酶作用於麥芽寡糖等澱粉部份分解物，以生成二個葡萄糖分子爲α，α -結合的海藻糖的方法係亦人所知者。現今海藻糖已以工業規模自澱粉予以生產，以其所具有之非還原性，溫和，高品質之甘味特性等被利用於各種用途。如上述做爲以葡萄糖爲構成糖的非還原性糖質，葡萄糖聚合度爲2之海藻糖，葡萄糖聚合度爲6、7及8之 α —，々一，r -環狀糊精，雖然利用其各具有之特性在本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ ί·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（3 ) 工業上被生產，被利用，但仍極希望能提供更多樣與此等糖質不同性質性狀之非還原性糖質，或低還原性糖質。另一方面’近年來已有報告提出以葡萄糖爲構成糖之新環狀構造之四糖類，即，「European Journal of Biochemistry」第 226 卷，641 〜648 頁（1994 )中曾揭示主要以葡萄糖殘基爲α — 1，3結合與，6結合交替連接的Alternan，使水解酶之八以1*1^1^6作用以生成環丨—6丨—α - D -吡喃葡糖基一（1 — 3) 一 a— D -吡喃葡糖基—（1 — 6) — α — D -吡喃葡糖基—（1-3) - α-D -吡喃葡糖基一（1 —)之構造的環狀四糖（此說明書中有時將此精質簡稱爲「環狀四糖」，在甲醇共存下將其晶析之內容。環狀四糖因具有環狀構造，具有包含能力，具有安定化揮發性有機物之作用，所以不會引起胺基羰基反應，不用擔心褐變劣化等之下可加工利用。受到期待。惟由於做爲製造環狀四糖之原料的alternan，或酶的Alternanase極不易取得，可以產生此等之微生物亦極不容易取得。在這種情況下，本發明人等係針對工業上極易實施之新的製造環狀四糖方法加以硏究，發現芽孢桿菌屬（ BacillusCohn)或節桿菌屬（Arthrobacter Conn et Dimmick )所屬之某種微生物可以產生一種以往從未人知之新穎酶α -異麥芽糖基轉移酶，該酶爲可自做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α 一 1，4 一葡萄糖基結合本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ------------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 588110 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) 的葡萄聚合度爲3以上糖質生成環狀四糖者，遂而將其揭示於P CT/J P 0 1/0 4 2 7 6號說明書中。更發現由此等微生物可以產生自葡萄糖聚合度2以上澱粉糖生成做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合的葡萄糖聚合度爲3以上之糖質的新穎酶，即α -異麥芽糖葡糖質生成酶，將其揭示於P C Τ/ J Ρ 0 1 / 0 6 4 1 2號說明書。然後又發現使用此等 α -異麥芽糖基轉移酶與α -異麥芽糖葡糖質生成酶時可以自葡萄糖聚合度2以上的澱粉糖生成環狀四糖。惟此等微生物均無法生產足夠量的α -異麥芽糖基轉移酶，有欲大規模製造環狀四時必須大量培養微生物的問題。另一方面，近代分子生物學上的進步，已確認酶之本質爲多肽，構成其之胺基酸序列可以左右其酵素之活性，而該胺基酸序列係經由基因D Ν Α所碼者。所以只要可以自編碼多肽之基因單離，解明其鹼序列，即可製作包含可編碼該多肱之D Ν A的重組D N A，將其導入於微生物或動植之細胞，培養所得轉形體，已較容易取得所希望之多肽。有鑑於上述狀況，單離可編碼上述^ -異麥芽糖基轉移酶本質的多肽之基因，解明其鹼序列，藉由基因重組技術，大量廉價，穩定地供給該構造被解明之多肽乃成爲當前急務。本發明之第一課題係創製可以自做爲非還原末端的結本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） —. S-----^^衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（5 ) 合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末 5而以外之結合樣式具有α-l，4 -葡萄糖基結合的葡萄糖聚合度3以上之糖質生成環狀四糖的具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽（以下稱爲「本發明之多肽」）者。本發明之第二課題係在於提供可編碼本發明之多肽的 D Ν Α 者。本發明之第三課題係在於提供含該D N A之可複製的重組D N A者。本發明之第四課題係在於提供導入有該重組D N A的轉形體者。本發明之第五課題係在於提供利用該轉形體，以製造本發明之多肽的方法者。本發明之第六課題係在於提供利用本發明之多肽，自做爲還原末端的結合樣式具有^ - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合的葡萄糖聚合度3以上之糖質生成環狀四糖的方法者。本發明之第七課題係在於提供使用本發明之多肽所得之環狀四糖與其用途者。本發明係以具有可以自做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖結合之葡萄糖聚合度3 以上之糖質，生成具有環丨-6 } - α - D -吡喃葡糖基 —(1~>3) — α - D — d比喃葡糖基—（1 — 6) — α - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（6 ) D -吡喃葡糖基一（1 — 3) — α - D —吡喃葡糖基一（ 1 —)構造之環狀四糖的酶活性，並且具有序列表中序列 1及2所示胺基酸序列，或此種胺基酸序列中1或複數個月安基酸缺失，取代，或附加之胺基酸序列的多肽解決上述之第一課題者。本發明係以可編碼該多肽之D Ν Α之解決上述第二課題者。本發明係以含可編碼該多肽之D Ν A與可自主複製之載體之可複製D NA以解決上述第三課題者。本發明係以含編碼該多肽之D Ν A與可自主複製之載體所成可複製之重組D NA將其導入適當之宿主所成的轉形體以解決第四課題者。本發明係以含編碼該多肽之D Ν A與可自主複製之載體所成可複製之重組DNA，將其導入適當之宿主，培養基所成之轉形體，自該培養物採收該多肽之該多肽的製造方法解決上述第五課題者。本發明係以含有使本發明之多肽作用於做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度3以上之糖質，生成環狀四糖的步驟所成環狀四糖的製造方法以解決上述第六課題者。本發明係以使用本發明之多肽製造環狀四糖，提供含有該環狀四糖或含其之混合糖質的飮食物、化糖品、醫藥品等組成物以解決第七課題者。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（7 ) 圖面之簡單之說明第1圖係表示圓孢芽孢桿菌c 1 1由來之具有α —異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之最適溫度圖。第2圖係表示圓孢芽孢桿菌C11由來之具有α-異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之最適Ρ Η値圖。第3圖係表示圓孢芽孢桿菌C11由來之具有α-異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之熱安定性圖。第4圖係表示圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之Ρ Η安定性圖。 ' 第5圖係表示圓孢芽孢桿菌Ν751由來之具有α-異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之最適溫度圖。第6圖係表示圓孢芽孢桿菌Ν 7 5由來之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之最適Ρ Η値圖。第7圖係表示圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之具有α —異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之熱安定性圖。第8圖係表示圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之ρ Η安定性圖。第9圖係示本發明之重組DNA「pBGC 1」之限制酶圖譜，圖中粗線部份係示編碼圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之本發明具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之 D Ν Α。第1 0圖係示本發明之重組DNA「pBGNl」之限制酶圖譜，圖中粗線部份係示編碼圓孢芽孢桿菌N 7 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) ~ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（8 ) 由來之本發明具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之 D Ν Α 〇本發明係根據發現以往從未爲人所知之新穎酶而得以完成者，該酶係可以自做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有1，4 -葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲3以上糖質生成環狀四糖者。該酶可以自本發明人等由土壤分離之新穎微生物C 1 1及Ν7 5株培養物做爲多肽取得。 C 1 1株係具有以下性質者，本發明人等係命名此菌爲新穎微生物圓孢芽孢桿菌（Bacillusglobisporus) C 1 1，於 2 0 0 0年4月2 5日寄存於日本通產省工業技術院生命工業工業技術硏究所，以寄存號碼F E R Μ Β Ρ -7 1 4 4寄存。又，Ν 7 5株係以具有以下性質者，本發明人等係命名此菌爲新穎微生物圓孢芽孢桿菌（Bacillus globisporus) N75，於2001年5月16曰寄存於日本通產省工業技術院生命工業工業技術硏究所，以寄存號碼FERM BP — 7591寄存。又，C11株及 N7 5株係如PCT/J P0 1/〇6 4 1 2號說明書所揭示亦可以自葡萄糖聚合度2以上之澱粉糖產生可以生成做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲此非速原末_以外的結合樣式具有α - 1 ’ 4 — 葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度3以上之糖質的酶，即α -異麥芽糖葡糖質生成酶。 —·----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公釐） -11 - 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（9 ) <圓孢芽孢桿菌C 1 1株> A 細胞形態 (1 )肉汁瓊脂培養，2 7 °C 通常0 . 5至1 . 0x1 . 5至5//m之桿菌。無多形性。有運動性。細胞內端形成球形孢子。形成膨潤之孢子囊。革蘭陽性。 B 培養性質 (1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 °C 形狀：圓形，大小係2天之間爲1至2 m m 周緣：全緣 ***：半鏡片狀光澤=無光表面：平滑色調：不透明，淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度形狀：釋散狀 (3 )肉汁明膠穿刺培養，於2 7 °C 液化。 C 生理學上性質 (1 ) V P試驗：陰性 (2 )吲哚之生成：陰性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 588110 A7 B7 五、發明説明（10) 丨. « — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3 )自硝酸生成氣體：陽性 (4 )澱粉之水解：陽性 (5 )色素生成：不會生成可溶性色素 (6 )脲酶：陽性 (7 )氧化酶：陽性 (8 )過氧化氫酶：陽性 (9)生育之範圍：PH5 . 5至9 . 0，溫度10至 3 5 t： (1 0 )對氧之態度：好氣性 (1 1 )碳源之利用性與生成酸之有無利用性生成酸葡萄糖利用陽性甘油利用陽性蔗糖利用陽性乳糖利用陽性 4 (12)DNA中之GC含量：39% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <圓孢芽孢桿菌N 7 5 > A 細胞形態 (1 )肉汁瓊脂培養，2 7 °C 通常0 · 5至1 . 0#mx 1 · 5至5//m桿菌。無多形性。有運動性。細胞內端形成球形孢子。形成膨潤之孢子囊。革蘭陽性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13- 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（11) B 培養性質 (1 )肉汁瓊脂平板培養，2 7 °C 形狀··圓形，大小係2天之間爲1至2 m m 周緣：全緣 ***：半鏡片狀光澤：無光表面：平滑色調：不透明，淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：中等程度形狀：釋散狀 (3 )肉汁明膠穿刺培養，於2 7 °C 液化。 C 生理學上性質 (1 ) V P試驗：陰性 (2 )吲哚之生成：陰性 (3 )自硝酸生成氣體：陽性 (4 )澱粉之水解：陽性 (5 )色素生成：不會生成可溶性色素 (6 )脲酶：陽性 (7 )氧化酶：陽性 (8 )過氧化氫酶：陽性 (9)生育之範圍：PH5.7至9·0,溫度10至 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14- 588110 A7 B7 五、發明説明（12) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ( 10 ) 對氧之態度 : 好氣性 ( 11 ) 碳源之利用性與生成酸之有無利用性生成酸葡萄糖利用陽性甘油利用陽性蔗糖利用陽性乳糖利用陽性 ( 12 ) D N A中之 G C 含量： 4 0 % 可以白圓孢芽孢桿菌 C 1 1 ( F E R Μ Β P — 7 1 4 4 ) 或圓孢芽孢桿菌 N 7 5 (F E R Μ B P - 7 5 9 1 ) 的培養物所得 a — 異麥芽糖基轉移酶係經由本發明人等以管柱層析爲中心組合各種精製方法予以單離後調查其性 ‘質性狀之結果確認可以自做爲非還原末端的結合樣式具有 a 一 1 6 — 葡萄糖基結合做爲此非還原末端以外的 '結合樣式具有 a — 1， 4 - 葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度 :3 以上之糖質 5 生成具有環 { —> 6 } — OL 一 D — 吡喃葡糖 :基 — (1 —> 3 ) — OL — D - 吡喃葡糖基一（ 1 —> 6 )- a — D -吡喃葡糖基 -( 1 - 3 ) — a — D - 吡喃葡糖基 — ( 1 -) 構造之糖質的酶活性，並且具有序列表中序列 1 及 2 所示胺基酸序列的多肽〇而該多肽的理化學性係如下所示者。 (1 ) 分子量藉由 S D S -聚丙烯醯胺膠電泳法測出其爲約本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（13) 82，〇〇〇〜132000達爾頓 (2 )最適溫度 PH6 . 0，反應30分鐘時約50°C (3 )最適P Η 35 °C反應30分鐘時pH約5 . 5〜6 . 0 (4 )溫度安定性 p Η 6 · 0，保持6 0分鐘’於約4 5 °C下具有溫度安定領域 (5 ) P Η安定性 4 °C保持2 4小時，於Ρ Η約4 . 5〜1 0 · 0範圍內有安定之Ρ Η領域。其次針對爲解明本發明有關具有^ -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之理化學性所進行之實驗加以說明。實驗1 調製圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之多肽實驗1 - 1 調製粗多肽在5 0 0J容積之三角形燒瓶中放入1 〇〇m 1由 4 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：「Paindex #4」 )、1 · 8w/v% 酵母萃取物（Asahimist) ，0 · lw /v%磷酸二鉀、〇 . 〇6w/v%磷酸一鈉· 1 2水鹽、0 . 0 5 w/ v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成培養基，以 1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種圓孢芽孢桿菌 c 1 1 ( F E R Μ BP — 7144)，於 27 °C、 2 3 0 r p m旋轉振盪培養4 8小時後，做爲種培養液。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明（14) 另外，在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻使其爲2 7 °C後接種1 v / v %種培養液，保持於溫度2 7 °C，p Η 6 · 0〜8 · 0，通氣攪拌培養4 8小時。測定培養後之培養液中的酶活性係α -異麥芽糖基轉移酶活性爲約 1 · 8單位/^，α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性爲約 0 . 5 5單位/J。測定經離心分離（1 〇，〇〇〇 r p m，3 0分鐘）此培養物回收之上澄液約1 8 <的酶活性時，α -異麥芽糖基轉移酶活性係1 · 7單位/W ( 總活性約3 0，4 0 0單位^ -異麥芽糖葡糖質生成酶活性係約0 . 5 1單位/ (總活性約9，1 8 0單位 )，兩酶活性均主要在培養上澄液中被檢測出，確認二酶爲可被分泌至培養液中之分泌型多肽。又，α -異麥芽糖基轉移酶之酶活性的測定係將人參三糖（panose)溶解於1 〇〇 m Μ乙酸緩衝液（ρ Η 6 · 0 )使其爲2 w/ ν %濃度，做爲基質溶液。在〇 . 5 W該基質溶液中加入0 . 5 4酶溶液，於3 5 t進行3 0分鐘之酶反應。煮沸該反應液1 0分鐘，停止反應後，以葡萄糖氧化酶法定量該反應液中之葡萄糖量。1單位α -異麥芽糖基轉移酶之酶活性係以上述條件下1分鐘內生成之1 //莫耳葡萄糖的酶量來表示。又，HPLC係用「Shodex KS-8〇l管柱」（昭和電工公司製造），其溶離條件係於 6 0 °C管柱內溫度，溶離液之水流速爲〇 . 5 m£ /分鐘，檢測所溶離之糖質係用示差折射計「R 1 - 8 0 1 2」( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 _五、發明説明（15 ) 東曹公司製）進行。以8 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 <實驗6所得培養上澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（1 〇〇〇〇 r p m，3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 〇 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 · 5 )後，對該緩衝液透析，得約4 1 6 J粗酶液。此粗酶液係約2 8，〇〇〇單位酶活性的粗酶液。含有8，4 4 0單位6 -葡萄糖基酶活性。以三菱化學製之Sepabeads FP-DA13凝膠的離子交換管柱層析（凝膠容量1 0 0 0 J )處理此粗酶液，α -異麥芽糖基轉移酶活性，^ -異麥芽糖葡糖質生成酶活性均不會被Sepabeads FP-DA13凝膠吸附，做爲非吸附餾份被檢測。回收此非吸附餾份以含1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩衝液 (ρ Η 7 . 0 )透析，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 J )處理。酶活性會吸附於Sephacryl HR S-200 凝膠，以自1 Μ至〇 Μ下降硫銨濃度之直線梯度，繼而以自OmM至1 0 OmM上昇之麥芽糖四醇濃度之直線梯度溶離時，α -異麥芽糖基轉移酶活性與α -異麥芽糖葡糖質生成酶會分離後自管柱溶離、α -異麥芽糖基轉移酶活性係在硫銨之直線梯度的其濃度爲約0 Μ附近餾份被檢測出，另一方面，α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性係在麥芽四糖之直線梯度的其濃度爲約3 0 m Μ附近之餾份被檢測出。在此分別收集α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份與α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性餾份，分別做爲具有α -異麥本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）一 -18- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（16) 芽糖基轉移酶活性之粗多肽，具有α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性的粗多肽回收。另外，依以下手法分別精製，分取具有^ -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽與具有α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性的多肽。實驗1 - 2 精製具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . ◦) 透析實驗1 - 1記載之所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之粗多肽、離心分離此透析液、除去不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toy opead 65 0Μ凝膠之疏水性管柱層析（凝膠量3 5 0 2 )處理。此酶活性會吸附於Butyl-Toyopearl 65 0M凝膠，於硫銨濃度自1 Μ減少至〇 Μ之直線梯度溶離之結果，在硫銨濃度約0 . 3 Μ附近吸附之酶活性會溶離出，收集示有此酶活性之餾份並回收。再以含 1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 · 〇 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性管柱層析粗製。將此精製之各步驟中α -異麥芽糖基轉移酶活性量，比活性，收率示於表1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） •19- 588110

7 7 A B 五、發明説明（17) 表 1 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶活性量（單位） α-異麥芽糖基轉移酶比活性 (單位/mg蛋白質）收率 (%) 培養上澄液 30,400 0.45 100 硫銨鹽析後之透析 28,000 1.98 92.1 液離子交換樹脂管柱 21,800 3.56 71.7 層析溶離液親和性管柱層析溶 13,700 21.9 45.1 灕液疏水性管柱層析溶 10,300 23.4 33.9 離液親和性管柱層析溶 5,510 29.6 18.1 離液 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以含有7.5w/v%v%濃度之聚丙烯醯胺的凝膠電泳檢定具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之精製多肽的純度，結果爲示單一之蛋白質帶，純度高之標品。實驗1 - 3 α -異麥芽糖葡糖質生成酶的精製以含1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 · 0 ) 透析實驗1 - 1所得具有α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 20 588110 Α7 Β7 五、發明説明（18) 之粗多肽，離心分離此透析液除去不溶物，以使用東曹公司製Buty 1-Toyopearl 65 0M凝膠疏水性管柱層析（凝膠量 3 5 0 m£ )處理。此酶活性會吸附於Butyl-Toyopearl 650M 凝膠，以硫銨濃度自1 Μ減至〇 Μ之直線梯度溶離之結果，在硫銨濃度約0 · 3 Μ附近吸附之酶活性成份會溶離出，收集示有此酶活性之餾份並回收。再以含1 Μ硫銨之 1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 · 〇 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl H R S — 2 0 0凝膠之親和性管柱層析精製。將此精製之各步驟中 α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性量，比活性，收率示於表 1. -----衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -21 - 588110 7 Β 五、發明説明（19) 表 2 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶活件量（單位） α-異麥芽糖基轉移酶比活性 (單位/mg蛋白質）收率 (%) 培養上澄液 9,180 0.14 100 硫銨鹽析後之透析 8,440 0.60 91.9 液離子交換樹脂管柱 6,620 1.08 7 2.1 層析溶離液親和性管柱層析溶 4,130 8.83 45.0 離液疏水性管柱層析溶 3,310 11.0 36.1 離液親和性管柱層析溶 2,000 13.4 21.8 離液 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以含有7.5w/v%v%濃度之聚丙烯醯胺之凝膠電泳檢測精製之^ -異麥芽糖葡糖質生成酶標品的純度，結果爲示單一蛋白質帶之純度高之標品。實驗2 具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽的理化學性質實驗2 - 1 作用本紙張尺度適用_家標準（⑽）Μ規格⑺OX騰釐）& 588110 A7 B7 五、發明説明（2〇) 調製含10mM做爲基質之葡萄糖，6 - 0 - α -葡糖基葡萄糖（別名：異麥芽糖），62 - ◦一 ^ 一葡糖基麥芽糖（別名：人參三糖Pan〇se) ，6 3-〇_ α —葡糖基麥芽三糖（別名：異麥芽糖基麥糖），64 - ◦一 ^ 一葡糖基麥芽四糖，或65 - ◦- α -葡糖基麥芽五糖之水溶液，對每1 mM基質添加2單位之實驗1 一 2所得具有α 一異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，於3 0 °C，ρ Η 6 _ 0反應1 2小時。依常法脫鹽反應物後，藉由使用三菱化學製 HPL用管柱「MCI GEL CK04SS」的 Η P L C分析糖組成。Η P L C係於8 0 °C溫度實施’以東曹製示差折射計「R 1 - 8 0 1 2型」監視溶離液’做爲溶離液以0 . 4 2/分鐘之流速通入水於管柱。結果如表3 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） -23- 588110

B 五、發明説明（21 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表 3 基質反應物中之糖質組成（％) 葡萄糖葡萄糖 100 6-Ο-α -葡糖基葡萄 6-Ο-α -葡糖基葡萄糖 100 糖 62-0-α -葡糖基麥葡萄糖 32.2 芽糖異麥芽糖 2.1 62-0-α -葡糖基麥芽糖 4.6 環狀四糖 43.5 異麥芽糖基人參三糖 4.8 異麥芽糖基人參三糖苷 1.8 其他 11.0 63-0-α -葡糖基麥葡萄糖 50.6 芽三糖異麥芽糖 2.0 63-0-α -葡糖基麥芽三糖 4.2 環狀四糖 30.8 其他 12.4 64-0-α -葡糖基麥異麥芽糖 1.9 芽四糖麥芽三糖 60.7 環狀四糖 25.6 64-0-α -葡糖基麥芽四糖 3.4 其他 8.4 65-0-α -葡糖基麥異麥芽糖 1.6 芽五糖麥芽四糖 66.5 環狀四糖 18.2 65-0-α -葡糖基麥芽五糖 4.3 其他 9.4 表3中，異麥芽糖基人參三糖係具有構造式1或2之構造的糖質（二種糖質），而異麥芽糖基人參三糖苷係具有構造式3之構造的糖質。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 24- 588110 Α7 --— _ Β7 五、發明説明（22 ) 構造式1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) a d G】cp-( 1 —6 )-cr-D-Glcp-( 1 — 3 )-a-d-Glcp-( 1 — 6 Glcp-( 1 —4 )-d-Glcp 構造式2 ( 1 6 ) -Glcj>~( 1 - 4 )-cc-d-Glcp-( 1 一 6〉-ck-d-Glcj>-（ 1 一 4〉-d- Glcp 構造式3 : d-Glci)-( 1 — 6 )-α-D—Glcp-( 1 〇 1 )女 d— Glcp 4 t 1 β~ι> — Glcjp_( 1 — 6 )-ct-D — Glcp 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由表3之結果可知，具有圓孢芽孢桿菌c 1 1由來之具有* α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽係會對於做爲非還原末端之結合樣式具有α 一 1 ，6 一葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外的結合樣式具有^ 一 1，4 一葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度3以上之糖質的6 2 一 ◦一 α 一葡糖基麥芽糖，θ3 — 〇 —葡糖基三糖，64_〇—α—葡糖基麥芽四糖，65 — ◦- α -葡糖基五糖作用，而生成主要爲環狀四糖，較基質之葡萄糖聚合度低2度的麥芽寡糖。除此等環狀四糖，與較基質之葡萄糖聚合度低2度之麥芽寡糖，與未反應之基質以外，在反應物還檢測出可能爲水解由來之微量異麥芽糖，與可能爲轉移作用由來的環狀四糖以外的其他糖質。自各基質所得之環狀四糖的收量係每本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -25- 588110 A7 B7 五、發明説明（23) 固體，自62 —〇—α -葡萄糖基麥芽糖係43 . 5%，自 63 —〇—α -葡萄糖基麥芽三糖係3〇 · 8%，自64 — ◦ 一 α —葡萄糖基麥芽四糖係2 5 . 6%，自65 —〇—α -葡萄糖基麥芽五糖係1 8 · 2%。又，自葡萄糖及6- ◦ - α -葡萄糖基葡萄糖係未見到新的糖質生成。實驗2 - 2 Ν末端側胺基酸序列依常法，使用PARKIN· ELMA製氣相蛋白質序列儀「4 7 3 A型」予以分析，結果具有α _異麥芽糖基轉移酶的多肽係在Ν末端側具有序列表中序列5所示之胺基酸序列。實驗2 - 3 部份胺基酸序列取適量之實驗1 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，以1 0 m Μ T r i s -鹽酸緩衝液（ P Η 9 · 0 )，於4 °C透析1 8小時後，加入1 〇 m Μ T r i s -鹽酸緩衝液（ρ Η 9 · 0 )，使酶濃度爲約1 mg / 。在1 J此溶液中，加入1 0 // g賴胺醯肽鏈內切酶（和光純藥公司販售），於3 0 °C保持恒溫2 2小時部份水解酶，使部份水解物負荷於預先以含有8 % ( ν / ν )水性乙腈的0 . 1 % ( ν / ν )三氟乙酸平衡化之液體層析用管柱「microbondapackC18管柱」（直徑2 · 1 mmx長度1 5 〇mm，Waters公司製），以流速〇 . 9 /分鐘，室溫下，通液至以〇 . 1%三氟乙酸—8%乙本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） ------------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 588110 A7 ______ B7_ 五、發明説明（24) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 腈溶液至0 · 1% (v/v)三氟乙酸—40%乙腈溶液 ’在1 2 0分鐘之間變化的直線梯度中，自管柱溶離之肽片段係測定波長2 1 0 n m吸光度予以檢測出。開始通液後約2 2分鐘，約3 8分鐘，約4 0分鐘，約6 3分鐘及約7 1分鐘之後溶液之含肽片段的餾份係分別予以採收，真空乾燥後，分別溶解於含5 0 % ( v / v )水性乙腈之 0 · 1 % ( v / v )三氟乙酸。其後與實驗2 — 2 —樣分析，結果得五種肽片段，該等胨片段係具有序列6至1 0 所示胺基酸序列。實驗2-4 分子量依據 U. K. Remuly 在「Nature」第 2 2 7 卷，6 8 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製至6 8 5頁（1 9 7 0年）提出之報告的方法，以SDS -聚丙烯醯胺膠電泳實驗1 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，結果在相當於分子量約 82，000至122，000達爾頓的位置觀察到有該酶活性的單一蛋白質頻帶。這時之分子標記係肌球蛋白（ 200，000達爾頓），石一半乳糖苷酶（ 1 16，250達爾頓），磷酸化酶Β (97，400達爾頓），血淸白蛋白（66，200達爾頓）及卵白（ 45 ，00〇達爾頓）。實驗2 - 5 最適溫度依常法，在2 0 mM乙酸緩衝液（ρ Η 6 · 〇 )中，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -27- 588110 A7 _____ B7___ 五、發明説明（25 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於不同溫度使實驗1 一 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽反應3 0分鐘，結果如第1圖所示，該多肽求有約5 0 °C之最適溫度。實驗2-6 最適pH値依常法，於p Η不同之Mackylvain氏緩衝液中’於 3 5 °C反應實驗1 一 2所得有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽3 0分鐘，結果如第2圖所示該多肽示有PH 約5 . 5〜6 . 〇之最適pH。實驗2 - 7 熱安定性依常法，在20mM乙酸緩衝液（pH6 · 0)中，於不同溫度下培育6 0分鐘實驗1 - 2所得具有^ -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，結果該多肽係如第3圖所示，在約4 0 °C以下具有溫度安定域。實驗2 - 8 P Η安定性經濟部智慧財產局員工消費合作社印製依常法在ρ Η不同之Mackylvain氏緩衝液或5 0 m Μ 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液中，於4 °C培育2 4小時實驗1 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之精製多肽，結果該多肽係如第4圖所示，在ρ Η約4 . 5〜9 . 0範圍具有Ρ Η安定域。實驗3 圓孢芽孢桿菌Ν 7 5由來之多肽本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -28- 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（26 ) 在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 〇〇m 1 4 . 〇w/v%激粉部份分解物（商品名：Paindex#4) ’ 1 · 8w/v%酵母萃取物（商品名：Asahimist)，〇 . lw/v%磷酸二鉀、0 · 06w/v%磷酸—鈉· 1 2水鹽、〇 _ 〇 5w/v%硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，經冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C75 (FERM BP — 7591)，於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液。在3 0 <容量之發酵器中放入約2 0 <與種培養時一樣組成之培養基’加熱殺菌，冷卻爲2 7 °C後接種1 v / v %種培養液，於2 7 °C保持於p Η 6 · 0〜8 · 0，通 .氣攪拌培養4 8小時。培養後之培養液中，本發明之酶活性係約1 . 1單位/m 1 ，經離心分離（1 〇〇〇〇 r ρ m，3 0分鐘）回收之約1 8 <上澄液之本酵素活性係約 1 · 1單位/m 1 (總酶活性約1 9，8 0 0單位），而α -異麥芽糖葡糖質生成酶係約〇 . 3 3單位/ 之活性（總活性約5，4 9 0單位），獲知二酶活性均爲可在培養上澄液中檢測出分泌型多肽。以6 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 <上述培養上澄液，於4 t放置2 4小時後，離心分離（1 0，0 0 0 r p m ，3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 〇 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 8 . 3 )後對該緩衝液透析，得約4 5 Ο m 1粗酶液。此粗酶液係具有^ -異麥芽糖基轉移酶活性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） J — Μ------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 -29- 588110 A7 ___ B7___ 五、發明説明（27 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 約1 5，7 0 0單位，具有α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性約4，7 1 0單位。以使用實驗1 — 1記載之Sepabeads FP-DA13凝膠（三菱化學公司製）的離子交換管柱層析（凝膠容量1 0 0 0 m 1 )處理此粗酶液。α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份係不會被Sepabeads FP-DA13凝膠吸附，溶離爲非吸附餾份，而α -異麥芽糖葡糖質生成酶係附於 Sepabeads FP-DA13凝膠者。繼而以Na C 1濃度0Μ至1 Μ之上昇直線梯度溶離，結果α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性餾份係在N a C 1之直線梯度濃度約〇 . 2 5 Μ附近溶出。分別收集α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份，與α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性餾份，分別得到具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之粗多肽，具有α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性之粗多肽。另外，依以下之精製方法分別精製•分取具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽，與具有α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性之多肽。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實驗3 - 2 精製具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 ) 透析實驗3 - 1所得有α -異麥芽糖基轉移酶活性之粗多肽，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephaerye HR S-200 凝膠（Amasham Phamacia Biotech 公司製）之親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 m 1 )處理。此多肽係會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ〜0 Μ減少濃度之硫本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -30- 588110 A7 __ B7 _ 五、發明説明（28 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 銨直線梯度溶離時，在約0 . 3 Μ硫銨濃度附近吸附之酶會溶離，回收具有此酶活性之餾份。另外以含1 Μ硫銨之 1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 )透析本此酶活性餾份，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Butyl-oyopearl 650M凝膠（東曹公司製）的疏水管柱層析（凝膠量3 5 0 m 1 )處理。此多肽係會吸附於Butyl-Toyopearl 650M凝膠，以直線梯度1 Μ〜0 Μ硫銨濃度溶離時，於約0 . 3 Μ 硫銨濃度附近，吸附之酶被溶離，回收具有此酶活性之餾份。以1 0 m M Tris —鹽酸緩衝液（ρ Η 8 · 0 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Super Q-ToyoPearl 650C之凝膠（東曹公司製）的離子交換管柱層析（凝膠量3 8 0 m 1 )處理。此酶係不會吸附於Super Q-Toyopearl 650凝膠，溶離爲非吸附餾份，回收此溶離餾份，得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之精製多肽。此精製之各步驟中的α -異麥芽糖基轉移酶的活性量、比活性、收率示於表4。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -31 - 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（29) 表 4 步驟 α-異麥芽福基轉移酶活性量（單位） α-異麥芽糖基轉移酶比活性 (單位/mg蛋白質）收率 (%) 培養上澄液 19,000 0.38 100 硫銨鹽析後之透析 15,700 0.64 82.6 液離子交換管柱溶離 12,400 3.56 65.3 液親和性管柱溶離液 8,320 11.7 43.8 疏水管柱溶離液 4,830 15.2 25.4 離子交換管柱溶離 3,850 22.6 20.3 液以含有7.5w/v%濃度之聚丙烯醯胺之SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D S - P A G E )檢測本實驗中最後所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽的純度，結果之蛋白帶係單一者，可知爲純度極高之標品。實驗3 - 3 α -異麥芽糖葡糖質生成酶之精製以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 ) 透析實驗3 - 1所得有α -異麥芽糖葡糖質生成酶的粗多肽，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 32- 588110 A7 _ B7___ 五、發明説明（30) HR S-200 凝膠（Amasham · Pharmacia · Biotech 公司製）之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 m 1 )處理。此酶活性成份係會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ〜〇 Μ減少硫銨濃度之直線梯度，繼而於0 m Μ至1 0 0 m Μ上昇麥芽四糖濃度之直線梯度溶離時α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性成份係在直線梯度之麥芽四糖濃度爲約3 0 m Μ附近吸附，自凝膠溶離，回收示有此酶活性之餾份。以含1 Μ 硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 · 0 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Butyl-oyopearl 650M凝膠（東曹公司製）的疏水管柱層析（凝膠量3 5 0 m 1 )處理。此酶係會吸附於Butyl-Toyopearl 650M凝膠，以直線梯度1 Μ〜0 Μ減少硫銨濃度溶離時，於約〇 . 3 Μ硫銨濃度附近，吸附之酶活性成份被溶離，回收具有此酶活性的餾份。再次以含有1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩衝液（Ρ Η 7 . 0 )透析此回收液，離心分離此透析液除去不溶物，以使用Sephacryl H R S - 2 0 0凝膠之親和性管柱層析精製。此等各精製步驟中之α -異麥芽糖葡糖質生成酶活性量，比活性及收率示於表5。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -33- 588110

7 7 A B 五、發明説明（31 ) 表 5 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶活性量（單位） α-異麥芽糖基轉移酶比活性 (單位/mg蛋白質）收率 (%) 培養上澄液 5,940 0.10 100 硫銨鹽析後之透析 4,710 0.19 79.3 液離子交換管柱溶離 3,200 2.12 53.9 液親和性管柱溶離液 2,210 7.55 37.2 疏水管柱溶離液 1,720 10.1 29.0 親和性管柱溶離液 1,320 12.5 22.2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以含有7.5w/v%濃度聚丙烯醯胺之SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D S - P A G E )檢測所得精製之 ^ -異麥芽糖葡糖質生成酶標品的純度，結果本酵素標品之蛋白帶係單一者，可知爲純度極高之標品。實驗4 具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之理化學上性質實驗4 — 1 作用調製含10mM做爲基質之葡萄糖，6 — ◦一葡糖基葡萄糖（別名··異麥芽糖），62 - ◦一 ^ 一葡糖基麥本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -34- 588110 A7 B7 五、發明説明（32 ) 芽糖（別名：人參二糖panose) ，6 3 —〇—α —葡糖基麥芽三糖（別名··異麥芽糖基麥糖），64-〇一^一葡糖基麥芽四糖，或65 - ◦- α -葡糖基麥芽五糖之水溶液，對每1 mM基質添加2單位之實驗3 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，於3 0 t，Ρ Η 6 _ 0反應1 2小時。依常法脫鹽反應物後，以實驗2 - 1記載之 Η P L C法分析糖組成。結果示於表6。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -35- 588110

7 B 五、發明説明（33 ) 表 6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製基質反應物中之糖質組成（％) 葡萄糖葡萄糖 100 6-0- α -葡糖基葡萄 6-Ο-α -葡糖基葡萄糖 100 糖 62-0-α -葡糖基麥葡萄糖 3 1.8 芽糖異麥芽糖 2.0 62-0-α -葡糖基麥芽糖 4.4 環狀四糖 43.2 異麥芽糖基人參三糖 6.5 異麥芽糖基人參三糖苷 2.4 其他 9.7 63-0-α -葡糖基麥葡萄糖 50.3 芽三糖異麥芽糖 1.9 63-0-α -葡糖基麥芽三糖 4.5 環狀四糖 30.9 其他 12.4 64-0- α -葡糖基麥異麥芽糖 1.5 芽四糖麥芽三糖 60.9 環狀四糖 25.8 64-0-α -葡糖基麥芽四糖 3.2 其他 8.6 65-0-α -葡糖基麥異麥芽糖 1.4 芽五糖麥芽四糖 66.6 環狀四糖 18.7 65-0-α -葡糖基麥芽五糖 4.2 其他 9.1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -36 588110 A7 B7 五、發明説明（34) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由表6之結果可知，具有圓孢芽孢桿菌C 7 5由來之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽係會對於做爲非還原末端之結合樣式具有^ - 1，6_葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外的結合樣式具有^ - 1，4 -葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度3以上之糖質的6 2 - ◦- α -葡糖基麥芽糖，63 — ◦- α -葡糖基三糖，64 —〇—α -葡糖基麥芽四糖，65 - 〇 - α -葡糖基五糖作用，而生成主要爲環狀四糖，較基質之葡萄糖聚合度低2度的麥芽寡糖。除此等環狀四糖，與較基質之葡萄糖聚合度低2度之麥芽寡糖，與未反應之基質以外，在反應物還檢測出可能爲水解由來之微量異麥芽糖，與可能爲轉移作用由來的環狀四糖以外的其他糖質。自各基質所得之環狀四糖的生成率係 .以固體而言，自62-〇 —α —葡萄糖基麥芽糖係得 43 . 2%，自63 — 〇 - α -葡萄糖基麥芽三糖係得 30 · 9%，自64 - 〇 - α —葡萄糖基麥芽四糖係得 25 . 8%，自65 -〇—α —葡萄糖基麥芽五糖係得 18 . 7%。又，自葡萄糖及6 - O-α -葡萄糖基葡萄糖係未見到新的糖質生成。實驗4 - 2 Ν末端側胺基酸序列依常法，使用Aplied Biosystem公司製蛋白質序列儀「4 7 3A型」分析實驗3 - 2調製具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之精製多肽的Ν末端側胺基酸序列，結果獲知具有序列表5所示胺基酸序列。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -37- 588110 A7 B7 五、發明説明（35) 實驗4 - 3 部份胺基酸序列取適量之實驗3 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，以1 〇 m Μ T r* i s -鹽酸緩衝液（ P Η 9 · 0 )，於4 °C透析後，加入同一緩衝液，使其稀釋爲濃度爲約1 mg / j。在此稀釋液約1 W中，加入1 〇 // g賴胺醯肽鏈內切酶（和光純藥公司販售），於3 〇艺反應2 2小時予以部份水精製多肽，使部份水解物負荷於預先以含有4 % ( v / v )水性乙腈的〇 · 1 % ( v / v )二氟乙酸平衡化之液體層析用管柱「micr〇b〇ndapackC18 管柱」（直徑3 . 9mmx長度1 5 〇mm，Waters公司製）’以流速0 · 9 J/分鐘，室溫下，通液至以〇 . 1 %三氟乙酸—4%乙腈溶液至0 · 1% (v/v)三氟乙酸- 4 2 _ 4 %乙腈溶液，在9 0分鐘之間變化的直線梯度中’自管柱溶離之肽片段係測定波長2 1 0 n m吸光度予以檢測出。開始通液後約2 1分鐘，約3 8分鐘，約 5 6分鐘及約6 9分鐘之後溶離之含肽片段的餾份係分別予以採收，真空乾燥後，分別溶解於含5 0 % ( v / v ) 水性乙腈之〇 . 1 % ( v / v )三氟乙酸。其後與實驗2 - 2 —樣分析，結果得五種肽片段，該等肽片段係具有序列8及1 1至1 4所示胺基酸序列者。實驗4 一 4 分子量與實驗2 - 4 —樣，以S D S —聚丙烯醯胺膠電泳法本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I‘ r----^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 1·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 38- 588110 A7 B7 _ 五、發明説明（36) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (膠濃度7 . 5w/v%)實驗3 - 2所得具有異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽，同時與電泳之分子量標識器（曰本Bio-rad · lab or at rys公司製）比較，測該多肽之分子量時，檢測出在相當於分子量約9 2，0 0 0至 1，3 2 0，0 0 0之位置，具有該酶活性的單一蛋白質頻帶。實驗4-5 最適溫度依據實驗1 - 4所示α -異麥芽糖基轉移酶之活性測定方法，在20mM乙酸緩衝液（ρΗ6 · 0)中，於不同溫度使實驗3 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽反應3 0分鐘，結果如第5圖所示，該多肽汞有約5 0 t：之最適溫度。實驗4一6 最適pH値經濟部智慧財產局員工消費合作社印製依實驗1 - 1所示，α -異麥芽糖基轉移酶之活性測定方法，於ρ Η不同之Mackylvain氏緩衝液中，於3 5 t：反應實驗3 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽3 0分鐘，結果如第6圖所示該多肽之最適ρ Η係約 6 . 0 〇實驗4 - 7 熱安定性依實驗1 - 1所示α -異麥芽糖基轉移酶之活測定方法，在2 0 m Μ乙酸緩衝液（ρ Η 6 · 〇 )中，於不同溫本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）一 -39- 588110 A7 __ _B7 _ _ 五、發明説明（37 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 度下反應6 0分鐘實驗3 - 2所得具有α -異麥芽糖基轉移_、活性的精製多肽，結果該多肽係如第7圖所示，在約 4 5 °C以下具有溫度安定域。實驗4 一 8 ρ Η安定性依實驗1 - 1所示α -異麥芽糖基轉移酶之活性的測疋方法’在ρ Η不同之Mackylvain氏緩衝液或5 0 m Μ碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液中，於4 °C反應2 4小時實驗3 -2所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之精製多肽，結果該如第8圖所示，具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的精製多肽之ρ Η安定域係ρ Η約4 . 5〜1 0 · 0範圍。

.實驗5 含可編碼圓孢芽孢桿菌C 1 1由來多肽之D N A 的重組D N A與轉形體實驗5-1 調製染色體DNA 在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 0 〇m 1由 2 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4 )，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 · 〇w/v%酵母萃取物（商品名：Asahimist，Asahi啤

酒公司製造），0 . lw/v%磷酸二鉀、〇 . 〇6w/ v%磷酸一鈉· 1 2水鹽、0 . 05w/v%硫酸鎂· 7 水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C 1 1 ( F E R Μ BP — 7144)，於27°C、23〇rpm旋轉振盪培養24 小時後。使自培養物以離心分離採取之菌體浮遊於T E S ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐) -40- 588110 A7 __ B7 _ 五、發明説明（38) 緩衝液（P Η値8 . 0 )，加入0 . 0 5 % ( w/ v )溶菌酶，於3 7 t培養3 0分鐘。於一 8 0 t凍結處理物1 小時後加入T S S媛衝液（p Η 9 · 0 )，加熱爲6 0 °C ，加入T E S緩衝液/酚混合液，冰水中一邊冷卻，一邊用力振盪5分鐘後，以離心分離採取上澄液。在此上澄液中加入2倍容量之冷乙醇，採取沈澱之粗染色體DNA，溶解於S S C緩衝液（p Η 7 · 1 )後，分別加入7 . 5 // g及1 2 5 // g之核糖核酸酶與蛋白酶，於3 7°C培養 1小時使其反應。反應物中加入氯仿/異戊醇混合液，萃取染色體D NA，加入冷乙醇，採取含有生成之染色體 D N A的沈澱，溶解上述所得精製染色體D N A MSSC 緩衝液（ρ Η 7 · 1 )，使其爲濃度約1 mg / mC，以 —8 0 °C凍結所得溶液。實驗5 - 2 調製重組DNA PBGC1與轉形體 B G C 1 取1 W實驗5 - 1調製之精製染色體D N A溶液，在其中加入約3 5單位限制酶S a u 3 A 1，於3 7 °C反應2 0分鐘，使染色體D N A部份分解後，藉由蔗糖密度梯度超離心法，採取由約2，0 0 0至6，〇 0 0鹼基對成 D N A 片段。另外依常法使 Stratagin· Clonning· System 質粒載體「Blue script Π SK( + )」與限制酶Β a m HI 作用，完全切斷後，使用寶酒造公司製「D N A連結組套」，依其說明書操作連結0 · 5 // g該切斷之質粒載體與 I紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -41- ♦111 —Μ--11 11 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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Jm. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 A 7 __ B7 五、發明説明（39) 約5 // g先前所得之D N A片段，使用所得重組D N A， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依一般之 Competent cell 法，轉形 1 〇〇 // 1 Stratagin · Clonning · System 製 Competent cell「Epicurian coli XLZ-Blue」製作基因庫。將這樣所得基因庫之轉形體，植菌於依常法調製之含1 0 g / z腺（Tryptone) ，5 g / 1酵母萃取物，5 g / 1氯化鈉，1 0 0 mg / 1胺苄青黴素鈉及 5 0 mg / 1 5 —溴—4 —氯一 3 —吲哚基一 yS —半乳糖經濟部智慧財產局員工消費合作社印製苷之瓊脂平板培基（p Η 7 · 0 )，於3 7 t培養2 4小時後，將約5，0 0 0個培養基上所形成白色菌落固定於 Amasham公司製尼龍膜「Hybond-N+」上。另外合成在實驗2 - 3方法獲知之序列表中序列8所示胺基酸序列第1 至6的胺基酸序列，以5 — — AAYTGGTGGATG W S N A A - 3 >所示鹼序列的低聚核苷酸，依常法使用「r — 3 2 p」A T P及T 4核苷酸激酶做同位素標記，得合成DNA (探針1 )。繼而採用一般之菌落雜交法，自先前所得尼龍膜上固體之菌落中可與探針1顯示有顯著結合於菌落選擇出四種轉形體。依常法，一方面自此四種轉形體採取重組D N A，另一方面，依據序列表中序列7所示胺基酸序列中第9至第1 4之胺基酸序列，化學合成 5 GTNTTYAAYCARTAYAA— 3 / 所示鹼序列之探針2，同樣地做同位素標記後，適用一般之南方·雜交法，選擇具有顯著結合的重組D N A，命名此選擇的轉形體爲「B G C 1」。依常法將此轉形體B G C 1 種植於含1 0 0 // g / 胺苄青黴素鈉鹽的L-broth (肉汁本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 -42 - 588110 A7 B7 _ 五、發明説明（40) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )培養基（P Η 7 . 0 )，於3 7 °C旋轉振盪培養2 4小時，培養完後以離心分離自培養物採取菌體，藉由一般之鹼- S D S法萃取重組D N A。以一般脫氧法分析該重組 D N A之鹼序列，結果獲知該重組D N A係含圓孢芽孢桿菌cil (FERM BP - 7144)由來之鏈長 3 8 6 9鹼基對的序列表中序列1 5所示鹼序列之D N A 。該重組D N A中，序列1 5所示鹼序列所成D N A係在第9圖中以粗線所示部份表示，被連結於限制酶X b a 1 之辨識部位的下游者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製另一方面，自此鹼序列被推定之胺基酸序列係如一倂記於該序列1 5中者，將此胺基序列與以實驗2 - 2之方法被確認之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽的N末端側胺基酸序列，與自實驗2 - 3之方法被獲知之中間部份胺基酸序列的序列5及序列6至1 0之胺基酸序列相比時，序列5所示胺基酸序列係與一倂記載於序列1 5之月安基酸序列中第3 0至4 0的胺基酸序列完全一致。又’序列6、7、8、9及1 0所示胺基酸序列係分別與序列 1 5中列出之胺基酸序列的第5 8 4至5 9 7，第2 9 2 至305，第545至550，第66至77及第390 至4 0 0的胺基酸完全一致。由以上可知，具α 一異麥芽糖基轉移酶活性的多肽係爲含有序列1所示胺基酸序列者，該多肽在圓孢芽孢桿菌Cl 1 (FERM ΒΡ -7 1 4 4 )中係表示藉由序列3所示鹼基序列之DNA所編碼者。又，序列1 5中倂列之胺基酸序列中第1至第2 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 588110 A7 B7 五、發明説明（41 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 9的胺基酸序列係被推定爲該多肽之分泌訊息序列。由此等即可知，該多肽分泌前之先驅動質多肽係由序列1 5所列胺基酸序列所成，該胺基酸序列係被編碼於序列1 5所示鹼基序列者。如上述所調製，被確認鹼基序列的重組D NA在此命名爲「pBGCl」。

實驗6 含可編碼圓孢芽孢桿菌N 7 5由來多肽之D N A 的重組D N A與轉形體實驗6—1 調製染色體DNA 在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 〇〇m 1由 2 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4 )， 1 . Ow/v%酵母萃取物（商品名：Asahimist，Asahi啤經濟部智慧財產局員工消費合作社印製酒公司製造），0 · lw/v%磷酸二鉀、〇 . (T6w/ v%磷酸—鈉· 1 2水鹽、0 . 05w/v%硫酸鎂· 7 水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種圓孢芽孢桿菌N 7 5 ( F E R Μ BP — 7591)，於27t：、23〇rpm旋轉振盪培養24 小時後。使自培養物以離心分離採取之菌體浮遊於T E S 緩衝液（pH値8 · 0)，加入0 . 05% (w/v)溶菌酶，於3 7 °C培養3 0分鐘。於一 8 0 °C凍結處理物1 小時後加入T S S緩衝液（p Η 9 . 0 )，加熱爲6 0它，加入T E S緩衝液/酚混合液，冰水中一邊冷卻，一邊用力振盪5分鐘後，以離心分離採取上澄液。在此上澄液中加入2倍容量之冷乙醇，採取沈澱之粗染色體D N A，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' -44 - 588110 A7 _ ____B7 五、發明説明（42) 溶解於S S C緩衝液（p Η 7 · 1 )後，分別加入7 . 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # g及1 2 5 // g之核糖核酸酶與蛋白酶，於3 7°C培養 1小時使其反應。反應物中加入氯仿/異戊醇混合液，萃取染色體DNA，加入冷乙醇，採取含有生成之染色體 DMA的沈澱，溶解上述所得精製染色體DNA於S S C 緩衝液（p Η 7 . 1 )，使其爲濃度約1 mg / J，以一 8 0 °C凍結所得溶液。實驗6 - 2 調製重組D N A P B G C 1與轉形體 B G C 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取0 · 1W實驗6 - 1調製之精製染色體DNA溶液 ’在其中加入約1 〇〇單位限制酶S a u 3 A 1，於 3 7 t反應6小時，以分解染色體D N A後，藉由瓊脂電泳法分離，使用Quontam · Biotechnology公司製之D N A 精製用組套「Geneclean Π Kit」依照該組套所附說明書操作，回收約3 0 0 0至7 0 0 0鹼基對所成D N A片段。另外依常法使Stratagin· Clonning· System製質粒載體「Blue script Π SK( + )」與限制酶S a c I作用，完全切斷後，使用寶酒造公司製「D N A連結組套」，依其說明書操作連結0 . 5// g該切斷之質粒載體與約5# g先前所得之D N A片段，使用所得重組D N A，依一般之 Competent cell 法，轉开多 1 〇 0 // 1 Stratagin · Clonning • System 製 Competent cell「Epicurian coli XLZ-Blue」製作基因庫。將這樣所得基因庫之轉形體，植菌於依常法調本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -45 - 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___ B7_五、發明説明（43) 製之含10g/<腺（Tryptone) ，5g/l酵母萃取物， 5g/l氯化鈉，100mg/l胺苄青黴素鈉及 5 0 mg / 1 5 -溴—4 —氯一 3 —吲哚基—/3 -半乳糖苷之瓊脂平板培基（p Η 7 · 0 )，於3 7 °C培養2 4小時後，將約4，0 0 0個培養基上所形成白色菌落固定於 Amasham公司製尼龍膜「Hybond-N+」上。另外合成在實驗2 - 3方法獲知之序列表中序列8所示胺基酸序列第1 至6的胺基酸序列，以5 / — AAYTGGTGGATG W S N A A - 3 >所示鹼序列的低聚核苷酸，依常法使用「r 一 3 2 p」A T P及T 4多核苷酸激酶做同位素標記，得合成D N A (探針1 )。繼而採用一般之菌落雜交法，自先前所得尼龍膜上固體之菌落中可與探針1顯示具有顯著結合於菌落選擇出二種轉形體。依常法，一方面自此二種轉形體採取重組D N A，另一方面，依據序列表中序列 1 4所示胺基酸序列中第8至第1 5之胺基酸序列，化學合成 5 >-GAYTGGATHGAYTTYTGGTT Y G G - 3 /所示鹼序列之探針2，同樣地做同位素標記後，適用一般之南方印亦•雜交法，選擇具有顯著結合的重組D N A，命名此選擇的轉形體爲「B G N 1」。依常法將此轉形體B G N 1種植於含1 0 0 // g / W胺苄青黴素鈉鹽的L-broth (肉汁）培養基（P Η 7 · 0 )，於3 7 °C旋轉振盪培養2 4小時，培養完後以離心分離自培養物採取菌體，藉由一般之鹼一 S D S法萃取重組D N A。以一般脫氧法分析該重組D N A之鹼序列，結果獲知該重組 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- 588110 A7 ___B7_ 五、發明説明（44) DNA係圓孢芽孢桿菌N75 (FERM BP-7 5 9 1 )由來之鏈長4 9 8 6鹼基對的序列表中序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 6所示鹼序列之D N A。該重組D N A中，序列1 6所示鹼序列所成D N A係在第1 〇圖中以粗線所示部份表示，被連結於限制酶S a c 1之辨識部位的下游者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製另一方面，自此鹼序列被推定之胺基酸序列係如一倂記於該序列1 6中者，將此胺基序列與以實驗4 - 2之方法被確認之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽的N末端側胺基酸序列，與自實驗4 - 3之方法被獲知之中間部份胺基酸序列的序列5、8及1 1至1 4之胺基酸序列相比時，序列5所示胺基酸序列係與一倂記載於序列1 6之胺基酸序列中第3 0至4 8的胺基酸序列完全一致。又，序列8、1 1、1 2、1 3及1 4所示胺基酸序列係分別與序列1 6中列出之胺基酸序列的第5 4 5至5 5 0，第 565至582，第66至83，第390至406及第 7 9 0至8 0 9的胺基酸完全一致。由以上可知，具α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽係爲含有序列2所示胺基酸序列者，該多肽在圓孢芽孢桿菌Ν 7 5 ( F E R Μ BP 一 7 5 9 1 )中係表示藉由序列4所示鹼基序列之DNA 所編碼者。又，序列1 6中倂列之胺基酸序列中第1至第 2 9的胺基酸序列係被推定爲該多肽之分泌訊息序列。由此等即可知，該多肽分泌前之先驅動質多肽係由序列1 6 所列胺基酸序列所成，該胺基酸序列係被編碼於序列1 6 所示鹼基序列者。如上述所調製，被確認鹼基序列的重組本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -47 - 588110 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（45) DNA在此命名爲「PBGNI」。實驗7 — 1 藉由轉形體產生具有^ -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽實驗7 — 2 轉形體BGC1 在5 0 «容量之三角燒瓶中放入1 0 含5 g/ 1澱粉部份分解物「Paindex #4」，20g/l多腺，20 g / 1酵母取物及1 g/ 1磷酸-氫鈉之水溶液，以 1 2 1°C熱壓器處理1 5分鐘’經冷卻，調節爲無菌， pH値7 · 0，無菌下添加1 〇呢胺苄青黴素鈉鹽成爲液體培養基。接種實驗3 - 2之方法所得轉形體B G C 1於此液體培養基，於2 7 °C通氣攪拌培養約4 8小時。爲調查此培養物中之該多肽的所在’依常法經離心分離，使培養上澄液與菌體分離，回收’對菌體則分別調製爲藉由超音波軋碎法自細胞所得之全萃取物’以及藉由滲透壓衝擊法之由細胞周質的萃取物。超音波軋碎法係懸濁菌體於1 0 m Μ磷酸緩衝液（P Η 7 · 0 )後’在冰水中一邊冷卻此菌體懸濁液’ 一邊以超音波均化器「模型U Η - 6 0 0 」（S Μ Τ公司製）軋碎細胞予以進行，以該軋碎物做爲細胞全萃取物。滲透壓衝擊法係以含有3 0 m Μ氯化鈉之 1 〇 m Μ T r i s -鹽酸緩衝液（ρ Η 7 · 3 )洗淨菌體後，將洗淨菌體懸濁於含2 Ο Ο g / 1蔗糖及1 m Μ Ε D Τ Α的3 3 m Μ T r i s -鹽酸緩衝液’於2 7 °C 振盪2 0分鐘，繼而離心分離回收菌體’在預先冷卻爲約本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 A7 B7 五、發明説明（46) 4 °C之0 · 5 m Μ氯化鎂水溶液中懸濁該菌體，冰水中振盪2 0分鐘，自細胞周質萃取。其後經離心分離回收上潑液，以其上澄液爲細胞周質萃取物。針對上述調製之培養上澄液，細胞全萃取物，細胞周質萃取物分別測定α -異麥芽糖基轉移酶活性，以每1 2培養物換算其各活性値。結果示於表7。表 7 試料 α -異麥芽糖基轉移酶活性 (單位/m 1 -培養物）培養上澄液 0 . 0 細胞全萃取物 3 . 4 細胞周質萃取物 3.0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由表7之結果可知，大腸菌轉形體B G C 1係可以在細胞內產生本發明之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽，其大部份係被分泌於細胞周質。又，做爲第一對照，除在不添加胺苄青黴素於培養基以後，其他均以上述轉形體時一樣之條件培養大腸菌X L 2 - Blue株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。第二對照係除不含胺苄青黴素以外，其他均與上述轉形體一樣條件培養圓孢芽孢桿菌C 1 1 ( F E R Μ Β Ρ - 7 1 44)，自培養調製培養上澄液與菌體軋碎物。結果第一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -49- 588110 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（47) 對照之培養上澄液，菌體軋碎物均未見到該酶之活性。第二對照之培養上澄液及菌體軋碎物中則分別有約1 · 2單位及約0 _ 1單位之該酶活性’每1單位培養物之全酶活性係約1 _ 3單位。此酶活性與每單位轉形體B G c 1的培養物之全酶活性3、4單位相比較’顯然較低水準。另外再依實驗1所示方法鹽析，透析此實驗所得細胞周質萃取物，以使用「SepabeadsFP-DA13凝膠」、「 Sephacryl HR S-200 凝膠」、「Butyl-Toyopearl 650M 凝膠」的管柱層析精製，再依實驗2之方法分析此精製酶多肽。結果依S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳法時分子量係約 82，◦00〜122，000達爾頓，等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法之等電點係約5 · 1〜6 · 1，α -異麥芽糖基轉移酶活性之最適溫度係約5 0 °C，最適ρ Η係約 5 . 5〜6 . 0，溫度安定性係約4 5 °C爲止，ρ Η安定性係約4 . 5〜9 · 0，與實驗1所示方法調製之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之理化學性質係實質上相同者。由以上可知，本發明之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽可由重組D Ν Α技術大量且廉價、安定地製造〇實驗7 - 3 轉形體B G Ν 1 在5 0 OmT容量之三角燒瓶中放入1 〇〇^含5 g/ 1澱粉部份分解物「Paindex #4」，20g/l多腺，20 g / 1酵母取物及1 g / 1磷酸-氫鈉之水溶液，以本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）丨， r----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1·. -50 - 588110 7 Β 五、發明説明（48) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 2 1 °C熱壓器處理1 5分鐘，經冷卻，調節爲無菌， pH値7 _ 0，無菌下添加1 Omg胺苄青黴素鈉鹽成爲液體培養基。接種實驗6 - 2之方法所得轉形體B G N 1於此液體培養基，於2 7 °C通氣攪拌培養約4 8小時。爲調查此培養物中之該多肽的所在，依常法經離心分離，使培養上澄液與菌體分離，回收，與實驗7 - 1 一樣分別調製爲藉由超音波軋碎法自細胞所得之全萃取物。針對上述調製之培養上澄液，細胞全萃取物，細胞周質萃取物分別測定α -異麥芽糖基轉移酶活性，以每1W培養物換算其各活性値。結果示於表8。表 8 試料 α -異麥芽糖基轉移酶活性 (單位/m1培養物）培養上澄液 0.2 細胞全萃取物 3 . 1 細胞周質萃取物 2 . 9 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由表8之結果可知，大腸菌轉形體B G N 1係可以在細胞內產生本發明之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽，其大部份係被分泌於細胞周質。該酶活性亦在培養上澄液中被確認。又，做爲第一對照，除在不添加胺苄青黴素於培養基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -51 - 588110 A7 B7 五、發明説明（49) 以後，其他均以上述轉形體時一樣之條件培養大腸菌 X L 2 - Blue株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。第二對照係除不含胺苄青黴素以外，其他均與上述轉形體一樣條件培養圓孢芽孢桿菌N 7 5 ( F E R Μ BP — 7 5 9 1 )，自培養調製培養上澄液與菌體軋碎物。結果第一對照之培養上澄液，菌體軋碎物均未見到該酶之活性。第二對照之培養上澄液及菌體軋碎物中則分別有約〇 . 7單位及約0 . 1單位之該酶活性，每1單位培養物之全酶活性係約0 . 8單位。此酶活性與每單位轉形體 B G N 1的培養物之全酶活性3、4單位相比較，顯然較低水準。另外再依實驗3所示方法鹽析，透析此實驗所得細胞周質萃取物，以使用「Sepabeads FP-DA13凝膠」、「 Sephacryl HR S-200 凝膠」、「Butyl-Toyopearl 650M 凝膠」的管柱層析精製，再依實驗2之方法分析此精製酶多肽。結果依S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳法時分子量係約 92，000〜132，000達爾頓，等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法之等電點係約7 . 3至8 . 3，α -異麥芽糖基轉移酶活性之最適溫度係約5 0 °C，最適ρ Η係約 6 . 0，溫度安定性係約4 5 °C以下，ρ Η安定性係約 4 . 5〜10 · 0，與實驗3所示方法調製之具有α —異麥芽糖基轉移酶活性的多肽之理化學性質係實質上相同者。由以上可知，本發明之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的多肽可由重組D Ν Α技術大量且廉價、安定地製造。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） * —JM HI —ϋ ϋϋ ϋϋ ϋ^— ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -52- 588110 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（50 ) 如以上說明，具有自做爲非還原末端的結合樣式具有 α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上的糖質生成環狀四糖的活性，且具有序列表中序列1或 2示胺基酸序列，或其胺基酸序列中1或複數個胺基酸爲缺失，取代，或附加之胺基酸序列的多肽係本發明人經長年硏究之一成果，爲其所首創發現者，具備以往公知之酶無法見到的獨特理化學性質。本發明係以應用重組D N A 技術，創製該多肽爲其課題者。以下一邊參照實施例等，一邊具體說明本發明之多肽及製造方法、用途。本發明所稱多肽係指具有自做爲非還原末端的結合樣式具有α 一 i，6 一葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α-l，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上的糖質生成環狀四糖的活性，且具有序列表中序列1或2示胺基酸序列，或其胺基酸序列中1或複數個胺基酸爲缺失，取代，或附加之胺基酸序列的全部多肽而言者。本發明之多肽係通常具有被解明之胺基酸序列，做爲其一例可爲例如序列表中序列1或2所示自Ν末端的胺基酸序列或與其相同之胺基酸序列。具有與序列1或2所示胺基酸序列相同的胺基酸序列之變異體可以在實質上不變更所期望之理化學性質下，使1或複數個，即’ 1個或2 個以上，有時爲1至50個，或1至30個，或1至1〇個缺失，或以其他胺基酸取代，更可附加於序列1或2之胺基酸序列即可得到。又，即使爲相同之D N A ’亦有時 —.----. ^^衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -53- 588110 A7 B7 五、發明説明（51 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 會因導入之宿主，或培養含該DN A之轉形體時使用之營養培養基成份，組成或培養溫度，p Η之不同，而藉由宿主內外酶的D Ν Α表現後之修飾等，雖可保持所期望之理化學性質，還會生成序列1或2所示胺基酸序列中N末端附近之胺基酸爲1或複數個，即1個或2個以上，有時爲 1至30個，或1至20個或1至1 〇個缺失，或以其他胺基酸取代，或N末端上1個或2個以上，有時有1至 3 0個，或1至2 0個，或1至1 〇個胺基酸新附加的變異體。這種變異體只要爲仍具備所期望之理化學性質，當然亦被包含於本發明之多肽中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明之多肽可將本發明之D NA導入適當之宿主，自所得轉形體之培養物採取者。本發明中使用之轉形體可爲例如含有序列表中序列3或4所示5 >末起之鹼序列，或其鹼序列中，1或4複數個鹼基缺失，取代，或附加之鹼序列，或與此等相輔之鹼序列或此等鹼序列中1或複數個爲因基因之簡倂，而在不改變編碼之胺基酸序列之下，以其他鹼基取代之鹼序列所成D Ν A的轉形體。又，上述鹼序列中亦可爲例如利用基因編碼之簡倂，在不改變編碼之胺基酸序列下，以其他鹼基取代鹼基之1或複數個，即，1個或2個以上，有時爲1至190個，或1至60個，或1至3 0個者。本發明有關之D Ν A係只要爲具有如上述之鹼序列，不論其來自天然者，或人爲合成者均無妨。天然之來源可爲例如包含圓孢芽孢桿菌C 1 1 ( F E R Μ BP — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " -54- 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（52) 7144)及圓孢芽孢桿菌N75(FERM BP— 7 5 9 1 )之孢芽桿菌屬的微生物。可以自此等微生物之菌體得到包含本發明D N A之基因。即’將該等微生物接於營養培養基，在好氣性條件下培養約1至3天後，自培養物取出菌體，以溶菌酶或/3 -葡聚糖酶等細胞壁溶解酶或超音波處理，即可將含有該D N A之基因溶離出菌體外。這時可倂用蛋白酶等蛋白質水解酶，或共存S D S等界面活性劑，或使其凍結熔解亦可。對這樣所得處理物採用例如酚萃取，醇沈澱，離心分離，核糖核酸酶處理等此業界通常被採用之方法即可得目的之DNA。另一方面欲人爲地合成D N A時，則可以依照序列表中序列3或4所示鹼序列化學合成即可。又，以該含有D N A之基因做爲模板，使用適當之可做爲質粒的化學合成D N A，進行 P C R合成亦可順利地合成。然後使可編碼化學合成之序列1或2所示胺基酸序列的D N A***可自主複製之適當載體使其成爲重組DNA，導入適當之宿主於其中，培養所得轉形體，自培養物採收菌體，自該菌體採取含該D N A之重組D N A即可。該D N A係通常以重組D N A之形態被導入宿主。重組DNA係通常包含DNA與可自主複製之載體者，只要可取得D N A，即可依一般重組D N A技術極易地調製。該載體之例有 pBR322、pUC18、Bluescript Π SK( + )、pUB110、pTZ4、pC194、 pHVl 4、TRp7、YEp7、pBS7 等質粒載體 —， Γ------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 J·. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -55- 588110 Α7 Β7 五、發明説明（53) 或 ^gt •Ac、；tgt ·λΒ、ρ11、0ΐ、 0 10 5等菌體載體。其中使本發明之DNA以大腸菌表現時係以 PBR322、pUC18、Bluescript Π SK( + )、又g t · λ c及；I g t · λ B較佳，另一方面以枯草菌使其表現時係PUB1 10、pTZ4、PC194 、Pll、01 及 0l〇5 爲宜。pHV14、TRp7 、YE p 7及p B S 7係使重組DNA在二種以上宿主內複製時較有用。***D ΝΑ於該載體時係可採用斯業界通常一般之方法。具體言，首先以限制酶及/或超音波切斷含DNA之基因與可自主複製之載體，其次，連結生成之 D ΝΑ片段與載體片段。對基因及載體之切斷可特異性地作用於核苷酸的限制酶，尤其Π型之限制酶係詳而言可使用 Sau 3AI，Eco RI，Hind 皿，

Bam HI，Sal I，XbaI，Sac I， P s t I等，即可極易使D N A片段與載體片段連結。視其需要退火二者後，在活體內或活體外使DNA連接酶作用即可。如此所得之重組D N A係導入適當之宿主使其爲轉形體，經培養即可無限制地複製。如此所得之重組D N A可導入大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母爲主之適當宿主微生物。選殖轉形體時，可適用菌落雜交法，或以含有做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上之糖質的營養培養基培養，選擇可自該糖質生成環狀四糖本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） —..I —— —Γ I —— I I I - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 J·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __ B7 _五、發明説明（54) 即可。如此所得形體係以營養培養基培養時即可在菌體內外產生本發明之多肽。營養培養基係通常使用含碳源、氮源、礦物質源，更可視其需要補足胺基酸或維他命等微量營養源的一般液體培養基。碳源可分別爲例如澱粉、澱粉水解物、葡萄糖、果糖、蔗糖、α，α -海藻糖、α，/5 -海藻糖、/5，/5 -海藻糖等糖質，氮源可爲例如氨及其鹽類、尿素、硝酸鹽、腺、酵母萃取物、脫脂大豆、玉米漿、肉萃取物等含氮無機/有機物。接種轉形體於營養培養基，保持營養培養基爲20〜40 °C溫度，PH2至10 ，在通氣攪拌等好氣性條件下培養約1〜6天，即可得含該多肽之培養物。此培養可直接使用做爲酶劑，惟通常係在使用前視其需要藉由滲透壓衝擊或界面活性劑自菌體萃取，或以超音波或細胞溶解酶軋碎菌體後，經過濾、離心分離等自菌體或菌體軋碎物分離。精製本發明之多肽。該精製方法可採用通常精製多肽使用之一般方法，例如對除去菌體或菌體軋碎物之培養物，適當地組合一種或二種以上濃縮、鹽析、透析、分離沈澱、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水性層析、親和性層析、凝膠電泳、等電點電泳等適用即可。本發明之多肽係具有可以自做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上之糖質生成環狀四糖的酶活性，且具有以往之酶 —. Γ----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -57- 588110 A7 __ B7 _ 五、發明説明（55) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 未能見到之具有序列表中序列1或2所示胺基酸序列，或其胺基酸序列中1或複數個胺基酸缺失、取代或附加之胺基酸序列的獨特性質。生成之環狀四糖因係非還原性之故，所以不會引胺羰基反應，極少褐變或劣化，同時因其爲環狀質，所以與乙醇或乙酸等揮發性成份有包含能力，更很少會因過度甜味而傷失食品原有之風味，係具極溫和之低甜味糖質，由於難發酵性、難消化性，具有做爲食物纖維極適合的有用特性。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製就環狀四糖之生成方法說明如下。該環狀四糖可使本發明之多肽作用其基質，即作用於做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上的糖質即可製得。該等糖質可爲使澱粉、支鏈澱粉、直鏈澱粉、糖原等澱粉或澱粉質，或以酸及/或激粉酶予以剖份水解此等者，以α -配糖酶、糊精葡聚糖酶，先前本發明人等在PCT/JP01/06412號說明書所揭示之α -異麥芽糖葡糖質生成酶等糖轉移所得糖質，或在Θ -澱粉酶與支鏈澱粉酶共存在水解支鏈澱粉所得糖質。此等糖質通常可爲一種或二種以上6 2 -〇一 α — 葡糖基麥芽糖、63 - ◦一 α —葡糖基麥芽三糖、64一〇一 ^ 一葡糖基麥芽四糖、65 - Ο — α -葡糖基麥芽五糖等做爲非速原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基，結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1，4 ~~葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上之糖質。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）一~~ ---- -58 - 588110 A7 B7 五、發明説明（56) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製使用本發明之多肽以生成環狀四糖的方法中，在生成上述之做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，6 -葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1， 4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度3以上的糖質之前後，亦可共存本發明之多肽，在生成糖質之後使其作用，亦可在開始生成該糖質時或生成途中，使本發明之多肽共存使其作用，此等均可隨意者。通常係在含有一種或二種以上如上述做爲基質之糖質的水溶液等適當溶液中共存本發明之多肽，一邊保持水溶液爲所定溫度，ρ Η値，一邊反應至生成所欲量之環狀四糖。反應係在〇 . 1 %左右之基質濃度下進行，惟欲以大規模實施環狀四糖的生成方法時，較佳係在較高濃度之1 % ( w/w )(以下本說明書中除特別明記以外，均將「％ ( w/w )」簡略爲「％」）以上，更佳係5〜5 0 %爲宜。反應溫度係反應可進行之溫度，即，於6 0 °C附近進行即可，惟較佳係3 0〜5 t附近之溫度。反應pH可調節爲4·5〜8之範圍，較佳係調整爲Ρ Η約5 · 5〜約7之範圍。本發明之多肽的使用量與反應時間有密切之關係，可視目的之反應程度適度地選擇。反應時可用公知之手法固定該多肽於適當之載體，做爲固定化多肽使用亦無妨。上述反應所得溶液係通常與環狀四糖一起含有葡萄糖、麥芽糖等麥芽糖糊精，更有做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1，6葡糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α - 1，4葡糖基結合之葡萄糖聚合度爲3以本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -59- 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7 _ 五、發明説明（57) 上的低聚糖等，可以直接做爲含有環狀四糖之糖液使用。又，視其需要使本發明之多肽作用後，使例如一種或二種以上選自α -澱粉酶、/3 -澱粉酶、葡糖澱粉酶，及α -配糖酶作用，做爲水解過夾雜之寡糖的含有環狀四糖液使用。通常係再予精製使用。其精製方法可適當地採用公知之方法，例如藉活性碳脫色，以Η型、◦ Η型離子交換樹脂脫鹽、藉離子交換管柱層析、活性碳管柱層析、矽膠管柱層析等管柱層析進行分餾，以醇類及丙酮等有機溶媒的分離，以具有適度分離性能之膜予以分離，更可藉不必利用環狀四糖資化或分解夾雜糖質之微生物，例如乳酸菌、乙酸菌、酵母等發酵處理、鹼處理等分解除去殘存之還原性糖質等，可適當地採用其一種或二種以上之精製方法。尤其環狀四糖之工業上大量製造方法係最適於使用離子交換樹脂之管柱層析，例如藉由特開昭5 8 - 2 3 7 9 9號公報，特開昭5 8 - 7 2 5 9 8號公報等揭示之強酸性陽離子交換樹脂之管柱層析，除去環狀四糖以外之夾雜糖類，可以有利地製造提高目的物含量之環狀四糖，或含其之糖質水溶液。這時可適當地採用固定床方式，移動床方式，擬似移動床方式、分批方式、半連續方式、連續方式之任一。如此所得之含環狀四糖的水溶液，或提高其含量之高含環狀四糖物係通常每一固體物含有環狀四糖1〇%以上，較佳係含4 0 %以上之水溶液，通常係予以濃縮做爲糖漿狀製品。此糖漿狀製品亦可隨意將其乾燥作成粉末狀製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 A7 ____B7 五、發明説明（58) 丨---1 ------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製品。另外，製造本發明中之環狀四糖結晶時係最好使用上述精製方法所得，較佳係每一固體物含環狀四糖4 〇 %以上之糖質水溶液。製造做爲結晶形態爲5〜6含水結晶時 ’通吊係使該糖質水溶液爲環狀四糖之過飽和水溶液，例如使其爲濃度約4 0 %至9 0 %之水溶液，放入助晶罐中，於約0 · 1〜2 0 %晶種共存下，於可保持過飽和之溫度’較佳於1 0〜9 0 °C範圍一邊攪拌一邊緩緩冷卻，製 is 3有結日B糖膏。欲晶析出環狀四糖一含水結晶或無水結晶時通常採用較高濃度，高溫度下之過飽和條件。自糖膏製造環狀四糖結晶，或含此之含蜜結晶之方法可適當地採用例如分蜜方法、塊狀粉碎方法、流動造粒方法，噴霧乾燥方法等公知方法。環狀四糖一含水結晶或無水結晶亦可以經由脫水或乾燥環狀四糖5至6含水結晶予以製造。如上述所製造之環狀四糖結晶或高含其之粉末係具有品位高且溫和之低甜味的非還原性至低還原性之白色粉末，係耐酸性、耐熱性極優之安定性糖質，與其他材料，尤其與胺基酸、低聚肽、蛋白質等含胺基酸之物質混合，加工亦不會褐變或發生異臭，幾乎不會影響所混合之其他材料。又，吸濕性低、粉末狀者亦具有防止附著，凝結之性質。又，環狀四糖本身因具有包含能力，可防止香氣成份，有效成份等揮發品質劣化，對香氣成份有效成份具極優之保持安定化效果，極適於做爲保香劑、安定劑等使用。迫時可視其需要與其他ί哀狀糖質，例如環狀糊精類、分岐環狀糊精類、環狀葡聚糖類、環狀果聚糖類等倂用，有利本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ~ - -61 - 588110 A7 _____ B7 _ 五、發明説明（59) 地實施強化安定性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另外’環狀四糖本身實質上不會被澱粉酶或α 一配糖酶所分解，所以既使經口攝取亦實質上不會被消化吸收，又，不易被腸內細菌發酵，可做爲極低熱量之水溶性食物纖維被利用。換言之，經口攝取環狀四糖時，可由做爲糖質所具有重量、容量，滿足飽食感，但卻實質上不會被消化，所以極適於做爲低熱量食品材料，減肥食品材料。又，不易被蛀牙誘發菌所發酵，極適於利用做爲不易蛀牙之甜味料。另外’環狀四糖本身係耐酸性、耐鹼性、耐熱性優之無毒、無害的天然甘味料。又因其爲安定之甜味料，所以結晶製品時，可以與支鏈澱粉，羥乙基澱粉，聚乙烯吡咯酮等結合劑倂用，利用於錠劑或糖衣片。另外還兼具有滲透調節性、賦形性、增光澤性、保濕性、粘性、防離水性、防凝結性、保香性、安定性、防止其他糖類之晶析性、難發酵性、防澱粉老化性、防蛋白質變性、防脂質劣化性等各種性質。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製因此環狀四糖，或含其之糖質係可直接做爲甘味料，難發酵性食品材料，難消化性食品材料，低腐蝕性食品材料、低熱量食品材料、調味改良劑、風味改良劑、品質改良劑、防離水劑、防固結劑、保香劑、防澱粉老化劑、防蛋白質變性劑、防脂質劣化劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等’可直接或視其需要適當地併用該糖質與公知材料，有利地利用於各種組成物，例如飲食物、嗜好本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ' -62- 588110 Α7 Β7 五、發明説明（60 ) 物、飼料、餌料、化粧品、醫藥品等。公知之材料可以適當地利用例如調味料、著色料、著香料、強化劑、乳化劑、防氧化劑、防紫外線劑、或藥效成份等。環狀四糖或含其之糖質可直接做爲附加甜味之調味料使用。視其需要可與粉糖膏、葡萄糖、果糖、異構化糖、砂糖、麥芽糖，α，α -海藻糖、α，々一海藻糖、/3， /3 -海藻糖、蜂蜜、楓糖、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、二氫查耳酮、甜葉菊苷、^ 一葡糖基甜葉菊苷、羅漢果甜味物、甘草、索馬精L 一天冬胺醯基- L -***酸甲酯、糖精、乙醯舒泛Κ、甘素、甘胺酸、丙胺酸等其他甘味料倂用，又，可以與糊精、澱粉、乳糖等類增量劑混合使用。尤其與一種或二種以上赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇等低熱量甘味料或α -葡糖基甜葉菊苷、索馬精、L -天冬胺醯基- L 一***酸甲酯、糖精、乙醯舒泛Κ及甘素等高甜味度甘味料倂用，亦極適於利用做爲低熱量甘味料或減肥甘味料等。又，環狀四糖’或含其之糖質的粉末或結晶狀製品可直接，或視其需要與增量劑、賦形劑、或結合劑等混合，隨意成形爲顆粒狀、球狀、短棒狀、板狀、立體狀或錠劑等各種形狀使用。又，環狀四糖，或含其之糖質的甘味可以與酸味、鹹味、澀味、鮮味、苦味等其他具有加味之各種物質極易調和、耐酸性、耐熱性亦大，所以可以有利地利用於一般飮食物之增甜、加味改良、風味改良，或品質改良用。例如本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210χ297公釐） —,---r----衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ί* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -63- 588110 A7 B7 五、發明説明（61 ) 對醬油、粉末狀醬油、味噌、粉末狀味嗜、醪、醃料、撒料、美乃滋、沙拉調味品、食用醋、二杯醋、粉末壽司醋、中式調味料、沾醬、湯麵料、香醋、蕃加醬、烤肉醬、咖哩原汁、燉牛肉調味料、鮮味、湯味、複合調味料、味酣、新味_、糖包、咖啡用糖包等各種調味料、做爲甘味料、加味改良劑、風味改良劑、品質改良劑等利用。另外，還可做爲對例如煎餅、米菓、糯米菓、糯米點心、湯圓、豆餡點心、米糕、餡類、羊_、水羊羹、二色卵、果凍、蛋糕、糖果等各種日式點心、麵包、餅乾、鹹餅乾、小餅乾、派、布丁、奶油、鮮奶油、泡芙、鬆餅、海棉蛋糕、甜甜圏、巧克力、口香糖、牛奶糖、奶油糖、糖果等各種西式點心、冰淇淋，凍果汁露等冰品、果實糖漬物、冰糖漿等糖漿類、花浸漬膏、花生醬、果醬等膏類、果醬、橘皮果醬、糖漿浸漬物、糖漬果實等果實、蔬菜的加工食品類、什錦醬菜、麯醃漬物、千層醃漬物、蕗蕎醃漬物等醃漬物類、醃蘿蔔加味料、醃白菜加味料等醃漬加味料、火腿、小臘腸等畜肉製品類、魚肉火腿、魚肉小蠟腸、板魚、竹輪、炸魚漿等魚肉製品、海膽、鳥賊內臟醃製品、酸海帶、魷魚絲、河豚米_漬干、鳕魚、鯛魚、蝦等之肉 fe等各種珍味類、由海苔、山菜、魷魚、小魚、貝等所製造之小菜、煮豆、馬鈴薯沙拉、海帶捲等料理食品、乳製品、魚肉、畜肉、果實、蔬菜之瓶裝、罐頭類、合成酒、釀造酒、淸酒、果實酒、酒等酒類、咖啡、可可亞、果汁、碳酸飮料、乳酸飮料、乳酸菌飮料等淸涼飮料水、布丁本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -64- 588110 Α7 Β7 五、發明説明（62) 粉、鬆餅粉、速食果汁、速泡咖啡、速食紅豆湯、杯湯等速食食品，更可爲嬰兒副食品、病人餐、飮用劑、含胺基酸飮料、肽食品、冷凍食品等各種飮食物的加甜味、加味改良、風味改良或品質改良等有利地利用。又，可做爲家畜、家禽、其他如蜜蜂、蠶、魚等飼養動物之飼料、餌料等提高嗜好性或減低熱量等目的使用。除此外，還可做爲香煙、牙膏、口紅、唇霜、內服液、錠劑、舌片、肝油糖、口中淸涼劑、口中香劑、嗽口劑等固體物、粉末、膏狀、液狀等各種形態之嗜好品、化粧品、醫藥品等各種組成物之甘味劑、或加味改良劑、改口味劑，更可做爲品質改良劑、安定劑等有利地利用。對品質改良劑或安定劑之用途可以有利地利用於極易喪失有效成份或活性之各種生理活性物質，或含其之健康食品、化粧品及醫藥品等。例如可對干擾素^、干擾素/5 、干擾素7、腫瘤壤死因子α、腫瘤壞死因子/3、巨噬細胞游走阻斷因子、菌落刺激因子、轉移因子、間白素Π等含細胞***素液、胰島素、成長激素、催乳激素、紅血球生成素、卵細胞刺激荷爾蒙等含激素液、B C G疫苗、曰本腦炎疫田、麻疼疫苗、小兒麻痒疫苗、痕苗、破傷風類毒素、毒蛇抗毒素、人免疫球蛋白等含生物製劑液、青黴素、紅黴素、氯黴素、四環素、金黴素、硫酸卡那黴素等含抗生素液、硫胺、核黃素、L -抗壞血酸、肝油、類胡蘿蔔素、麥角甾醇、生育酚等含維生素液、脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、/3 -澱粉酶、異澱粉酶、葡聚糖酶、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ 297公釐） —------------^^衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本買) 訂 1·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -65- 588110 A7 ___ B7___ 五、發明説明（63) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 乳糖酶等含酶液、藥用人參萃取物、鱉萃取物、綠藻萃取物、蘆薈萃取物、維奇氏箬竹萃取物、桃葉萃取物、枇杷葉萃取物、蟹橙皮萃取物、蜂膠萃取物等萃取物類、病毒、乳酸菌、酵母等生菌膏、蜂王漿等各種生理活性物質亦可以在不失此等有效成份、活性、極容易製造爲高品質之液狀、糊狀、固體狀或粉末狀之健康食品、化粧品、醫藥品等。在如上述之各種組成物中欲使其含有環狀四糖或含此等之糖質的方法，係在完成該製品爲止之步驟中使其含於其中即可，例如可適當地選擇混溶、混捏、溶解、熔解、浸漬、滲透、撒佈、塗佈、被覆、噴霧、注入、晶析、固化等公知方法。其配合量係爲發揮環狀四糖之各種特性，尤其包含作用、呈味改良、風味改良等起見，以固體單位做爲環狀四糖爲0 . 1 %以下則嫌不足，通常係使其含有 0 . 1 %以上，較佳含有1 %以上。以下藉由實施例具體說明本發明之多肽的製造方法，使用其製造環狀四糖，或含其糖質的方法。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實施例1 製造多肽在5 0 0^容量之三角燒瓶中放入1 0 0J含5 g/ 1澱粉部份分解物「Paindex #4」，20g/l多腺，2〇 g/ 1酵母萃取物及1 g/ 1磷酸—氫鈉之水溶液，以 1 2 1°C熱壓器處理1 5分鐘，經冷卻，調節爲無菌， P Η値7 · 0，無菌下添加1 0 mg胺苄青黴素鈉鹽。在此本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） -66- 588110 Α7 Β7 五、發明説明（64) 液體培養基中接種實驗5 - 2之方法所得轉形體B G C 1 ，於3 7 °C，2 3 0 r p m旋轉振盪培養2 4小時得種培養液。其次在3 0 <容積之發酵器中放入約1 8 <與上述組成相同的液體培養基，同樣殺菌，冷卻至2 7 °C，加入 5 0//g/mU安苄青黴素鈉鹽，接種1% (v/v)種培養液，於2 7 °C通氣培養4 8小時。以超音波處堙培養物，軋碎菌體，經離心分離除去不溶物後，測定上澄液中之本發明多肽的α -異麥芽糖基轉移酶活性，結果每1 <培養物中被檢測出約3，1 〇〇單位之酶活性。使用此上澄液依實驗1之方法精製，結果得到約7 4 2之每1 4中含約1 3 5單位的具有比活性約3 0單位/ mg蛋白質之α -異麥芽糖基轉移酶活性的本發明多肽水溶液。實施例2 製造多肽依實施例1記載之方法種培養實驗6 - 2所得轉形體 B G Ν 1後，使用3 0 <容積之發酵器主培養。所得培養物以超音波處理、軋碎菌體、離心分離除去不溶物後，測定上澄液中之本發明多肽的α -異麥芽糖基轉移酶活性，結果，每 < 培養中檢測出約3 0 0 0單位之酶活性。使用實驗3之方法精製此上澄液，得約1 5 0 之每1 W中含約7 2單位之具有比活性約3 0單位/ mg蛋白質之α -異麥芽糖基轉移酶活性的本發明多肽水溶液。實施例3 製造含環狀四糖之粉狀物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）丨- r 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T j·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -67- 588110 A7 B7 五、發明説明（65 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 溶解人參三糖（panose林原生物化學硏究所公司製）於水使其爲1 0 %濃度後，調節爲p Η 6 . 0，溫度3 5 °C ’在其中對1 g人參三糖以2單位比率加入實施例1之方法所得酶多肽，反應3 6小時。加熱反應液爲9 5 °C保 1 〇分鐘後，經冷卻，過濾得濾液，依常法以活性碳脫色，以Η型及〇H型離子交換樹脂脫鹽，精製，更予以濃縮，乾燥，粉碎，以固體單位收率約9 1 %得含環狀四糖粉末。本品係以固體單位而言含3 4%葡萄糖、2 . 1%異麥芽糖、2 · 3%人參三糖、45 . 0%環狀四糖、 4 · 8%異麥芽糖基人參三糖、1 · 8%異麥芽糖基人參三糖、1 0 . 0%其他糖質，具有溫和之甜味適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等之組成物。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實施例4 製造含環狀四糖之糖漿狀組成物使粉末麥芽糖（林原公司製造，商品名「Sunmalto」爲3 0%水溶液，對每單位麥芽糖固體物添加〇 . 0 8% 含有α -配糖酶之酶劑（天野製藥公司，商品名「

TransglucosidaseAmano」調整爲 ρ Η 5 . 5，於 5 5 C 反應1 8小時，繼而加熱失活後，調整爲ρ Η 6 . 〇 ’溫度 3 5 °C，對每1 g固體物添加2單位之實施例1之方法所本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -68- 588110 A7 B7 五、發明説明（66) 得之酶多肽，反應3 6小時。加熱反應液爲9 5 °C，保持 1 0分鐘後冷卻，過濾’所得瀘液則依常法用活性碳脫色，以Η型及0H型離子交換樹脂脫鹽、精製、再予濃縮，以每單位固體收率約9 2%得濃度7 0%之糖漿。本品係以固體單位而言爲3 2 . 5 %葡萄糖、 15 . 7%麥芽糖、9 · 8%異麥芽糖、4 . 〇%麥芽三糖、0 . 3%人參三糖、1 .6%異麥芽三糖、17. 5 %環狀四糖、1 · 2%異麥芽糖基人參三糖、0 . 7%異麥芽糖基人參三糖苷、16·7%其他糖質，具有溫和之甜味適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等之組成物。實施例5 製環環狀四糖結晶粉末在1 5 %之馬鈴薯澱粉乳中，加入碳酸鈣使其濃度〇.1%，調整爲ΡΗ6 . 0，對每lg澱粉加入α —澱粉酶劑（Nobo公司製，商品名「Tarmameel60L」）使其可成爲0 . 2%，於95 °C反應15分鐘。在2 kg/ cm2 壓力下於熱壓器中處理該反應液3 0分鐘後，冷卻爲3 5 °C，在其中對每1 g澱粉添加7 . 5單位之實施例1之方法所得本發明之多肽，與對每1 g澱粉添加2單位實驗1 - 3之方法所得α -異麥芽糖葡糖質生成酶，再對每1 g 澱粉添加1 0單位環麥芽糖基糊精葡聚糖基轉移酶（林原本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I·--------^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 J·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -69- 588110 A7 B7 五、發明説明（67) 生化學硏究所公司製），反應4 8小時。使反應液保持 95艺30分鐘後，調整爲5%濃度，？^^5.0，溫度 4 5 °C後，在每1 g固體物中分別添加1 5 0 0單位及 7 5 單位 α —配醣酶劑「TransglucosidaseL Amano」’及葡糖澱粉酶劑（Nagase生化學工業公司製，商品名「 glucoteam」），反應2 4小時，加熱該反應液爲9 5 °C，保持於3 0分鐘後，冷卻，過濾，所得濾液依常法以活性碳脫色，藉Η型及0H型離子交換樹脂脫鹽、精製，再予濃縮得6 0 %濃度之糖漿。此糖漿係以固體單位含有 27 . 4%葡萄糖，65 · 1%環狀四糖，7 · 5%其他糖質者。使用強酸性陽離子交換樹脂（Amberlit CR-310，Na 型Organo公司製）對所得糖液進行管柱分餾。將樹脂塡充於4支內徑5 · 4 c m附套不銹鋼製管柱，直排連接使樹脂層之全長爲2 0 m。維持管柱內溫度爲6 0 t，對樹脂加入5 v / v %糖液，以S V 0 . 1 3灌入6 0 °C溫水予以分餾，以Η P L法監視溶出液之糖組成，採取高含環狀四糖之餾份，以固體單位之收率約2 1 %得到高含環狀四糖液。此高含有液係以固體單位含約9 8 %之環狀四糖〇濃縮上述溶液爲約7 0 %濃度後，放入助晶罐中，力口入約2 %環狀四糖5〜6含水結晶做爲晶種，得晶出率約 4 5 %的糖膏。自乾燥塔上的噴嘴以1 5 0 k g / c m 2高壓噴霧此糖膏。同時自乾燥塔上方送入8 5 °C熱風，在底部所設移送金用屬網輸送帶上搜集結晶粉末，自輸送帶下本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） '~~ -70- —,---Γ ----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

Jm 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 五、發明説明（68) 方邊送4 5 C溫熱風，將該粉末慢慢移動至乾燥塔外，取出。將此結晶粉末塡充於熟成塔，一邊送溫風，一邊使其蟪成1 0小時’完成晶化與乾燥，得環狀四糖5〜6含水結晶粉末。此品係還原性極低，很難引起胺羰基反應，亦不具吸濕性’很容易保存處理，具有溫和的低甜味，適度之粘度、保濕性、包合性、難消化性、做爲甜味料、低熱量食品材料、呈味改良劑、風味改良劑、品質改良劑、防離水劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等組成物。實施例6 使玉米澱粉成爲濃度約2 8 %之澱粉乳，在其中加入對每1 g澱粉加入 0 . 1 %碳酸鈣，調整爲p Η 0 . 3 % α —澱粉酶劑（Nobo公司製，商品名「 Tarmameel 60L」），於 9 5 t：反應 1 5 分鐘。在 2 kg / 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) c m2壓力下於熱壓器中處理該反應液3 0分鐘後，冷卻爲 5 0°C，在其中對每1 g澱粉添加6單位之實施例2之方法所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之本發明多肽，與對每1 g澱粉添加1 · 8單位實驗3 — 3之方法所得α — 異麥芽糖葡糖質生成酶，再對每1 g澱粉添加1單位環麥芽糖基糊精葡聚糖基轉移酶（林原生化學硏究所公司製），反應7 2小時。使反應液保持9 5 °C 3 0分鐘後，調整爲pH5 . 0，溫度50°C後，在每lg固體物中分別添本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -71 - 588110 A7 ____ B7 _ 五、發明説明（69) 加 3 0 0 單位 α —配醣酶劑（「Transglucosidase L Amano (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 」天野製藥公司製）反應2 4小時，再分別對每1 g固體物加入1 0單位及2 0單位之葡糖澱粉酶劑（「Glucoteam 」Nagase生化學工業公司製）及α -澱粉酶劑（「 Neospitase ΡΚ2」反應1 7小時，加熱該反應液爲9 5 °C，保持於3 0分鐘後，冷卻，過瀘，所得瀘液依常法以活性碳脫色，藉Η型及〇Η型離子交換樹脂脫鹽、精製，再予濃縮得6 0 %濃度之糖漿。此糖漿係以固體單位含有 35 · 1%葡萄糖，51 · 1%環狀四糖，13 . 8%其他糖質者。使用實施例5記載之強酸性陽離子交換樹脂進行管柱分餾，採取高含環狀四糖之餾份，得單位固體收率約3 9 %的高含環狀四糖餾份。此溶液係單位固體含有約 8 0 %環狀四糖者。一邊濃縮此丨谷液一邊連續晶析’以籃型離心分離機分密所得糖膏，以少量水噴霧洗淨結晶，每單位固體得約 2 3 %收率之高純度環狀四糖5至6含水結晶。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製此品係還原性極低，很難引起胺幾基反應，亦不具吸濕性，很容易保存處理，具有溫和的低甜味，適度之粘度、保濕性、包合性、難消化性、做爲甜味料、低熱量食品材料、呈味改良劑、風味改良劑、品質改良劑、防離水劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等組成物。產業上之可利用性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐) " --- -72- 588110 Α7 Β7 五、發明説明（70) 如以上說明，本發明係可提供具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之新穎多肽，其製造方法及用途之發明。本發明之多肽因可以藉由基因重組技術，大量且廉價安定地供給，所以使用該多肽即可在工業上大量且廉價地製造具有環 { — 6} — a — D — π比喃葡糖基一（1 — 3) — α - D -吡喃葡糖基一（1 - 6 ) - α - D -吡喃葡糖基一（1 — 3 ) — α - D -吡喃葡糖基—（1 —)構造的環狀四糖，含其之混合糖及各種組成物。使用該多肽所得之環狀四糖係還原性極低，很難引起胺羰基反應，亦不具吸濕性，極易處理，具有溫和之低甜味，適度之粘度，保濕性，包合性，難消化性，可以極有利地做爲甘味料，低熱量食品材料，加味改良劑，風味改良劑，品質改良劑，防離水劑，安定劑，賦形劑，包合劑，粉末化基材等利用於各種飮食物，化粧品，醫藥品等組成物。本發明係可發揮如上述之顯著作用效果的發明，可謂對此業界貢獻極大，且爲極有意義的發明。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -73- 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

At /27， B7 五、發明説明（W ) ' 序列表 <110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120〉 Polypeptide having α-isomaltosy卜transferring enzymatic activity <130> W0870 〈160〉 16 〈210〉 1 <211> 1064 <212> PRT <213〉 Microorganism 〈220〉〈400〉 1 lie Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly lie Asp Asp Leu Tyr Glu 15 10 15 Me Gin Ala Thr Glu Arg Ser Pro Arg Asp Pro Val Ala Gly Asp Thr 20 25 30 Val Tyr lie Lys lie Thr Thr Trp Pro lie Glu Ser Gly Gin Thr Ala 35 40 45 Trp Val Thr Trp Thr Lys Asn Gly Val Asn Gin Ala Ala Val Gly Ala 50 55 60 Ala Phe Lys Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu 65 70 75 80 Gly Thr Phe Ala Lys Gly Asp Val He Ser Tyr Thr Val His Gly Asn 85 90 95 Lys Asp Gly Ala Asn Glu Lys Val lie Gly Pro Phe Thr Phe Thr Val 100 105 110 Thr Gly Trp Glu Ser Val Ser Ser lie Ser Ser lie Thr Asp Asn Thr 115 120 125 Asn Arg Yal Val Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Lys Pro 130 135 140 Lys lie Asn Leu Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Leu Arg Yal Gin Val 145 150 155 160 Ser Pro Thr Gly.Thr Gly Thr Leu Ser Ser Gly Leu Ser Asn Tyr Thr 165 170 175 Val Ser Asp Thr Ala Ser Thr Tiir Trp Leu Thr Thr Ser Lys Leu Lys 180 185 190 Val Lys Val Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Yal Tyr Lys Pro Asp I-----------Ί.--IT-------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -74 - 588110 ΑΤί /27 Β7 五、發明説明（F) * 195 200 205

Gly Thr Thr Leu lie Ala Arg Gin Tyr Asp Ser Thr Thr Asn Arg Asn 210 215 220 lie Ala Trp Leu Thr Asn Gly Ser Thr lie lie Asp Lys Yal Glu Asp (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 225 230 235 240

His Phe Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Glu Phe Phe Gly Phe Gly Glu His 245 250 255

Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Arg Gly Asn Asp Yal Asp Thr Tyr Yal Phe 260 265 270

Asn Gin Tyr Lys Asn Gin Asn Asp Arg Thr Tyr Met Ala lie Pro Phe 275 280 285

Met Leu Asn Ser Ser Gly Tyr Gly lie Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr 290 295 300

Ser Lys Phe Arg Leu Ala Thr Glu Arg Thr Asp Met Phe Ser Phe Thr 305 310 315 320

Ala Asp Thr Gly Gly Ser Ala Ala Ser Met Leu Asp Tyr Tyr Phe lie 325 330 335

Tyr Gly Asn Asp Leu Lys Asn Yal Val Ser Asn Tyr Ala Asn lie Thr 340 345 350

Gly Lys Pro Thr Ala Leu Pro Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser 355 360 365

Ala Asn Glu Trp Asp Arg Gin Thr Lys Val Asn Thr Ala lie Asn Asn 370 375 380

Ala Asn Ser Asn Asn lie Pro Ala Thr Ala Yal Val Leu Glu Gin Trp 385 390 395 400

Ser Asp Glu Asn Thr Phe Tyr lie Phe Asn Asp Ala Thr Tyr Thr Pro 405 410 415 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Lys Thr Gly Ser Ala Ala His Ala Tyr Thr Asp Phe Thr Phe Pro Thr 420 425 430

Ser Gly Arg Trp Thr Asp Pro Lys Ala Met Ala Asp Asn Yal His Asn 435 440 445

Asn Gly Met Lys Leu Val Leu Trp Gin Yal Pro lie Gin Lys Trp Thr 450 455 460

Ser Thr Pro Tyr Thr Gin Lys Asp Asn Asp Glu Ala Tyr Met Thr Ala 465 470 475 480

Gin Asn Tyr Ala Yal G.ly Asn Gly Ser Gly Gly Gin Tyr Arg lie Pro 485 490 495 75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） /27588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（β) ^ Ser Gly Gin Trp Phe Glu Asn Ser Leu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Thr 500 505 510 Ala Ala Lys Asn Trp Trp Met Ser Lys Arg Ala Tyr Leu Phe Asp Gly 515 520 525 Val Gly lie Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Gly Glu Met Yal Trp Gly 530 535 540 Arg Ser Asn Thr Phe Ser Asn Gly Lys Lys Gly Asn Glu Met Arg Asn 545 550 555 560 Gin Tyr Pro Asn Glu Tyr Val Lys Ala Tyr Asn Glu Tyr Ala Arg Ser 565 570 575 Lys Lys Ala Asp Ala Val Ser Phe Ser Arg Ser Gly Thr Gin Gly Ala 580 585 590 Gin Ala Asn Gin lie Phe Trp Ser Gly Asp Gin Glu Ser Thr Phe Gly 595 600 605 Ala Phe Gin Gin Ala Val Asn Ala Gly Leu Thr Ala Ser Met Ser Gly 610 615 620 Yal Pro Tyr Trp Ser Trp Asp Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Pro 625 630 635 640 Thr Ala Glu Leu Tyr Lys Arg Ala Thr Glu Met Ala Ala Phe Ala Pro 645 650 655 Yal Met Gin Phe His Ser Glu Ser Asn Gly Ser Ser Gly lie Asn Glu 660 665 670 Glu Arg Ser Pro Trp Asn Ala Gin Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr lie 675 680 685 lie Ser His Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro 690 695 700 Tyr lie Tyr Ser Glu Ala Lys Met Ala Ser Asp Thr Gly Val Pro Met 705 710 . 715 720 Met Arg Ala Met Ala Leu Glu Tyr Pro Lys Asp Thr Asn Thr Tyr Gly 725 730 735 Leu Thr Gin Gin Tyr Met Phe Gly Gly Asn Leu Leu lie Ala Pro Val 740 745 750 Met Asn Gin Gly Glu Thr Asn Lys Ser lie Tyr Leu Pro Gin Gly Asp 755 760 765 Trp lie Asp Phe Trp Phe Gly Ala Gin Arg Pro Gly Gly Arg Thr lie 770 775 780 Ser Tyr Thr Ala Gly lie Asp Asp Leu Pro Val Phe Yal Lys Phe Gly (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A4 /27， B7 五、發明説明（β) · 785 790 795 800 Ser lie Leu Pro Met Asn Leu Asn Ala Gin Tyr Gin Yal Gly Gly Thr 805 810 815 lie Gly Asn Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Asn Leu Ala Phe Arg lie Tyr 820 825 830 Pro Leu Gly Thr Thr Thr Tyr Asp Trp Asn Asp Asp lie Gly Gly Ser 835 840 845 Val Lys Thr lie Thr Ser Thr Glu Gin Tyr Gly Leu Asn Lys Glu Thr 850 855 860 Val Thr Val Pro Ala lie Asn Ser Thr Lys Thr Leu Gin Val Phe Thr 865 870 875 880 Thr Lys Pro Ser Ser Val Thr Val Gly Gly Ser Val Met Thr Glu Tyr 885 890 895 Ser Thr Leu Thr Ala Leu Thr Gly Ala Ser Thr Gly Trp Tyr Tyr Asp 900 905 910 Thr Yal Gin Lys Phe Thr Tyr Yal Lys Leu Gly Ser Ser Ala Ser Ala 915 920 925 Gin Ser Val Val Leu Asn Gly Yal Asn Lys Val Glu Tyr Glu Ala Glu 930 935 940 Phe Gly Val Gin Ser Gly Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr 945 950 955 960 Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Phe Glu Thr Leu Gly Asp Asn Val 965 970 975 Ala Phe Asp Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Met Lys Val 980 985 990 Arg Tyr Ser Ser Gly Ala Gly Asn Gly Ser Arg Ala lie Tyr Val Asn 995 1000 1005 Asn Thr Lys Yal Thr Asp Leu Ala Leu Pro Gin Thr Thr Ser Trp Asp 1010 1015 1020 Thr Trp Gly Thr Ala Thr Phe Ser Val Ser Leu Ser Thr Gly Leu Asn 1025 1030 1035 1040 Thr Val Lys Val Ser Tyr Asp Gly Thr Ser Ser Leu Gly lie Asn Phe 1045 1050 1055 Asp Asn lie Ala He Val Glu Gin 1060 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 77 588110 A5 /27, B7 五、發明説明（< ) *

<210〉 2 <211> 1064 <212> PRT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <213> Microorganism 〈400> 2 lie Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly lie Asp Asp Leu Tyr Glu 1 5 10 15 lie Gin Ala Thr Glu Arg Ser Pro Arg Asp Pro Val Ala Gly Glu Thr 20 25 30

Val Tyr lie Lys lie Thr Thr Trp Pro Me Glu Pro Gly Gin Thr Ala 35 40 45

Trp Yal Thr Trp Thr Lys Asn Gly Val Ala Gin Pro Ala Val Gly Ala 50 55 60

Ala Tyr Lys Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu 65 70 75 80

Gly Ser Phe Ala Lys Gly Asp Val lie Ser Tyr Thr Val Arg Gly Asn 85 90 95

Lys Asp Gly Ala Asn Glu Lys Thr Ala Gly Pro Phe Thr Phe Thr Val 100 105 . 110

Thr Asp Trp Glu Tyr Yal Ser Ser lie Gly Ser Val Thr Asn Asn Thr 115 120 125

Asn Arg Val Leu Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Ser Pro 130 135 140

Lys lie Asn lie Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Phe Arg Yal Gin Leu 145 150 155 160

Ser Pro Thr Gly Ser Gly Thr Leu Ser Thr Gly Leu Ser Asn Phe Thr 165 170 175 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Yal Thr Asp Ser Ala Ser Thr Ala Trp lie Ser Thr Ser Lys Leu Lys 180 185 190

Leu Lys Val Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Val Tyr Lys Pro Asp 195 200 205

Gly Thr Thr Leu lie Ala Arg Gin Tyr Asp Ser Thr Ala Asn Arg Asn 210 215 220

Leu Ala Trp Leu Thr Asn Gly Ser Thr Val lie Asn Lys lie Glu Asp 225 230 235 240

His Phe Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Glu Phe Phe Gly Phe Gly Glu Arg 78 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） /27 ,588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（知） ^ 245 250 255 Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Arg Gly Thr Asp Val Asp Thr Tyr Yal Tyr 260 265 270 Asn Gin Tyr Lys Asn Gin Asn Asp Arg Thr Tyr Met Ala lie Pro Phe 275 280 285 Met Leu Asn Ser Ser Gly Tyr Gly lie Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr 290 295 300 Ser Lys Phe Arg Leu Ala Thr Glu Arg Ser Asp Met Tyr Ser Phe Thr 305 310 315 320 Ala Asp Thr Gly Gly Ser Ala Asn Ser Thr Leu Asp Tyr Tyr Phe lie 325 330 335 Tyr Gly Asn Asp Leu Lys Gly Yal Yal Ser Asn Tyr Ala Asn lie Thr 340 345 350 Gly Lys Pro Ala Ala Leu Pro Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser 355 360 365 Ala Asn Glu Trp Asp Arg Gin Ser Lys Val Ala Thr Ala lie Asn Asn 370 375 380 Ala Asn Thr Asn Asn lie Pro Ala Thr Ala Yal Val Leu Glu Gin Trp 385 390 395 400 Ser Asp Glu Asn Thr Phe Tyr Met Phe Asn Asp Ala Gin Tyr Thr Ala 405 410 415 Lys Pro Gly Gly Ser Thr His Ser Tyr Thr Asp Tyr lie Phe Pro Ala 420 425 430 Ala Gly Arg Trp Pro Asn Pro Lys Gin Met Ala Asp Asn Val His Ser 435 440 445 Asn Gly Met Lys Leu Yal Leu Trp Gin Val Pro lie Gin Lys Trp Thr 450 455 460 Ala Ala Pro His Leu Gin Lys Asp Asn Asp Glu Ser Tyr Met lie Ala 465 470 475 480 Gin Asn Tyr Ala Val Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gin Tyr Arg lie Pro 485 490 495 Ser Gly Gin Trp Phe Glu Asn Ser Leu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Pro 500 505 510 Ser Ala Lys Asn Trp Trp Met Ser Lys Arg Ala Tyr Leu Phe Asp Gly 515 520 525 Yal Gly lie Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp Gly 530 535 540 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） 79 588110 A7 /27. B7 五、發明説明（Μ) ^

Arg Trp Asn Thr Phe Ala Asn Gly Lys Lys Gly Asp Glu Met Arg Asn 545 550 555 560

Gin Tyr Pro Asn Asp Tyr Yal Lys Ala Tyr Asn Glu Tyr Ala Arg Ser 565 570 575 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Lys Lys Ser Asp Ala Yal Ser Phe Ser Arg Ser Gly Thr Gin Gly Ala 580 585 590

Gin Ala Asn Gin lie Phe Trp Ser Gly Asp Gin Glu Ser Thr Phe Gly 595 600 605

Ala Phe Gin Gin Ala Val Gin Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ser Gly 610 615 620

Val Pro Tyr Trp Ser Trp Asp Leu Ala Gly Phe Thr Gly Ala Tyr Pro 625 630 635 640

Ser Ala Glu Leu Tyr Lys Arg Ala Thr Ala Met Ser Ala Phe Ala Pro 645 650 655 lie Met Gin Phe His Ser Glu Ala Asn Gly Ser Ser Gly lie Asn Glu 660 665 670

Glu Arg Ser Pro Trp Asn Ala Gin Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr lie 675 680 685 lie Ser His Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro 690 695 700

Tyr lie Tyr Ser Glu Ala Lys Ala Ala Ser Asp Thr Gly Yal Pro Met 705 710 715 720

Met Arg Ala Met Ala Leu Glu Tyr Pro Ser Asp Thr Gin Thr Tyr Gly 725 730 735

Leu Thr Gin Gin Tyr Met Phe Gly Gly Ser Leu Leu Yal Ala Pro Yal 740 745 750

Leu Asn Gin Gly Glu Thr Asn Lys Asn lie Tyr Leu Pro Gin Gly Asp 755 760 765 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Trp lie Asp Phe Trp Phe Gly Ala Gin Arg Pro Gly Gly Arg Thr lie 770 775 780

Ser Tyr Tyr Ala Gly Yal Asp Asp Leu Pro Yal Phe Val Lys Ser Gly 785 790 795 800

Ser lie Leu Pro Met Asn Leu Asn Gly Gin Tyr Gin Yal Gly Gly Thr 805 810 815 lie Gly Asn Ser Leu Thr Ala Tyr Asn Asn Leu Thr Phe Arg lie Tyr 820 825 830

Pro Leu Gly Thr Thr Thr Tyr Ser Trp Asn Asp Asp lie Gly Gly Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 80 588110 A3 /27 B7 五、發明説明（β) ' 835 840 845

Yal Lys Thr lie Thr Ser Thr Glu Gin Tyr Gly Leu Asn Lys Glu Thr 850 855 860

Yal Thr Leu Pro Ala lie Asn Ser Ala Lys Thr Leu Gin Yal Phe Thr (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 865 870 875 880

Thr Lys Pro Ser Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Ala Leu Thr Ala His 885 890 895

Ser Thr Leu Ser Ala Leu lie Gly Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Asp 900 905 910

Thr Val Gin Lys Leu Ala Tyr Yal Lys Leu Gly Ala Ser Ser Ser Ala 915 920 925

Gin Thr Val Val Leu Asp Gly Val Asn Lys Val Glu Tyr Glu Ala Glu 930 935 940

Phe Gly Thr Leu Thr Gly Val Thr Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr 945 950 955 960

Met Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Phe Asp Ala Ala Gly Asp Ala Val 965 970 975

Thr Phe Asp Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Ala Leu Lys Val 980 985 990

Arg Tyr Ala Ser Ala Gly Gly Asn Ala Ser Arg Ala lie Tyr Val Asn 995 1000 1005

Asn Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Leu Pro Ala Thr Ala Asn Trp Asp 1010 1015 1020

Thr Trp Gly Thr Ala Thr Val Asn Val Ala Leu Asn Ala Gly Tyr Asn 1025 1030 1035 1040

Ser lie Lys Val Ser Tyr Asp Asn Thr Asn Thr Leu Gly lie Asn Leu 1045 1050 1055 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Asp Asn lie Ala lie Yal Glu His 1060

〈210〉 3 <211〉 3192 <212〉 DNA <213〉 Microorganism 〈400〉 3 attgatggtg tttatcatgc gccatacgga atcgatgatc tgtacgagat tcaggcgacg 60 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210X297公釐） 81 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Ag /27 . B7 五、發明説明（”） ^ gagcggagtc caagagatcc cgttgcaggc gatactgtgt atatcaagat aacaacgtgg 120 cccattgaat caggacaaac ggcttgggtg acctggacga aaaacggtgt caatcaagct 180 gctgtcggag cagcattcaa atacaacagc ggcaacaaca cttactggga agcgaaccU 240 ggcacttttg caaaagggga cgtgatcagt tataccgttc atggcaacaa ggatggcgcg 300 aatgagaagg ttatcgglcc titlactttt accgtaacgg gaigggaatc cgttagcagt 360 atcagctcta ttacggataa tacgaaccgt gttgtgctga atgcggtgcc gaatacaggc 420 acattgaagc caaagatcaa cctttccttt acggcggatg atgtcctccg cgtacaggtt 480 tctccaaccg gaacaggaac gttaagcagt ggacttagta attacacagt ttcagatacc 540 gcctcaacca cttggcttac aacttccaag ctgaaggtga aggtggataa gaatccattc 600 aaacttagtg tgtataagcc tgatggaacg acgttgattg cccgtcaata tgacagcact 660 acgaatcgta acattgcctg gttaaccaal ggcagtacaa tcatcgacaa ggtagaagat 720 catttttatt caccggcttc cgaggagttt tttggctttg gagagcatta caacaacttc 780 cgtaaacgcg gaaatgatgl ggacacctat gtgttcaacc agtataagaa tcaaaatgac 840 cgcacctaca tggcaattcc ttttatgctt aacagcagcg gttatggca丨 tttcgtaaat 900 teaacgtatt attccaaatt tcggttggca accgaacgca ccgatatglt cagctttacg 960 gctgatacag ggggtagtgc cgcctcgatg ctggattatt atttcattla cggtaatgat 1020 ttgaaaaatg tggtgagtaa ctacgctaac attaccggta agccaacagc gctgccgaaa 1080 tgggctiicg ggtlatggal glcagctaac gagtgggatc gtcaaaccaa ggtgaataca 1140 gccattaata acgcgaactc caataatatt ccggctacag cggttgtgct cgaacagtgg 1200 agtgatgaga acacgtttta tattttcaat gatgccacct ataccccgaa aacgggcagt 1260 gctgcgcatg cctataccga tttcactttc ccgacatctg ggagatggac ggatccaaaa 1320 gcgatggcag acaatgtgca taacaatggg atgaagctgg 丨gctttggca ggtccctatt 1380 cagaaatgga cttcaacgcc clatacccag aaagataatg atgaagccta tatgacggct 1440 cagaattatg cagttggcaa cggtagcgga ggccagtaca ggataccttc aggacaatgg 1500 ttcgagaaca gtttgctgct tgaltttacg aatacggccg ccaaaaactg gtggatgtct 1560 aaacgcgctt atctgtttga tggtgtgggt atcgacggct tcaaaacaga tggcggtgaa 1620 atggtatggg gtcgctcaaa tactltctca aacggtaaga aaggcaatga aatgcgcaat 1680 caatacccga atgagtatgt gaaagcctat aacgagtacg cgcgctcgaa gaaagccgat 1740 gcggtctcct ttagccgttc cggcacgcaa ggcgcacagg cgaatcagat tttctggtcc 1800 ggtgaccaag agtcgacgtt tggtgctttt caacaagctg tgaatgcagg gcttacggca 1860 agtatgtctg gcgttcctta ttggagctgg gatatggcag gctttacagg cacttatcca 1920 acggctgagt tgtacaaacg tgctactgaa atggctgctt ttgcaccggt catgcagttt 1980 cattccgagt ctaacggcag ctctggtatc aacgaggaac gttctccatg gaacgcacaa 2040 gcgcgtacag gcgacaatac gatcattagt cattttgcca aatatacgaa tacgcgcatg 2100 aatttgcttc ct.talattta lagcgaagcg aagatggcta gtgatactgg cgttcccatg 2160 atgcgcgcca tggcgcttga atatccgaag gacacgaaca cgtacggttt gacacaacag 2220 tatatgttcg gaggtaattt acttattgct cctgttatga atcagggaga aacaaacaag 2280 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 82

I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110

At)/27， B7 五、發明説明（和） * agtatttatc ttccgcaggg ggattggatc gatttctggt tcgglgctca gcglcctggc 2340 ggtcgaacaa tcagctacac ggccggcatc gatgatctac cggtttltgt gaaglttggc 2400 agtattcttc cgatgaattt gaacgcgcaa tatcaagtgg gcgggaccat tggcaacagc 2460 ttgacgagct acacgaatct cgcgltccgc atttatccgc ttgggacaac aacgtacgac 2520 tggaatgatg atattggcgg ttcggtgaaa accataactt ctacagagca atatgggttg 2580 aataaagaaa ccgtgactgt tccagcgatt aattctacca agacattgca agtgtttacg 2640 actaagcctt cctctgtaac ggtgggtggt tctgtgatga cagagtacag tactttaact 2700 gccctaacgg gagcgtcgac aggctggtac tatgatactg tacagaaatt cacttacgtc 2760 aagcttggtt caagtgcatc tgctcaatcc gttgtgctaa atggcgttaa taaggtggaa 2820 latgaagcag aattcggcgt gcaaagcggc gtltcaacga acacgaacca tgcaggttat 2880 actggtacag gatttgtgga cggctttgag actcttggag acaatgttgc ttttgatgtt 2940 tccgtcaaag ccgcaggtac ttatacgatg aaggttcggt attcatccgg tgcaggcaat 3000 ggclcaagag ccatctatgt gaataacacc aaagtgacgg accttgcctl gccgcaaaca 3060 acaagctggg atacatgggg gactgctacg tttagcgtct cgctgagtac agglctcaac 3120 acggtgaaag tcagctatga tggtaccagt tcacttggca ttaatttcga taacatcgcg 3180 attgtagagc aa 3192

<210〉 4 <211> 3192 <212〉 DNA <213〉 Microorganism <400> 4 altgacggcg tataccacgc gccttacggg atcgacgatc tttatgagat tcaggcgacg 60 gagcgcagtc cgagagaccc tgtggccggg gagacggtgt atatcaaaat cacaacatgg 120 ccgatcgagc ccggacagac ggcatgggtg acctggacga aaaacggcgt cgcccagccg 180 gcggtcggtg ccgcctacaa gtacaacagc ggcaacaaca cctactggga ggcgaacctg 240 ggcagcttcg ccaaaggaga cgtaatttcc tacaccgttc gcggcaataa ggacggtgcc 300 aatgaaaaaa cggccggacc gitcaccltt accglaaccg actgggaata cgtcagcagc 360 atcggctcgg tcacgaataa cacgaaccgt gtcctgctga atgcggtgcc gaacacgggg 420 acgctgtccc ccaagatcaa catttcgttc acggcggacg atgtgttccg cgttcagctc 480 tcccctacgg gatcggggac gttgagcacg ggcctgagta attttaccgt cacggacagt 540 gcgtccacgg cctggatctc tacatccaaa ttaaagctga aggtggataa gaatccgttc 600 aaactgagcg tgtacaagcc ggacggcacg acgctgatcg cgcgccagta tgacagcacg 660 gccaaccgca atctcgcttg gctgaccaat ggcagcactg tcatcaataa aatcgaggac 720 cacttctact cgccggcgtc cgaggagttt 丨tcggcttcg gggagcgcta caacaacttc 780 cgcaagcgcg gaaccgacgt ggacacgtat gtctacaatc agtacaaaaa tcaaaacgac 840 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~ 1·---Γ----I-------IT------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

All/27, ____ B7 五、發明説明（W) ^ cgcacctata tggcaatccc cttcatgctg aacagcagcg ggtacggtat cttcgtaaac 900 tccacgtact actccaaatt ccgcttggca actgagcgct ccgatatgta cagttttacg 960 gccgataccg ggggcagcgc caattcgacg ctggattact actttattta cggcaalgac 1020 ttgaagggcg tcgtcagcaa ttatgcgaac atcacaggca agccggctgc tctgcccaaa 1080 tgggcgtltg gcctctggat gtcggccaat gagtgggacc ggcaatccaa agtagcgact 1140 gcgatcaata acgccaatac gaacaacatc ccggcgacgg ccgtcgtgct ggagcaglgg 1200 agtgacgaga atacgttcta tatgttcaac gatgcgcagt atacggccaa acctggcggc 1260 agcacacact cctatacgga ciatatcttc ccggcggccg gccgttggcc gaatccgaag 1320 caaatggcgg ataatgtaca cagtaacggg atgaagctgg tgctgtggca ggtgccgatt 1380 cagaaatgga ccgccgctcc tcatctgcag aaggacaacg acgaaagcta tatgatcgcg 1440 caaaattalg ccgtaggcaa cggcagcgga ggccagtacc gcatccctag cgggcaalgg 1500 tttgagaaca gcctgctgct ggacttcacg aacccgagcg ccaaaaactg gtggatgtcc 1560 aagcgcgcct atctgtttga tggcgtcggc atcgacgggt tcaagacgga cggaggggag 1620 atggtctggg gccgctggaa cacgttcgcc aatggcaaaa aaggcgatga aalgcgcaac 1680 cagtacccga acgattacgt gaaggcctac aacgaatatg cgcgctcgaa gaaaagcgat 1740 gccgtcagct tcagccgttc gggcacgcaa ggggcgcaag cgaatcagat cttctggtcc 1800 ggtgaccagg aatcgacgtt cggtgccttc cagcaagccg tccaggcggg actgaccgca 1860 ggcttgtccg gcgttccgta ttggagctgg gacttggctg gattcaccgg cgcttatccg 1920 tcggccgagc tataUaacg cgcgacggca atgtcggcat ttgccccgat tatgcagttc 1980 cactccgaag ccaacggcag ttccggcatc aatgaggagc ggtccccgtg gaatgctcag 2040 gcccggactg gcgacaacac gatcatcagc cattttgcca agtatacgaa cacccggatg 2100 aacctgcttc cttatattta cagcgaggct aaagcagcaa gcgatactgg cgtgccgatg 2160 atgcgcgcga tggcgctgga gtatccgagc gatacccaga cgtacggatt gacgcagcag 2220 tacatgttcg gcggcagcct gctggtggcg cctgtcttga accaaggcga gacgaataag 2280 aatatctacc ttccgcaagg agattggatc gacttctggt tcggcgcgca gcgtccgggc 2340 gggcgaacga tcagctacta cgcgggcgtg gacgatcttc ccgtcttcgt gaagtccggc 2400 agcatcctgc cgatgaatct gaacgggcag tatcaggttg gcggcacgat cggcaacagc 2460 ttgaccgcct acaacaacct gacgttccgg atttatccac tgggtacgac gacgtacagc 2520 tggaatgatg acatcggcgg ctcggtgaag acgattacgt cgacagagca gtatggactg 2580 aataaagaga cggtgacgct tccggcgatc aactcggcga agacgctcca ggtgttcacg 2640 accaagccgt cgtcggtgac gctgggcggc acggccctca ccgcgcatag cacattaagc 2700 gcattgatcg gcgcttcctc cggctggtat tacgatacgg tgcaaaagct cgcctatgtg 2760 aagctcggcg ccagctcatc ggcgcaaacc gtcgtgcttg acggcgtcaa caaggtcgag 2820 tatgaggclg agttcggcac acttaccggc gtcacgacca atacgaatca tgccggctat 2880 atgggtaccg gctttgtcga cggcttcgat gcggcaggcg atgcagtgac cttcgacgta 2940 tccgtcaaag cggccggcac gtatgcgctc aaggtccggt acgcttccgc tggtggcaac 3000 gcttcacgcg ctatctatgt caacaacgcc aaggtgaccg atctggcgct tccggcaacg 3060 I ^IT. (請先閲讀背面之注意事項再#寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）„ 84 ” 588110

AiS/27' B7 五、發明説明（衫） ’ gccaaclggg acacctgggg gacggcaacc gtcaacgtag ccttaaacgc cggctacaac 3120 tcgatcaagg tcagclacga caacaccaat acgctcggca ttaatctcga taacaltgcg 3180 atcgtggagc at 3192 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

〈210〉 5 〈211〉 19 〈212〉 PRT <213> Microorganism 〈400〉 5 lie Asp Gly Yal Tyr His Ala Pro Tyr Gly lie Asp Asp Leu Tyr Glu 1 5 10 15 lie Gin Ala

<210〉 6 〈211〉 14 <212> PRT <213> Microorganism 〈400〉 6

Gly Asn Glu Met Arg Asn Gin Tyr Pro Asn Glu Tyr Yal Lys 1 5 10

〈210〉 7 〈211〉 14 <212> PRT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製〈213〉 Microorganism 〈400〉 7

Arg Gly Asn Asp Val Asp Thr Tyr Val Phe Asn Gin Tyr Lys 1 5 10

<210> 8 <211> 6 <212> PRT 〈213〉 Microorganism 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）„ 85 „ 588110 43/27 B7 五、發明説明（W ^ <400〉 8

Asn Trp Trp Met Ser Lys 1 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

〈210〉 9 <211> 12 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 9 lie Thr Thr Trp Pro lie Glu Ser Gly Gin Thr Ala 1 5 10

〈210〉 10 <211> 11 <212> PRT <213> Microorganism 〈400〉 10

Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser Ala Asn Glu 1 5 10

<210> 11 <211〉 18 <212> PRT <213〉 Microorganism <400> 11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

The Asp Gly Gly Glu Met Yal Trp Gly Arg Trp Asn Thr Phe Ala Asn 15 10 15

Gly Lys

〈210〉 12 〈211〉 18 <212> PRT 〈213〉 Microorganism 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 588110 ΑΓ4/27 B7 五、發明説明（#) * 〈400〉 12 lie Thr Thr Trp Pro lie Glu Pro Gly Gin Thr Ala Ti*p Val Thr Trp 1 5 10 15

Thr Lys (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

〈210〉 13 <211〉 17 <212> PRT <213〉 Microorganism <400〉 13

Trp Ala Phe Gly Leu Trp Mel Ser Ala Asn Glu Trp Asp Arg Glu Ser 15 10 15

Lys

〈210〉 14 <211> 20 <212> PRT <213〉 Microorganism 〈400〉 14

Asn lie Tyr Leu Pro Gin Gly Asp Trp lie Asp Phe Trp Phe Gly Ala 1 5 10 15

Gin Arg Pro Gly 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

〈210〉 15 <211〉 3869 〈212〉 DNA <213〉 Microorganism <220〉

<221> CDS 〈222〉（241)·.·(3522) <400〉 15 tcatcgctac tggcaatcgg attcaaacaa atggctgcag ctcgcacaga cgattgtgga 60 aagggaatat ctgatttaac catacggcgg tcgcgattga ttgaatagga ttcgtggccg 120 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 87 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 ΑΓ5/27 ‘ _ _ B7 五、發明説明（β) * cctaatattg aaagggggga tgcgtggagc agcgcatgca cggcgaggaa taactgttgt 180 tggagcctct aagtcattca tgtttagcaa acaaatttcg gtacgaaagg ggaaatgttt 240 atg tat gta agg aat eta aca ggt tea ttc ega ttt let etc tet ttt 288

Met Tyr Val Arg Asn Leu Thr Gly Ser Phe Arg Phe Ser Leu Ser Phe 1 5 10 15 ttg etc tgt ttc tgt etc ttc gtc ccc tel atl tat gee att gat ggt 336

Leu Leu Cys Phe Cys Leu Phe Val Pro Ser lie Tyr Ala lie Asp Gly 20 25 30 gtt tat cat geg cca tac gga ate gat gat ctg tac gag att cag geg 384

Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly lie Asp Asp Leu Tyr Glu lie Gin Ala 35 40 45 aeg gag egg agi cca aga gat ccc gtt gca ggc gat act gtg tat ate 432

Thr Glu Arg Ser Pro Arg Asp Pro Val Ala Gly Asp Thr Val Tyr lie 50 55 60 aag ata aca aeg tgg ccc att gaa tea gga caa aeg get tgg gtg acc 480

Lys lie Thr Thr Trp Pro lie Glu Ser Gly Gin Thr Ala Trp Yal Thr 65 70 75 80 tgg aeg aaa aac ggt gtc aat caa get get gtc gga gca gca ttc aaa 528

Trp Thr Lys Asn Gly Val Asn Gin Ala Ala Val Gly Ala Ala Phe Lys 85 90 95 tac aac age ggc aac aac act tac tgg gaa geg aac ett ggc act ttt 576

Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu Gly Thr Phe 100 105 110 gca aaa ggg gac gtg ate agl tat acc gtt cat ggc aac aag gat ggc 624

Ala Lys Gly Asp Val lie Ser Tyr Thr Val His Gly Asn Lys Asp Gly 115 120 125 geg aat gag aag gtt ate ggt cct ttt act ttt acc gta aeg gga tgg 672

Ala Asn Glu Lys Yal lie Gly Pro Phe Thr Phe Thr Yal Thr Gly Trp 130 135 140 gaa tee gtt age agt ate age tet att aeg gat aat aeg aac cgt git 720

Glu Ser Yal Ser Ser lie Ser Ser lie Thr Asp Asn Thr Asn Arg Yal 145 150 155 160 gtg ctg aat geg gtg ccg aat aca ggc aca ttg aag cca aag ate aac 768

Val Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Lys Pro Lys lie Asn 165 170 175 ett tee ttt aeg geg gat gat gtc etc ege gta cag gtt tet cca acc 816 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）„ 88 - I.--------------IT------φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Aff/27 B7 五、發明説明（W ) * Leu Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Leu Arg Val Gin Val Ser Pro Thr 180 185 190 gga aca gga acg tta age agt gga ett agt aat tac aca gtt tea gat 864 Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ser Gly Leu Ser Asn Tyr Thr Val Ser Asp 195 200 205 acc gcc tea acc act tgg ett aca act tcc aag ctg aag gtg aag gtg 912 Thr Ala Ser Thr Thr Trp Leu Thr Thr Ser Lys Leu Lys Val Lys Val 210 215 220 gat aag aat cca ttc aaa cit agt gtg tat aag cct gat gga acg acg 960 Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Yal Tyr Lys Pro Asp Gly Thr Thr 225 230 235 240 tig ait gcc cgt caa tal gac age act acg aat cgt aac att gcc tgg 1008 Leu lie Ala Arg Gin Tyr Asp Ser Thr Thr Asn Arg Asn lie Ala Trp 245 250 255 tta acc aat ggc agt aca ate ate gac aag gta gaa gat cal tit tat 1056 Leu Thr Asn Gly Ser Thr lie lie Asp Lys Val Glu Asp His Phe Tyr 260 265 270 tea ccg get tcc gag gag ttt ttt ggc ttt gga gag cat tac aac aac 1104 Ser Pro Ala Ser Glu Glu Phe Phe Gly Phe Gly Glu His Tyr Asn Asn 275 280 285 ttc cgt aaa ege gga aat gat gtg gac acc tat gtg ttc aac cag tat 1152 Phe Arg Lys Arg Gly Asn Asp Yal Asp Thr Tyr Val Phe Asn Gin Tyr 290 295 300 aag aat caa aat gac ege acc tac atg gca atl cct ttt alg ett aac 1200 Lys Asn Gin Asn Asp Arg Thr Tyr Met Ala lie Pro Phe Met Leu Asn 305 310 315 320 age age ggt tat ggc att ttc gta aat tea acg tat tat tcc aaa ttt 1248 Ser Ser Gly Tyr Gly lie Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Lys Phe 325 330 335 egg ttg gca acc gaa ege acc gat atg ttc age ttt acg get gat aca 1296 Arg Leu Ala Thr Glu Arg Thr Asp Met Phe Ser Phe Thr Ala Asp Thr 340 345 350 ggg ggt agt gcc gcc teg atg ctg gat tat tat ttc att tac ggt aat 1344 Gly Gly Ser Ala Ala Ser Met Leu Asp Tyr Tyr Phe lie Tyr Gly Asn 355 360 365 gat ttg aaa aat gtg gtg agt aac tac get aac att acc ggt aag cca 1392 Asp Leu Lys Asn Val Val Ser Asn Tyr Ala Asn lie Thr Gly Lys Pro 本紙張尺度適用中81國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 89 588110

Af7/27 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（W) ^ 370 375 380 aca gcg ctg ccg aaa tgg get ttc ggg tta tgg atg tea Thr Ala Leu Pro Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser 385 390 395 tgg gat cgt caa acc aag gtg aat aca gcc att aat aac Trp Asp Arg Gin Thr Lys Val Asn Thr Ala lie Asn Asn, 405 410 aat aat atl ccg get aca gcg gtt gtg etc gaa cag tgg Asn Asn lie Pro Ala Thr Ala Val Val Leu Glu Gin Trp 420 425 aac aeg ttt tat att ttc aat gal gee acc tat acc ccg Asn Thr Phe Tyr lie Phe Asn Asp Ala Thr Tyr Thr Pro 435 440 445 agt get gcg cat gee tat acc gat ttc act ttc ccg aca Ser Ala Ala His Ala Tyr Thr Asp Phe Thr Phe Pro Thr 450 455 460 tgg aeg gat cca aaa gcg atg gca gac aat gtg cat aac Trp Thr Asp Pro Lys Ala Met Ala Asp Asn Val His Asn 465 470 475 aag ctg gtg ett tgg cag gtc cct att cag aaa tgg act Lys Leu Val Leu Trp Gin Val Pro lie Gin Lys Trp Thr 485 490 tat acc cag aaa gat aat gat gaa gee tat atg aeg get Tyr Thr Gin Lys Asp Asn Asp Glu Ala Tyr Mel Thr Ala 500 505 gca gtt ggc aac ggl age gga ggc cag tac agg ata cct Ala Val Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gin Tyr Arg lie Pro 515 520 525 tgg ttc gag aac agt ttg ctg ett gal ttt aeg aat aeg Trp Phe Glu Asn Ser Leu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Thr 530 535 540 aac tgg tgg atg tet aaa ege get tat ctg ttt gat ggt Asn Trp Trp Met Ser Lys Arg Ala Tyr Leu Phe Asp Gly 545 550 555 gac ggc ttc aaa aca gat ggc ggt gaa atg gta tgg ggt Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp Gly 565 570 get aac gag Ala Asn Glu 400 gcg aac tee Ala Asn Ser 415 agt gat gag Ser Asp Glu 430 aaa aeg ggc Lys Thr Gly tet ggg aga Ser Gly Arg aat ggg atg Asn Gly Met 480 tea aeg ccc Ser Thr Pro 495 cag aat tat Gin Asn Tyr 5l〇 tea gga caa s^r Gly Gin gcc gee aaa Ala Ala Lys gtS ggt ate Val Gly lie 560 cgc tea aat Arg Ser Asn 575 1440 1488 1536 1584 1632 1690 1728 1776 1824 1872 1920 1968 請先閲讀背之注意事項再填馬本頁 f 訂 90 ^ 588110

2016 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（财） ’ act ttc tea aac ggt aag aaa ggc aat gaa atg ege aat caa tac ccg Thr Phe Ser Asn Gly Lys Lys Gly Asn Glu Met Arg Asn Gin Tyr Pro 580 585 590 aat gag tat gtg aaa gee tat aac gag tac geg ege teg aag aaa gee Asn Glu Tyr Val Lys Ala Tyr Asn Glu Tyr Ala Arg Ser Lys Lys Ala 595 600 605 gat geg gtc tee ttt age cgt tee ggc aeg caa ggc gca cag geg aat Asp Ala Yal Ser Phe Ser Arg Ser Gly Thr Gin Gly Ala Gin Ala Asn 610 615 620 cag att tic tgg tee ggt gac caa gag teg aeg ttt ggt get ttt caa Gin He Phe Trp Ser Gly Asp Gin Glu Ser Thr Phe Gly Ala Phe Gin 625 630 635 640 caa get gtg aat gca ggg ett aeg gca agt atg tet ggc gtl ect tat Gin Ala Val Asn Ala Gly Leu Thr Ala Ser Met Ser Gly Val Pro Tyr 645 650 655 tgg age tgg gat atg gca ggc ttt aca ggc act tat cca aeg get gag Trp Ser Trp Asp Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Ala Glu 660 665 670 Itg tac aaa egl get act gaa atg get get ttt gca ccg gtc atg cag Leu Tyr Lys Arg Ala Thr Glu Met Ala Ala Phe Ala Pro Yal Met Gin 675 680 685 ttt cat tee gag let aac ggc age tet ggt ate aac gag gaa cgt tet Phe His Ser Glu Ser Asn Gly Ser Ser Gly He Asn Glu Glu Arg Ser 690 695 700 cca tgg aac gca caa geg cgt aca ggc gac aat aeg ate att agt cat Pro Trp Asn Ala Gin Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr Ile He Ser His 705 710 715 720 ttt gee aaa tat aeg aat aeg ege atg aat ttg ett cct tat att tat Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro Tyr He Tyr 725 730 735 age gaa geg aag atg get agt gat act ggc gtt ccc atg atg ege gee Ser Glu Ala Lys Met Ala Ser Asp Thr Gly Val Pro Met Met Arg Ala 740 745 750 atg geg ett gaa tat ccg aag gac aeg aac aeg tac ggt ttg aca caa Met Ala Leu Glu Tyr Pro Lys Asp Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Thr Gin 755 760 765 cag tat atg ttc gga ggt aat tta ett att get cct gtt atg aat cag 2064 2112 2160 2208 2256 2304 2352 2400 2448 2496 2544 2592 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T • I - I 1^1 表纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 588110 袖/27 B7 五、發明説明（朽） ^

Gin Tyr Met Phe Gly Gly Asn Leu Leu lie Ala Pro Yal Met Asn Gin 770 775 780 gga gaa aca aac aag agt att tat ctt ccg cag ggg gat tgg ate gat 2640

Gly Gill Thr Asn Lys Ser lie Tyr Leu Pro Gin Gly Asp Trp lie Asp (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 785 790 795 800 ttc tgg ttc ggt get cag cgt cct ggc ggt ega aca ate age tac aeg 2688

Phe Trp Phe Gly Ala Gin Arg Pro Gly Gly Arg Thr lie Ser Tyr Thr 805 810 815 gcc ggc ate gal gat eta ccg gtt ltt gtg aag ttt ggc agt att ctt 2736

Ala Gly lie Asp Asp Leu Pro Val Phe Yal Lys Phe Gly Ser lie Leu 820 825 830 ccg atg aat ttg aac geg caa tat caa gtg ggc ggg acc att ggc aac 2784

Pro Met Asn Leu Asn Ala Gin Tyr Gin Val Gly Gly Thr lie Gly Asn 835 840 845 age ttg aeg age tac aeg aat etc geg ttc ege att tat ccg ctt ggg 2832

Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Asn Leu Ala Phe Arg lie Tyr Pro Leu Gly 850 855 860 aca aca aeg tac gac tgg aai gat gat att ggc ggi teg gtg aaa acc 2880

Thr Thr Thr Tyr Asp Trp Asn Asp Asp lie Gly Gly Ser Val Lys Thr 865 870 875 880 ata act tet aca gag caa tat ggg ttg aat aaa gaa acc gtg act gtt 2928 lie Thr Ser Thr Glu Gin Tyr Gly Leu Asn Lys GIu Thr Yal Thr Val 885 890 895 cca geg att aat tet acc aag aca ttg caa gtg ttl aeg act aag cct 2976

Pro Ala lie Asn Ser Thr Lys Thr Leu Gin Yal Phe Thr Thr Lys Pro 900 905 910 tee tet gta aeg gtg ggt ggt tet gtg atg aca gag tac agt act tta 3024 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Ser Ser Yal Thr Yal Gly Gly Ser Val Met Thr Glu Tyr Ser Thr Leu 915 920 925 act gcc eta aeg gga geg teg aca ggc tgg tac tat gat act gta cag 3072

Thr Ala Leu Thr Gly Ala Ser Thr Gly Trp Tyr Tyr Asp Thr Val Gin 930 935 940 aaa ttc act tac gtc aag ctt ggt tea agt gca tet get caa tee gtt 3120

Lys Phe Thr Tyr Yal Lys Leu Gly Ser Ser Ala Ser Ala Gin Ser Yal 945 950 955 960 gtg eta aat ggc gtt aat aag gtg gaa tat gaa gca gaa ttc ggc gtg 3168

Val Leu Asn Gly Val Asn Lys Yal Glu Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Val 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製鄉/27 ____ B7 五、發明説明（V) ^ 965 970 975 caa age ggc gtl tea aeg aac aeg aac cat gca ggt tat act ggt aca 3216 Gin Ser Gly Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Thr 980 985 990 gga ttt gtg gac ggc ttt gag act ett gga gac aat gtt get ttt gat 3264 Gly Phe Yal Asp Gly Phe Glu Thr Leu Gly Asp Asn Yal Ala Phe Asp 995 1000 1005 gtt tee gtc aaa gee gca ggt act tat aeg atg aag gtl egg iat tea 3312 Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Met Lys Yal Arg Tyr Ser 1010 1015 1020 tee ggt gca ggc aat ggc tea aga gee ate tat gtg aat aac acc aaa 3360 Ser Gly Ala Gly Asn Gly Ser Arg Ala lie Tyr Val Asn Asn Thr Lys 1025 1030 1035 1040 gtg aeg gac ett gee ttg ccg caa aca aca age tgg gat aca tgg ggg 3408 Yal Thr Asp Leu Ala Leu Pro Gin Thr Thr Ser Trp Asp Thr Trp Gly 1045 1050 1055 act get aeg ttt age gtc teg ctg agt aca ggt etc aac aeg gtg aaa 3456 Thr Ala Thr Phe Ser Val Ser Leu Ser Thr Gly Leu Asn Thr Val Lys 1060 1065 1070 gtc age tat gat ggt acc agt tea ett ggc att aat ttc gat aac ate 3504 Val Ser Tyr Asp Gly Thr Ser Ser Leu Gly lie Asn Phe Asp Asn lie 1075 1080 1085 geg att gta gag caa taa 3522 Ala lie Yal Glu Gin 1090 aaggtcggga gggcaagtcc ctcccttaat ttetaatega aagggagtat ccttgatgcg 3582 tccaccaaac aaagaaattc cacgtattct tgcttttttt acagcgttta cgttgtttgg 3642 ttcaaccctt gccttgcttc ctgctccgcc tgcgcatgcc tatgteagea gcctaggaaa 3702 tctcatttct tcgagtgtca ccggagatac ettgaegeta actgitgata acggtgcgga 3762 geegagtgat gacctcttga ttgltcaagc ggtgcaaaac ggtattttga aggtggatta 3822 tcgtccaaat ageataaege egagegegaa gaegeegatg ctggatc 3869 l------------Ί,--IT------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

<210> 16 <211> 4986 <212> DNA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 O X 297公釐） 93 588110 51/27. _ B7 ___ 五、發明説明（W ) * <213> Microorganism <220>

<221〉 CDS 〈222> (667)·· (3948) <400> 16 gagctcggga agaacccgtc cctgcaagct tggacgcagg cggtggagga ggcgggagtc 60 tacatcgctt ccgctatggc aggggctggg ggaggtgcat acggcttgat cggccactgc 120 tggggagggc tgctggcgtt cgagaccggc cactggctga aggcltgcgg gatgcaggag 180 ccgacgcatc tgttcgtgtc cgggtgcagc ccgccccatc tgctgcaagc gcggccggac 240 ttgggaacgg gaccatccgg cccggclccg ctccccgatg cctgccggat cgcccaagcg 300 taccgtatgc cttccaggcg cgggccgctg cttgcccggc tgagtgtatt cgccggccgc 360 cgagacccgg gcgtgtatgt ggatagtttg gccgaatggg gccgctatac ggcccgcata 420 tgcgatgttc atattggcga gggcgggcat gcagattggg gacctgatgc agaccgttgg 480 ctgccattcg tgcaaatgat tgcggagagg gaataltcgt cttcttgaag ccaggtgacc 540

Icagaiaaga tglcgcacta agcigtatag tticggaagg gaggtgaggc agagaagcgc 600 accatgagct gttagcttga cgtttaacgg tcaaaaccaa ttttactttg ggaaggagca 660 708 756 804 852 900 948 996 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） l--------•衣----Ί 祖——IT------Φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) agattt atg cat gga aga aac ata ccg aga ccc ate aag etc att gtt Met His Gly Arg Asn lie Pro Arg Pro lie Lys Leu lie Val 1 5 10 tet tgg ctg ctg att ttc ttt tta atg gtg cca age ate tat gca att Ser Trp Leu Leu lie Phe Phe Leu Met Val Pro Ser lie Tyr Ala lie 15 20 25 3〇 gac ggc gta tac cac geg cct tac ggg ate gac gat ett tat gag att Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly lie Asp Asp Leu Tyr Glu lie 35 40 45 cag geg aeg gag ege agt ccg aga gac cct gtg gcc ggg gag aeg gtg Gin Ala Thr Glu Arg Ser Pro Arg Asp Pro Yal Ala Gly Glu Thr Val . 50 55 60 tat ate aaa ate aca aca tgg ccg ate gag ccc gga cag aeg gca tgg Tyr lie Lys lie Thr Thr Trp Pro lie Glu Pro Gly Gin Thr Ala Trp 65 70 75 P gtg acc tgg aeg aaa aac ggc gtc gcc cag ccg geg gtc ggt gcc gcc Yal Thr Trp Thr Lys Asn Gly Yal Ala Gin Pro Ala Val Gly Ala Ala 80 85 90 tac aag tac aac age ggc aac aac acc tac tgg gag gCg aac ctg Tyr Lys Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu Gly 95 100 105 m 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 94 588110 M/27 B7 五、發明説明（72 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 age ttc Ser Phe gac ggt Asp Gly gac tgg Asp Trp cgt gtc Arg Yal 160 ate aac lie Asn 175 cct aeg Pro Thr aeg gac Thr Asp aag gtg Lys Val aeg aeg Thr Thr 240 get tgg Ala Trp 255 ttc tac Phe Tyr aac aac Asn Asn cag lac gee aaa Ala Lys gee aat Ala Asn 130 gaa tac Glu Tyr 145 ctg ctg Leu Leu att teg He Ser gga teg Gly Ser agt geg Ser Ala 210 gat aag Asp Lys 225 ctg ate Leu lie gga gac Gly Asp 115 gaa aaa Glu Lys gtc age Val Ser aat geg Asn Ala ttc aeg Phe Thr 180 ggg aeg Gly Thr 195 tee aeg Ser Thr aat ccg Asn Pro geg ege Ala Arg ctg acc aat ggc Leu Thr Asn Gly 260 teg ccg geg tee Ser Pro Ala Ser 275 ttc ege aag ege Phe Arg Lys Arg 290 aaa aat caa aac gta att Yal lie aeg gee Thr Ala age ate Ser lie 150 gtg ccg Val Pro 165 geg gac Ala Asp ttg age Leu Ser gee tgg Ala Trp ttc aaa Phe Lys 230 cag tat Gin Tyr 245 age act Ser Thr tee tac Ser Tyr 120 gga ccg Gly Pro 135 ggc teg Gly Ser aac aeg Asn Thr gat gtg Asp Val aeg ggc Thr Gly 200 ate tet lie Ser 215 ctg age Leu Ser gac age Asp Ser gtc ate Val lie acc gtt Thr Val ttc acc Phe Thr gtc aeg Val Thr ggg aeg Gly Thr 170 ttc ege Phe Arg 185 ctg agt Leu Ser aca tee Thr Ser gtg tac Val Tyr aeg gee Thr Ala 250 aat aaa Asn Lys 265 ggc ttc Gly Phe gag gag ttt ttc Glu Glu Phe Phe 280 gga acc gac gtg gac aeg Gly Thr Asp Val Asp Thr 295 gac ege acc tat atg gca ege ggc Arg Gly ttt acc Phe Thr 140 aat aac Asn Asn 155 ctg lee Leu Ser gtt cag Val Gin aat ttt Asn Phe aaa tta Lys Leu 220 aag ccg Lys Pro 235 aac ege Asn Arg ate gag lie Glu ggg gag Gly Glu tat gtc Tyr Val 300 ate ccc aat aag Asn Lys 125 gta acc Val Thr aeg aac Thr Asn ccc aag Pro Lys etc tee Leu Ser 190 acc gtc Thr Yal 205 aag ctg Lys Leu gac ggc Asp Gly aat etc Asn Leu gac cac Asp His 270 ege tac Arg Tyr 285 tac aai Tyr Asn 1044 1092 1140 1188 1236 1284 1332 1380 1428 1476 1524 1572 ttc atg 1620 請先閱讀背之注意事項再 i 费訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 95 588110 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（？5 Gin Tyr Lys Asn Gin 305 ctg aac age age ggg tac ggt Leu Asn Ser Ser Gly Tyr Gly 320 325 aaa ttc ege ttg gca act gag Lys Phe Arg Leu Ala Thr Glu 335 340 gat acc ggg ggc age gee aat Asp Thr Gly Gly Ser Ala Asn 355 ggc aat gac ttg aag ggc gtc Gly Asn Asp Leu Lys Gly Val 370 aag ccg get get ctg ccc aaa Lys Pro Ala Ala Leu Pro Lys 385 aat gag tgg gac egg caa tee Asn Glu Trp Asp Arg Gin Ser 400 405 aat aeg aac aac ate ccg geg Asn Thr Asn Asn lie Pro Ala 415 420 gac gag aat aeg ttc tat atg Asp Glu Asn Thr Phe Tyr Met 435 cct ggc ggc age aca cac tee Pro Gly Gly Ser Thr His Ser 450 ggc egl tgg ccg aat ccg aag Gly Arg Trp Pro Asn Pro Lys 465 ggg atg aag ctg gtg ctg tgg Gly Met Lys Leu Val Leu Trp 480 485 get cct cat ctg cag aag gac Ala Pro His Leu Gin Lys Asp

Asn Asp Arg Thr Tyr 310 ate ttc gta He Phe Val ege tee gat Arg Ser Asp teg aeg ctg Ser Thr Leu 360 gtc age aat Val Ser Asn 375 tgg geg ttt Trp Ala Phe 390 aaa gta geg Lys Val Ala aeg gee gtc Thr Ala Val ttc aac gat Phe Asn Asp 440 lat aeg gac Tyr Thr Asp 455 caa atg geg Gin Met Ala 470 cag gtg ccg Gin Val Pro aac gac gaa Asn Asp Glu 勒/27, B7 Met Ala He Pro Phe Met 315 aeg Uc Uc tee Thr Tyr Tyr Ser aac tee Asn Ser 330 atg tac Met Tyr 345 gat tac Asp Tyr tat geg Tyr Ala ggc etc Gly Leu act geg Thr Ala 410 gtg ctg Val Leu 425 geg cag Ala Gin tat ate Tyr lie gat aat Asp Asn att cag lie Gin 490 age tat Ser Tyr 1668 agt ttt Ser Phe lac ttt Tyr Phe aac ate Asn lie 380 tgg atg Trp Met 395 ate aat lie Asn gag cag Glu Gin tat aeg Tyr Thr ttc ccg Phe Pro 460 gta cac Val His 475 aaa tgg Lys Trp aeg gee Thr Ala 350 att tac lie Tyr 365 aca ggc Thr Gly teg gee Ser Ala aac gee Asn Ala tgg agt Trp Ser 430 gee aaa Ala Lys 445 geg gee Ala Ala agt aac Ser Asn acc gee Thr Ala 1716 1764 1812 1860 1908 1956 2004 2052 2100 2148 ι·-------------r——IT------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) atg ate geg caa Met lie Ala Gin 2196 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x 297公羡） -96 I588110 靡7 B7 五、發明説明（矜經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 495 aat tat Asn Tyr ggg caa Gly Gin gcc aaa Ala Lys ggc ate Gly lie 560 tgg aac Trp Asn 575 tac ccg Tyr Pro aaa age Lys Ser geg aat Ala Asn ttc cag Phe Gin 640 ccg tat Pro Tyr 655 gcc gag Ala Glu atg cag Met Gin gee gta ggc Ala Yal Gly 515 tgg tt丨 gag Trp Phe Glu 530 aac tgg tgg Asn Trp Trp 545 gac ggg ttc Asp Gly Phe aeg ttc gcc Thr Phe Ala aac gat tac Asn Asp Tyr 595 gat gcc gtc Asp Ala Val 610 cag ale ttc Gin lie Phe 625 caa gcc gtc Gin Ala Val tgg age tgg Trp Ser Trp eta tat aaa Leu Tyr Lys 675 ttc cac tee Phe His Ser 690 500 aac ggc Asn Gly aac age Asn Ser atg tee Met Ser aag aeg Lys Thr 565 aat ggc Asn Gly 580 gtg aag Val Lys age ttc Ser Phe tgg tee Trp Ser cag geg Gin Ala 645 gac ttg Asp Leu 660 ege geg Arg Ala gaa gcc Glu Ala age gga Ser Gly ctg ctg Leu Leu 535 aag ege Lys Arg 550 gac gga Asp Gly aaa aaa Lys Lys gcc tac Ala Tyr age cgt Ser Arg 615 ggt gac Gly Asp 630 gga ctg Gly Leu get gga Ala Gly aeg gca Thr Ala aac ggc Asn Gly 695 505 ggc cag tac Gly Gin Tyr 520 ctg gac lie Leu Asp Phe gcc tat ctg Ala Tyr Leu ggg gag atg Gly Glu Met 570 ggc gat gaa Gly Asp Glu 585 aac gaa tat Asn Glu Tyr 600 teg ggc aeg Ser Gly Thr cag gaa teg Gin Glu Ser acc gca ggc Thr Ala Gly 650 ttc acc ggc Phe Thr Gly 665 atg teg gca Met Ser Ala 680 agt tee ggc Ser Ser Gly ege ate Arg He aeg aac Thr Asn 540 Itt gat Phe Asp 555 gtc tgg Val Trp atg ege Mel Arg geg ege Ala Arg caa ggg Gin Gly 620 aeg ttc Thr Phe 635 ttg tee Leu Ser 510 ect age Pro Ser 525 ccg age Pro Ser ggc gtc Gly Val ggc ege Gly Arg aac cag Asn Gin 590 teg aag Ser Lys 605 geg caa Ala Gin ggt gcc Gly Ala ggc gtt Gly Yal 2244 2292 2340 2388 2436 2484 2532 2580 2628 I. \ 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 get tat ccg teg Ala Tyr Pro Ser 670 ttt gcc ccg att Phe Ala Pro lie 685 ate aat gag gag lie Asn Glu Glu 700 2676 2724 2772 、紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（2i〇x 297公釐 -97 588110 ) 紹I2T B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（β) * egg tee ccg tgg aat get cag gee egg act ggc gac aac aeg ate ate 2820 Arg Ser Pro Trp Asn Ala Gin Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr He He 705 710 715 age cal tit gee aag tat aeg aac acc egg atg aac ctg ett cct tal 2868 Ser His Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro Tyr 720 725 730 att tac age gag get aaa gca gca age gat act ggc gtg ccg atg atg He Tyr Ser Glu Ala Lys Ala Ala Ser Asp Thr Gly Val Pro Met Met 735 740 745 750 ege geg atg geg ctg gag tat ccg age gat acc cag aeg tac gga ttg Arg Ala Met Ala Leu Glu Tyr Pro Ser Asp Thr Gin Thr Tyr Gly Leu 755 760 765 aeg cag cag tac atg ttc ggc ggc age ctg ctg gtg geg cct gtc ttg Thr Gin Gin Tyr Met Phe Gly Gly Ser Leu Leu Yal Ala Pro Val Leu 770 775 780 aac caa ggc gag aeg aal aag aat ate tac ett ccg caa gga gat tgg Asn Gin Gly Glu Thr Asn Lys Asn lie Tyr Leu Pro Gin Gly Asp Trp 785 790 795 ate gac ttc tgg ttc ggc geg cag cgt ccg ggc ggg ega aeg ate age 3108 lie Asp Phe Trp Phe Gly Ala Gin Arg Pro Gly Gly Arg Thr lie Ser 800 805 B10 tac tac geg ggc gtg gac gat ett ccc gtc ttc gtg aag tee ggc age Tyr Tyr Ala Gly Val Asp Asp Leu Pro Val Phe Val Lys Ser Gly Ser 815 820 825 830 ate ctg ccg atg aat ctg aac ggg cag tat cag gtt ggc ggc aeg ate lie Leu Pro Met Asn Leu Asn Gly Gin Tyr Gin Val Gly Gly Thr lie 835 840 845 ggc aac age ttg acc gee tac aac aac ctg aeg ttc egg att tat cca 3252 Gly Asn Ser Leu Thr Ala Tyr Asn Asn Leu Thr Phe Arg lie Tyr Pro 850 855 860 λ 〇 Λ Π ctg ggt aeg aeg aeg tac age tgg aat gat gac ate ggc ggc teg gtS 0 Leu Gly Thr Thr Thr Tyr Ser Trp Asn Asp Asp lie Gly Gly Ser Val 865 870 875 aag aeg att aeg teg aca gag cag tal gga ctg aat aaa gag aeg gtS 3348 Lys Thr lie Thr Ser Thr Glu Gin Tyr Gly Leu Asn Lys Glu Thr Val 880 885 890 3396 aeg ett ccg geg ate aac teg geg aag aeg etc cag gtg ttc aeg ^cc 2916 2964 3012 3060 3156 3204

國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） )--------φ^—----Γ---IT------φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 588110 267/27, B7 五、發明説明（V) *

Thr Leu Pro Ala lie Asn Ser Ala Lys Thr Leu Gin Val Phe Thr Thr 895 900 905 910 aag ccg teg teg gtg acg ctg ggc ggc acg gcc etc acc gcg cat age 3444

Lys Pro Ser Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Ala Leu Thr Ala His Ser 915 920 925 aca tta age gca ttg ate ggc get tee tee ggc tgg tat tac gat aeg 3492

Thr Leu Ser Ala Leu lie Gly Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Asp Thr 930 935 940 gtg caa aag etc gee tat gtg aag etc ggc gee age tea teg geg caa 3540

Val Gin Lys Leu Ala Tyr Val Lys Leu Gly Ala Ser Ser Ser Ala Gin 945 950 955 acc gtc gtg ett gac ggc gtc aac aag gtc gag tat gag get gag ttc 3588

Thr Val Val Leu Asp Gly Val Asn Lys Val Glu Tyr Glu Ala Glu Phe 960 965 970 ggc aca ett acc ggc gtc aeg acc aat aeg aat cal gee ggc tat atg 3636

Gly Thr Leu Thr Gly Val Thr Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Met 975 980 985 990 ggt acc ggc ttt gtc gac ggc ttc gat geg gca ggc gat gca gtg acc 3684

Gly Thr Gly Phe Yal Asp Gly Phe Asp Ala Ala Gly Asp Ala Val Thr 995 1000 1005 ttc gac gta lee gtc aaa geg gee ggc aeg tat geg etc aag gtc egg 3732

Phe Asp Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Ala Leu Lys Val Arg 1010 1015 1020 tac get tee get ggt ggc aac get tea ege get ate tat gtc aac aac 3780

Tyr Ala Ser Ala Gly Gly Asn Ala Ser Arg Ala lie Tyr Yal Asn Asn 1025 1030 1035 gee aag gtg acc gat ctg geg ett ccg gca aeg gee aac tgg gac acc 3828

Ala Lys Val Thr Asp Leu Ala Leu Pro Ala Thr Ala Asn Trp Asp Thr 1040 1045 1050 tgg ggg aeg gca acc gtc aac gta gee tta aac gee ggc tac aac teg 3876

Trp Gly Thr Ala Thr Val Asn Val Ala Leu Asn Ala Gly Tyr Asn Ser 1055 1060 1065 1070 ate aag gtc age tac gac aac acc aat aeg etc ggc att aat etc gat 3924 lie Lys Val Ser Tyr Asp Asn Thr Asn Thr Leu Gly He Asn Leu Asp 1075 1080 1085 aac att geg ate gtg gag cat tga 3948

Asn lie Ala lie Val Glu His ------—__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - - I -- - i, I 11— - - m I -1: I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 99 588110 ^7/27 B7 五、發明説明（w) 4 1090 cagcaggaal cttcgcgagg aatgagttag cgaagagttc atgcaggcag aggggttacc 4008 cataatlgta aagcccggcg cagccaggca ccaagtatgc ccgggagggc cgccggccct 4068 ccctttattt caatgalgaa aggcggcatc gatatgggtc talggaacaa acgagtcact 4128 cgcalcctct ccgtaclcgc agcaagcgcg ctgatcggct ctaccgtacc ttctctagcg 4188 ccacctcccg ctcaagccca tgtgagcgcg ctgggcaacc tgctttcctc ggcggtgacc 4248 ggggatacgc tcacgctgac gatcgataac ggcgcggaac cgaatgacga tattctaglt 4308 ctgcaagcag tccagaacgg tattctgaag gtggactacc ggccgaacgg tgtagctcca 4368 agcgcggata cgccgatgct ggatcccaat aaaacctggc cgtccatagg cgccgttatc 4428 aatacagcct ctaatccgat gacgatcaca acgccggcga tgaagattga gattgccaaa 4488 aatccggtgc gcclgaccgt gaaaaaaccg gacggcaccg ctctgttatg ggaacccccg 4548 accggcggcg tcttctcgga cggcgtccgt ttcttgcacg ggacgggcga caatatgtac 4608 ggcatccgca gcttcaatgc ttttgacagc ggcggggatc tgctgcgcaa cagctccacc 4668 caagccgccc gtgcaggcga ccagggcaac tccggcggcc cgclgatctg gagcacagcc 4728 gggtacgggg tgctcgttga cagcgacggt gggtatccgt tcacggacga ggctaccggc 4788 aagctggagt tctattacgg cggcacgcct ccggaaggcc ggcgctatac gaagcaggat 4848 gtggagtact acatcatgct cggcacgccg aaagagatca tgtccggcgt cggggaaatt 4908 acgggcaaac cgccgatgct gcccaagtgg tccctgggct ttatgaactt cgagtgggat 4968 ctgaatgaag ctgagctc 4986 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家榡準（cns ) A4規格（2iox297公釐） 100 一

Claims

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公告本六、申請專利範圍第90 1 28473號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國93年4月19日修正 1·一種多肽，其特徵爲藉由α-異麥芽糖基轉移自做爲非還原末端的結合樣式具有α — 1 ，6 —葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α — 1 ，4 -葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲3以上之糖質，藉由α -異麥芽糖基轉移可生成具有環{-6 } - α — D -吡喃葡糖基一（1— 3) - a — D -吡喃葡糖基—（1 — 6) —α —D —卩比喃葡糖基一（1— 3) - α — D—d比喃葡糖基一 (1 —)構造的糖質’其具有酵素活性，且具有序列表中序列1或2所示胺基酸序列，或此等胺基酸序列中，1或複數個胺基酸爲缺失、取代、或附加之胺基酸序列者。 2 ·如申請專利範圍第1項之多肽，其爲具有以下理化學性質者， (1 )分子量藉由S D S —聚丙烯醯胺膠電泳法測出其爲 82 ，〇0〇〜132 ，〇〇〇達爾頓 (2 )最適溫度 p Η 6 · 0，反應3 0分鐘時5 0 t (3 )最適P Η 35°C反應3〇分鐘時ρΗ5 . 5〜6 . 〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210Χ297公釐） -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 588110 A8 B8 C8 D8 ___ 六、申請專利範圍2 (4 )溫度安定性 P Η 6 · .0，保持6 0分鐘，於4 5 °C下具有溫度安定領域 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (5 ) p Η安定性 4 °C保持2 4小時，於ρ Η 4 · 5〜1 〇 · 〇範圍內爲安定之ρ Η領域。 3 · —種D N A，其特徵爲可編碼如申請專利範圍第 1項或第2項之多肽者。 4 ·如申請專利範圍第3項之D N A，其爲含有序歹U 表中序列3或4所示鹼基序列，或此等鹼基序列中，1或複數個鹼基爲缺失、取代、或附加之鹼基序列，或與此等相輔之鹼基序列或根據基因之簡倂使此等之鹼基序列中之 1或複數個在不改變其編碼之胺基酸序列下以其他鹼基取代之鹼基序列者。 5 ·如申請專利範圍第3項或第4項之D N A，其中根據基因密碼之簡倂，在不改變序列表中序列1或2所示胺基酸序列之下，將1或複數個序列表中序列3或4所示鹼基序列中之鹼基以其他鹼基取代者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 .如申請專利範圍第3項或第4項之 DN A，其爲來自孢芽桿菌屬之微生物者。 7 · —種可複製之重組DNA，其特徵爲包含如申請專利範圍第3項至第6項中任一項之D N A，與可自主複製之載體所成者。 8 ·如申請專利範圍第7項之可複製之重組d N A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格( 210X297公羡） ----- 588110 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍其中該可自主複製之載體爲質粒載體Bin escript Π SK( + ) ο (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 . 一種轉形體，其特徵爲將如申請專利範圍第7項或第8項之重組DNA導入適當之宿主所成者。 1〇·如申請專利範圍第9項之轉形體，其中宿主爲大腸菌。 1 1 · 一種多肽之製造方法，其特徵爲培養如申請專利範圍第9項或第1 0項之轉形體，自該培養物採取如申請專利範圍第1項或第2項之多肽者。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之多肽之製造方法，其中以一種或二種以上選自離心分離、過濾、濃縮、鹽析、透析、分離沈澱、離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和性層析、凝膠電泳及等電點電泳之方法予以採取培養物中之如申請專利範圍第1項或第2項之多肽者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 3 · —種具有環{ — 6丨一 α — D -吡喃葡糖基— (1 — 3) — a — D -卩比喃葡糖基—（1 — 6) - a — D —吡喃葡糖基一（1 -> 3 ) - a - D -吡喃葡糖基一（1 ->)之構造之糖質的製造方法，其特徵爲包含使如申請專利範圍第.1項或第2項之多肽作用於做爲非還原末端的結合樣式具有a - 1 ，6 -葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有a - 1 ，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度爲3以上之糖質，以生成具有環{->6 } — a — D 一吡喃葡糖基一（1 — 3 ) — a - D -吡喃葡糖基—（1 —6 ) — a - D - 吡喃葡糖基—（1 — 3 ) — a — D —吡本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 588110 申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 喃葡糖基一（1 -> )之構造之糖質的步驟者。 1 4 ·如申請專利範圍第1 3項之具有環{ 6丨一 α - D -吼喃葡糖基一（丄—3 ) — α — d 一吡喃葡糖基一（1 — 6) — α — D - 吡喃葡糖基—（1— 3) — D —吡喃葡糖基一（1 —)之構造之糖質的製造方法，其中做爲非速原末端的結合樣式具有α 一 1 ，6 一葡萄糖基結合’做爲非還原末端以外的結合樣式具有α 一 1 ，4 — 葡萄糖基結合、.葡萄糖聚合度爲3以上之糖質爲以^ 一配糖酶、糊精葡聚糖酶、α 一異麥芽糖葡糖質生成酶使澱粉、澱粉質或以酸及/或澱粉酶部份水解者糖轉移所成者。 1 5 ·如申請專利範圍第1 3項或第1 4項之具有環 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 6 } — α — D -吡喃葡糖基—（丄―3) 一 a D 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製吡喃葡糖基一（1 — 6) - a — D—吡喃葡糖基一（丄― 3 ) — a — D —吡喃葡糖基一（1 —丨之構造之糖質的製造方法，其中做爲非還原末端的結合樣式具有α 一 1 ，6 一葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有^ 一 1 ，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度爲3以上之糖質爲使支鏈澱粉在/3 -澱粉酶與支鏈澱粉酶共存下水解後所得者。 1 6 ·如申請專利範圍第1 3項或第14項之具有環{ —6} — α - D —吡喃葡糖基一（1—3) — a — D—吡喃葡糖基一（1 — 6 ) —α - D -吡喃葡糖基一（1— 3 )一 α - D -吡喃葡糖基—（1 —)之構造之糖質的製造方法’其中做爲非速原末端的結合樣式具有a ~ 1 ，6 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） 588110 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍葡萄糖基結合，做爲非還原末端以外的結合樣式具有α -1 ，4 -葡萄糖基結合、葡萄糖聚合度爲3以上之糖質爲 62 —〇一 α —葡萄糖基麥芽糖、63 —〇一 α —葡萄糖基麥芽三糖、64 -〇一 α -葡萄糖基麥芽四糖及/或65 — 〇一α—葡萄糖基麥芽五糖。 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）