TW557213B - Pharmaceutical composition for treating chronic progressive vascular scarring diseases - Google Patents

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經滴部中央標準局員工消費合作社印製 557213 A7 ---^______ 五、發明説明（1 ~ ~ t明背景 、本發明係關於用以治療慢性進行性血管瘢痕疾病之方 法及藥學組成物。 I知技術之斂诫 慢性進行性血管瘢痕疾病（CPVSD)為一種由數個困擾 已發展國家之最平常疾病所構成的併發症，該等疾病包括

糖尿病、高血壓及各種血脂肪過多症等。目前對付CPVSD 之藥學療程係針對基礎病因。不幸地，就大部分而言，其 並未有習用之療法，或其控制甚難及於一般族群。此外， CPVSD通常隨著基礎病因接受藥物治療的時間而確立並擴

展。因此，對一嘗試著治療二次併發症的人而言，cpvsD 是最嚴重的，因為其會導致腎衰竭、中風、心臟病及視力 喪失。 一般而言，CPVSD係藉由血管平滑肌細胞之變化來鑑 定。主要變化之一為數量上之增加以及其等所合成之結締 組織的種類變化。此造成了瘢痕與功能上之顯著變化。在 血茇中，此造成彈性喪失，而致使血管不會舒張與收縮， 並具有變厚之管壁與變窄之管腔。最終結果是降低血液流 動或完全阻塞。由此等病態生理學方法所鑑定出之血管瘢 痕疾病的例子包括慢性進行性腎小球病，例如糖尿病引發 性腎小球硬化（瘢痕）；腎臟移植後之進行性腎衰竭·，對罹 患末期腎病且利用血液透析來進行治療之病人提供血管通 路所使用的分流道產生閉合；其他慢性小血管疾病（諸如 在發生在某些患有高血壓之病人者）；已接受冠狀動脈繞 _ -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^ -- --------^裝--,----訂--------Ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 557213 A7 ——〜一 ___B7 五、發明説明（2 ) ^ 一 — 道手術之病人所復發的狹窄症；以及糖尿病性視網膜病 變。 針對CPVSD之任何治療的藥學目標皆需降低已形成之 過置胞内基質（瘢痕），俾以恢復正常的血管能力與功能， 或至少避免或實質上減緩進一步之發展。但是，目前並沒 有干擾平滑肌組織代謝之不正常或調控結締組織之合成的 直接方法，縱使其等對慢性進行性疾病是重要的。此等疾 病之進行性已被認為是無法避免且不可逆的。 因此，特別重要的是，已發展出一種用於CPVSD之食 療法’較佳為有關於經口投予一種藉著使已形成之傷害退 化並降解而有效於治療及逆轉CPVSD的低毒性藥劑。 戊聚糖多硫酸酯（PPS)為一種高度硫醯化之半合成多 醣，其依分離方式之不同而具有一位在丨，5〇〇至6, 〇〇〇道爾 吞之範圍内的分子量。PPS可能屬於與肝燐脂及類肝燐脂 相同的一般性種類中，但PPS與肝燐脂在化學結構、生成 方法及物理化學性質上具有數個不同點。肝燐脂通常係由 諸如牛及豬之肌肉、肝臟及腸的哺乳類動物組織中分離出 來，但PPS為一種半合成化合物，其多聽主鏈（即聚木糠） 係由山毛櫸之樹皮或其他植物來源所萃取出，並隨後以諸 如氣確酸或亞硫醯三氣及酸的硫醯化劑處理之。經硫醯化 後’通常利用氫氧化鈉處理PPS，以生成其鈉鹽。 如下式所示， 本紙張尺度適用中Λ4規丨Gx 297j#_·)- (讀先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)

、1T Φ 557213 A7 B7 五、發明説明（3 ) COONa

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 0 — 脂 戊聚糖多硫酸酯 肝燐脂為一種由（D)-葡萄糖胺與（D)—葡萄糖醛酸（皆為六 石厌糖）之重覆性雙重糖單體所構成的硫醯化聚合物，且在 葡萄糖胺上具有一胺基功能性；pps為一種由呈呋喃糖環 形式之（D )-木糖（一種五碳糖）重覆性單一單體所構成的硫 醯化線性聚合物。肝燐脂係朝右旋方向旋轉平面偏極光， 但PPS係朝左旋方向旋光。 就生物性質之觀點而言，PPS可延長部分凝血致活酶 (thromboplastin)時間，並已被用以避免深度靜脈栓塞，但 其僅具有肝燐脂約1/5之抗凝血效力（參見Wardle，人//?ί· 允α·，20:361-370，1 992)。PPS亦經揭露可供用以 治療尿道感染及腸性膀胱炎（美國專利第5, 18〇, 715號）， 以及與一出血性類固醇共同供用以阻滯血管生成與微血 管、細胞或胞膜洩漏（美國專利第4, 820, 693號）。 一些研究者已發現，PPS可抑制平滑肌細胞增殖並降 低高血脂肪，基於此則暗示了，PPS可供用於預防性地抑 制動脈硬化蝕斑之生成，抑制腎小球膜細胞之增殖以及避 免膠原蛋白之生成及腎小球硬化（Paul eiW·， 77/royz/Z?. 价51· ,46:793-801，1987; Wardle，同前）。但是，在此之 前並無人針對諸如動脈硬化症的CPSVD瘢痕態樣（與抑制細 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 557213 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（4 )

胞增殖相反），或顯示其可用以m L J用Μ遏止及/或逆轉血管瘢痕， 即P P S並未被考量於此範圍。再本 丹者’習知技術對PPS在瘢痕 疾病上之可能應用的教示中，盔 τ 無一者為經由完整動物體所 產生的任何實質科學效力之數據所 ^ a ^ ^ ^ ^ m所支持，而是基於經常無 法預期活體内功效的動物組織活體外研究。 雖然目前已有將PPS應用在抑制纖維化與瘋痕形成的 揭示（參見例如Roufa Μ 3人，美國專利第56〇5 938號）， 但此等教示係針對纖維母細胞侵入皮膚與相關組織區域的 抑制，而非在病因與病理上皆極為不同的平滑肌細胞之瘋 痕疾病。 發明概述 本發明之目的在於提供一種治療cpvSD之方法，其不 僅遏止該疾病之進程，亦在實際上逆轉該進程，並使存在 的瘢痕或傷害退化。本發明之另一目的在於提供一種應用 一能商業上可獲得之藥劑的治療方法，該藥劑可藉由習知 方式投藥、無毒性、似乎不會引發嚴重的副作用且在治療 CPVSD上高度有效。 簡言之，為達成此等目的以及其他於此後將會變得明 確之目的，本發明之特徵在於揭露一種治療罹患cpvsD2 哺乳類患者的方法，以遏止該疾病之進展，並在受影響之 器官或脈管系統中消除或減輕已形成之瘢痕或纖維化損 害，該方法包含：將一含有一有效於血管瘢痕疾病之治療 量的戊聚糖多硫酸酯或其藥學上可接受之鹽的藥學組成物 投予一病人。PPS之經口投藥是投藥的較佳形式，例如呈 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 衣 - 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 五、發明説明（ 旋片、膠囊或液體者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1圖係反映藉由令1/10源自於一正常五週齡鼠之腎 J球進仃競爭性PCR來定量αιΐν型膠原蛋白之mRNA，其係 插述： a) 上圖為反應流程及經PCR擴增後被溴化乙錠所染色 之對應凝膠；以及 b) 下圖係描繪出突變株膠原蛋白⑼^相對於分別置入 9個含所有PCR試劑之試管中之突變株cDna用量的圖譜。 第2圖係描述：

a) 上圖顯示出源自於具有腎癌之腎切除檢體並被pAS 所木色之腎臟切片（A_正常腎小球組織；B-被標記之硬化 處）； b) 中圖（C-D)顯示出在相同腎臟中施用針對於第jy型 膠原蛋白之抗體的免疫螢光顯微法；以及 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 c) 下圖（E)顯示反映出相同腎臟之硬化指數的柱狀 圖’ a2lV型膠原蛋白cdna係藉由在5〇個經微切片之腎小 球存庫中進行競爭性pCR定量（數值為：145±22對 1(Η6±74χ1(Κ4渺莫耳/腎小球）來測定。 第3圖為相對於5位患有硬化症之病人而反映出5位未 患有腎小球硬化症之人類病人之腎臟中的硬化指數的柱狀 圖’其係以相對腎小球細胞數與α 2贝型膠原蛋白cDNA量 來表示 〇 球 第4圖為一柱狀圖，其反映出源自於患有膜性腎小 本紙張尺度適财HD家標準（CNS ) A4規格（2iQx 297公楚 557213 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 i、發明説明（6 ) 腎炎（MN)與糖尿病性腎病（dm)以及源自於罹患腎小球硬化 症（NX GS)與未罹患腎小球硬化症（Νχ NI)之人類病人中 a V a 3IV型膠原蛋白mRNA的相對比例。 第5圖為一反映出在正常腎小球膜細胞中pps鈉對DNA 合成之影響的柱狀圖’其係藉由滴定胸腺哺σ定之編納來測 定，並對應於PPS鈉濃度（/zg/ml)而描繪出每分鐘内於每 103個細胞中之滴定量。 第6圖為一反映出在正常腎小球膜細胞中pps鈉對細 胞生長之影響的柱狀圖，其係對應於添加之pps鈉濃度 (/zg/ml)而描繪出經三天培育後之細胞數目。 第7圖為一柱狀圖，其係比較在正常腎小球膜細胞 中，PPS鈉與肝燐脂（與未經處理之對照組）經五天培育後 對細胞生長之影響。 第8圖為一柱狀圖，其係比較出以血清與pps鈉進行 培育之細胞以及僅以血清進行培育之細胞中，正常腎小球 膜細胞相對於時間之增殖。 第9圖為一源自於正常腎小球膜細胞層imRNA數值的 圖譜，該腎小球膜細胞層係被暴露至PPS鈉歷時不同時間 再進行反轉錄，該圖譜反映出在ailV與型膠原蛋白 mRNA、膠原蛋白酶（金屬蛋白酶）72 kDa與92 kDa之mRNA、 生長因子TGF- 3之mRNA以及細胞蛋白質々—肌纖維蛋白之 mRNA量上的增加、減少或無變化。 第10圖為一反映出αιΐν型膠原蛋白/GAPDH之比例的 柱狀圖，其係分別利用源自於在飲水中投予PPS鈉歷時1 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） --------裝--.----訂--------1---7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 557213 A7 B7 五、發明説明（7 ) 至12週的GH基因轉移鼠之腎小球，以及源自於接受未處理 水的對照組GH鼠之腎小球，並藉由競爭性PCR來測定。 第11圖顯示出源自於一未處理對照組之安樂死華騰納 兔以及源自於進行皮下輸注PPS. (Elmiron® )之治療組中 另一華騰納兔的腹腔主動脈截面切片。 第12圖為一柱狀圖，其反映出僅接受高膽固醇日常飲 食之華騰納兔中主動脈各分支的内膜截面積，以及由接受 咼膽固醇日常飲食與飲水中之PPS鈉的華騰納兔中主動脈 各分支所測得之比較性截面積。 第13圖為一柱狀圖，其反映出僅接受高膽固醇日常飲 食之華騰納兔中主動脈各分支的内膜對中腔截面積比，以 及由接受高膽固醇日常飲食與飲水中之PPS鈉的另一組華 騰納兔中主動脈各分支所測得的相對比值。 發明詳沭 本發明係關於一種治療一個在受影響之脈管系統中 (特別是在一諸如主動脈之動脈中）罹患一慢性進行性血管 瘢痕疾病（CPVSD)之哺乳類患者的方法，以遏止或實質地 減緩該疾病之進展，而消除及/或減輕已形成之瘢痕傷害。 本方法包含：將一含有一有效於血管瘢痕疾病之治療量的 戊聚糖多硫酸酯或其藥學上可接受之鹽的藥學組成物投予 一病人。 可藉由該新穎方法來治療的疾病包括但不限於：慢性 進行性腎小球疾病，包括瘢痕型糖尿病引發性腎小球硬化 症；因動脈硬化所造成之動脈瘢痕，包括動脈粥瘤硬化症； _____ -10- I錄尺度 家標準T^yA4規格（21〇x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事 I# •項再填· 裝-- :寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 557213 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) ^ ' —--- 因腎臟移植後之間質薇痕所盡絲 貝殿展所導致的進行性腎衰竭；對罹串 末期腎病且利用血液透析來進行治療之病人提供也管通: 所使用的分流道因形成瘢痕而導致閉合；其他慢性小灰管 疾病（諸如發生在某些患有高血I之病人者）；已接受冠^ 動脈繞道手術之病人因瘢痕所導致之狹窄症復發；以及糖 尿病性視網膜病變。 由於該疾病的普及性及致死性，故特別重要的是，藉 由該新穎方法來治療慢性動脈硬化性瘢痕病理，以逆轉或 避免該疾病之進展，並消除存在之血管瘢痕及傷害。例如， 依據本發明而投予PPS，可遏止並逆轉主要血管中動脈粥 瘤硬化之進展，而消除及/或減輕受粥瘤硬化症所影響之 動脈管壁的相關已形成瘢痕，並實質地增加血管内膜之截 面積，以使更多血液能流過血管内腔。 此處所使用之用語「有效於血管瘢痕疾病之治療量」 係指：一個納入於一藥學組成物中之PPS或其鹽的用量， 當每日投予一或數次歷時一特定期間後，該藥學組成物能 有效地遏止並逆轉CPVSD之進行性病徵。就人類患者而言， 成人患者每曰總劑量為每公斤患者體重約5至約30毫克， 或每日約350至約2, 000毫克，且較佳為約500至約1，500毫 克之PPS或PPS鹽，該每曰劑量係以一至四個等分劑量來投 藥’即可有效地達成治療並逆轉CPVSD之治療目標。就較 小之哺乳類動物而言，該劑量範圍需以體重、品種及症狀 性質而向下調整。 該新穎治療方法之較佳實施例為，將一種含有一有效 (請先閲讀背面之注意事 J· 項再填· 裝-- :寫本頁) 訂 11 矣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 557213 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) 置之PPS與至少一藥學上可接受之惰性組份的藥學組成物 投予患者。該組成物可呈任何標準之藥學劑型，但較佳為 一經口投藥之劑型。 口服劑型可包括傳統型錠片、塗覆錠片、膠囊或微膠 囊；持續釋放型錠片、膠囊或微膠囊；***錠、液體、酏 劑或樂學上所習用之任何其他口服劑型。 關於藥學上可接受之惰性組份，則有不會干擾PPS之 CPVSD治療活性的所欲填充劑、結合劑及溶劑等。再者， 若有需要，可利用諸如陶土或矽土之填充劑來調整劑型之 尺寸。 諸如賦形劑及載劑之其他組份可能是必須的，以賦予 δ亥劑型所欲之物理性質。此等物理性質為諸如釋放速率、 質地及尺寸。可供用於口服劑型之賦形劑及載劑的例子為 諸如蜂蠟、蓖麻蠟、糖蠟與巴西棕櫚蠟之蠟；諸如甲基纖 維素、乙基纖維素、致甲基纖維素纖維素乙酸酯鄰苯二甲 酸醋、羥丙基纖維素與羥丙基甲基纖維素之纖維素化合 物；聚乙烯氯；聚乙烯吡咯烷酮；硬脂醇；單硬脂酸甘油 酯；諸如聚異丁烯酸酯、異丁烯酸甲酯與乙二醇二異丁烯 酸酯之異丁烯酸酯化合物；聚乙二醇以及親水性膠。 在本發明之組成物中，PPS活性組份係較佳為呈約5〇 至300 mg/劑量單元之用量。投予各個病人之準確劑量將 會是欲治療之症狀及該病人之身體特徵（諸如年齡及體重） 的一個函數。 該活性藥學組份可為PPS或其藥學上可接受之鹽，例 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 4 •項再填_ 裝— :寫本頁) .着 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 557213 A7 B7 五、發明説明（10 ) 如納鹽。供用於本發明之方法的一種較佳口服劑型為 Elmiron® 明膠膠囊（Baker N〇rt〇n pharmaceuticals，Inc·，

Miami，Florida) ’其含有loo mg之pps鈉以及微結晶纖維 素與硬脂酸鎮作為賦形劑。 雖然口服途徑投藥是較佳的，本治療方法亦包含PPS 或其鹽之經腸道外、穿皮及穿粘膜途徑投藥，抑或經由習 知或習用於醫學與藥學技藝的其他途徑。同理，本發明之 組成物可包括存在於藥學上可接受之腸道外、穿皮、穿粘 膜或其他習用載劑及劑型内的PPS，以及適當之惰性溶劑、 賦形劑及添加劑。此等藥學上可接受之載劑的許多例子可 見於 Rgmington, s Pharmaceutical Sciences (第 17 版 ( 1 985))及其他範本。無論使用何種投藥途徑或藥學劑型， PPS活性組份之劑量範圍係由約5至3〇 mg/kg病人體重，或 約35 0至約2 0 0 0 mg且較佳為約50 0至約15 0 0 mg，即使針對 該範圍之低限劑量可能被用於腸道外投藥。 用於本發明方法之藥學組成物可包括PPS或PPS鹽以外 的活性組份，例如可供用於調理CPVSD的其他試劑。 本新穎方法能使罹患各種形式之CPVSD的病人獲得便 利、安全且有效的治療，在許多情形下，該等CPVSD可能 會威脅生命或器官。藉由本方法，一被證實具有低毒性及 低副作用的藥學試劑不僅可被用於遏止長久以來被認為是 無法逆轉之慢性血管瘢痕疾病的進展，並可確實地遏止及 /或逆轉已形成之瘢痕傷害，以恢復正常的血管有效性及 功能。 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) --------裝—^----訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 557213 A7 B7 五、發明説明（11 ) "~' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 下列實例包括：（a)已公開於醫學文獻之實驗陳述， 該等實例確認了應用某些競爭性PCR(聚合酶連鎖反應）技 術來定量瘢痕型膠原蛋白mRNA&腎小球内之相關因素，此 顯不出相關腎小球細胞數目與瘢痕型膠原蛋白之生成量無 關；（b)本案發明人所進行或由其監督之實驗，其顯示pps 在向下調控瘢痕型膠原蛋白與細胞生長因子之產生以及向 上調控膠原蛋白酶活性以降解既存之瘢痕膠原蛋白上的活 體外與活體内效力；以及（c)本案發明人所進行或由其監 督之貫驗，其顯示PPS在逆轉動脈粥瘤硬化上的活體内效 力’包括在受害血管中實質地降低粥瘤硬化姓斑的數量與 刀佈。但是’此等實例並非意欲用以發表實施本發明所應 用之材料、技術或劑量，亦非以任何方式來限制本發明。 實例1 滕廉鲞白之定詈 如 Peten ei a/·， Am. J. Physiol. . 32: F951-957 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (1992)中所述者，在老鼠腎小球内之Qijy及型膠原 蛋白可藉由下列方法來定量：將代表源自於一正常五週齡 老鼠腎小球之1 /1 〇 mRNA的cDNA量以及及a2IV型膠 原蛋白引子之標準量，加入含有來自於GeneAmp DNA Amplification Kit (PerkinElmer Cetus, Norwalk, Connecticut) 之所有PCR試劑的各個試管。在擴增前，將含有一個新限 制酶切割址或一刪除之突變型cDNA的系列稀釋加入此一混 合物内（如第1圖所示，上圖）。該突變株之濃度係在一被 設計來涵蓋平衡點（y = l)的先前實驗中測定。 PCR擴增後，將整個反應混合物直接載入於一個位在 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 557213 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（l2 ) 一 H5 Horizon 凝膠裝置（Life Science)中的 4°/〇 Nusieve:Seakem (3:1) (FMC Bioproducts，Rockland, ME)瓊脂糖凝膠内，並進 行電泳。利用溴化乙錠染色及紫外光（UV)穿透照射而目視 DNA 譜帶。利用正 / 負 55 Polaroid 底片（p〇iar〇id，

Cambridge，ΜΑ)來拍攝照片（參見第1圖，中圖）。藉由一 維雷射密度計量儀來掃描凝膠負片，俾供競爭性pCR分析 (Schimadzu; Scientific Instruments, Columbia, MD)。 計算出測試株及突變株譜帶的密度值，並將其等於各 反應試管中的比例繪製成突變株模版添加量的一函數（第 1圖’下圖）。就α 2IV型膠原蛋白突變株而言，測得之密 度譜帶係在繪製突變株/測試株譜帶比例之前藉由一個 562/479之因數來修正。至於型突變株譜帶，其等之 密度值係於除以野生株（即測試）譜帶值之前加成。藉由線 性迴歸分析而繪出一直線。在測試樣品之cDNA量係經計算 而為突變株/測試株譜帶密度比等於1的量。競爭性pCR分 析被實施二或三次。 t例2 在硬化之腎小玻上的y化 如？eten，et aL，λ βχρ· Med.，176: 1571 -1576 (1992)所述者，由人類患者獲得含有腎癌之單側腎切除樣 口口。该等患者無糖尿病、高血壓或其他與腎小管疾病有關 之系統性疾病的病史。將遠離顯明癌腫處的皮質組織樣品 置入卡諾氏固定劑中，包埋於異丁烯酸酯或石蠟内，並利 用週期酸-Schiff (PAS)來染色切片。腎小球硬化症之存 在係被界疋為腎小球膜基質之擴展，其係個別地藉由PAS — ___15_ 本紙張尺度適财(CNS) Α4娜（21GX:97公釐） "~~- -- ----------.----IT------9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 557213 A7 B7 五、發明説明（13 ) 染色材料之組織學檢驗（第2圖，圖上）以及在暴露至一種 對抗第IV型膠原蛋白之抗體後（PHM__12， Silenus， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Westbury，NY)藉由冷凍切片之免疫螢光顯微術（第2圖， 圖中）來評在。 競爭性PCR分析係如實例1中所述者來進行，以定量α 2IV型（瘢痕型）胞外基質膠原蛋白之量。如第2圖之圖下 所示，測定先前被發現為正常或硬化的該型膠原蛋白在腎 小球内的相對漠度。 將五位未患有腎小球硬化症之病人（正常）在腎小球内 的相對細胞濃度與五位罹患硬化症之病人相比較。如第3 圖所反映者，該等群組間在腎小球相對細胞數目上的差異 並不顯著（Ρ>0· 8)，但就α 2ιν型膠原蛋白cDNA位準而言， 其差異在統計學上是顯著的（〇. 〇1 <p<〇. 〇25)。 實例3 在_诼自於正常及病變腎艟之腎小球内的相掛膳廉蛋白mRNA比 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 利用實例1及2中所述之方法，定量在取樣自於患有 膜性腎小球腎炎（MN)與糖尿病性腎病（DM)之人類病人的診 斷性活組織檢體以及源自於罹患腎小球硬化症（NX GS)與 未罹患腎小球硬化症（NX NI)之腎切除檢體的腎小球内α 2/ a 3IV型膠原蛋白mRNA的相對比例。如第4圖所反映者， 較之位於NX NI中者，位在DM及NX GS中之α2/ύ：3ΐν型膠 原蛋白mRNA比顯著地較高。（**Ρ = 0· 0002，*Ρ = 0· 02)。 »»] 4 刺用PPS之活II外研究

研究A -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 557213 A7 B7 五、發明説明（I4 ) 實驗設計： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將正常腎小球膜細胞（8)以2-2· 5 X 1〇4個細胞/井之 密度置入位在24-井培養皿中（Nunc，PGC Scient i f ic Corp.， Gaithersburg，MD)含有 20%小牛血清（Gibco，Grand Island, NY)之基本培養基内。24小時後，丟棄該培養基，利用pbs 來洗滌細胞二次，並在含有0· 1%牛血清蛋白（RIA級，Sicjma) 的無血清培養基内培養24至72小時。以含有或不含有5至 100 // g/ml之PPS的新鮮基本培養基+20%小牛血清來取代該 培養基’或將該培養基與肝燐脂基準（100//g/ml)相比較。 在+ 3及+ 5天時，以騰蛋白.酶處理位在重覆井内之細胞，並 在 Elzone® 細胞計數儀中（Particle Data Inc.，Elmhurst， IL)進行計數。在類似之井内，胸腺嘧啶之編納係藉由添 加1 // Ci/井之[3H]胸腺嘧啶（[甲基_3h]胸腺嘧啶）來測 定；2· 0 Ci/mM (DuPont NEN，Boston，MA)。在第 1 天或 Ϊ 第3天測定讀數。 結果： 在第1天時（24小時），最高劑量反應可達5〇eg/mi(第 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5圖）’而在第3天時，最高抑制反應出現在25/z g/ml(第 6圖）。 比較無添加物（對照組）及肝燐脂（丨00 " g/ml)及 PPSC100 // g/ml)顯示出，在莫耳體積濃度之基礎上，pps 約二倍有效於天然肝燐脂（第7圖）。該等反應之再現性甚 南（块差柱極為緊密）。 一概圖（第8圖）係比較加入血清内之PPS的效應與僅 _ -17-本紙張尺度通用T國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X29T^Jy 心 7213 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 kl '— _____B7 五、發明説明（15 ) ~ — ' 暴露於血清中之對照組細胞。

免究B 將正常腎小球膜細胞層暴露於pps (1〇〇Vg/ml)中歷 時不同期間，再反轉錄之，在第丄天時測量選定分子的mRNA 位準，並與第3及5天時之位準相比較（參見第g圖）。在 第IV型膠原蛋白mRNA上無變化，第J型膠原蛋白mRNA係大 致降低，TGF- mRNA降低約50%，且92 kDa酵素活性增加 超過50%。對照組為冷—肌纖維蛋白，其未發生變化，而與 被處理細胞未增殖相符合。 ^L5__利_用GH基目轉殖小白a_的研费 實驗設計： 12隻6週齡之GH基因轉殖小白鼠係利用不會與小白鼠 GH序列產生父叉反應之牛生長激素的特定引子，而藉 由PCR分析源自於尾部活組織檢驗的清潔劑萃取材料來鑑 定。利用存在於飲水中之口服性PPS鈉（Elmir〇n®，Baker

Norton Pharmaceuticals，Inc.)處理六隻 gh 鼠歷時 10 至 12 週，而六隻同齡GH鼠則接受自來水歷時相同之期間。飲水 中之PPS鈉含量為約1〇〇 mg/kg動物體重。 腎小球之分離及原位反棘鐮： 腎小球係在RNase抑制劑之存在下藉由微切片來分 離。利用生理食鹽水並隨後以一含有可溶性RNase抑制劑 之膠原蛋白酶溶液來灌洗餘下的腎臟。在膠原蛋白酶灌洗 之刖移去下極，並於冰上急遽冷卻，以供用於酵素圖譜研 究。經膠原蛋白酶消後，在4°c及氧釩基核苷複合物之存 ____ -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規梏（210X 297公釐) ~ --------裝--，----訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 557213 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（16 ) 在下分離出40至60個腎小球，以供用於反轉錄（RT)。原位 RT實施如上，除了將腎小球在丙酮乾冰内予以冷凍-解凍 乙次，並在添加RT成份之前，於2°C及2% Triton與4單位/ // 1 之人類胎盤 RNase 抑制劑（Boehringer Mannheim， Indianapolis, IN)的存在下超音波振盪5分鐘。在施加超音 波時，使用一具微型超音波細胞破壞機（Kontes，Vineland, NJ)來冷卻樣品。 標準及競爭性PCR分析： 在一具PCR-Mate (Applied Biosystems，Foster City，CA) 用於鼠a i IV及a i I型膠原蛋白、α平滑肌細胞肌纖維蛋 白、冷，肌纖維蛋白、那密寧B1 (laminin B1)、田那素 (tenascin)、92 kDa金屬蛋白酶及72 kDa金屬蛋白酶之mRNA 以及用於牛生長激素體DNA的引子。各個被擴增產物的身 份係藉由大小及限制酶分析來確認。引子對mRNA專一性 係藉由省略反轉錄酶來測定。PCR係利用GeneAmp DNA擴 增套組（Perkin Elmer Cetus，Norwalk, CT)來實施。源自於 一 40至60個腎小球/鼠之存庫最初係利用PCR擴增之對數線 性部分而藉由標準PCR來分析。此獲致了一個mRNA位準 之快速且非定量估計。隨後，利用競爭性PCR分析來測量 ailV型膠原蛋白（並計算^^：^型膠原蛋白對GAPDH酶之 比例，以標準化不同動物間的數據）、PDGF-B、α平滑肌 細胞肌纖維蛋白、冷-肌纖維蛋白及那密寧Β1之cDNAs， 其係藉由針對各分子建構一個具有一短小之内部删除區域 或一新限制酶位址的cDNA突變株來達成。競爭性PCR分 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ^^裝 ^ 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 557213 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1?) 析被實施二或三次。 結果： 如第10圖所示，在利用口服PPS鈉來治療的小白鼠群 組中，第IV型膠原蛋白/GAPDH之平均比例係低於未治療 組（對照組）小白鼠。此差異指出，較之於未治療之動物， 存在於經治療之動物的腎小球内的瘢痕型膠原蛋白顯著地 較低，該事實係藉由組織學檢驗·及免疫螢光顯微法來確 認。 兔例6 利用蓁腠納毚之 華騰納（Watanabe)兔係供用作為一個天然内生性血膽 固醇過多症的動物模型。此一性狀會在同基因型狀態下完 全表現’在異基因型狀態下部分表現，且該性狀係肇因於 單基因缺陷。同基因型華騰納兔具有較正常日本白兔高8 至14倍之血膽固醇濃度。 華騰納兔具有極高之粥瘤硬化餘斑發生率，特別是位 在主動脈者。粥瘤硬化症之發展速度與嚴重性可藉由餵給 兔子高膽固醇食料來增加。 下列兩個研究被進行，以確定pps在華騰納兔中之抗 粥瘤硬化活性。 研究A: PPS之虔下評仕 將12隻華騰納免分成各有6隻的兩組（組A與組B)，並 餵予高膽固醇食料（〇·5%膽固醇）。組A之動物每曰經皮下 投予正常生理食鹽水，而組B之動物每日經皮下投予1 〇mg/kg之PPS鈉（Elmiron® )。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規^ (請先閱讀背面之注意事項再楨寫本頁) 4 項再續 裝· 、1Τ -.9 557213 A7 B7 五、發明説明（18 ) 在該研究完成之前，有四隻投予PPS之動物死亡，其 中一隻在第22天，三隻在80至86天之間。令組A之動物及 組B所餘下之兩隻動物進行安樂死再檢驗其屍體，並評估 其等組織，特別是源自於主動脈之不同主要分支的切片。 結果： 如下表1所示，相較於組A之對照組兔子，治療組B之 動物被發現在所有受檢主動脈切片上具有較小之#斑區以 及極高之平滑肌層對蝕斑比例（高達6. 8倍）。此等發現示 於第11圖中。源自於對照組動物之腹腔主動脈切片顯示出 高度發展之動脈硬化蝕斑的大致截面積。雖然治療組動物 如同對照組般被餵以相同之高膽固醇食料，但以PPS鈉進 行治療之動物的腹腔主動脈之切片幾乎未顯示出蝕斑病 兆。 表1 華賸納兔 主動脈«傷之形態計董 對照組 (cm2) 平滑肌/蝕 斑 PPS (cm2) 平滑肌/蝕 斑 1虫斑大小之 降低倍數 上行主動脈 平滑肌層 0.328 0.61 0.243 4.12 6.8X 0.54 0.59 主動脈弓 平滑肌f 蝕斑 胸腔主動脈 平滑肌f 0.244 0.47 0.334 1.184 2.5X 麵主動脈 平滑肌f 0.265 0.74 0.303 7. 58 10. 2X 0.358 0.04 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 研究B: PPS之口服評估 將廿隻華騰納兔分成各有五隻的四組，即組A至D。所 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 557213 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（l9 ) 有的兔子被餵予相同的高膽固醇食料（〇· 5%膽固醇）。組a 及B之動物被給予自來水飲用，而組c及D之動物則被給予 含有0.5 11^/1111之？？8鈉（£111^]：〇11(^)的自來水。依據觀察 動物消耗食水之預備研究，在該治療組中，每隻動物消耗 PPS鈉之總日常劑量為約30 mg/kg。 兩隻被治療的兔子分別於第4及11天時，因明顯與pps 無關的膿腫而由該研究中移除。 在該研究的第50天，令組A及C之動物進行安樂死再檢 驗屍體，並檢驗其等之主動脈。在組A(對照組）動物與組 C(被治療）動物的内膜之間可肉眼觀察到顯著差異，且後 者顯現出較低的粥瘤硬化餘斑發展。 在該研究的第64天’令組B及D之兔子進行安樂死並檢 驗屍體。組織學檢驗此二組之主動脈，並測量在許多主動 脈分支上之内膜與中腔層的個別截面積。 第12圖為一柱狀圖，其反映出分別由對照組（組B)與 治療組（組D)兔子之主動脈各分支所取得的平均内膜截面 積。第1 2圖顯不出，相較於未經治療者，經治療之動物在 各個被檢測的主動脈分支中的内膜面積係大致較小，此指 出：在治療組之脈管分布中，存有大致較少的粥瘤硬化損 傷及餘斑區。 第13圖顯示，如第12圖所述者，在由組6及〇之免子所 取得的相同主動脈切片中，内膜對中腔之面積的平均值。 反映出瘢痕組織與位在血管壁上之蝕斑區（該等蝕斑區會 增加内膜之截面積）的相對量的此一比例，經治療兔子（組

(請先閲讀背面之注意事 J· 項再填· 裝-- :寫本頁)

、1T 會 1 - — 5572l3 --- B7___ 五、發明説明（2〇 ) D)在各個主動脈分支中均較未經治療之動物（組β)為低。 經由科學化之合理實驗過程所產生的前述數據顯示 出：PPS係有效於增進過量胞外基質膠原蛋白及某些細胞 生長因子的合成’並同時增加膠原蛋白降解酶之活性。此 等效應指出’ PPS在調理與逆轉cpVSD上（特別是動脈硬化 症及粥瘤硬化症）應是極有效的。 因此顯不出，已存有可達成本發明之各個目標的方法 及組成物，並適供用於實際應用上的條件。 因為上述發明可完成許多可能之實施態樣，且因為上 述實施例中可完成許多變化，故應明暸，述於此處的所有 事項係僅供用於例示，而非用於限制。 (請先閱讀背面之注意事 1· 項再填· 裝-- :寫本頁) 、-=口 會 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 11. 23 NS C 準 標 家 一國 I國 I中 用 一適 度 尺 張 紙 磐

Claims (1)

1. 557213

   ο Λ b( 申請專利範圍 補充 第87105754料利再審錢巾請專利 修正曰期：92年8月 -種用以治療哺乳類患者之藥學組成物，該患者在受 影響之脈管系統巾罹患—慢性進行性血管瘢痕疾病 (SD)而1«成6亥脈管系統的血管腔之窄化及舒張 性之降低，該藥學組成物可遏止該疾病之進展並使已 :成之瘢痕傷害得以消除或減輕，該藥學組成物包 3 3有—有效於血管瘢痕疾病之治療量的戊聚糖 多硫酸醋（PPS)或其藥學上可接受之鹽的藥學組成物。 如申請專利範圍第Μ之藥學組成物，其中該受影響 之脈管系統為一動脈。 如申請專利範圍第2項之藥學組成物，其中.該動脈為 主動脈或其主要分支。 如申請專利範圍第2項之藥學組成物，其中該疾病係 為以瘢痕為特徵之一種動脈硬化症形式，且其中該動 脈硬化瘢痕化過程被該組成物所逆轉。 如申請專利範圍第4項之藥學組成物，其中該動脈硬 化症形式係為粥瘤硬化症，且該瘢痕涉及到受粥瘤硬 化斑所影響之動脈管壁。 如申請專利範圍第〗項之藥學組成物，其中一足夠量 之該藥學組成物係提供一總曰常劑量為約5至約3〇 mg/kg患者體重或者約35〇至約2,〇〇〇之pps或其 藥學上可接受之鹽。 如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其中該日常劑 -24- 1. 裝 2. 3. 4. 5· 6. 氏張尺度適用中國國家標準（CMS) A4規格（ϋ_297_ϋ) 訂 申6青專利範圍 I為約500至約1,500 mg。 士申明專利範圍第6項之藥學組成物，其中該曰常劑 量係以1 i 4個等分之劑量而被投予之。 如申睛專利範圍第1項之藥學組成物，其中該藥學組 成物係為一口服投藥劑型。 士申明專利範圍第9項之藥學組成物，其中該劑型係 擇自於由傳統型或持續釋放型錠片、包覆錠片、膠 4政膠囊、***旋、液體及Sfc劑所組成之群組中。 士申明專利範圍第9項之藥學組成物，其中該劑型式 G B至少一種藥學上可接受之惰性組份。 申μ專利範圍第丨丨項之藥學組成物，其中該惰性 仞為填充劑、結合劑、溶劑、賦形劑或載劑。 13. T申請專利範圍第9項之藥學組成物，其中該劑型每 單位3有約50至約3〇〇 mg的pPS或其藥學上可接受 之鹽。 14·如申請專利範圍第Μ之藥學組成物，其中該藥學上 可接受之鹽係為鈉鹽。 15·如申請專利範圍第14項之藥學組成物，其中該組成 物係呈-含有PPS鈉、微結晶纖維素與硬脂酸鎂的明 膠膠囊形式。 申°月專利ie>圍第1項之藥學組成物，其中該患者為 一人類患者。 _ _____ -25- 冗張尺度適用中國---一