TW509697B - Humanized antibody against parathyroid hormone related peptide - Google Patents

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Yuji Wakahara
Naohiro Yabuta
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 _B7_ 五、發明説明（> ) 0 血症，Hu臟oral hypercalee釀ia of 臟alignacy)、 經由於骨中轉移或浸渗之腫瘤局部的作用所造成之LOH (局部溶骨之高鈣血症）。於Η HM為經由骨吸收或骨破禳 之亢進而使鈣流出增加，且被認為與腎酹***能力降低 相輔地産生高鈣血症（和因誠基及永因直一，内科69, 6 4 4 - 6 4 8 ) 〇 高鈣血症為在若血清鈣值超過12· g/dl則其症狀出現 ，而其症狀初期於惡性腫瘤患者中非特異地察見食欲不 振、噁心、喔吐。若高鈣血症惡化，則因為蹵達尿小管 之障礙且降低水分之濃縮而變成多尿，又，由噁心、囉 吐造成水分無法充分攝取而伴隨脱水。 於惡性腫瘤所伴隨之高鈣血症中作為引起ΗΗΜ之液性 因子之類ΡΤΗ(副甲狀腺激素；Parathyroid Hor麗one)物 質的副甲狀腺檄素鼷連胜肽（Parathyroid Hormone related Peptide,以下稱為「PTHrPj 為由 Moseley, J· Μ·等所發現（Proc· Natl· Acad. Sci. USA(1987) ,84, 5048-5052)〇
其後，單離出纗碼PTHrP之基因（Suva, L. J.等人， Science ( 1 98 7 ) 2 3 7, 89 3 >,並由其解析而明瞭人PTHrP 為基於基因之蘧擇性接合而存在三種由139, 141及173 德胺基酸所組成者，及基於血中具有全構造之PTHrP(卜 139>的限定分解而存在各種片段（Baba, H. Clinical Caleiui(1995)5,229-223)。 PTHrP除了 N 終端攧第 1位 至第13位之13値胺基酸中有8値輿PTH相同以外，推_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再頁) 訂 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 其第14位至第34位胺基酸部位中亦呈現輿ΡΤ Η類似之立 體構造，且至少於Ν終端錮中輿ΡΤΗ共通之PTH/PTHrH 受體進行結合（Jueppner， Η·等，Science(1991}254, 1 0 2 4 — 1 0 2 6、 Abou-Sa^ara, A-B等，Proc. Natl. Acad.
Sci · US A ( 1 9 9 2 )89· 2732-27 36 ) 〇 PTHrP雖已被報導由各種腫瘤組織所産生，但不僅於 腫痛，已知可由以皮虜、中欏神經、子宮、胎盤、受乳 中的乳臃、甲狀腺、副甲狀腺、副醫、肝、罾、勝胱為 首之由胎兒至成人為止的各種正常組饑所産生（Burtis, W . J . Clin. Che豔·（ 1 992 ) 38 , 2 1 7 1 — 2 1 83 , Stewart,Α· F . & Broadus, A· E. J . C 1 i n . Endocrinol. (1991)71, 141fl-1414)e又，PTHrP被認為在胎兒期至新生兒期於 保持比母體更高之鈣代謝讕節上扮演重饔的角色。 PTH/ PTHrP受醱已知主要存在於骨和罾中{滋野長平 ,Cll ini cal ( 1 9 9 5 ) 5 , 3 5 5 - 3 5 9 ),且 PTHrP為經由銪合 至受體而令複數細胞内訊號傳達条統活化。其一者為臃 t酸環化酶，又一者為磷脂_(3。經由腺甘酸璨化鼸之 活化，使細胞内CAMP濃度上升並令蛋白激_A活化。又 磷脂酶C為分解磷臌醯肌酵4, 5-雙鰣酸酯並生成肌酵1, 4,5-三瞵酸釀和甘油二酯。G蛋白質為參輿此些訊號傅 達条（C ο 1 e 通 a n , D · T ·等，B i 〇 c h e 班 i c a 1 靈 e c h a n i s 鼸 s 〇 f parathyroid hormone action.於:「The parathyroids」 (B i 1 e z i k i a n , J · P ·等），R a v e n p r e s s ,紐約，（1 9 9 4 )第 2 3 9頁）0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1_1· fluiBi ϋ·— tMmmmmmmmt —κκ— κ·—·— mmmmmmmmmmmmm ml HBB— tmmt (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 線· 509697 A7 B7 五、發明説明（4 ) PTHrP為透遇此些訊號傅達条，並引起BHM中所觀察到 的高鈣血症、低磷血症、醫磷再吸收能力降飫、翳性cAMP ***之增加等。 如此，可明瞭PTHrP為密切鼸連於惡性腫瘸中所伴随 的高鈣血症於治療惡性腫癱所伴隨之高鈣血症中除了 進行補液以外，可使用降鏐素、類固醇劑、吲呤美議辛 、無機磷酸鹽、雙勝酸酯。然而，由於此些麵劑經由連 缠使用而效果降低、表現出強的副作用、和蕖效表現慢 ，故期待使用治療效果更高且副作用少之 另一方面，伴隨惡性腫癯之高鏐血症治療之新嘗試為 由Kukreja, S.C等所報告，若對人肺癌細胞和人喉頭癌 細胞移檀並産生高鈣血症之無胸腺鼠投予對PTHrP之中 和抗血清，則使血中鈣濃度及尿cAHP濃度減少U. Clin· Invest, ( 1 988 ) 82 , 1 7 98- 1 802)。佐藤幹二等報告若對 産生PTHrP之人臛瘤所移植之小裸鼠投予對PTHrP之抗體 ，則降低，並使鼠之生存時間大幅延長（J.bone ft Mine· Res. (1993)8,849-&60)。又，於特蘭平 4-228089 號中掲 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 裝· 訂 對 示 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 體 抗 型 含 嵌 人 / 鼠 之 VI/ 4
Hr單原的被，之 PT之抗法因短生 為情 體之 抗 J 株性 單 之 鼠 Γ 為 受 乃 值 價 的 法 藥 翳 體 人),限 在形到 f% 性 原 疫 免 度 高 有 具 中 此 因 稱之 有鼸 亦抗 株 犟 鼠 中 驩 人 在 人 至 予 投 體 抗 鼠 將 若 f 如 例 〇 制 則較 體為 産 所 期讎 衰抗 半鼠 之予 中投 體 ， 人者 於再 醱 0 抗果 鼠效 故之 *待 謝期 代所 而揮 物發 異法 為無 視且 龌 抗 鼠 抗 人 6 敏 遇 之 他 其 或 病 清 血 起 引 為 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明U ) 反窿等之對患者而言為不適當的危險性免疫回應。因此 ，鼠單株抗龌無法對人投予數園。 為了解決此等問題，乃開發令來自非人類之抗讎，例 如來自鼠之犟株抗鐮的免疫原性降低之方法。其一例為 製作抗體之可變區（V匾）為來自原來的鼠單株抗釀，且 恆定匾（C匾）為來自適當的人抗體之嵌合型抗體之方法。 因為所得之嵌合型抗體為含有縻來鼠抗嫌之可變區之 完全形態，故可期待具有與原來鼠抗體相同之專一性並 結合至抗原。再者，嵌合型抗體為實質上減少來自人類 以外之胺基酸序列比率，因此預測其比縻來鼠抗體之免 疫原性低。嵌合型抗體雖為與原來之鼠單株抗體同等地 結合抗原，且免疫原性低，但其中仍亦有對鼠可變匾産 生免疫回應之可能性（LoBuglio, A.F·等，Proc· Natl· Acad . Sci. USA, 86，4 2 2 0 - 4 2 2 4 , 1 98 9 ) 〇 為了降低鼠抗體之免疫原性之第二方法雖為更加複雜 ，但期待可再大輻降低鼠抗鼸之潛在的免疫原性。此方 法為僅將來自鼠抗體可變匾域之互補性決定匾 (c 〇 in p 1 e 麗 e n t a r i t y d e t e r 靈 i n i n g r e g i 〇 n ; C D R )移植至 人類可變匾並製作成「再構成j UeshapecU人類可變匾 β但，依據霈要，為了令再溝成人類可變匾之CDR構造 更加接近原來的鼠抗體構造，乃有將支持CDII之骨架邏 (FR)部分之胺基酸序列，由鼠抗龌之可變匾移植至人類 可變匾之情形。 其次，令此些人型化再構成之人類可變匾遽結至人類 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） I---------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再^^本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 _ _ 五、發明説明（b ) 恆定匾。最後，令再構成之人型化抗讎之來自人類以外 胺基酸序列之部分僅為CDR及極少部分之FIU CDR為由超 可變胺基酸序列所構成，其不顯示出種專一性序列^因 此，以鼠CDR支持之人型化抗體，已經含有人類CDR故應 不具有比天然人抗體更強之免疫原性。 關於人型化抗鼸，讅再參照Riechnann, L.等，Nature ，332-323-327, 1988; Verhoeye, 等，Science, 239 ,1 5 3 4 - 1 5 3 6 , 1 988; Ke111 eborough , C.A.等，Protein Engng. ,4,773-783,1991; Naeda 9 H.等 Hu黼an antibodies and Hybrido麵a, 2,124-134, 1 9 9 1 ; Gor雇an, S . D . # ,
Proc . Natl. Acad . Sc i. USA, 8 8,4 1 8 1 -4 1 85 , 1 99 1 ;
Te通pest， R.R.等，Bio/Technology, 9,266-271, 1991 ;Co, M 丄等，Proc . Nat 1 . Acad. Sci. USA, 88,2869 -2873, 1991 ; Carter , P.等 Proc. Nat 1 . Acad . Sci. USA , 89,4 285-4 28 9 , 1 9 9 2 ; Co . H.S.等，J. I 麗蘭unol, 148-1149-1154, 1 9 9 2 ;及 Sato, K.等，Cancer Res·, 53.851- 856， 1993〇 如前逑，雖然預澜人型化抗龌因為療法目的而為有用 ,但對於PTHrP之人型化抗體則為未知，於前逑文獻中 亦未提及。又，於人型化抗體之製法中未存在任意抗膿 所可普遍適用之一致性方法，而為了製作對特定抗原顯 示出充分的結合活性、中和活性之人型化抗鼸，乃必須 進行各種研究（例如，參照Sato, Κ.等，Cancer Res., 53.851- 856,1993)。 一 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----------裝-- (請先聞讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（9 ) 〔發明所欲解決之課題〕 本發明為以提供對PTHrP之鼠單株抗體之可變區（V區 和人抗饑之恒定匾（C匾）所組成之人/鼠嵌合型抗體、 對PTHrP之鼠單株抗體輕鐽（L鏈）V匾及重_(B鏈）V匾 之互補性決定匾為被移植至人抗讎之人型化（hu* an i zed) 抗體、含有該抗饑之L鐽及H鐽、及構成該抗體L鏈及 Η鍵V匾之多肽為其目的〇 本發明再以提供含有編碼上逑抗體，特別是其V匾之 _基序列之DNA、及編碼含有具有V區多肽之L鏈或Η鍵 之DN Α為其目的·本發明再以提供含該DN Α之重組載讎、 及經由該載體所轉形之宿主為其目的·本發明再以提供 對PTHrP之嵌合型抗體及人型化抗體之製法為其目的。 本發明再以提供中和活性高之對PTHrP之抗體為其目的 。本發明再以提供含有對PTHrP之抗體或人型化抗體作 為有效成分及醫藥組成物及高麫血症抑制剛、低磷血症 改善劑及鹼中毒改善爾為其目的。 〔解決課題之手段〕 本發明者等基於上逑課題進行致力研究，結果成功 取得對PTHrP之鼠犟株抗鼸之在人龌中降低免疫原性的 抗讎，並達到完成本發明。 即，本發明為含有人抗體之L鏈C區、及對PTHrP之 鼠單株抗體之L鏈V區之嵌合型L鏈。L鏈V匾可列舉 含明序列繡號4 5所示之胺基酸序列者，L鍵C匾可列舉 C λ匾者e 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） I.---------裝-- (請先聞讀背面之注意事項^^^本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（牙） 再者，本發明為含有人抗體之H _C匾、及對PTHrP 之鼠單株抗體之Η鐽V匾的嵌合型Η鏈<> Η鏈V匾可列 舉含有序列編號46有序列鏞號46所示之胺基酸序列者， C匾可列舉C r 1匾者c 再者，本發明為含有前逑嵌合型L鏈及嵌合型Η Μ， 對PTHrP之嵌合型單株抗體《 再者，本發明為含有人抗驩L鐽V匾之骨架區1〜4、 及對PTHrP之鼠單株抗讎之L鏈V匾之互補性決定匾域 1〜3,為含有人型化抗體之L鋪V匾之多肽。互補性決 定匾域1~ 3可列舉分別含有序列纗虢59〜61所示之胺基 酸序列者，骨架匾1〜3可列舉分別來自人抗鼸Η8ϋβ3888 之骨架匾1〜3者，且骨架匾4可列舉來自人抗鼸S25755 之骨架區4者。或者，骨架匾1〜3可列舉分別與人抗讎 HSU0 3868之骨架匾1〜3實質相同者，且骨架匾4可列舉 與人抗體S2 5 7 55之骨架區4實質相同者〇 此處，所諝「實質相同」意指人型化抗體中所使用之 人抗體骨架匾中，為了令人型化抗體為具有輿鼠單株抗 體同等活性地形成鼠單株抗體之互補性決定匾，亦可産 生必要的胺基酸缺失、取代、加成等。 再者，本發明為依據骨架區中之Kabat規定Uabat, Ε·Α·等，US Dept· Health and Hunan Services, US GoverniBent Printing Offices, 1991)於第 36傭胺基酸 為酪胺酸，且同第49锢胺基酸為天冬胺酸，為含有人型 化抗體之L鐽V匾之多肽· -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 509697 A7 B7__ 五、發明説明（9 ) 再者，本發明為含有序列繡號48〜51任一者所示之胺 基酸序列，為含有人型化抗醱之L鏈V匾之多Ife。 再者，本發明為依據骨架匾中之Kabat規定，於第45 個胺基酸為離胺酸，且同第87個胺基酸為異白腠酸，為 含有人型化抗塍之L鏈V匾之多肽❶ 再者，本發明為含有序列編號52〜5 5任一者所示之胺 基酸序列，為含有人型化抗體之L鏈卩匾之多肽® 再者，本發明為含有人抗髏之H 匾之骨架匾1〜4
,及對人PTHrP之鼠單株抗體之Η鏈V區之互補性決定 區1〜3,為含有人型化抗體之Η鏈V匾之多ifec互補性 決定區域1〜3可列舉含有分別序列钃號62〜64所示之胺 基酸序列者，骨架區1〜4可列舉來自羼於人類亞群III (H u m a n S u b g r 〇 u p 111 ( H S G 111}、K a b a t，E · A ·等，ϋ S Dept , Health and Human Services, US Govern班ent Printing OFfices, 1991)之人抗體骨架匾1〜4者，更 詳言之，可列舉分別來自人抗體S31679之骨架匾1〜4者 ,或者與人抗體S31679之骨架匾1〜4實質相同者。 再者，本發明為含有前逑人型化抗體之L鏈V區之多 肽及含有具人抗體L鰱C區之多肽，為對人PTHrP之人 型化抗體之L鏈。此處，C匾可列舉CA匾、骨架區1〜 4可分別抗舉與人抗體HSD03868之骨架區1〜3實質相同 者、骨架匾4可列舉與人抗體S25755之骨架匾4實質相 同者、而互補性決定匾1〜3之胺基酸序列可分別列舉序 列編號59〜61所示者。 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------^-- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂 -線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 Α7 Β7 五、發明説明（α) 再者，本發明為含有具前逑人抗鼸之H _c匾之多肱 及Η鏈V匾之多肽，為對人PT Hr P之人型化抗體之Η鏈。 C匾可列舉Crl匾c»骨架區1〜4可列舉羼於HS8 III之來 自人抗體之骨架區1〜4者、而互補性決定匾1〜3可分別 列舉含有序列編號62〜64所示之胺基酸序列者。 再者，本發明為關於抗原性弱，且中和活性高之抗 PTHrP抗體〇該PTHrP抗體為含有可供於治療人類疾病之 人抗體、人型化抗龌、嵌合型抗體、引子化抗體等❹又 ，該抗體為具有低的解離常數。再者，由於本發明之抗 體為解離常數小，故中和活性高，並可供於人類疾病之 治療。 本發明之抗體為具有1·86Χ1 (Γ7 〔Μ〕以下之解離常 數、1 . 2 2 X 1 (Γ1 〔 1 / s e e〕以下之解離速度常數，而 6 · 5 5 X 1 0 4 〔 1 / Μ · S e c〕以上之結合速度常數。又，此 些常數可經由使用ΙΠ標帽之配位體之Sketchard解析和 表面質粒基因組共振感應器等予以測定。 再者，本發明為含有编碼對人PTHrP之鼠單株抗體L 鏈V區之鹸基序列的DN A或含有纗碼Η鐽V匾之齡基序 列的DNA。L鏈V匾及Η鏈V匾可分別列舉含有序列鑛 號45、4 6所示之胺基酸序列者。含有编编《IL鰱V區之 鹼基序列的DNA可列舉例如序列编號65所示者，含有編 碼Η鐽V匾之鹸基序列的DN A可列舉序列縝號57所示者β 再者，本發明為编碼前逑嵌合型L鍵或嵌合型Η鏈之 DNA。鏞碼該L _之DNA可列舉例如含有序列纗號65所示 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ----------装-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、1Τ' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7___ 五、發明説明（d ) 之鹼基序列者，編碼該11鏈之DN A可列舉含有序列編號 57所示之齡基序列者。 再者 本發明為含有鍰碼前逑人型化抗體之L鐽V匾 之鑛基序列的DN A或含有编碼Η維V匾之鹼基序列的DN A 。含有鏞碼L鐽V匾之鐮基序列的DNA可列舉含有序列 編66〜7 4所示之任一鹸基序列者，含有編碼H _V匾之 鹼基序列的DNA可列舉序列編號58所示者〇 再者，本發明為含有纗碼序列鏞號47〜55所示之任一 胺基酸序列之鹼基序列的人型化抗體之L _V區之DBA 。該DN A可舉例含有序列編號66〜74所示之任一齡基序 列〇 再者，本發明為含有鏞碼前逑人型化抗體之H _v匾 之鹼基序列的DNA。 再者，本發明為纊碼序列編號56所示之胺基酸序列的 人型化抗體之Η鐽V區之DNA。該DH A可列舉含有序列編 號58所示之鹼基序列者。 再者，本發明為含有前述任一 DNA之重組載體· 再者，本發明為經由前逑重組載鼸所轉形之轉形鼸〇 再者，本發明為培養前逑轉形體，並由所得之培餐物 採集對人副甲狀腺激素闘連胜肽之嵌合型抗體或人型化 抗體為其特徽之對人副甲狀腺激素鼷連胜肽之嵌合型抗 體或人型化抗齷之製法。 再者，本發明為含有前逑抗臞作為有效成分之醫麵組 成物及高鈣血症抑制劑及低磷血症改善該鈣血症為 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 509697 A7 B7 五、發明説明（…） 中於 者對 患於 症用 血使 鈣可 高體 性抗 隨之 伴明 瘤發 腫本 性 * 惡此 於因 又 〇 ，症 瘤血 腫磷 性低 惡見 於察 因次 起屢 輕癌 減肺 之 、 狀痛 症鼸 狀胰 血如 磷例 低自 或選 症種 血一 錚少 高至 或舉 療列 治可 之瘤 瘤腫 腫性 性惡 惡， 逑尚 上❹ 膽性鼸 、惡性 癌及惡 爾癌之 、臃症 癌列血 道前錚 食、高 、癌成 癌宮進 肉子 ， 齒、癌 、癌些 癌胱此 舌勝於 、、定 癌癌限 頭腎並 喉、非 、癌但 £3 —U 癌？， 頭、癱 咽癌巴 、管淋 象 對 用 適 之 劑 制 抑 症 〇 血明 酹發 高本 之明 明說 發細 本詳 為， 部下 全以 瘤 態 形ΗΓ 施PT 實人 之對ΗΓ 明作P.T 發製對 之株 )- 單 鼠 之 所 物 動 之 疫 免 原 抗 令 由 體藉 抗可 株， 單體 鼠抗 行 1 瘤 胞 細 髓 脅 和 專 生 産 出 〇 選製 瘤調 合以 融予 、之面 胞得株 細所殖 生由選 産並之 體 ，體 抗瘤抗 之合之 得融性 取製活 n I 諝 Η Τ ， Ρ 合制 融抑 胞性 細一 (請先聞讀背面之注意事項再頁) 裝· -、1Τ (i)抗原之調製 動物免疫中所用之PTHrP可列與經由重組DNA法或化學 合成所諝製之PTHrP胺基酸序列之全部或一部分之胜肱 ，或來自引起高鈣血症之癌細胞培餐上清液之。 例如，可使用公知之PTBrPUeap, Β·Ε·等，Science (1987)238, 1568-1570)第1〜34傾胺基酸所組成之胜肱 (PTHrP(l-34)作為抗原。尚，人PTBrP(l-34)為具有序 列編號75所示之胺基酸序列❶ 令所得之PTHrP結合至載醱蛋白質（例如甲狀腺球蛋白） -1 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ) 1 1 I 後 t 添 加 佐 劑 〇 佐 爾 可 列 舉 弗 洛 因 德 兀 全 佐 m 、 氟 洛 因 1 1 I 德 不 兀 全 佐 劑 $ 且 亦 可 其 任 一 者 混 合 〇 1 1 (2 )免疫及抗體産生細胞之採集 請 1 I 先 1 令 如 上 逑 處 理 所 得 之 抗 原 投 予 至 哺 乳 動 物 $ 例 如 小 氪 閲 讀 1 I 大 鼠 馬 猴 、 兔 X 山 羊 線 羊 等 之 哺 乳 動 物 〇 免 疫 背 面 1 I 之 1 I 9 若 為 現 存 之 方 法 則 任 何 方 法 均 可 使 用 $ 但 主 要 為 經 由 注 意 1 I 靜 脈 内 注 射 X 皮 下 注 射 腹 腔 内 注 射 等 予 以 進 行 〇 又 9 事 項 再 1 1 免 疫 之 間 隔 並 無 特 別 限 定 9 可 為 數 B 至 數 遇 之 闢 隔 9 較 本 1 裝 佳 為 以 4 Λ -2 1曰之間隔進行免疫。 頁 1 I 由 最 終 免 疫 曰 2 - - 3 曰 後 採 集 抗 體 産 生 細 胞 〇 抗 齷 産 生 1 1 1 細 胞 可 列 舉 脾 細 胞 、 淋 巴 絡 細 胞 » 末 播 血 細 胞 9 但 一 般 1 1 為 使 用 脾 細 胞 〇 抗 原 之 免 疫 量 為 1 次 對 毎 1 隻 鼠 使 用 1 訂 100 M g ί 〇 1 (3)抗體價之測定 1 1 為 了 確 認 免 疫 動 物 之 免 疫 國 應 程 度 $ 及 由 細 胞 m 合 處 1 I 理 後 之 細 胞 蘧 出 百 的 融 合 瘤 9 乃 澜 定 免 疫 動 物 之 血 中 抗 1 1 艟 價 、 或 抗 龌 産 生 細 m 之 培 養 上 清 液 中 的 抗 讎 價 〇 線 | 檢 測 抗 體 之 方 法 可 列 舉 公 知 技 術 f 例 如 El A( 酵 素 免 疫 1 I 分 析 )、 RIA J放射免疫分析） N ELISA(酵 素 建 結 免 疫 級 附 1 1 分 析 )等0 1 I (4 ί )細胞融合 1 1 I 令 與 抗 體 産 生 細 胞 融 合 之 骨 髓 細 胞 鱔 (骨髓癱〉細 胞 1 1 可 使 用 來 白 小 鼠 Ν 大 鼠 、 人 等 之 各 種 動 物 且 為 業 者 一 般 1 1 可 購 入 之 株 化 細 胞 〇 所 使 用 之 細 胞 株 為 具 有 抗 藥 性 $ 且 1 1 I 事1 5 一 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 五 ______ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7___ 發明説明（4) 具有於未融合狀態下無法在選擇性培餐基（例如HAT培餐 基）生存，而僅在融合狀態下可生存之性質者。一般為 使用8-氮鳥樣昤耐性株，此細胞株為缺乏次黃螵昤鳥昤 轉磷酸核糖基酶，且在次黃螵昤-胺基蝶睑-胸腺核甘 (BAT)培養基無法生長。 骨髄瘤細胞可適當使用己公告之各種細胞株，例如，P3(P3X63Ag 8·853> (J.Immunol.(1979)123:1548-1550) , P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7), NS-1(Kohler,G.and Milstein, C., Eur.J.Immunol.(1976)6:511-519), MPC-11 (Margulies,D.H.et al., Cell (1976) 8:405-415), SP2/0 (Shulman,M. et al., Nature(1978)276:269-270), F0(de St·Groth, S.F.et al·， J·Immunol· Methods (1980) 35:1-21)、 S194 (Trowbridge, I.S., J.Exp.Med. (1978)148:313-323) , R210 (Galfre.G. et 等，Nature( 1 9 7 9 ) 2 7 7 : 1 3 卜133)等〇 抗醱産生細胞為由肺繊細胞、淋巴結細胞等所取得。 即，由前逑各種動物摘出或採集肺議、淋巴結等，並將 此些組鐡弄碎。令所得之破碎物懸浮於PBS、DMEM、 PRMI164D等之培養基或缓衝液，並以不綉銷等過濂後， 進行離心分離調製目的之抗體産生細胞。 其次，令上逑骨髓瘤細胞和抗體産生細胞予以細胞融 合〇 細胞融合為在MEM、DMEM、RPME- 1640培餐基等之動物 細胞培餐用培餐基中，令骨黼癱細胞和抗讎産生細胞以 混合比1: 1〜1: 10且於融合促進劑存在下，令於30〜 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（A ) 37Τ!下接觴1〜15分鐘而進行•為了促進細胞融合，可 使用平均分子量㈣〜6,〇〇〇之聚乙二酵、聚乙烯醇或 前代病毒等之融合促進_和_合病毒。又•亦可使用利 用電剌激（例如電穿孔 > 令市售細胞融合裝置令抗體産生 細胞和骨醣瘤細胞進行融合❶ (5) 融合瘤之選擇及選殖 由細胞融合處理後之細胞遵出目的融合瘤。其方法可 列舉在蘧澤性培養中利用細胞之選擇性增殖之方法等。 即，以適當的培養基將細胞懸浮液稀釋後，塗於撤檩 度平板上，並於各孔穴中加入選擇性培餐基（HAT培餐基 等），且以後適當地更換蘧擇性培養基並進行培餐。 其結果，可生長之細胞為以融合瘤型式取得。 融合瘤之篩蘧為以界限稀釋法、螢光激發細胞分類器 法進行，最後取得産生單株抗體之融合癘β (6) 單株抗體之採集 由所得之融合癯採集單株抗臞之方法，可列舉通常的 細胞培養法和腹水形成法等。 細胞培養法為將融合癱於含有10〜2(1%牛胎兒血淸 之RPMI- 1 64 0培養基、MEM培餐基、或無血清培餐基等之 動物細胞培餐基中，以通常之培養條件（例如37eC, 5% C〇2濃度）下培養2〜14日，並由此培養上清液取得抗體。 腹水形成法為在與骨髓瘤細胞來源之哺乳動物同種之 動物腹腔内投予融合瘤，令融合瘤大量增殖。於1〜4邇 後採集腹水或血清。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（& ) 上逑抗體之採集方法中，於必須精製抗體時，可適當 蘧揮硫酸銨鹽析法、離子交換層析、親和性層析等之公 知方法，或將其組合進行精製。 2.嵌合型抗體之構築 (1)含有编碼對人PTHrP鼠單株抗體V匾之籲基序列的DNA 選殖 (i) »RNA之調製 為了進行含有編碼對人PTHrP鼠犟株抗體V匾之鍊基 序列的DN A選殖，可由所國收之融合癯依公知方法，例 如胍超離心法（Chirgwin, J.M·等，Bioche證istry<1979} ,1 8 , 5 2 94 - 5 2 9 9 )、 AGPC^ ( C h ο ιι c z y n s k i , P 等、
Analytical Biochemistry(1987), 1 6 2, 1 56- 1 59 )等調 製全部 R N A ,並經由 O A P u r i f i c a t i o n K i t ( P h a r 窗 a c i a 公司製）所附上之寡（dT)-纖維素旋轉柱等_製1|11»4。又 ，經由使用 Q υ i c k P r e p n R N A P u r i f i c a t i ο η K i t ( P h a r 屋 a c i a 公司製），則亦可不經過全部8NA萃取操作地進行iiEHA 之讕製。 (ii) cDNA之調製及放大 由上逑U)所得之HR NA,使用逆轉錄_分別合成L鏞 及Η鏈V匾中之cDNA。cDNA之合成可使用與寡_dT引子 或L鏈C匾或Η鐽C匾雑交之適當引子（例如具有序列 繡號1所示之鹼基序列之MHC2引子）。 cDHA合成反應為將前iRHA和引子混合，並於逆轉錄酶 存在下例如於52°C下進行30分鐘反應。 -1 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（π ) cDNA之放大為依據使用L鍵及Η鏈之S^Anpli FINDER RACE^#(CL0NTECH^_)^5,-RACE_(FrohMan Μ·Α·等，Proc · Natl. Acad . Sc i . USA 85 , 8998- 90 0 2, 1 988, Belyavsky, A·等，Nucleic Acids Re s . 1 7 , 2919 -2932, 1989)以PCR(聚合_鋪反塞）進行。即，於上述 合成之cDNA的5*終端連結Aipli FIHDER Anchor(序列編 號42),並對於含有纗碼L _V匾及Η鐽V匾之鹼基序列 的DNA(以下，含有鏞碼L鍵V匾之鹼基序列的DNA亦簡 逑為「L鏡V區之DHA」或「编號L鏞V匾之DNA」（_ 於Η鏈V匾、C匾等亦為同樣））進行PCR。 用於放大L _ V匾DU Α之引子，可使用例如由Anchor 引子（序列編號2)及鼠抗體L鐽；I鐽恆定匾（CA匾）之保 字序列所設計之引子（例如具有序列钃號4所示之鑛基 序列的MLC引子）。又，用於放大Η鐽V匾DNA之引子， 可使用例如Anchor引子（序列編號2)及MBC-G1引子（序列 編號 3 ) ( S · T · J ο η e s 等，B i 〇 t e c h η ο 1 〇 g y , 9 , 8 8，1 9 9 1)。 (iii) DNA之精製及齡基序列之決定 對於PCR産物，依公知方法進行瓊脂糖醪電泳，切出 目的DNAH段後，進行DNA之回收及精製，並連結至載體 DN “ DNA之精製為使用市售之套件（例如GENECLEAN II; BI0101)進行。用於保持DNAH段之載鼸DNA可使用公知 物質（例如 PUC19, Bluescript等）〇 令前逑DNA和上述載體DNA,使用公知之建接套件（寶 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I.---------裝-- (請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 線- 509697 A7 B7 五、發明説明（d ) 酒造製）予以連結，取得重組載龌。其次，將所得之 重組載體導入大腸稈鯆JMlfl 9等之後選取安比西林耐性 _落，並依公知方法調製載讎DNAU.Sanbrook,等， 「Molecular Cloning」，冷泉港實驗室印，1989)。目 的DN A之錶基序列為經由令上逑載體DN A以限制酶切開後 ，以公知方法（例如雙脱氣法）予以決定（U.SaBbroofc, 等，「Molecular Cloningj ,冷泉港實驗室印，1 989 ) 。本發明中，可使用自動齡基序列決定裝置（DNA Sequencer 3 7 3 A ; ABI公司）0 (iv)互補性決定區 Η鏈V區及L鐽V匾為形成抗原結合部位，且其全盤 構造為相互具有類似性。即，分別4骨架匾（FR)部分， 為由3儀超可變區，即互補性決定區（CDR)所連結。FB 之胺基酸序列雖為被較良好的保存，但另一方面，CDR 區之胺基酸序列的變異性極高（Rabat , Ε· Α.等，「Sequence of Proteins of I 道luno 1 ogica 1 Interest j US Dept· Health and Hu通an Services, 1 98 3 )〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----------^-- (請先閲讀背面之注意事項^^|^本頁) 線- 前逑4個FR之許多部分為呈泠-H構造，其結果，3掴 CDR為形成環狀。CDR於某些情形中，亦形成泠-ϋ構造之 一部分。因此，3傾CDR為經由FR而相互保持於立體上 非常接近之位置，而FR為與構成對區域之3儀CDR共間 形成抗朦結合部份。 基於此類事實，對人PTHrP鼠犟株抗體之可變匾的胺 基酸為適用於依Kab at等所作成之抗體胺基酸序列的資 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（β ) 料 ϋ 基(r S equenc e of Proteins of I 應 iiuno 1 o g i c a 1 Interest」 US Dept, Health and Hu臟an Services, 1 98 3 ),且藉由讕査相同性則可發現CDR匾。 (2)嵌合型抗體之表現載鼸之製作 若將繡碼鼠單株抗體之鼠L鏡（以下，表示抗體之L 鏈或Η鍵之情形為對於鼠以「鼠L鍵」、對於人抗鼸之 Η鋪以「人Η鍵j簡逑）及Η鏈V匾之DjiAH段進行選殖 ,則此些編碼鼠V匾之DNA,藉由與纗碼人抗龌恒定匾 之DNA連結並表現，則可取得嵌合型抗人PTHrP抗體。 用於製作嵌合型抗饑之基本性方法為含有令邐殖化之 cDN A所存在之鼠前導序列及V區序列，與哺乳類細胞之 表現載體中已存在之編碼人抗龌C匾之序列連絲。或者 ，含有令選殖化之cDN A所存在之鼠前導序列及V匾序列 與繡碼人抗體C匾之序列連結後，連結至哺乳類縐胞表 現載體。 含有人抗體C匾之多肽，可為任意的人抗龌之Η鏈C 區及人抗體之L鍵C匾，例如於人Η鐽者可列舉Crl、 Cr2、Cr3或Cr4,及L鐽者可列舉CA或Ck· 為了製造嵌合型抗體，首先，製作二種表現載體，即 經由如增強子/啓動子条表現控制區為控制基磔之含有 碥碼鼠L鏈V區之DNA及纗碼人L _C區之DNA之表現載 體、及以如增強子/啓動子条表現控制區為基礎之含有 編碼鼠H _V匾之DNA及鏞碼人Η鏈C匾之DNA的表現載 體。其次，經由此些表現載體對如哺乳類細胞之宿主細 -2 1- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 ______ 五、發明説明（>c;) 胞進行同時轉形，並將經轉形之細胞以生體外或生髏内 培養製造嵌合型抗體（例如，參造W0 9 1/ 1 6 92 8 )。 或者，將經蘧殖化之cDNA所存在之竄前導序列及编碼 鼠L鏈V匾之DNA及編碼人L鱅C區之DNA,和鼠前導序 列及编碼鼠Η鏞V匾之DNA及編碼人Η鋪C匾之DHA,導 入犟一之表現載體（例如，參照W0 9 4/ 1 1 5 2 3 ),並使用 該載艨轉形宿主細胞，其次令此經轉形之宿主以生體内 或生膿外培養生産目的之嵌合型抗體。 (i)嵌合型抗體Η鐽之構築 嵌合型抗體之Η鍵表現載體，可藉由含有編碼鼠Η鏞 V區之餘基序列的cDNA(以下，亦稱為「Η鏈V匾之cDNA) ,導入含有鏞碼人抗體Η鐽C匾之鹼基序列的基因組DN A (以下，亦稱為「Η鏞C匾之基因組DNA>或含有編碼該 匾域之CDNA(以下，亦稱為「H _C匾之eDNA>之適當的 表現載龌而取得e Η鏈C匾可列舉例如（^1,(^2^以或 Cr4 區。 (卜a)含有編碼Η鍵C區之基因組DN A的嵌合型Η鐽表 現載體之構築 具有編碼Η鏈C匾之基因組DN Α的表現載體，於鏞碼 Crl匾者可列舉例如HEF-PMh-grl(參照W092/ 19759)或 DHFR-Λ E-RVh-PMl-f (參照 W092/ 19759號）β 此處，令鏞碼鼠Η鏈V匾之eDN Α***此些表現載體時 ,可經由PCR法於該CDNA導入適當的鹼基序列。例如， 使用令該eDN A之51-終端具有適當的限制酶辨識序列， -2 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項^^|||^本頁) 訂 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明説明（y)) 且用於令轉錄效率良好而在該^11^之起始密碼子正前具 有Kozak交威序列所設計的PCR引子、及使用令該cDN A之 3*-終端具有適當的限制酶辨識序列，且用於令基因組 DN A之一次轉錄産物成為正確接合之A而具有接合供 髏部位所設計的PCR引子進行PCR,則可將此些適當的鐮 基序列導入表現載體中。 令如此所構築之鏞碼鼠Η鐽V區之eDSA,以適當的限 製酶處理後，***上逑載體，並構築含有繡碼Η鍵C匾 (Crl匾）之基因組DNA之嵌合型Η鍵表現載體〇 (i-b)含有編碼Η鍵鑛基序列之cDN Α之嵌合型Η鏈表現 載體之構築） 具有纊碼Η鏈C匾（例如Crl區）之cDNA的表現載髏可 如以下處理而構築。即，令含有編碼人型化PMI抗體Η _ V區及人抗體Η鏈C匾Crl之基因組DNA《S.Takahashi, 等，Cell 2 9 , 6 7 卜 6 7 2 1 98 2 )之 DNA 的表現載體 DHFR- ΔΕ-RVh-PMI-f(參照W092/ 19759)、和含有鏞碼人型化 PM1抗體L鏈V匾之基因組DNA及人抗體L鏈k鏈C區之 基因組DNA之DNA的表現載體RVl-PMla(參照W092/ 19759) 所導入之CH0細胞調製HiRiJA,並以RT-PCR法，選殖编碼 人型化PM1抗體Η鏈V區之CDNA及编碼人抗體Η鍵C匾 (Crl)之cDMA,並經由該cDH Α進行適當的限制酶處理並 連結至動物細胞表現用載體，則可構築目的之表現載體。 此處，令鏞碼鼠Η鏞V匾之cDNA,直接連結編碼人抗 體11鏈（；匾（^1之〇0»1時，可在含有編碼1!鍵¥匾之〇0^ -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項^1||^本頁) 、11 線 川9697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明説明（p ) Μ段中，以PCR法導入適當的鐮基序列。例如，使用令 該CDHA之5夂終端具有適當的限制酶辨織序列，且用於 令轉錄效率良好而在該CBN A之起始密碼子正前面具有 Kozak交威序列所設計的PCR引子、及使用令該cBNA之 3 ^終端具有與Η鏈C匾Cr 1之DNA直接連結之適當的限 制酶辨識序列所設計的PCR引子進行PCE,則可將此些適 當的鹼基序列導入該cDNA。 令如此所構築之编碼鼠Η鏈V區之cDNA,以適當的限 制酶處理，並與編碼上逑Η鐽C匾Crl之CDNA連結，藉由 ***如PC0S1或pCHOl之表現載體中，則可構築含有纊碼 嵌合型Η鏞cDNA之表現載體。 (U)嵌合型抗體L鏈之構築 嵌合型抗髏之L鍵表現載膿可藉由令鏞碼鼠L鐽V區 之CDNA、和编碼人抗體L鏈C匾之基因組DNA或eDNA連 結，並導入適當的表現載體而取得。L鏈C區可列舉例 如k鐽或又鏈β (ii-a)含有編碼嵌合型L鍵λ鏽之eDNA之表現載髅的 構築 在構築含有編碼鼠L鍵V區之cDN A的表現載鼸時，可 依PCR法將適當的鐮基序列導入該表現載體^例如，使 用令該cDNA之5’-終端具有適當的限制酶辨識序列，且 具有令轉錄效率良好之Kozak交感序列所設計的PCR引子 、及使用令3〜終端具有適當的限制酶辨織序列所設計 的PCR引子進行PCR,將此些適當的齡基序列導入該cDNA。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ----—-------裝-- (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂 -線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7__ 五、發明説明（—） 编碼人L鏈；I區C匾之cDNA,為以DNA合成機合成全 部驗基序列，並依PCR法構築。人L· _A_C匾為依據 同功類型之不間而已知至少存在4種，且任一種同功類 型均可使用於表現載醱之構築。例如，由輿蘧殖之鼠單 株抗體L鐽；I鱅C區之相同性之檢索，選出人L鏈Λ鐽 C匾片段之同功類型Mcg+ Ke+ Qz_ (accession Ho· X57819)(P.Dariravach等，Proc· Hatl· Acad· Sei.USA ，8 4 , 9 0 7 4 - 9 fl ? 8，1 9 8 7 )並使用於表現載嫌之構築。公 知之人L _又鏈C匾，例如為了構築Mcg+ Ke+ Qz-之 CD ΝΑ,可分成例如序列編碼11至14所示之下逑4種引子 〇引子MBC1HGP1(序列編號11)及MBC1H8P3(序列纗號13) 為具有有意義DNA序列，HBC1HGP2(序列纗號2)及MBC1H6P4 (序列編號1〇為具有反意義DNA序列，且在各別的引子 兩端設計具有20至2 3 bp之互補序列β MBC1HGPS(序列编號15)及MBC1H6PR(序列編號16)稱為 外部引子，為與MBC1H6P1、MBC1H6P4分別具有相同之序 列，且分別含有各別適當的限制酶辨識序列。使用PCR 法，將4種引子裝配，合成完全長度之eDNA,再加上外 部引子，進行cDNA之放大〇所譖以PCR法裝配，意指將 MBC1H6P2、或MBC1HGP3和MBC1HGP4輿其互補序列黏接， 合成 MBC1HGP1-MBC1HGP2M 段和 MBC1H6P3-MBC1H6P4片段 ，再經各Η段之互補序列黏接，合成纊碼完全長度之人 L鏈λ鏈C匾之cDNA。 令如此所構築之纗碼人L鋪又鐽C匾之cBNA、和如上 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項^1||^本頁) 訂 -線· 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7____五、發明説明（4 ) 逑所構築之編碼鼠L鐽V匾之cDNA,以適當的限制酶部 位間連結，再經由***至PC0S1或PCH01之表現載體，則 可構築含有編碼嵌合型抗體之L鏡；L鐽之cDN A的表現載 體〇 (ii-b)含有繡碼嵌合型L鳙k _之cDNA之表現載讎的 構築 於構築含有編碼鼠L鐽V匾之cDN A的表現載體畤，可 依PCR法，於該cDNA導入適當的鐮基序列。例如，使用 令於該eDNA之51-終端具有適當的限制酶辨識序列，且 具有為了使轉錄效率良好之Kozak交威序列所設計的PCR 引子，及使用含3夂終端具有適當的限制_辨識序列所 設計的PCR引子進行PCR,將此些適當的錄基序列導入該 cDNA中。 用於與編碼鼠L鏈V匾之DN A連結之鏞碼人L鐽k鐽 C區之DHA,例如可由含有基因組DNA之HEF-PMIK-gk(參 照 W0 9 2 / 1 9 7 5 9 )構築。 經由PCR法，於編碼L鏈k _ C匾之DNA的5’-終孅及 3^終端，導入適當的限制酶辨序列，並令如上逑權築 之編碼鼠L鐽V匾之DNA和纗碼L鏞k鐽C匾之DNA遽結 ，且經由***至如PC0S1或PCH01之表現載體，則可構築 含有編碼嵌合型抗體之L鏈k鐽之cD N A的表現載髏。 3·人型化抗醱之製作 (1)輿人抗體相同性之檢索 於鼠單株抗體之CD R移檀至人抗饑製作人型化抗體中 一 2 β _ (請先閱讀背面之注意事項 本頁) •裝· 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明（/ ) ，期望鼠犟株抗體之FB輿人抗體之FR之間存在高相同性 。因此，令鼠抗人PTHrP單株抗齷之Η鏈及L鋪之V匾 ，與使用蛋白質資料庫解明構造之全鄯已知抗驩之V匾 比較。又，同畤地輿依據Kabat等，依抗龌之FR長度、 胺基酸之相同性等所分類之人抗龌亞群（HS8 : Hti»an subgroup) Rabat , Ε·Α·等,ϋ S D ep . Health and Eluian Services, US Govern殖ent Printing Offices, 1991) 進行比較。 人H鏈V區之情形，侬據Rabat等以HSG分類，可分類 成HSGI〜III,鼠抗人PTHrP單株抗體Η鍵V匾為典HSGII 之交感序列具有82.7之同質性。另一方面，人L鐽λ鐽 V匾之依據Rabat等以HSG分類，可分別成HS6I〜VI,鼠 抗人PTHrP單株抗體L鍵；I鐽V匾均與任一層於匪群之 人L鏡；l_V區之交威序列不具有高同質性。 因此，於令鼠抗人PTHrP單株抗體人型化時，期望以 羼於HS6III,且相同性最高之人Η鏞V匾、或典型構造 (Chothia C·等，J.Mol.Biol· 196-901_917, 1987>— 致之具有FR構造之人Η鏈V區作為人Η鏈V匾，使用於 人型化抗體之構築。又，於人L鏈λ鏈V匾之亞群中無 相同性高的交威序列，故期望以蛋白質資料庫中所登記 之具有最高相同性之人抗龌L鏞；I鏽V匾，使用於人型 化抗體之構築。 (2)鏞碼人型化抗體V匾之DN Α之設計 於繡碼人型化抗體V匾之DN A之設計中，第一階段為 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 本頁) -裝- 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（4) 選擇作為設計基礎之人抗鼸v匾❶ 本發明中，與鼠抗齷v匾之FR具有80%以上同質性之 人抗體V匾之F8,可使用於人型化抗體❶此處，Η鏈？ 區之FR為颺於亞群III者，可列舉例如以來自S31678 (HBRF-PDB、Cuisinier Α·Μ·等，Eur· J· I 臟 nuiiol.23, 110- 1 1 8 , 1 99 3 )之FR作為實質相同之FRH.e又，L鏈 V區之FR可列舉例如以來自人抗體HSU 0 3 7 5 7 ( 6EN-BANK 、Deftos MU、 Scand· J· I 祖戮unol.39, 95-103， 1994) 之FR1、FR2及FR3、和來自人抗體S25755(NBRF-PDB)之 FR4作為實質相同之FRH段〇 尚，人抗體S 3 1 6 7 9為由人胎兒肝臓之CDNA庫所邐殖之 抗體，人抗體HSB 0386 8為以新潁之人L鏈又鍵V區之 基因型式被選殖之抗體。 (3)含有人型化抗體V區之多肽之製作 本發明之人型化抗體為以該抗體之C匾、及V匾之骨 架（FR)匾為來自人類者，V區之互補性決定匾域（CDR) 為來自鼠者（第1圖本發明含有人型化抗體V匾之多 阪，若為可取得作為模板之人抗讎DNAH段，則可侬PCR 法以所諝的CD Ε移檀之手法予以製作。所諝「CDR-移植」 ，意指製作鏞碼來自鼠之CDR的DNA片段，並以此作為模 板與人抗醱之CDR進行交換之手法。 又，若無法取得作為模板之人抗體DNAH段時，則以 DNA合機機合成資料_基所發記之鐮基序列，並依卩“法 製作人型化抗體V區之DNAC再者，於僅登記胺基酸序 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------^ II (請先閲讀背面之注意事項再mr本頁) 訂 線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7___ 五、發明説明（巧） 列之資料鹼基時，則以此胺基酸序列為基礎，侬據Kabat ,E . A.等報吿（US Dep· Health and Huaan Services, U S G o v e r n 麗 e n t P i1 i n t i n g 0 f f i c e s，1 9 9 1)之抗體密碼 組之使用頻率，則可類推全部的鹼基序列❹以DN A合成 機合成此鐮基序列，並依PCR法製作人型化抗儒V匾之 DNA,且經由令其導入適當宿主並表現，則可製作目的 多肽。 以下，示出可取得作為模板之人抗釅DHAH段時之依 PCR法之CDR-移檀的一般性概要。 (i) CDR-移植 如第2圖所示，鏞碼V匾之DNA為以編碼FR1、CDR1、 FR1、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4 之順序連結。 首先，合成對應於各CDR之來自鼠之DNA片段。CDftl〜 3為以先前所選殖之鼠Η鐽V匾及L _V匾之鐮基序列 為基礎所合成之DNA。移植引子B僳合成為具有有意義 方向之鼠CDR1和雜交至人抗體FR2之序列，移植引子E 偽合成為具有反意義方向之CDR1和雜交至人抗體FR1之 序列（鼸於移植引子C和F、移植引子D和G亦同樣）（第 2(1>圖）。又，亦合成在FR1之上游區域及FR4之下游區 域可雜交之適當引子（所譖的外部引子；第2(1)圖之A 及H>。尚，移植引子之分離、萃取可依公知之手法進行 (Sambrook等，Molecular Cloning; A Laboratory Manual,冷泉港實驗室印，1 989 )。 其次，使用移檀引子E和外部引子A ,移植引子B和 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐） ----------^-- (請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7___ 五、發明説明（4 ) F、移植引子C和G、移植引子D和外部引子H、進行第 一 PCR。其結果，分別取得Η段A-E、片段B-F、Μ段C-G 及片段D-Η(第2(2)圖）。 如前逑，因為移植引子Β之上游和移植引子Ε之下游 部分區域為令以重覆設計（鬭於移植引子C和下、D和6 亦同樣），故此些片段，經由令以適當的溫度條件下反 塵，則黏接至各別之互補性序列，並經由PCR則可裝配 具有A至Η為止長度之DNA。其後，在取得編碼V匾之 一個DNAH段處加上外部引子Α和Η、並經由進行PCR， 則可取得FR1〜4為來自人者而CDR1〜3為來自鼠者之纗 碼人型抗體V匾之DHAe其後，藉由令其導人適當宿主 並表現，則可取得目的多酞（第2(3)圖>。 (ii>纗碼人型化Η鏈V匾之DN A及表現载醱之構築 本發明為因無法天然取得作為人型化抗嫌模板之編碼 人抗體Η鏈V區之DNA,故該DNA為以DNA合成機合成編 碼Η鏈V匾之DN A的全部鹼基序列，並依PC R法可將其構 築。 鼠抗人PTHrP單株抗體Η鏠V區為與羼於人亞群III之 S31679具有高相同性。為了以此人抗簾作為模板並構築 編碼石型化Η鐽V區之DNA,則例如可分別使用序列编 碼23至26所示之4種引子，引子MBC1H6P1(序列鏞碼23) 及MBC1HGP1(序列鯆號24)為具有有意義DNA序列， MBC1HGP2(序列編號25)及MBC1HGP4(序列編號26)為具有 反意義DNA序列，且在各別的引子兩端設計具有15至21bp -30- (請先閲讀背面之注意事項 本頁) •裝· 訂 -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（β ) 之互補序列。 外部引子MBC1HVS1(序列钃號27)、MBC1HVR1(序列纗 號28)為具有與MBC1HGP1、MBC1HGP4分別相同之序列， 且分別含有各別適當的限制酶辨識序列。使用PCR法， 合成裝配4種引子之完全長度cDNA,再加入外部引子並 進行CDUA之放大。所譖以PCR法裝配，意指將MBC1HGP1 和MBC1HGP2、或MBC1HGP3和HBC1HGP4經其互補序列黏接 ，合成 MBC1HGP1-MBC1HGP3H 段和 MBC1H6P2-MBC1H6P4H 段，再者，經由各片段之互補序列黏接，合成完金長度 之人型化Η鐽V區之DNA。 人抗體Η鏈C區可為任意的人Η鍵C匾，可列舉例如 人 Η 鏈 C r 1、C r 2、C r 3 或 C r 4 0 如前逑所構築之人型化抗體Η鏈V匾之DN A可輿任意 之人抗饑H _C匾，例如人Η鏈C匾Crl匾之DNA連結。 如嵌合型抗體Η鰱之構築所逑，以適當的限制酶處理後 ，如在增強子/啓動子条之表現控制匾為基礎與编碼人 Η鏈C區之DN Α連結，製作含有人型化Η鐽V匾及人Η鰱 C區之DN Α的表現載體。 (iiU繡碼人型化L鏈V區之DNA及表現載體之構築 本發明為輿編碼Η鋪V區之DN A情形相同，因無法天 然取得作為模板之人抗體L鋪V區之DNA,故以DNA合成 機合成編碼L鏈V匾之DAN的全部鹼基序列，並依PCR法 可將其構築。 為了以與鼠抗人PTHrP單株抗體L鐽V匾最具相同性 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 -裝·
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^^697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明（w) 之人抗體HSU 0388 8作為模板，柳築人型化L _V匾之 D ΝΑ,乃例如分別使用序列編號29至3 2所示之4種引子 。引子MBC1LGP1(序列鏞碼29)及MBC1L6P3(序列纗碼30> 為具有有意義D8A序列，MBC1LGP2(序列鑛號31)及MBC1LGP4 (序列钃號32)為具有反意義DNA序列，且分別於引子之 兩端設計具有15至21b p之互補序列。 外部引子MBC1LVS1(序列編號33>、MBC1LVR1(序列編 號34)為具有與MBC1LGP1、MBC1LGP4分別相同之序列， 且分別含有各別適當的限制酶辨識序列•使用PC11法， 合成裝配4種引子之完全長度DNA,再加入外部引子進 行DNA之放大〇所諝以PCR法裝配，意指將MBC1LGP1和 MBC1LGP3、或MBC1LGP2和MBC1H6P4與其互補序列黏接， 合成 MBC1LGP1-MBC1LGP3H 段和 MBC1LGP2-MBC1LGP4片段 ，再者，經由各Η段之互補序列黏接，合成完全長度之 繡碼人型化Η鏈V區之DNA。 人抗體L鐽C匾可為任意的人L鐽C區，可列舉例如 人L鍵C又和Cke 如前逑所構築之人型化抗體L _V區之DN A可輿任意 之人抗體L鐽C匾，例如人L鐽C；l匾者連結·以適當 的限制酶處理後，如在增強子/啓動子条之表現控制匾 域為基磔，與鐮碼人L鏈；I鐽C區之DN A連結，製作含 有编碼人型化L鐽V匾及人L鏈；I鏈C區之DNA的表現 載體。 如前逑處理，即使被製作成含有人型化抗體V區之多 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 •本頁) -裝· 訂 509697 A7 B7 五、發明説明（w ) 肽，亦不一定明瞭該多酞是否具有作為抗體之活性（對 抗原之結合活性、中和活性等）。特別於L _之倩形， 因鼠抗人PTHrP單株抗體L鐽V區為來自非常稀少之VAX 基因，故經由令輿人型化Η鐽組合而在如COS-7之動物 細胞中表現，則有必要檢討活性之有無。 用於明瞭人型化抗鼸V匾之何種FR為參輿人型化抗體 之結合活性及中和活性之方法，為以構築雜交V匾 (0 h t 〇 磁 ο，T ·等 Μ ο 1 e c u 1 a r I 酿霣 U n ο 1 〇 g y , 3 2 , 4 0 7 - 4 1 6 , 1995)、確認者為有效。為了讕査本發明之人型化抗龌 L鍵V區中，令任何胺基酸變異則可取得具有活性者， 乃構築人型化抗體之FR區Μ段來自鼠之FR匾Η段重組者 之編碼DNA,並進行用以人型化之各區之評價。 如第3圖所示，製作具有FR1及FR2為來自人抗饑但FR3 及FR4為含有來自鼠抗驩重組V匾之多肽之抗體（具有此 類重組Η段之抗體稱為「雜交抗醱J )、僅FR1重組為人 者之雜交抗體、僅FR2重組為人者之雜交抗體。其後， 令編碼此些雑交抗體之DHA組入表現載體中，並使人型 化抗體一次性地表現，調査抗醱性之有 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再IJfN：頁) 本發明者，使用此方法檢討關於含有L _V區之多肽 的抗原結合活性及中和活性，結果判定於FR及FR3中， 存在該取代之按基酸。 本發明者為判定在FR2及FR3區存在參與活性之胺基酸 ，且明瞭依據 Kabat, E.A.等（US Dep. Health and Huian Services, US Government Printing Offices, -33-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（& ) i99l)所決定之抗體之胺基酸編碼第36、45及49個之胺 基酸、及第87個胺基酸（存在於FB3匾）為參與活性之胺 基酸。 於是，本發明為製作含有此些胺基酸經變異（例如取 代）之V區之多肽。 首先，依據前逑之CDR-移植，調製含有用於導入胺基 酸變異之基本胺基酸序列之V區之多肽。此基本多！fe為 含有序列編碼47所示之胺基酸序列，為「型式a」（表1 之a)e 其次，以此型式a作為基準，製作令FR之數餹胺基酸 變異之各種變異型Η段。 變異之導入為設計编碼欲導入目的變異之胺基酸的寡 核甘酸引子（變異原引子），並使用該引子以PCR進行。 如此處理，則可製作含有令F82及FR3特定胺基酸變異 之V區之多鏞碼（型式b-t)(表1之b〜t)e -----------I . (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 »34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（衫
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E 3IXAislosnl-----------------------c.oc.:13UHM VJVASSHuss,uu.nM>svssvsf S二SI.IA.OaDaconvlll 3UAiSH〇SSMl :U1MVSVU1SJS<-Sss0rl>10 ，一η·ι·Ί 3i KU0SV132 cnossiusst9SKn 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2®公釐） -35- 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (Μ ) 1 1 如 前 逑 所 構 築 之 编 碼 人 型 化 抗 體 L m V匾各型式之BNA 1 1 9 可 與 任 章 /SS\ 之 人 抗 體 L 鐽 C 區 例 如 人 L鍵CA區之DNA 1 1 連 結 〇 以 適 當 的 限 制 Μ 處 理 後 5 如 在 增 強子/啓動子条 請 1 I 先 1 之 表 現 控 制 區 左 右 輿 编 碼 人 L 鐽 Λ 鐽 C 匾之DNA連結。 閲 讀 1 I 製 作 含 有 编 碼 人 型 化 L 鐽 V 區 各 型 式 之 DNA、和編碼人 背 面 1 | 之 1 型 化 L 鐽 λ 鏈 C 匾 之 DNA的表現載膿。 注 意 1 I 又 ， 令 如 前 逑 所 構 築 之 鏞 碼 人 型 化 抗 醱Η鏞V區及人 事 項 再 1 I Η 鏈 C 匾 之 DN Α. 和纒碼人型化L 鍵V 匾及人L鐽C匾 本 1 裝 之 DN Α, 導入單- -之表現載體（例 如 > 參 照冒094/ 11523) 頁 1 I > 並 使 用 該 載 醱 轉 形 宿 主 細 胞 其 次 令 此經轉形宿主於 1 1 生 内 或 生 體 外 培 養 % 可 産 生 百 的 之 人 型化抗讎。 1 1 4 . 嵌 合 型 抗 體 及 人 型 抗 體 之 製 造 1 訂 為 了 製 造 嵌 合 型 抗 體 或 人 型 化 抗 體 $ 乃如前逑分別製 1 作 二 種 表 現 載 體 〇 即 9 對 於 嵌 合 型 抗 體 ,製作經由如增 1 | 強 子 / 啓 動 子 % 表 現 控 制 區 為 控 制 基 礎 之含有編碼鼠Η 1 鏈 V 區 及 人 Η 鐽 C 區 之 DNA的表現載體、 及以如增強子 1 1 / 啓 動 子 条 統 表 現 控 制 區 為 基 礎 之 含 有 鏞碼鼠L鏞V匾 • 線 | 及 人 L 鏈 C 匾 之 DNA的表現載體， 對於人型化抗體，製 讎 1 1 作 經 由 如 增 強 子 / 啓 動 子 条 表 現 控 制 區 為控制基礎之含 1 1 有 編 碼 人 型 化 Η 鐽 V 匾 及 人 Η 鏈 C 匾 之 DNA的表現載髏、 1 I 及 以 如 增 強 子 / 啓 動 子 条 表 現 控 制 匾 為 基礎之含有鏞碼 1 1 I 人 型 化 L 鏈 V 區 及 人 L 鍵 C 區 之 D8A的表現載體。 1 1 其 次 $ 經 由 令 此 些 表 現 載 體 於 如 哺 乳 類細胞之宿主細 1 I 胞 中 同 時 轉 形 t 其 後 令 經 餺 形 之 細 胞 以 生體外或生體内 1 1 -36- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) 培養製造嵌合型抗體或人型化抗龌（例如，參照W091/ 16928)0 又，令编碼H _V區及Η鏡C區之DNA、及鏞碼L鏈 V區及L鐽C匾連結至單一載體，並轉形適當的宿主細 胞，可産生抗體。即，於嵌合型抗體之表現中，令經選 擇之cDN Α所存在之鼠前導序列及编碼鼠Η鏈V區及人Η 鐽C區之DN Α、和鼠前導序列及鏞碼鼠L鐽V區及人L 鏈C區之DNA,導入單一之表現載體（例如，參照W0 9 4/ 11523)。於人型化抗髏之表現中，令繡碼人型化Η鰱V 區及人Η鍵C區之DNA,和編碼人型化L鏈V區及人L鐽 C匾之DNA,導入單一之表現載體（例如，參照W0 94/ 1 1 5 2 3 )。其後，使用此些載體轉形宿主細胞，其次令此 經轉形之宿主以生體内或生體外培養，産生目的之嵌合 型抗體或人型化抗體。 將如上處理經编碼目的嵌合型抗體或人型化抗體之DN A 所轉形之轉形體予以培養，且所産生之嵌合型抗體或人 型化抗體可由細胞内或細胞外分離並精製至均勻為止。 尚，本發明目的蛋白質之嵌合型抗讎或人型化抗髏之 分離、精製，可使用蛋白質A瓊脂糖柱進行。又，其他 若使用通常蛋白質所用之分離、精製方法即可，並無任 何限定。例如若適當選擇、組合各種層析、超遇濂、鹽 析、透析等，則可分雜，精製嵌合型抗鼸或人型化抗體〇 為了製造對人PTHrP之本發明的嵌合型抗龌或人型化 抗體中，可使用任意的表現条。例如，於使用真核細胞 -37- (請先閲讀背面之注意事項 本頁) 裝. 訂 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7___ 五、發明説明（W ) 時可列舉動物細胞（例如已建立之哺乳細胞条）、輿絲狀 _或酵母細胞等，於使用原核細胞時可使用細鯖細胞（ 例如大腸捍豔細胞等）等。較佳令本發明之嵌合型抗龌 或人型化抗體為在哺乳細胞例如C0S細胞或CH0細胞中表
XM 塊Ο 此些情形中，或使用在哺乳細胞表現中所有用的常用 啓動子。例如，以使用人類巨細胞病毒前期《hu»an c y t 〇 进 e g a 1 〇 v i r U s i 祖进 e d i a t e e a r 1 y , H C Μ V }啓動子為較 佳。含有HCM啓動子之表現載體例為HCMV-VH-HCrl、 HCMV-VL-HCK等，包含來自 pSV2neo者（W092-19759)。 又，其他，於本發明可使用之哺乳動物細胞中基因表 現之啓動子，若為使用逆轉錄酶病毒、多瘤病骞、腺病 毒、猴病毒40(SV4fl)等之病毒啓動子和人類多肽鏈延長 因子la (HEF-lcr )等之來自哺乳動物細胞之啓動子即可 c例如於使用SV40啓動子之情形中，若依Mulligan等之 方法（N a t u r e 2 7 7 , 1 0 8 , 1 9 7 9 ),於使用 Η E F - 1 α 啓動子 之情形中，若依Μ i ζ u s h i a a , S ·等之方法（Ν u c 1 e i c Acids Research, 18, 5322, 1990)則可輕易實施 e 複製起源可使用來自SV4fl ,多瘤病毒、膝病毒、牛乳 頭狀瘤病毒（BPV)等者，再者為了在宿主細胞条中放大 基因之複數數，表現載饑可含有磷酸轉移酶APH(3’）II 或I(neo)基因、胸腺核甘激_(TK)基因、大腸桿餹黃噤 冷素-鳥嗦昤轉磷酸核糖基_(Ecogpt)基因、二氳葉酸 還原酶（DHFR)基因等作為選捧標記。 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再mr本頁) •裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 聊697 A7 —^___ 五、發明説明（W ) 5·嵌合型抗體及人型抗體之抗原結合活性及中和活性之 評價 (1)抗體之濃度測定 所得精製抗體之濃度的測定，可依EUSA進行。 用於測定抗體濃度之ELIS A平板為如下調製。於ELISA 用之96孔穴平板（例如Maxisorp，NUNC)之各孔穴，以例 如調製成l/i g/inl濃度之山羊抗人IgG抗體100# 1予以固 相化。以20#1之稀釋緩衝液（例如50nM Tris-HCl、InM MgC 1 2、〇 . 1M NaCl、0.05% Tween 20、0.02% NaNs、 1%牛血清白蛋白（BSA)、PH7.2)封阻後，將表現出嵌合 型抗體、雜交抗體或人型化抗體之C0S-7細胞或CH0細胞 之培養上清液、或精製之嵌合型抗體、雜交抗體或人型 化抗體予以階段稀釋並加至各孔穴，其次加入_性鐮酸 酶所結合之山羊抗人Ig6抗體並加入lfflg/ml之 受質溶液（Sig®a 1D4，對-硝苯基磷酸、SI6MA)、其次 以微平板讀數器（Bio Rad)测定4 0 5 H11下之吸光度。測定 濃度之標準品可使用Hu IgGlA Purified(The Bing S 11 e ) 〇 (2)抗原結合能力之測定 用以測定抗原結合之ELISA平板，為如下調製。於ELISA 用96孔穴平板之各孔穴中，以調製成l>ug/ ml濃度之人 P T H r P (卜3 4 ) 1 0 0 >u 1予以固相化。以2 0 0 # 1之稀釋緩衝液 封阻後，將表現出嵌合型抗體、雑交抗體或人型化抗體 之C0S-7細胞或CHO細胞之培養上清液、或精製之嵌合型 -39- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）
Huai ^—·κκ 1_11 11 1_1 -—^1· mmmmmmmmmim m··- I (請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（W ) 抗體、雜交抗體或人型化抗體予以階段稀釋並加至各孔 穴，其次加入鹸性磷酸酶所結合之山羊抗人IgG抗體 100/i 1 ,並加人lmg/ Bl之受質溶液（SigBia 104、對-硝 苯基憐酸、SIGMA)、其次以撤平板讀數器（Bio Rad)測 定定4 0 5ηηι下之趿光度。 (3 )中和活性之拥I定 鼠抗體、嵌合型抗體及人型化抗體之中和活性的测定 ，可使用例如大鼠骨肉腫細胞株R0S 1?/2·8-5細胞（ Sato, Κ·等，Acta Endocrinology 116，113-120，1987 )進行。即，令R〇S 17/2.8-5細胞以4®M之氳基膠吡啶 剌激、誘發PTH/PTHrP受體。以ΙβιΜ之異丁基-1-甲基黃 嘌昤素（IBMX、SIGMA)抑制cDNA之分解酶，測定中和活 性。令鼠抗體、嵌合型抗體或人型化抗體輿PTHrP(l-34) 等量混合，且在各孔穴中加入各抗體和PTHrP(l-34)之 混合液。經由PTHrP之剌激，測定大鼠骨肉瘤細胞株 R0S17/2.8-5細胞所産生之cAMP量，則可評價鼠抗龌、 嵌合型抗體或人型抗體之中和能力。 (4)於PTHrP和抗PTHrP抗體之相互作用解析速度論 本發明為在PTHrP和抗PTHrP抗體之相互作用中，使用 各種手法解析速度論。具體而言，可藉由Sketchard解 析和稱為BIAC0RE之表面質粒基因組共振感應器（Pharmacia Biotech公司所開發、實用化）測定解離常數、解離速度 常數、結合速度常數，而本發明為以其一例，説明依稱 為BIAC0RE之表面質粒基因組共振感應器解析之情形。 -40- (請先閲讀背面之注意事項 本頁) •裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（Μ ) BIAC0RE之基本構造為以三稜鏡作為光源、由檢波器 和测撤計流路所構成。實際上，於上匣式之_應器蕊Η 上令配位體固定化，且於此注入被分析物。若兩者具親 和性，則以光學檢_其結合量。 其檢測原理稱為表面質粒基因組共振現象。即，於玻 璃和金羼薄膜之界面以全反射入射之光中，某些角度之 入射光為使用於表面質粒基因組之激發而衰減。其角度 為依賴於接觸金羼薄膜（威應器）之溶劑濃度變化而變動 。BIAC0RE為所諝檢測此變動。 於BIAC0RE中此變化稱為共振訊號（SPR訊號），0.1度 的變化視為 l〇D〇RU(resonance unit)。 1000RU為在表面 積I*·2之薄金臧應器上結合約lng蛋白質時之變化量， 若為蛋白質則可充分檢澜50RU(50pg)左右之變化。 所撿测之訊號為在BIAC0RE所附羼之電腦將所稱之威醮 器克數（sensor gra*)變換成結合曲線，並於實時處理 中於電腦顯示器出描出（夏出徹他、（ 1 9 9 5 )實驗B學13 、563-569 頁）（Karlsson, 8·等，（1991)J.lBiiBiinol· Methods 145, 229-240頁）〇 依據上逑之BIAC0RE,可測定本發明抗PTHrP抗體之動 力學參數，即解離常數（KD)、解離速度常數Udiss)及 結合速度定數（Kass)。 本發明之抗PTHrP抗體為以解離常數（KD值）愈小值者 具有中和活性愈佳。於本發明之抗PTHrP抗體中，KD值 為1.86X1 (T?以下為較佳，以1.86X1 (T3以下為更佳， -41- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 線 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明（0 ) 且以3 · 5 8 X 1 0%以下為較佳，以下為最佳。 又，KD值為由解離速度常數（Kdiss)及結合速度常數 (Kass)二種參數所決定（KD=Kdiss/Kass)e因此，可知 Kdiss值小，且若Kass值大則KD值變小β 具體而言，本發明之抗PTHrP抗體之情形，以Kdiss值 若為1.22X 10-1 〔 l/Sec〕以下則佳。較佳為Kdiss值為 1 · 2 2 X 1 (Γ2以下，更佳為3 . 1 6 X 1 (Γ4以下，最佳為 2.32XUT4 〔Ι/Sec〕以下 β Β — 方面，Kass之值若為 6.55Χ104 〔1/Μ· Sec〕以 上則佳❶較佳為Kass值為6.55X105以上，更佳為 0.883X106 以上，最佳為 i.〇3XlOe 〔l/M*Sec〕 再者，Kdiss 值為 1.22X10-1 〔Ι/Sec〕以下，且 Kass 值為6.55X 1〇4以上之抗體亦佳。 再具體而言，本發明之抗PTHrP抗體以KD值為在 1 · 0 2 X 1 〜1 · 8 6 X 1 (Γ7 〔 Μ〕之範圍，以 1 · fl 2 X 1 Ο·10 〜1 · 8 6 X 1 0㈤〔Μ〕者為最佳，以1 · 3 4 X 1 0-⑽〜 3·58Χ ΙΟ， 〔 Μ〕者更佳，以 2·25Χ ΙΟ,〜3.58Χ l(Ti0 〔Μ〕者為最佳β 又，Kdiss 值為在 7·38Χ l〇，s 〜1·22Χ 1()-1 [l/sec]之 範圍，以 7·38Χ 〜le22>< 1(r2 [1/see^ 較佳 以 1·66Χ 1〇·4 〜3·16χ 1{r4【1/sec^ 更佳以 16β>< ι〇4 〜2·32Χ 10·4 [1/sec】者最佳， 而 Kass值為在 6·55χ 104 〜1·24Χ 1〇7 之範 圍，以 6.55X11JS 〜ι·24Χΐ〇β 〔i/jj· jjec〕者較佳， _ 4 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填頁)
、1T 線 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印f 五、發明説明（41 ) 以 7.23X105 〜1·〇3ΧΐΟβ 〔1/M· Sec〕者更佳，以 0.883X i〇6 〜1·〇3Χ 10β 〔 1/M· Sec〕者最佳。 此些KD值、Kdiss值及Kass值雖可依Sketchard解析、 或BIACORE等之表面質粒基因組共振威應器等所取得， 但以使用BIACORE取得為較佳。 6·含有抗PTHrP抗體或人型ft抗體作為有效成分之醫藥 組成物及高鈣血症抑制劑 於確認對PTHrP抗體或人型化抗體之治療效果上，可 將對PTHrP之抗體或人型化抗體投予呈現高鈣血症之動 物，並經由測定高錚血症之指檫則可確認其治療效果。 又於呈現高鈣血症之動物及高鈣血症患者中，屢次察見 低磷血症，而本發明之抗膿亦可使用於改善此低磷血症。 本發明所使用之抗體，為具有前述解離常數、解離速 度常數及結合速度常數之抗PTHrP抗體（含有人抗體、嵌 合型抗體、引子化抗體）或對PTHrP之人型化抗體、此抗 體為經由結合至PTHrP,而中和PTHrP活性之抗體，特別 地，較佳可列舉人型化# 2 3 - 5 7 -137-1抗體。人型化#23-57-137-1抗體之製作方法為記載於實施例1〜3β 本發明所使用之抗體可組合鹽析法、使用HPLC等之醪 過濂法、使用蛋白質Α柱等之親和性層析法等之通常的 精製手段予以高純度精製。如此所精製之抗體可經由放 射免疫測定法（RIA)、酵素免疫測定法（EIA、ELISA)、 或螢光抗體法（Itauiiiiofliiorescence Analysis)等邋常 之免疫學手段、確認可高精確度地辨識PTHrP。 -43- (請先閱讀背面之注意事項再 -裝- 頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 Α7 Β7 五、發明説明（p) 於呈現高錚血症之動物，可使用經由令産生PTHrP之 腫瘤細胞移檀至免疫機能降低或缺失之實驗動物，所製 作之模型動物。所移植之腫瘤細胞，以來自人類之腫癯 細胞為較佳，可列舉例如人胰臓癌ΡΑΝ-7。又，腫瘤細 胞所移植之免疫機能降低或缺失之動物可列舉裸鼠、 SCID 鼠。 高鈣血症之抑制的評價，可經由經時觀察血中鈣濃度 、體重減少、或蓮動量降低，並評價其改善程度而進行。 本發明之含有對PTHrP抗體或人型化抗體作為有效成 分之醫藥組成物及高鈣血症抑制劑，可非經口地全身或 或局部地投予。例如，可邐擇點滴等之靜脈内注射、肌 肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、且可依患者之年齡 、症狀而選擇適宜投予之方法。有效投予悬為在每一次 對體重1公斤以0.0 1毫克至10 0 0毫克範圍中選擇。或者 ，可選擇每患者5〜10000毫克/値體，較佳為50〜1000 毫克/傾體之投予量。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再頁) 本發明之含有對PTHrP抗簾或人型化抗體作為有效成 分之醫藥組成物及高鈣血症抑制_，亦可依投予途徑而 共同含有醫藥容許載體和添加物。此類載體及添加物之 例可列舉水、翳藥容許之有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、 聚乙烯基毗咯烷_、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素納 、聚丙烯酸納、藻酸納、水溶性Μ聚糖、羧甲基澱粉納 、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃蓍膠、***_ 、酪蛋白、明膠、洋菜、二甘油、甘油、丙二醇、聚乙 -44-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（d ) 二醇、凡士林、石蟠、硬脂醇、硬勝酸、人類血清白蛋 白（HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫藥添加 物所容許之界面活性薄等。所使用之添加物可依據本發 明之劑型，由上逑之中適當或組合選擇，但並非限定於 此。 尚，本發明之抗體可廣泛使用於經由各種癌（惡性腫 瘤）所誘發之高鈣血症此些癌種並無特別限定，不僅 為單一之癌且亦包含併發複數癌者。癌種可列舉例如胰 臓癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、齒肉癌、食遒癌 、胃癌、臛管癌、乳癌、腎癌、勝胱癌、子宮癌、前列 腺癌或惡性淋巴腫等。 〔實施例〕 以下，依參考例及實施例再具體説明本發明。但，本 發明並非以此些實施例等而限定其技術性範睡。 〔參考例1〕 産生抗PTHrP(l-34)鼠單株抗體之融合瘤之製作 産生對人PTHrP(l-34)單株抗體之融合瘤#23-57-154 及#23-57 - 1 37-1之製作，為依據佐鼷幹二等而進行。 為了使用作為免疫原，令PTHrP(l-34)(Peninsula製） 和載體蛋白質之甲狀腺球蛋白使用硪化二亞胺（Doji nil) 予以結合。將與甲狀腺球蛋白結合之PTHrP(l-34)透析 ，並將蛋白質濃度調整至2#g/Bl後，與弗洛因德佐劑 (Difco)以1: 1混合，製作成乳劑後，於16隻BALB/C母 鼠之背部皮下或腹腔内以每動物100# g免疫11回。初回 -45- (請先閲讀背面之注意事項再· -裝 填 頁) 、1Τ 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7__ 五、發明説明（Μ ) 免疫為使用弗洛因德完全佐劑，於第二回以後之追加免 疫中使用弗洛因德不完全佐劑。 免疫鼠血清中之抗體價之測定為以下逑方法進行❻卽 ，由鼠尾靜脈採血，且將血清分離後以RIA緩衝液稀釋 之抗血清與混合，並測定結合活性 。於抗體價上升之鼠腹腔中，將未結合載體蛋白質之 卩111^?(1-34)以每動物50//8進行最終免疫。 於最終免疫第3日屠殺鼠，將脾臓摘出後，令脾臓細 胞和鼠骨鏈瘤細胞之細胞株P3X63Ag 8U.1,使用50% 聚乙二醇40D0依常法進行細胞融合。將細胞融合之細胞 以2X104/孔穴之細胞數裝入85値96孔穴平板。融合 瘤之選取為使用HAT培養基進行。 融合瘤之篩選為經由令HAT培養基中可察見生長之孔 穴的培養上清液，以固相化RIA法测定並選擇有無PTHrP 辨識抗體而進行。由察見與抗體結合能力之孔穴回收融 合瘤，並懸浮於含有1596FCS之RPMI-1640培養基中添加 OPI-Supple»ent (Sigma)之培養基中，並以限界稀釋法 實施融合瘤之犟一化。取得與PTHrP(l-34)之結合能力 強之選殖株 #23-57-154及 #23-57-237-1。 尚，融合瘤蘧殖株#23-57-137-1為以nouse-«ouse hybridoiaa # 2 3 - 5 7 - 1 3 7 - 1 ,於工業技術院生命工學工業 技術研究院（茨城懸築波市東1 丁目1-3號）中，於平成 8年8月15日，以FERM BP-5631依布達佩斯條約予以國 際寄存。又在1 9 9 7 - 9 - 2 4寄存於食品所（CCRC 9 6 0 0 6 9 )。 -4 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------^1. (請先聞讀背面之注意事項再ml本頁) 訂 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（“） 〔實施例1〕編碼對人ρ τ H r P《1 - 3 4 )鼠株抗體V區之D N A 的選殖 編碼對人PTHrP(l-34)鼠單株抗體#23-57-137-1可變 區之DNA,為如下進行選殖。 (1) hiRNA之調製 來自融合瘤#23-57-137-1之uRN A為使用Quick Prep nR N A Purification Kit(Phar»acia Biotech公司)予以 調製。融合瘤# 2 3 - 5 7 - 1 3 7 - 1之細胞以萃取緩衝液完全地 均質化，並依套件所附之配方，以寡（dT)-纖維素旋轉 柱（0 1 i g 〇 ( d T〉- C e 1 1 u 1 〇 s e S p u n C ο 1 U 扭 n )精製 si R N A ,並 進行酒精沈澱。將iRNA沈濺物以溶出緩衝液溶解。 (a)編碼鼠Η鏈V區基因之cDN A的製作及放大 (i) # 2 3 - 5 7 - 1 3 7 - 1抗體Η鏈V區之cDNA的選殖 編碼對人PTHrP鼠單株抗體Η鍵V匾之DNA的選殖為依 δ'-RACEti (Frohinan* Μ·Α·等，P r o c . Natl. Acad. Sci· USA, 85,8998-9002, 1988;Belyvasky, A·等，Nucleic Acids Res . 17， 2 9 1 9 - 2 9 3 2 , 1989)進行 〇 於 5*-RACE法 中使用 5 · - A p 1 i F I N D E R P A C E K i t ( C L 0 N E T E C H 公司）， 且依套件所附之配方進行操作· cDN A合成中所用之引子 為使用與鼠Η鏈恆定匾（C區）雑交之MHC2引子（序列纗 號1)。以如前逑調製之SIRNA約2>ug作為模板並加入MHC2 引子lOpaole,經與逆轉錄酶於52°C、反應30分鐘，進行 對cDNA之逆轉錄。 以6N NaOH將RNA水解（65°C、30分鐘）後，以酒精沈醱 -47- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ----------^ ! (請先聞讀背面之注意事項再ιΐϋ本頁) 訂 線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 ' _ B7_____ 五、發明説明（4 ) 精製cDNAe以T4RNA連接酶經於3PC下6小時、室溫下 16小時反應，則可在合成之cDNA的5·終端連結Anipli FINDER Anchor(序列編號42)。以其作為模板PCR放大所 用之引子為使用Anchor引子（序列編號2)及MBC-G1引子 (序列編號 3)(S.T.Jones，等，Biotechnology， 9， 88， 1991) 〇 PCR溶液為在其 中，含有 l〇_M Tris-HCl(pH8.3) 、50ιιΜ KC1、fl.25mM dNTPsUATP、dGTP、dCTP、dTTP) 、1.5eM MgCl2、2.5單位之 TakaPa Taq(寶酒造）、10 Pfflol 之 Anchor 引子、及 MHC-G1 引子及連結 Aapli FINDER Anchor之cDNA反應混合物1#1。此溶液中以之礦 油作為上層 c PCR為使用 Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer),於 94°C 中 45 秒、60°C 中 45 秒、72X：中 2分鐘之溫度週期下進行30回。 (ii) # 2 3 - 5 7 - 1 3 7 - 1抗體L鏈V區之cDNA的選殖 編碼對人PTHrP鼠犟株抗體L鏈V區之DNA的蘧殖為依 5*-RACE法（Frohman, Μ·Α·等，Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 8 5 , 8 998- 90 0 2 , 1 988 ; Belyvasky, A.等，Nucleic
Acids Res. 17, 2 9 1 9 - 2 9 3 2 , 1989)進行。於 5*-RACE法 中使用 ^-ABipli FINDER PACE Kit(CL0NETECH公司）， 且依套件所附之配方進行操作· cDN A合成中所用之引子 為使用01igo-dT引子。以如前逑調製之bRNA約2>ug作為 模板並加入oligo-dT引子，經與逆轉錄_於52*€、反應 30分鐘，進行對cDHA之逆轉錄。以6N NaOH將RNA水解 一 4 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I--------^II (請先閲讀背面之注意事項再本頁)
、1T 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（) (65°C, 30分鐘）後，以酒精沈澱精製cDSA«於合成之 cDNA的 5*終端，將前逑 Anpli FINDER Anchor 以 T4 RNA 連接酶於37 °C下6小時，室溫下16小時反應予以連結。 由鼠L鏈；I鏈恆定區之保存序列設計PCR引子MLC(序 列編號4>,並使用3 9 4 DNA/RNA合成機（ABI公司）予以 合成❶PCR溶液為在其1〇〇#1中，含有Tris-HCl (ΡΗ8·3)、50mM KC1、0·25 进 M dNTPsUATP、dGTP、dCTP 、dTTP)、1.5niM MgCl2、2.5單位之 AnpliTaq(PERKIN ELMER)、5flpffl〇l之Anchor引子（序列編號2)、及MLC(序 列編號4)及連結Aiipli FINDER Anchor之cDNA反應混合 物1#1。此溶液中以5()；ul之礦油作為上層。PCR為使用 Thermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer),於 94Ό 中45秒、60 °C中45秒、72 °C中2分鐘之溫度週期下進行 3 5回。 (3) PCR産物之精製及Η段化 將如前逑處理經PCR法放大之DNAH段，以使用3%Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio Products)之瓊脂糖膠電泳 予以分離c將含有Η鏈V區約55flbp長、L鏈V區約 5 5 0 bp長之DNA片段的瓊脂糖Η切出，使用GENECLEAN II Kit(BIOlDl),依套件所附之配合精製DNAH段。令精製 之DNA以酒精沈澱後，溶解於l〇«M Tris-HCl(pH7.4)、 IBM EDTA溶液20/i U將所得之DNA溶液l>u 1以限制酶 Xmal(fiew England Biolabs)於 37 °C 下切開 1 小時，且 其次以限制酶EcoRI(寶酒造）於37°C下切開1小時〇此 切開之混合物以苯酚及氯仿萃取，並以酒精沈澱回收 DN Α〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（-240&<-297公釐） -49_ (請先閲讀背面之注意事項再 -裝- 頁) 訂 -線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 ____B7_ 五、發明説明（Ο ) 如此處理，可得於5，-終端具有EcoRI辨識序列，且在 終端具有χΒ8Ι辨識序列之編碼鼠Η鰱V匾之DHA及纗 碼L鏈V區之DHA。 令如上述調製之含有編碼鼠Η鐽V匾之DN Α及編碼L 鐽 V 匾之 DNA 的 EcoRI-Xaal DHAH 段，與經 EcoRI 及 Xiial 切開所諝製之PUC19載體，使用DNA連接套件ver.2(簀酒 造），依所附之配方於16TC下反應1小時令其連結。其 次，將10ϋ/1上述之連結混合物加至大腸桿餹JM109受容 細鏞（Nippon Gene)l 00 Ml,令此細胞於冰上15分鐘、 42 1C中1分鐘、再於冰上1分鐘靜置。其次，加入3 00衫1 之 S 0 C 培養基（Μ ο 1 e c U 1 a r C 1 ο n i n g : A L a b 〇 r a t 〇 r y M a n u a 1 ,Sambrook等，冷泉港實驗室印，1989)並於371C培餐 30分鐘後，將此大腸桿_於含有100# g/®l或50 m g/通1 安比西林、O.lmM IPTG、20iug/ml X-gal之LB洋菜培養 基或 2XYT洋菜培養基（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook,等，冷泉港實驗室印，1989)上塗 布，於37 υ培養一夜，取得大腸捍_轉形體。 令此轉形體於含有100m g/al或50m g/ml安比西林之LB 培養基或2XYT培養基2ml中37t!培養一夜，並由_體 部分，使用質醱萃取機？卜1001(1^以》)〇)或£11為?^6|>11>4 Plasmid Kit(QIAGEH)調製質體DKA,進行鹼基序列之決 定。 (4)編碼鼠抗體V匾之DNA的_基序列決定 前述質體中cDNA之编碼匾的鐮基序列，使用Dye -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） ----------装-- (請先閱讀背面之注意事項再个頁)
、1T -線- 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（0 )
Terainator Cycle Sequencing Kit(Perkiη - E 1 »er), 以DNA序列機373A(ABI公司PerkU-EUer)決定。使用H13 Priner M4(寶酒造）（序列编碼5)及MB Primer RV(寶酒 造）（序列编碼6)作為決定序列用引子•經由確認兩方向 之鹼基序列而決定序列。 來自經此處理所得融合瘤#23-57-137-1之含有编碼鼠 Η鏈V區DNA之質體命名為MBC1H04、含有编碼L鏈V區 DNA之質體命名MBC1L24。質體MBC1H04及MB.C1L24所含之 編碼鼠#23-57-1 37 - 1抗體Η鏈V區及L鐽V區DHA之鹼 基序列（含有對應之胺基酸序列）分別示於序列编號57、 6 5所示之鹼基序列第58値（编碼麩胺醯胺）開始。此些胺 基酸序列，於含有H_V區多肽中者示於序列编號46、 於含有L鏈V區多Ife中者示於序列编號45。 再者，具有前述質體MBC1H04及MBC1L24之大腸桿菌 Escherichia coli JM109 (MBC1H04)及 Escherichia coli JM109 (MBC1L24)，依照布達佩斯條約進行國際寄存，Escherichia coli JM109 (MBC1H04)以 FERM BP-5628、Escherichia coli JM109 (MBC1L24)以FERM BP-5627於平成8年8月15日寄存於工業技 術生命工學工業技術硏究院所(茨城縣築波市東1 丁目1-3號），亦 於1997年9月24日寄存於中華民國臺灣新竹食科所，分別編號爲 CCRC940180 (Escherichia coli JM109 (MBC1H04))及 CCRC940179 (Escherichia coli JM109 (MBC1L24))。 (5)對人PTHrP鼠單株抗體#23-57-137-1之CDR之決定 Η鏈V區及L鏈V區之金部構造為相互具有類似性， 各別4個骨架部分為經由3傾超可變區，卽互補性決定 -5 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -5'«» 4 509697 A7 B7 五、發明説明（p) 匾（C DR)所連結。骨架之胺基酸序列雖被較佳保存，但 B —方面，CDR區之胺基酸序列的變異性極高（Rabat, 等,「Sequence of Proteins of I 雇班unolgical Interest」 US Dept· Health and Hunan Services, 1983)0 基於此類事實，將對人PTHrP鼠單株抗體之可變匾的 胺基酸序列_用ICabat等所作成之抗體的胺基酸序列之 資料_基，調査相同性則如表2所示決定出CDR匾。 尚，L鏈V區之CDR1〜3之胺基酸序列為分別示於序列 纊號59〜61，Η鰱V匾之CDR1〜3之胺基酸序列為分別 示於序列編號62〜64。 〔表2〕 ----------裝_ (請先閱讀背面之注意事項再^1^4頁 V匾 序列编號 CDR1 CDR2 CDR3 Η 鐽V 匾 57 31-35 50-66 99-107 L 鏈V 匾 65 23-34 50-60 93-105 -線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 〔實施例2〕嵌合型抗龌之構築 (1)嵌合型抗體Η鱅之構築 為了連結至含有人Η鍵C匾Crl基因組DNA之表現載膿 ，羚選殖之編碼鼠Η鏈V匾之DNA依PCR法修飾。後方之 引子MBC-S1 (序列編號7)為雑交至V區前導条列5〜侧之 編碼DHA且設計成具有Kozak交感序列（Kozak,Μ.等， -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（η ) Mol. Biol·,196,947-950, 1987)及限制酶 Hind III之 辨識序列。前方之引子MBCl-a(序列纗號8)為雑交至J 區3’側之编碼DNA,且設計成具有接合供體序列及限制 酵素BanHI之辨識序列。PCR為使用TakaRa Ex Taq(寶酒 造），於50//1之反應混合液中以0.07/ug之質體MBC1H04 作為模板DHA、以各50i>iiole之MBCl-a及MBC1-S1作為引 子、使用含有 2.5U TakaRa Ex Taq, 0·25βΜ dHTP條件 之所附緩衝液並以50 ul磯油作為上層，於941C中1分 鐘、72t：中2分鐘之溫度遇期下進行30回。依PCR法放 大之DHA片段以使用3%Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio Products)之瓊脂糖膠電泳予以分離。 切出含有437bp長之DHAH段之瓊脂糖片，使用GENECLEAH II KiUBIO 101),依套件所附配方精製DHA片段。精製 之DHA以酒精沈澱回收後，溶解於ΙΟβΜ Tris-HCl(pH7.4) 、ImM EDTA溶液20α 1中〇所得之DNA溶液liu 1以限制_ BamHI、HindIII(寶酒造）37t!切開1小時。此切開之混 合物以苯酚及氱仿萃取，以酒精沈鎩回收DHA。 令如上述譎製之含有編碼鼠Η鏈V匾DHA之Hindlll-BanHI DNAM段，次選殖至經Hindlll及BanHI所切開調 製之DUC19載體中。為了確認此質體之鐮基序列，以引 子 MB Primer M4 及 M13 Priaer RV 作為引子，使用 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin一E 11 er ), 以DHA序列機373A(Perkin-Elaier〇決定鐮基序列。來自 具有正錶基序列融合瘤#2 3-57-137-1之含有編碼鼠H鐽 _ 5 3 _ (請先閲讀背面之注意事項再頁) •裝· 訂 線„ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（β ) V區之DHA,且在5·-側具有HUdlll辨識序列及Kozak序 列、於3’-側具有BanHI辨織序列之質體命名為MBC1H/ PUC19。 (Π)用於製作cDHA型之鼠-人嵌合型H鏈之Η鏈V匾的 構築。 為了與人Η鏈C區Crl之cDNA連結，令如上述構築之 編碼鼠Η鐽V區DNA依PCR法進行修飾。用於修餘Η鏞V 區之後方引子MBC1HV2(序列編號9)為將編碼V區前導序 列最初序列之第2値天冬醯胺變換成甘胺酸，且設計成 具有 KozaK交感序列（Kozak, M.等，J.Mol. Βίο1·,196, 947-950,1987)並具有以11<1111及£<;〇1{1辨識序列。用於 修飾Η鍵V匾之前方引子MBC1HVR2(序列纗號10>為雜交 至編碼J匾3’-側之DNA序列，且設計成編碼C匾之5’-側序列且具有Apal及Snal辨識序列。 PCR為使用TakRa Ex Taq(寶酒造），於50m 1之反應混 合液中以〇.6Mg之質體MBC1H/PUC19作為模板DNA,以 各50pnole之MBC1HSV2及MBC1HVR2作為引子、使用含有 2.5U TakaRa Ex Taq、0.25mM dNTP條件之所附緩衝液 ，並以50α1磯油作為上層，於941C1分鐘、55101分 鐘、72 t? 1分鐘之溫度週期下進行30_。依PC R放大之 DNAH 段以使用 l%Sea Rea GTG瓊脂糖（FMC Bio. Products)之瓊脂糖膠電泳予以分離。切出含有456bp 長之DNAH段之瓊脂糖使用GEHECLEAH II Kit(BI0 101),依套件所附配方精製DHAH段。精製之DNA之酒 -54- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) -裝.
、1T -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 509697 A7 _ B7__ 五、發明説明（d ) 精沈鎩回收後，溶解於1〇®Μ Tris-HCl(pH7.4)、IbiM EDTA溶液 20 iu 1 中。 令所得之DHA溶液1μ 1以限制_EcoRI及Smal(賫酒造） 於37 υ下切開1小時。此切開之混合物以苯酚及氨仿萃 取，並以酒精沈澱回收DHA。 令如上述調製之含有鑕碼鼠Η鐽V區之DHA之EcoRI-Sinal DHA片段，次選殖至經EcoRI及Snal所切開調製之 PUC19載體中。為了確認此質體之_基序列•以引子MB Priuer M4 及 M13 Primer RV 作為引子，使用 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit ( Perkiη-E 1 mer), 以DN A序列機373 A (Perk in-El ner)決定鹼基序列。來自 具有正基序列融合瘤#23-57-137-1之含有編碼鼠Η _ V區之DNA,且在5’-倒具有EcoRI及Hindlll辨識序列及 Kozak序列、於3’-側具有Apal及Snal辨識序列之質齷命 名為 MBCIHv/ PUC19。 (iii)嵌合型抗體Η鐽之表現載醱之構築 含有人抗體H _C匾Crl之cDHA,為如下調製。邸， 由編碼人型化PM1抗體Η鰱V區及人抗體Η鰱C匾IgCl 基因組 DHA(N.Taka hashi,等，Cell29,671«679 1983) 之表現載體 DHFIi-AE-RVh-PM-l-f(參照 V0 92/19759)、 和编碼人型化pMI抗膿L鐽V匾DNA及人抗臁L鐽k鏡C 區基因組DNA之表現載體RVl-PMla(參照W092/19759)所 導入之CH0細胞，調製bRNA,並以RT-PCR法選殖含有人 型化PM1抗體Η鏈V區及人抗體C匾ΟΙ之cDNA,並次選 _ 5 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再^^4頁)
、1T 線‘ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 殖至PUC19之Hindlll及BanHI部位。確認鹼基序列後， 將具有正序列之質嫌命名為r>RVh-PMlf-cDMA。 製作令DHFR-AH-EVh-PM-l-f上之SV啓動子和DHPli基 因藺之某Hindlll部位、及EF-la啓動子和人型化PM1抗 體Η _ V匾間之某EcoRI部位缺失之表現載鑲，且使用 於構築含有人型化PM1抗體Η鏈V匾及人抗體C匾Crl eDHA之表現載釀。 pRVh-PMlf-cDNA 以 Ba»HI 切開後，以 KlenovH 段予以 平滑化，且再以Hindlll切開，網製Hindll卜Ba*HI平滑 化Η段。令此Hindlll-BamHI平滑化片段，連結至上逑 Hindlll部位及 EcoRI部位缺失之 DHFR-AE-RVh-PMl-f經 Hindlll及Seal所切開調製之表現載體，構築含有鏞碼 人型化PM1抗體Η鏈V區及人抗體C匾Cr。cDHA之表現 載體 R V h - Ρ Η1 - c D N A。 令含有纗碼人型化PM1抗體Η鏈V匾及人抗體C區Crl cDNA之表現載體RVh-PMl-cDHA,以Apal及EcoRI切開後 ，回收含有Η鏈C區之DMAK段，並導入經Apal及BanHI 所切開調製之MBC1Hv/pUC19中。將如此製作之質體命名 為MBC1HcDNA/pUC19。此質體為含有編碼鼠抗體Η _ V匾 及人抗齷C區Crl之cDHA,且在5’-終禰具有EcoRI及 Hindlll辨識序列、3’-終端具有BanHI辨識序列。 質MBC1HcDHA/pUC19以EcoRI及BanHI切開，且將所得 之含有纊碼嵌合型抗體Η鰱之鹼基序列的DNAH段，導 入經EcoRI及BanHI所切開調製之表現載體PC0S1中。將 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I.---------裝—— (請先閲讀背面之注意事項再頁
、1T 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（κ) 如此所得之嵌合型抗體之表現質體命名為HBCIHcDNA/ pCOSI。尚，表現載體PC0S1為由HEF-PMhirl(參照W092 / 19759),經EcoRI及Snal切開削除抗體基因，連結 EcoRI-HotI-Ba*HI Adaptor(lf 酒造）而構築。 再者，為了製作CH0細胞中表現所用之質體，將質體 HBC1HcDHA/pUC19以EcoRI及BanHI切開，並將所得之含 有嵌合型抗體H _序列之DNAH段，導入經EcoRI及BanHI 所切開讕製之表現質體PCH01。將所得之嵌合型抗體之 表現質體命名為MBCIHcDHA/pCHOI。尚，表現載體pCHOI 為由 DHFR-ΔΕ-ΓνΗ-ΡΜ 卜 f(參照 W092/19759),經 EcoRI 及Smal切開削除抗體基因，連結EcoRI-Hotl-BamHI Adaptor(寶酒造）而構築。 (2)人L鏈恆定區之構築 (i)選殖載體之製作 為了構築含有人L鏈恆定匾之PUC19載鼸，製作Hindlll 部位缺失之PUC19載鐮。將PUC19載體2/ig於含20mM Tris 画HC1(pH8.5)、ΙΟβιΜ MgCl2、1®M DTT、IOOibM KC1、8U HindIII(寶酒造）之反應混合液20iul中，37t!下切開1 小時。將切開之混合液以苯酯及氯仿萃取，將DMA以酒精 沈澱回收。 令回收之 DHA 於含有 50nM Tris-HCl(pH7.5)、ΙΟβιΜ HgCl 2 λ lmM ΒΤΤλ lOOmH HaCK 0.5aH dNTP^ 6U KlenowH段（GIBCO BRL)之50m1反應混合液中室溫下反 應20分鐘，並令終端平潸化。反應混合液以苯酚及氱仿 -5 7 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I---------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（) 萃取，以酒精沈澱回收載體DHA。 令回收之載體 DHA 於含有 50aM Tris-HC1(PH7.6>、ΙΟιιΜ MgCl2、ImM ATP、IbiM DTT、5%(v/v)聚乙二酵- 8000、 0.5U T4 DNA連接酶（GIBCO BRL)之反應混合液l〇iul中 ,16t!下反應2小時令其自我連結。將反應混合液5# 1 加至大腸桿豔JM109受容細胞（Nippon Gene)10〇Ml,於 冰上靜置30分鐘後，於42 υ中1分鐘，再於冰上1分鐘 靜置。加入S0C培養基500ul,於371C下培養1小時後 ，塗於X-gal和IPTG表面塗布之2XYT洋菜培養基（含有 50// g/ial安比西林）（Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook 等，冷泉港實驗室，1989),於 37tJ 下培養一夜取得轉形體。 令轉形體於含有50m g/iil安比西林之2X YT培養基20 祖1中371C下培養一夜，由餹體部分，使用Plasmid Mini Ut(QIAGEN),侬所附之配方精製質體DHA。精製之質膿 以Hindlll切開，且將確認Hindlll部位缺失之質體命名 為 pUC19A Hindlllo (ii)纗碼人L鐽λ鏈恆定區DNA之構築 人抗體L鏈λ鍵C匾已知至少有Mcg+ Ke+ 0z_ 、
Meg - Ke~ 0z-、Hcgle- 0z+、Meg 一 Ke+ 0z_ 4 種 同功類型（P. Dariavach,等，Proc· Hatl. Aead. Sci. USA, 84, 9074-9078, 198 7)。與 #23-57-137-1鼠 L 鐽 λ鏈C匾具有相同性之人抗體L鏈λ鏈C區，以E MB L資 料鐮基檢索，結果同功類型為M c g + K e + 0 z (a c c e s s i ο η -5 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填m:頁)
、1T -線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7___ 五、發明説明（θ )
Mo· X57819)(P*Dariavach,等，Proc· Hatl. Acad· Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987)之人抗體L鏈λ鐽為顯示 最高之相同性，且與#23-57-1 37-1鼠L鰱λ鐽C區之相 同性於胺基酸序列為64.4%·於繾基序列為73·4%。 於是，编碼此人抗體L鏈λ鏈C區之DHA之構築為使用 PCR法進行。各引子之合成為使用394 DHA/ RHA合成機 (ΑΒΙ公司）進行。HLAMB1(序列鏞號11)及HLAMB3(序列编 號13)為具有意義DHA序列，HLAMB2(序列編號12)及HLAMB4 (序列纗號14)為具有反意義DHA序列，且於各引子之兩端 具有20至23bi>之互補序列。 外部引子HLAMBS (序列編號15)、HLAMBR (序列編路16) 為與HLAMB1、HLAMB4各具有相同序列、HLAMBS為含有 EcoRI、Hindlll、Blnl辨織序列、HLAMBR為含有 EcoRI 辨識序列。以第一 PCR進行HLAMB1-HLAMB2和HLAMB3-HLAMB4之反應。反應後，將其等混合，以第二PCR進行 裝配。再添加外部引子HLAMBS及HLAMBR,以第三PCR令 全長DHA放大。 PCR為使用TakaRa Ex Taq(寶酒造），依所附配方進行 。於第一 PCR 為使用含有 5i>eiole HLAMB1 及 0·5ριιο1β LAMB2 和 511 TakaRa Ex Taq(寶酒造）之 lOOit/ 1 反應混合 液，或者含有 0.5pmole HLAMB3及 5pnole HLAMB4和 5ϋ TakaRa Ex Taq(寶酒造）之ΙΟΟκΙ反應混合液，且以50μ1 礦油作上層•於9410中1分鐘、60t!中1分鐘、72¾中 1分鐘之溫度週期下進行5回。第二PCR為將反應液各 一 5 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再頁
、1T 線 509697 A7 B7 五、發明説明（w ) -----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再^^4:頁 50W1混合，且以50m 1礦油作上曆，於94¾中1分鐘、 60¾中1分鐘、721C中1分鐘之溫度週期下進行3 _。 第三PCR為在反應液中添加各5(^1»〇16之外部引子111^»^5 及H L A Μ B E R ,於9 4 C中1分鐘，6 0 t 1分鐘、7 2 1C中1 分鐘之溫度週期下進行30回。 將第三PCR産物之DHAH段以3%低熔點瓊脂糖膠 (NuSieve GTG Agarose, FMC)電泳後，使用 GEHECLEAHII Kit(BIOlOl)、依所附之配方由膠回收、精製。 訂 令所得之DHAH段於含有50bM Tris-HC1(PH7,5)、10臟Μ HgCl2、ΙιιΜ DTT、100·Μ NaCl、811 EcoRI(寶酒造）之 20 ul反應混合液中，37 t：下切開1小時。切開之混合 液以苯酚及氱仿萃取，並以酒精沈澱回收DHA後，溶解 於 10mM Tris-HCl (pH 7·4)、ImM EDTA溶液 8ite 1中。 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 質體 ρΙΙ(Π9Δ Hindlll 0.8m g/ml同樣地以 EcoRI切開 ，以苯酚及氱仿萃取，經酒精沈澱回收。令切開之質體 PUC19 △Hindlll 於含有 50®M Tris-HCl(pH9,0)、ImM MgCl 2 λ鐮性磷酸酶（E. col i C75,寶酒造）之反_混 合液50/il中，37υ下反應30分鐘，予以脱磷酸處理（BAP 處理）。反應液以苯酚及氣仿萃取，以酒精沈澱回收DN A 後，溶解於 IObiM Tris-HCl(pH 7.4)、IdiM EDTA溶液 10//1 中〇 令上述BAP處理之質體PUC19 ΔΗίηίΠΙΙ 1/i 1與先前 之 PCR 産物 4α 1,使用 DNA Ligation Kit Ver,2(賫酒造） 連結，並於大腸桿麵JM109受容細胞中轉形。所得之轉 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2H)X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（θ) 形體以含有50u g/Bl安比西林之2X YT培養基2ml培養一 夜•由鯆髏部分，使用QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEH)精製質體。 對於上述質膿，進行經選殖DN A之鐮基序列的確認。 於鹸基序列之決定中使用373A序列機（ABI公司 >、於引 子中使用M13 Primer M4及M13 Primer RV(寶酒造）。其 結果，於所選殖之DMA内部確認12bp之缺失。含此DNA之 質體命名為（：λΔ/ί>ϋ(：19。其後，新合成用於修補此部 分之引子HCLMS(序列编號17)、HCLMR(序列編號18>,並 以PCR再度進行正確DNA之構築。 於第一 PCR,以含有缺失DNA之質醱（：λΔ/Ρ11(：19作為 模板，以引子HLAMBS和HCLMR、HCLMS和HLAMB4進行反應 。將PCR産物分別精製，以第二PCR進行裝配。再添加外 部引子HLAMBS及HLAMB4,以第三PCR令全長DNA放大。 第一 PCR中，使用含有O.liug (：λΔ/ρϋ(：19作為模板 、引子 HLAMBS 及 HCLMR 各 50pniole、或者 HCLHS 及 HLAMB4 各 50pnole、5U TakaRA Ex Taq(寶酒造）之 lOOju 1 反應 混合液，並以50m 1礦油作上層，於941中1分鐘、60¾ 中1分鐘、72¾中1分鐘之溫度週期下進行30回。 ?€1?産物1}1^»18$-[1(：1^1{(2361)|>)、11(：1^$隹111^»184(1471>1>) 各以3%低熔點瓊脂糖_進行電泳後，使用GEHEC LEAN II Kit(BIOlOl)由膠回收、精製。於第二PCR為使用含有精 製 DNA片段各 40ng、1U TakaRa Ex Taq (寶酒造）之 20 μ 1 反應混合液，以2 5//1礦油作上層，於94¾中1分鐘、 -6 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填 頁) -裝· 訂 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（Μ ) 60¾ 中1分鐘、72¾中1分鐘之溫度週期進行5回。 第三PCR為使用含有第二PCR反應液2#1、外部引子 HLAMBS、HLAMB4各 50pnole、5U TakaRa Ex Taq(寶酒造） 之lOtel反應混合液，以50iul礦油作上靥。PCR為於941C 於94¾中1分鐘、601C中1分鐘，721〇中1分鐘之溫度 週期下進行30_。令第三PCR産物之357bp DHAH段以3% 低熔點瓊脂糖膠進行電泳後，使用GENECLEAHII Kit (BI0101)由膠回收、精製。 所得之DNAH段O.lag以EcoRI切開後•次選殖至經 BAP處理之質體pUC19 △Hindlll中。於大腸桿HJM109 受容細胞中轉形，於含有5〇Mg/ml安比西林之2XYT培 養基2ml中培養一夜，並由舖體部分，使用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)精製質體。 對於精製質齷之鐮基序列，例如MB Priner M4、M13 Primer-RV(寶酒造），以373A序列機（ABI公司）決定。將 確認具有無缺失之正鐮基序列之質體視為CX Δ/ρυ(：19。 (iii)編碼人L鰱k鍵恆定區DNA之構築 來自質體 HEF-PMlk/gk(tf092/19759)之編碼 L _k _ C區之DNA片段，使用PCR洗予以選殖。使用394 DNA/RHA 合成機（ABI公司）所合成之前方引子HKAPS (序列繡號19) 為設計成具有EcoRI、BamHI、Blnl辨識序列，後方引子 HKAPA(序列編號20)為設計成具有EcoRI辨識序列。 使用含有作為模板之質體HEF-PMlk-gk O.liUg、引子 HKAPS、SKAPA 各 50pniole、5ϋ TakaRA Ex Tag(寶酒造） -62- (請先閱讀背面之注意事項再 裝· 頁) 、?τ 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 〜一一. —_ .........— .................................................................—..-........... ...........— ........ —五、發明説明（W ) 之IOOmI反應混合液，並以50#1礦油作上層。令94¾ 中1分鐘、60¾中1分鐘、72t：中1分鐘之反應進行30 锢週期。令360bP之PCR産物以3%低熔點瓊脂糖膠進行 電泳後，使用GENECLEAN II Kit(BIOlOl)由膠回收、 精製。 所得之DNAH段以EeoRI切開後，選殖至經BAP處理之 質體PUC19 △Hindlll。於大腸桿菌JM109受容細胞中轉 形，於含有50ug/al安比西林之2XYT培養基2rol中培養 一夜，由 _ 體部分，使用 QIA i>rep Spin Plasmid Kit (QIAGEH)精製質體。 精製質體之鹸基序列，使用M13 Priaier M4、M13 Primer RV(寶酒造）以373A DHA序列機（ABI公司）決定。 將確認具有正鹸基序列之質體視為Ck/PUC19。 (3)嵌合型抗體L鏈表現載體之構築 構築嵌合型#23 -57 -1 37-1抗體L鍵表現載體。於質體 CX/plJC19、Ck/pUC19之人抗體恆定區正前之Hindlll、 Blnl部位，連結编碼#23-57-1 37- 1 L鏈V區之DHA,製 作含有編碼各嵌合型#23-57-1 3卜抗體L鏈V區及L鐽 λ鐽或L鏈k鏡恆定區之DHA的PUC19載體。經EcoRI切 開而使編碼嵌合型抗體L鏈之DH A切出，並以HEF表現載 體進行次蘧殖。 即，來自質體MBCIL24之编碼#23-57-1 37- 1抗體L鏈 V區之DNA,使用PCR法進行選殖。各引子之合成為使用 394 DHA/RHA合成機（ABI公司）進行。後方引子MBCCHL1 -63- 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 裝 頁 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（P ) (序列编號21)被設計成具有Hindlll辨識序列和Kozak序 列（Kozak, M·等，J· Mol· Biol· 196， 947-950, 1987) 、前方引子HBCCHL3(序列编號22)被設計成具有EcoRI辨 識序列。 PCR 為使用含有 IOiiM Tris-HCl(pH 8.3)、50aM KC1、 1 . 5 _ Μ M g C 1 2、〇 · 2 屋 M d N T P、0 · 1 ju g Μ B C IL 2 4、各 5 0 Pinole之 MBCCHL1 及 MBCCHL3作為引子，1m1 AeipliTaq (PERKIN ELMER)之100m 1反應混合液，以50iul礦油作 上層且於94¾中45秒、60¾中45秒、72¾中2分鐘之溫 度週期下進行30回。 44 4bΡ之PCR産物以3%低熔黏瓊脂糖膠進行電泳後， 使用GENECLENII Kit(BIOlOl)由膠回收、精製、並溶解 於 IObiM Tris-HCl(i>H7.4)、IiiM EDTA 溶液 20# 1 中、令 PCR 産物 1 各於含有 1〇bM Tris-HCl(pH7.5)、ΙΟιιΜ MgCla、1·Μ DTT、50·Μ NaCl、8U HindIII(簀酒造）及 8 ϋ E c o R I (寶酒造）之反應混合液2 0 μ 1中，3 7 1C下切開 1小時。切開混合液以苯酚及氯仿萃取，以酒精沈澱回 收 DHA,並溶解於 10·Μ Tris-HCl(pH 7·4>、 1·Μ EDTA溶 液8 μ 1中。 令質體PUC19 liug同樣地以Hindlll及EcoRI切開，以 苯酚及氯仿举取，經酒精沈澱回收，並以鹼性磷酸酶 (E.coli C75,簀酒造）進行BAP處理。反應液以苯酚及 氯仿萃取，以酒精沈濺回收DNA後，溶解於10bM TrU-HC1(pH7.4>、1通M EDTA溶液 10μ1中。 -64- (請先閱讀背面之注意事項再 裝· 頁)
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7___五、發明説明（W ) 經BAP處理之質體pUC19 1/il與先前之PCR産物4/il, 使用DNA Ligation Kit Ver.2(賨酒造）連結，並同前述 於大腸捍菌JM109受容細胞（Nippon Gene)中轉形。將其 塗在含有5〇ag/ml安比西林之2XYT洋菜培養基，並於 371C下培養一夜。所得之轉形體於含有50/tig/ml安比西 林之2XYT培養基2ml中371C下培養一夜。由菌體部分， 使用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)讕製質體。 決定_基序列後，將具有正鑛基序列之質體視為CHL/ pUC19〇 令質體CA/p11C19、Ck/pUC19各1ms分別於含有20biM Tris-HCl (pH8. 5). 10»Μ HgCl 2 、 ImH DTT、 100祖M KC1 、8U HindIII(寶酒造）及2U Blnl(寶酒造）之反應混合 液20/il中37 t：下切開1小時。令切開混合液以苯酣及 氱仿萃取，以酒精沈澱回收DHA後，於37ti下進行30分 鐘BAP處理。反應液以苯酚及氯仿萃取，以酒精沈濺回 收 DHA,並溶解於 ΙΟιιΜ Tris-HCl(pH 7.4)、1·Μ EDTA 溶液1 0 u 1中。 含有編碼#23-57-137-1 L鍵V匾DKA之質體CHL/pUC19 8/ig同樣地以Hindlll及Blnl切開。所得之409bp DNAH 段以3%低熔點瓊脂糖膠進行電泳後，使用GEHECLEAH II Kit(BIOlOl)由膠回收、精製，並溶解於10*只1>丨3-HC1(pH 7·4)、IiiM EDTA溶液 10/i 1 中。 令此L鏈V區DHA 4m 1,次選殖至經BAP處理之質體 CA/pUC19或Ck/pUC19各1m1中，並於大腸桿_JM109受 -65- (請先閲讀背面之注意事項再 裝- 頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（Μ 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 容細胞中轉形。於含有50ug/ml安比西林之2XYT培養 基3b1中培養一夜，並由_體部分，使用QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEH)精製質體。其分別為質體MBCIL (λ ) /PUC19、MBCIL(k)/pUC19〇 質體 MBCIL(X)/pUC19、 MBCIL(k)/pUC19分別以 EcoRI 切開，並以3%低熔點瓊脂糖膠進行電泳後，使用GENE CLEAHII Kit(BIOlOl)由膠回收、精製 743bp 之 DNAH 段 ，並溶解於 IObiM Tris-HCl(f>H 7.4)、linM EDTA溶液 10鉍1中。 作為表現載體之質體HEF-PMlk-gk 2.7/ig以EcoRI切 開，並以苯酚及氱仿萃取，以酒精沈澱回收DHA。回收 之DHAH段以BAP處理後，以1%低熔點瓊脂糖膠進行電 泳，使用GEHECLEANII Kit(BIOlOl)由膠回收、精製 6561bj> 之 DNAM 段，並溶解於 10nM Tris-HCl(pH 7.4) 、luM EDTA溶液 10 μ 1 中。 令BAP處理之HEF載髏2/i 1與上述之質體MBCILU )或 MBCIL(k)EcoRlH段各3μ1連結，於大腸捍菌JM109受容 細胞中轉形。於含有5〇Mg/ml安比西林之2XYT培養基 2 ml中培養，並由0膿部分，使用QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEH)精製質體。 令精製之質體於含有20d»M Tris-HCl(pH 7.4)、IroM MgCl2 IbiM DTT、100nM KC1、8U HindIII(寶酒造）及 2U Prul(寶酒造）之反應混合液20/il中切開1小時。由 若片段為以正方向***則産生5 104/21 95bp之切開片段 -6 6 - 請 先 閱 讀 背 面 之 注
I 裝 頁 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（w ，若以逆方向插人則産生4378/ 2926bp之切開Η段，時 下方向所插人之質體分別視為MBCILU)/neo、MBCIL(k) /neo 〇 (4) C0S-7細胞之轉移感染 為了評價嵌合型抗膿之抗原結合活性及中和活性，乃 令前述表現質體於C0S-7細胞中一次性地表現。 即，於嵌合型抗體之一次性表現為以質體MBCIHcDNA/ PC0S1 和 MBClL(A)/neo,或 HBCIHcDNA/pCOSI和 MBC1L (k)/neo之組合，使用Gene Pulser裝置（Bio Rad)依電 穿孔作用，同時轉形至COS-7細胞。於PBS(-)中以1X107 細胞/al細胞濃度所懸浮之C0S-7細胞0.8al中，加入各 質體0^10以8,並以1,500?、25从？之靜電容董賦予脈 衝。於室溫下10分鐘之回復期間之後，令經電穿孔處理 之細胞懸浮於含有2% Ultra Low IgG牛胎兒血清（GIBC0) 之DMEM培養基（GIBC0),並使用10公分培養皿於C〇2培 餐箱中培養。72小時培養後，收集培養上清液，並依離 心分離除去細胞碎H,作為ELISA之試料。 又，由C0S-7細胞之培養上清液精製嵌合型抗體，可 使用 AffiGel Protein MAPSII 套件（Bio Rad)依所附配 方進行。 (5) ELISA (i)抗體濃度之測定 用於澜定抗體濃度之ELISA平板為如下調製。於ELISA 用之96孔穴平板（Maxisorp, NUHC)之各孔穴，以固相化 -67- 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 裝 頁 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w ) 緩衝液（0.1MHaHC03、0.02% HaH3)讕製成 1 iug/al 濃度之山羊抗人IgG抗體（TAGO)lOOtel予以固相化。以 20/i 1之稀釋緩衝液（例如50應M Tris-HCl、1b»M MgCU、 0·1Μ HaCl、0.05%Tveen20、（K02%NaN3、1% 牛血 清白蛋白（BSA)、PH7.2)封阻後，將表現出嵌合型抗體 之C0S細胞的培養上清液或精製嵌合型抗體予以階段稀 釋並加至各孔穴。於室溫中培養1小時，並以PBS-Tween 20洗淨後，加入鹼性磷酸酶所結合之山羊抗人IgG抗體 (TAGO)IOOmI。於室溫中培養1小時，並以PBS-Tween 20洗淨後，加入l®g/ml之受質溶液（Signa 104,對-硝 苯基磷酸、SIGMA)、其次以撤平板讀數器（Bio Rad)測 定405riBi下之吸光度。溯定濃度之標準品可使用Hu IgGlA Purified(The Bing Site)。 (ii)抗原結合能力之測定 用以測定抗原結合之ELISA平板，為如下調製。於ELISA 用96孔穴平板之各孔穴中，以固相化緩衝液調製成1/ig /ml濃度之人PTHrP(l-34)(胜肱研究所）l〇〇# 1予以國 相化。以20 0 Ml之稀釋緩衝液封阻後，將表現出嵌合型 抗體之C0S細胞的培養上清液或精製嵌合型抗體予以階段 稀釋並加至各孔穴。於室溫中培養1小時，以PBS-Tireen 20洗淨後，加入_性磷酸酶所結合之山羊抗人IgG抗體 (TAGO)lOOiul,於室溫中培養，以PBS-Tween20洗淨後 ，加入lmg/iiil之受質溶液（Sigma 104、對-硝苯基磷酸、 SIGMA)、其次以橄平板讀數器（Bio Rad)澜定定405nn下 -6 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填HI頁) -裝·
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 __B7 _____ 五、發明説明（β ) 之吸光度。 其結果，顯示嵌合型抗體為對人PTHrP(l-34)具有結 合能力，具有選擇之鼠抗體V區之正構造（第4圈）。又 ,於嵌合型抗體中由於L鏈C匾之λ鐽或k鐽任一者均 對於抗體PTHrP(l-34)之結合能力無變化，故人型化抗體 之L鰱C匾為使用人型化抗體L鍵λ鐽予以構築。 (6) CH0安定産生細胞株之建立 為了建立嵌合型抗體之安定産生細胞株，乃令前述表 現質體導入CH0細胞（DX Β11) 即，嵌合型抗體之安定産生細胞株之建立，為令CH0 細胞用表現質體 MBCIHcDNA/pCHOl 和 MBClL(A)/neo、或 MBCIHcDNA/pCHOl 和 MBClL(A)/neo 之組合，使用 Gene Pulser裝置（Bio Rad)經由電穿孔作用，同時轉形至CH0 細胞中。各表現載體以限制酶Pvul切斷作成直鐽DNA, 以苯酣及氱仿萃取後，以酒精沈澱回收DHA並用於電穿 孔作用。於PBS(-)中以1X107細胞/»1之細胞濃度懸 浮之CH0細胞0.8ial中，加入各質體DHA lOiug,並以 1,500V、25mF之靜電容量賦予脈衝。於室溫中1〇分鐘 回復期間之後，令經電穿孔處理之細胞懸浮於添加10% 牛胎兒血清（GIBC0)之MEM-ot培養基（GIBC0)中，使用 3偁96孔穴平板（FaleorO並於C02培養箱中培餐。於培 養開始隔天，以添加10%牛胎兒血清（GIBC0)及5 00 /ig/ml GENETICIN(G418 Sulfate, GIBC0)、但不含核糖核甘及 去氯核糖核甘之EME-ot培養基（GIBC0)之選擇培養基予 -6 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填ιίι：頁) 、1Τ 線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 ) B7 五、發明説明（α) 以更換，並蘧出經抗體基因導入之細胞，選擇培養基更 換後，於2週前後以顯微鏡下觀察細胞，並於察見調順 之細胞增殖後，以上述測定抗醱濃度ELISA,测定抗體 産生量，並選出抗體産生量多之細胞。 令建立之抗體的安定産生細胞株的培養擴大，於滾動 瓶中使用添加2% Ultra Law IgG牛胎兒血清、但不含 核糖核甘及去氧核糖核苜之MEM培養基，進行大量培養 。培養第3至4日，回收培養上清液，並以0.2μβ濂紙 (Mi 11 ip0re)除去細胞碎Η。 由CH0細胞之培養上清液精製嵌合型抗體，為使用 P0R0S蛋白質 Α 柱（PerSeptive Biosysteits),以 ConSep LC100(MiHiP〇re)依所附配方進行，並用於中和活性之 _定及高鈣血症模型動物之藥效試驗。所得之精製嵌合 型抗體之濃度及抗原結合活性，為於上逑ELISA条中測 定。 〔實施例3〕人型化抗髏之構築 (1)人型化抗饑Η鍵之構築 (i)人型化Η鏈V匾之構築 人型化#23-57-137 -1抗體Η _，為以PCR法侬CDR-移 檀而製作。為了製作具有來自人抗體S31679 (NBRF-PDB 、Cuisinier Α·Μ·等，Eur· J· I 藤猶 ιιηο1·»23，110-118 ,1993)之FR之人型化#23-57 - 1 37-1抗體Η鏈（型式「a j ) ,乃使用6個PCR引子。CDR-移檀引子MBC1HGP1(序列編 號23)及MBC1HGP3(序列編號24)為具有有意義DHA序列， -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） ----------裝— (請先閱讀背面之注意事項再頁 、1Τ 線- 509697 A7 B7 五、發明説明（p ) 切出含有421bp長之DMA片段之瓊脂糖Η,使用GEHE CLEAHII Kit (ΒΙ0101),依套件所附配方精製DNAH段 。精製之DNA以酒精DNA以酒精沈濺後，溶解於10mH Tris -HCl(pH 7.4)、laMEDTA 溶液 20μ1中。令所得之 PCR 産 物，次選植至經BaaiHI及Hindlll所切開調製之PDC19中， 並決定_基序列。將具有正序列之質臛命名為hMBCHv/ pUC19〇 (ii)人型化Η鋪cDNA用之Η鍵V區之構築 為了與人H _C匾Crl之cDNA連結，令如上述構築之 人型化H _V區之DHA以PCR法修飾。後方引子MBC1HVS2 為與V匾前導序列5’-侧之纗碼序列雜交，且設計成具 有 Kozak交感序列（Kozak, M,等，J· Mol. Biol. 196， 947-950, 1987)、Hindlll及EcoRI辨識序列。用於修飾 Η鏈V區DNA之前方引子MBC1HVR2為與J匾3〜側之编碼 DHA序列雜交，且编碼C區之5’-侧序列並設計成具有Apal 及Smal辨識序列。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PCR為使用TakaRa Ex Taq(寶酒造），使用〇.4/ig之 hMBCHv/pl!C19作為模板 DNA,各 50pm〇le 之 MBC1HVS2 及 MBC1HVR2 作為引子，使用含有 2·5ϋ TakaRa Ex Tag、 0.25mM dNTP條件之所附緩衝液，於9410中1分鐘， 551C中1分鐘、7210中1分鐘之溫度週期下進行30回。 依PCR法所放大之DNA片段，為經由使用3%Nu Sieve GTG 瓊脂糖（FMC Bio Products)之瓊脂糖膠電泳予以分離。
切出含有456bp長之DNA片段之瓊脂糖片，使用GENE -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（Η ) 而CDR移植引子MBC1HGP2(序列編號25)及MBC1HGP4(序列 编號26)為具有反意義DMA序列，於各引子之兩端具有15 至21bp之互補序列。外部引子MBC1HVS1(序列编號27) 及MBC1HVR1(序列编號28)為與CDR移植引子MBC1HGP1及 MBC1HGP4具有同質性。 CDR-移檀引子MBC1HGP1、 MBC1HGP2、 MBC1HG3及 »<8(：11110?4為使用尿素變性聚丙烯醸胺膠予以分離（ Molecular Cloning*· A Laboratory Manual , Sa 通 brook 等，冷泉港實驗室印，1989),由膠之萃取為以crush and soak法（Molecular Cloning· A Laboratory Mannual， Sambrook等，冷泉港實驗室印，1989)進行。 邸，令各IriBiole之CDR-移植引子以6%變性聚丙烯醯 胺_分離，於矽膠薄層析上照射紫外線，進行目的大小 之DHAH段之鑑定，並以crush and soak法由_回收， 且溶解於 20/i 1 之 10nM Tris-HCl(pH 7.4)、IbM EDTA 溶 液中。PCR為使用TakaRa Ex Taq(寶酒造），於100m 1反 應混合液中含各liu 1之如上述調製的CD卜移植引子 MBC1HGP1、 MBC1HGP2、 MBC1HGP3及 MBC1HGP4,使用含有 0·25·Μ dHTP及2.5U TakaRa Ex Taq條件之所附緩衝液 ，於941C中1分鐘、55ti中1分鐘，721C中1分鐘之溫 度遇期下進行5回。再加入50pieole之外部引子MBC1HVS1 及MBC1HVR1,進行30回相闻的溫度週期。依PCR法所放大 之DHAM段，為經由使用4%Hii Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio. Products)之瓊脂耱膠電泳予以分離。 -71- (請先閱讀背面之注意事項再 填 裝· 頁)
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（~ ) CLEANII Kit (BI0101),依套件所附配方精製DHA。精 製之DNA以酒精沈澱後，溶解於l〇®M Tris-HCl(pH 7.4) 、IbM EDTA溶液20/ul。令所得之PCR反應混合物，次選 殖至經EcoRI及Saal所切開調製之PUC19中，並決定鹸基 序列。如此所得之來自融合瘤#23-57-137-1之含有編碼 鼠Η鏈V區之DNA,且在5〜側具有EcoRI及Hindlll辨識 序列及Kozak序列，於31-侧具有Apal及Smal辨識序列之 質體命名為hMBClHv/pl!C19。 (2)人型化抗髏Η鏈之表現載體之構築 含有hPMl抗體Η鐽cDHA序列之質體RVh-PMlf-cDNA以 Apal及BamHI切開，並回收含有編碼Η鏈C B齡基序列 之DNAH段，將其導人經Apal及BanHI所切開調製之 hMBClHv/pl)C19中。將如此製作之質體命名為hMBCIHcDNA /PUC19。此質體為含有編碼人型化#23-57-1 37-1抗體 Η鏈V區及人Η鍵C區Crl之DNA,於5*-終端具有EcoRI 及Hindlll辨識序列，於3’-終端具有BamHI辨識序列。 質體hMBClHeDNA/pl!C19中所含之人型化Η鱅型式「a」 之螓基序列及對應之胺基酸序列示於序列编號58。又， 型式a之胺基酸序列示於序列编號56。 令 hMBClHcDHA/pUC19 以 EcoRI 及 BaniHI 切開，並將所 得之含有Η _序列之DNAH段，導人經EcoRI及BaniHI所 切開調製之表現載體PC0S1中。如此所得之型化抗體之 表現質體命名為hMBCIHcDHA/pCOSI。 再為了製作在CH0細胞表現所用之質體，令hMBCIHcDNA -73- (請先聞讀背面之注意事項再填頁) 裝. 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（π) /pUC19以EcoRI及BaaHI切開，令所得之含有Η鋪序列之 DHAH段，導人經EcoRI切及BaeiHI所切開調製之表現載 體PC H01中。如此所得之人型化抗體之表現質體命名為 hMBCIHcDHA/pCHOI〇 (3) L鏈雑交可變區之構築 (i> FR1、2/PR3、4雑交抗體之製作 構築編碼人型化抗體和鼠（嵌合型）抗體PR區所重組L _2DNA,並進行用以人型化之各匾之評價。經由利用 CDR2内所具有之限制酶Aflll切斷部位，製作FR1及2為 來自人抗體和FR3及4為來自鼠抗體之雜交抗體。 令質體 MBClL(X)/neo 及 hMBClL(A)/neo 各 10//g，於 含有 10mM Tris-HCl(pH 7·5)、IOhiM MgCl2、IbM DTT 、50mM MaCl、0.01% (w/v>BSA、Afl 11((寶酒造）10ϋ 之反應混合液100m 1中371C下切開1小時。反應液於2% 低熔點瓊脂糖膠中進行電泳，並將來自質體MBC1L( λ) /neo之6282Η段（視為Cl)及1022bpH段（視為c2)、來 自質體 hMBClUX )/neo 之 6282bpH 段（視為 hi)及 1022bp Η 段（視為 h2),使用 GENECLEANII Kit(BIOlOl)由膠回 收、精製。 對回收之cl、hlH段各Ι/ig,進行BAP處理。DNA以苯 酚及氛仿萃取，並以酒精沈澱回收後，溶解於10 mH TrU -HC1(pH 7.4)、 IbiM EDTA溶液 10m 1〇 令BAP處理之cl及hlH段Ιαί分別連結至h2、c2M段 4/i 1 (41C , 一夜），並於大腸桿鯖JM109受容細胞中轉形 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---------裝 _ I (請先閱讀背面之注意事項再填頁)
、1T 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（W ) 。於含有50//8/1111安比西林之2乂¥11培養基2!1|1中培養， 並由菌體部分，使用 Q I A ϊ> r e P S p i n P 1 a s n i d Ki t ( Q I A G E Η ) 精製質體。 令精製質體於含有 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、IOibH MgCl2 及 ΙϋΜ DTT 及 ApaLI(寶酒造 >2U、BamHI(寶酒造） 8ϋ或HindIII(寶酒造）8U之反應混合液20μ1中37¾、切 開1小時。依據若cl-h2為正連結，則以ApaLI産生5560 /1246/49 8bp之切開H段，以BaIlHI/HindIII産生7134/ 269bf>之切開片段，進行質艨之確認。 編碼人FR1、2/鼠FR3.4雜交抗體L鍵之表現載醱視 為h/niMBClL(X)/neo。另一方面，因未取得hl-c2之選 殖株，故由PUC載體上重組選殖至HEF載體。此時，令含 編碼無胺基酸取代之人型化抗體L鏈V區DH A之質體 hMBClLa(A)/pUC19、及含有繡碼FR3内第91位（依據 Ka bat規定為胺基酸第8 7位）酪胺酸被取代成異白胺酸之 人型化抗體L鏈V匾DNA之質體hMBClLd(A)/pUC19使用 作為模板。 令質體 MBC1L(A )/i>UC19、hMBClLa(A >/pUC及 hMBClLd(A)/i>UC19各 10/ig,於含有 ΙΟιιΜ Tr*is-HCl(pH 7·5)、ΙΟπιΜ MgCl2、1_M DTT、50應M HaCl、0.01% (w/v) BSA、Hindlll 1611、Aflll 4U 之反應混合液 30m 1 中 37¾ 下、切開1小時。令反應液以2%低熔點瓊脂糖驂中進 行電泳，將來自質體MBC1L(A)/pUC19之215bp(c*)、來 自質體 hMBClUX /r>UC19 及 hMBClLdX /pUC19 之各 3218bp -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 裝 、τ 線 509697 A7 ____B7 五、發明説明（94 ) (hal’、hdlJDNAH 段，使用 GENECLEAHII Kit(BIOlOl) 由膠回收、精製。 令hal’、hal’片段分別連結至C2’片段，並於大腸桿 _JM109受容細胞中轉形。於含有50/ig/Bl安比西林之 2XYT培養基2»1中培養，並由菌體部分，使用QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)精製質體。含有 hal·、 hdl’H段之質體分別視為質體B/hMBCILaX /pUC19及 祖/hMBCILd λ /pUC19〇 令所得之質讎11^»8(：11^入/|>11(：19、1外1(8(：11^<^/|>11(：19 以EcoRI切開。各743bp之DNAH段，以2%低熔點瓊脂糖驂 中進行電泳後，使用GEKECLEAHII Kit(BIOlOl)由膠回 收、精製，並溶解於 10mM Tris-HCl(pH 7.4)、 luM EDTA 溶液20以1中。 令各DHAH段4u Γ連結至前述經BAP處理之HEP載體1/i 1 ，並於大腸桿_JH109受容細胞中轉形。於含有50iug/nl 安比西林之2XYT培養基2ml中培養，並由餹體部分，使 用 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)精製質體。 令精製之各質體，於含有20mM Tris-HCl(pH 8.5)、 IOibH MgCl2、InM DTT、IOObM KC1、Hindlll(寶酒造） 8U、Pvul(寶酒造）2ϋ之反應混合液20m 1中37Ό下切開 1小時。依據若Η段為正方向***則産生5104/2195pb 、若逆方向插人則産生4378/2926bp之切開Η段，進行 質體之確認。其分別為編碼鼠FR1、2人FR3、4雜交抗體 L _ 之表現載體 m/hMBClLaA/neo、 m/hMBClLdA/neo。 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填办 -裝·
、tT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 _ _B7__ 五、發明説明（K ) (ii) FR1/FR2雑交抗體之製作 經由利用CDR1内所具有之SnaBI切斷部位，同樣地製 作FR1和FR2之雜交抗體。 令質體 MBClL(A)/neo及 h/m MBClL(A)/neo各 l〇Mg 於含有 ΙΟπιΜ Tris-HCl(j>H 7·9)、IObH HgCl2、InM DTT 、5 0 ro Μ N a C 1、0 · 〇 1 % ( w / v > B S A、S a η B I (寶酒造）6 ϋ 之反 應混合液20/ul中，37¾下切開1小時。其次於含有 20hiM Tris-HCl(pH 8·5)、10·Μ MgCl2、IhiM DTT、 l〇〇»M KC1、 0.01% (w/v>BSA、 Pvul 6U之反應混合液 50 ju 1中37 t!下切開1小時。 反應液以1.5%低熔點瓊脂糖膠進行電泳後，將來自 質體 MBC1L ( λ)/ηβο之 4955bpUl)及 2349bp(m2)、來自 質體 h/m MBC1L(A )/neo 之 4955bF>(hail)及 2349bp(hm2) 之各DNA片段，使用GENECLEANII Kit (BI0101)由醪回 收、精製，並溶解於 10mM T>is-HCl(pH 7.4)、 ImM EDTA 溶液40 μ 1中。 令ml、hulH段分別連結至h應2、·2Η段4//1,並 於大腸捍齄JM109受容細胞中轉形。於含有5〇Mg/al安 比西林之2XYT培養基2ml中培養，並由鏞體部分，使用 QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEH)精製質體。 令精製之各質體，於含有10aM Tris-HCl(pH 7.5)、 lOntM MgCl2、ImM DTT 及 Ai>al(賨酒造）811 或 ApaLI(寶酒 造）2U之反應混合液20 μ 1中37 1C下切開1小時。 依據若各Η段為正連結，則以Apal産生7304bP、以 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填良 •裝· 、?! 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（外）
ApaLI 産生 5650/1246/498bp(nl-hn2)、以 Apal産生 6538 /766bi>、以 ApaLI 産生 3535/2025/1246/498bMhBili2) 之切開片段，進行質體之確認。 編碼人FR1/鼠FR2、3、4雜交抗體L _之表現載體視 為 hffiiaMBClL(X )/neo，编碼鼠 FR1/人 FR2/ 鼠 FR3、4雑 交抗體L鏈之表現載體視為mhffiMBClL(A)/neo。 (4)人型化抗體L鏈之構築 人型化轉23-57-134-1抗體L鏈，為以PCR法依CDR -移 檀而製作。為了製作具有來自人抗體HSU03868(GEH-BAHK 、D e f t 〇 s Μ 等，S c a n d · J · I 坩诅 u η ο 1 · , 3 9 , 9 5 - 1 0 3 , 1 9 9 4) 之FR1、FR2及FR3、且具有來自人抗體S25755 (NBRF-PDB) 之FR4之人型化#23-57-137-1抗體L鏈（型式「a」），乃 使用6個PCR引子。 CDR-移植引子MBC1LGP1(序列编號29)及MBC1HGP3(序 列編號30)為具有有意義DNA序列，而CDR移植引子 MBC1LGP2(序列編號31)及MBC1LGP4(序列編號32)為具有 反意義DNA序列，於各引子之兩端具有15至21bp之互補 序列。外部引子MBC1LVS1(序列編號33)及MBC1LVR1(序 列編號34)為與CDR移植引子MBC1LGP1及MBC1LGP4具有同 質性。 CD 卜移植引子 MBC1LGP1、MBC1LGP2、MBC1LHG3 及 MBC1HILGP4為使用尿素變性聚丙烯醯胺醪予以分離（ Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Sambrook 等，冷泉港實驗室印，1989),由膠之萃取為以crush and -7 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 -線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（竹） soak 法（Molecular Cloning·· A Laboratory Hannua 1 , Sambrook等，冷泉港實驗室印，1 989)進行。 卽，令各lnmole之CDR-移植引子以6%變性聚丙烯醯 胺膠分離，於矽膠薄層析上照射紫外線，進行目的大小 之DNA片段之鑑定，並以crush and soak法由膠回收， 且溶解於 20// 1 之 lOfflM Tris-HCl(pH 7.4)、IibM EDTA溶 液中。PCR為使用TakaRa Ex Taq(寶酒造），於100/i 1反 應混合液中含各1/i 1之如上述調製的CDR -移植引子 MBC1LGP1、 MBC1LGP2、 MBC1LGP3及 MBC1LGP4，使用含有 0.25aM dHTP及2.5U TakaRa Ex Taq條件之所附緩衝液 ，於94Ό中1分鐘、55t!中1分鐘，72υ中1分鐘之溫 度週期下進行5 _。於此反應混合液中加入50puole之 外部引子MBC1LVS1及HBC1LVR1,再於相同的溫度遇期反 應30回。依PCR法所放大之DHA片段•為經由使用3%Nu Sieve GTG瓊脂糖（FMC Bio· Products)之9脂糖膠電泳 予以分離。 切出含有421bp長之DNAH段之瓊脂糖H,使用GEHE CLEAHII Kit (BI0101),依套件所附配方精製DNAH段 。令所得之PCR反應混合物，次選植至經BamHI及Hindlll 所切開調製之PUC19中，並決定鹼基序列。將如此所得 之質體命名為hMBCL/pUC19。然而，由於CDR4之104位 (依據Rabat規定之胺基酸編號第96位）之胺基酸變成天 冬醯胺，故設計並合成用以將其修正為酪胺酸之修正引 子 MBC1LGP10R(序列编號 35)。PCR 為使用 TakaRa Taq(寶 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 裝· 訂 509697 ' A7 B7 五、發明説明（# ) 酒造），於100/ul之反應混合液中使用0.6/ig之質體 hMBCL/pUC19作為模板 DNA,各50pnole之 MBC1LVS2及 MBC1LGP10R 作為引子，使用含有 2.5U TakaRa Ex Taq、 0.25bM dNTP條件之所附緩衝液並以50iu 1之礦油作上靥 ，於941C中1分鐘、55¾中1分鐘、72¾中1分鐘之溫 度週期下進行30回。依PCR法所放大之DHAH段，為經由 使用 3%Hu Sieve GTG 瓊脂糖（FMC Bio Products)之瓊 脂糖膠電泳予以分離。 切出含有456bp長之DHAH段之瓊脂糖片，使用GEHE CLEANII Kit (BI0101),依套件所附配方精製DHAH段 。令所得之PCR反應混合物，次選殖至經BaaiHI及Hindlll 所切開調製之DUC19中。 使用M13 Priuer M4引子及M13 Priaer RV引子決定鑛 基序列，結果因為可得正序列，故此質體以Hindi II及 Blnl切開，可經1%瓊脂糖顧電泳分離出416bp之片段。 使用GENECLEAHII Kit (BI0101),依套件所附配方精製 DHAH段。令所得之PCR反應混合物，導人經Hindlll及 Blnl所切開_製之質體CX/pUC19中，並命名為質體 hMBClLaX/PUC19。此質體以EcoRI切開，將編碼人型化 L鐽之DHA導入質體pCOSl，並令EFla啓動子之下游作為 人型化L鏈起始密碼子之位置。將如此所得之質體命名 為hMBCILaX/pCOSI。人型化L鐽型式「aj之鐮基序列 (含有對應之胺基酸）示於序列編號66。又，型式a之胺 基酸序列示於序列編號47。 -8 0 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填宣 -裝·
、1T 經濟部中央榡準局員Η消費合作社印製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7___ 五、發明説明（Μ ) 依PCR法使用導入變異，製作型式「b」。設計令型式 「b」中第43位（依據Kabat規定之胺基酸繡號第43位）之 甘胺酸變更為脯胺酸、第49位（依據Kabat規定之胺基酸 鏞號第49位）之離胺酸變更為天冬胺酸。經由變異原引 子MBC1LGP5R (序列編號36)和引子MBC1LVS1,以質體 hMKBClLaX/pl!C19作為模板，進行PCR,令所得之DNA片 段以BanHI及Hindlll切開，並次選殖至PUC19之BairHI、 Hindlll部位。鐮基序列決定後，以限制酶Hindlll及 Aflll切開，並與 Hindlll及 Aflll切開之 hMBClLaX/pUC19 連結。 將如此所得之質體視為hMBClLbA/PUC19，令此質體 以EcoRI切開，並導入至含有編碼人型化L鍵DNAH段之 質體i>C0Sl中，且令EFla啓動子之下游作為人型化L鏈 起始密碼子之位置。將如此所得之質體命名為hMBCILbA / PC0S1 〇 依PC R法使用導入變異，製作型式「cj。設計令型式 「c」中第84位（依據Rabat規定之胺基酸编號第80位）之 絲胺酸變更為_胺酸。經由變異原引子MBC1LGP6S(序列 編號 37)和引子 M13 Primer RV,以質體 hMKBClLaA/p(JC19 作為模板，進行PCR,令所得之DNAH段以BamHI及Hindlll 切開，並次選殖至PUC19之BamHI、Hindlll部位。鐮基 序列決定後，以限制酶BstPI及Aor51HI切開，並與BstPI 及Aor51HI切開之hMBClLaA/pUC19連結。將如此所得之 質體視為hMBClLeA/pUC19,令此質體以EcoRI切開，並 -81- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 -線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（P ) 導入至含有編碼人型化L鰱DNA片段之質體pCOSI之 EcoRI部位中，且令EFlot啓動子之下游作為人型化L鏈 起始密碼子之位置。將如此所得之質體命名為hMBCILcA / PC0S1 〇 依PCR法使用導入變異，製作型式「dj、 「e」及「f」 。設計令各型式均顒次將「a」、「b」、「c」型式之 第91位（依據Kabat規定之胺基酸编號第87位）之酪胺酸 變更為異白胺酸。經由變異原引子MBC1LGP11M序列編 號38)和引子M-S1(序列纗號44),分別以MBCILaA/pCOSI 、hMBCILbX /pCOSI、hMBCILcA /pCOSI 作為模板，進行 PCR,令所得之DHA片段以BamHI及Hindlll切開，並次選 殖至經BanHI及Hindlll所切開調製之PUC19中。蠔基序列 決定後，以Hindlll及Blnl切開，並與Hindlll及Blnl所 切開調製之C λ /PUC19連結。 將如此所得之質體依序視為hMBCILdX /PUC19、 hMBClLeA/pUC19、 hMBClLfX/pUC19。令此些質體以 EcoRI切開，並將含有編碼人型化L鏈序列之序列導入 質體PC0S1之EcoRI部位中，且令EFlcx啓動子之下游作 為人型化L鏈起始密碼子之位置。將如此所得之質體依 序命名為 hMBCILdA /pCOSI、 hMBCILeA /pCOSI、 hMBCILf λ /pCOSI 〇 依PCR法使用導入變異，製作型式「g」及「hj 。設 計令各型式均順次將「a」、 「dj型式之第36位（依據 Rabat規定之胺基酸编號36位）之組胺酸變更為酪胺酸。 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I----------裝！ (請先閲讀背面之注意事項再填頁
、1T 線 Α7 ^^^___—------- 1、發明説明（W) 經由使用變異原引子MBC1LGP9R(序列編號39)及Μ13 PM®er RV作為引子，以hMBClLaX/pUC19作為模板，進 行PCR,並將所得之PCR産物和M13 Primer M4使用作為 引子，以質體hMBClLaA/pUC作為模板，再進行PCR。令 所得之DHAH段以Hindlll及Blnl切開，並次選殖經 Hindlll及Blnl所切開調製之質體CA/pIIC19。以此質體 作為模板，以引子MBC1LGP13R(序列纗號40)和MBC1LVS1 作為引子，進行PCR。令所得之PCR片段以Apal及Hindlll 切開，並導入至經Ai>al及Hindlll所切開之質體hMBCUaA /PUC19及hMBClLdX/pUC19中。決定鹼基序列，含有正 序列之質體依序視為hMBCILgX /j>UC19及hMBCILhX /pUC19 ，並令此些質體以限制酶EcoRI切開，將含有編碼人型化 L鍵序列之序列導入質體PC0S1之EcoRI部位，且令EFlcx 啓動子之下游作為人型化L鏈起始密碼子之位置。將如 此所得之質體依序命名為hMBCILgA /pCOSI及hMBCILhX /pCOSIo 依PCR法使用導入變異，製作型式「i」、 「j」、「k」 、「1」、「nj及「〇」。經由變異原引子MBC1LGP14S (序列编號41)和引子VI RV ( λ )(序列編號43),以質體 hMBClLaA/pUC19作為模板，進行PCR,且令所得之DNA 片段以Apal及Blnl切開，並次選殖至經Apal及Blnl所切 開調製之質體hMBClLgX/j>UC19中。進行齡基序列決定 ,並選出對應於各型式經導入變異之蘧殖株。將如此所 得之質體視為 hMBClLxX/pUC19(x=i、 j、 k、 1、 m、 n、 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝I , (請先閱讀背面之注意事項再填頁 訂 線- 經濟、哪中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（) 0),且令此質體以EcoRI切開，將含有編碼人型化L鐽 序列之序列導入質體PC0S1之EcoRI部位，且令EFla啓 動子之下游作為人型化L鏈起始編碼子之位置。將如此 所得之質體命名為 hMBClLxA/PCOSl(x = i、j、k、1、、 ^、〇)。型式「』」、「1」「1」及「〇」之鐮基序列（含 有對應之胺基酸）分別示於序列纗號67、68、69、70。 又，此些各型式之胺基酸序列分別示於序列編號48、49 ,50. 51〇 型式「p」、 「q」、 「r」、「8」及「1;」為令型式 「i」、 「jj、 「hj、 「1」或「〇」之胺基酸序列第 87位之酪胺酸以異白胺酸取代之型式，利用FR3内所具 有之限制酶Aor51MI切斷部位，並經由令型式「h」變換 連接各型式「i」、 「jj、 「」、「1」或「〇」而製 作。即，令表現質體 hMBClLxX/pCOSl(x=i、j、hi、 1、 〇)中將CDR3及含有FR3之一部分及FR4之Aor51HlH段514 bp除去，並於此表現質體hMBCILhX/pCOSI中，經由 CDR3及含有FR3之一部分及FR4之Aor51H IH段514bp所連 接之第91位（依據Rabat規定之胺基酸編號87位）之酪胺 酸變成異白胺酸而成。進行_基序列決定，並選出各型 式「i」、 「jj、 「nu、 「1」及「〇」之第91位（依據 Rabat規定之胺基酸繡號87位）之酪胺酸被異白胺酸所取 代之遘殖株，並將對應之型式分別視為「P」、「q」、 「s」、「rj及「t」，且將所得之質體命名為hMBCILxX / P C 0 S 1 ( X = p、q、s、r、t)。型式「q j、 「r」、「s j -8 4 - (請先閱讀背面之注意事項再填^< -裝·
、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 Α7 Β7 五、發明説明（W ) 及「t」之鹸基序列（含有對謹之胺基酸）分別示於序列 編號71、72、73、74。又，此些各型式之胺基酸序列分 別示於序列編號52、53、54、55。 令質體 hMBCILqA/pCOSI以 Hindlll 及 BamHI 切開，並 次選殖至經Hindlll及EcoRI切開之質體PUC19中，命名 為質體 hMBCILq λ /pUC19。 於人型化L鏈各型式中之取代胺基酸之位置示於表3C 表3 序列表中取代胺基酸之位置 (依據Rabat規定之胺基酸編碼） ---------'—裝^-- (請先閱讀背面之注意事項再填) 式 型 6 3 3 5 4 7 4 9 4 ο 8 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ab cdefghijklmn opqr St ΥΥΥΥΥΥΥΥΥΥΥΥΥΥ ΚΚΚΚ
V V V V κκ Κ
V V
D D
D DD D DDDD 訂 τι τι η Τ1 I I I I Τ1 表中，Y為表示酪胺酸、P為脯胺酸、K為離胺酸、 V為纈胺酸、D為天冬胺酸、I為異白胺酸。 -85- -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697
經濟部中央標準局員工消費合作社印IL A7 B7 五、發明説明（抖） 再者，具有前述質體hMBClHcDNA/pUC19及hMBCILqA /pUC19 之大腸桿菌各別爲 Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19)及 Escherichia coli JM109 (hMBCILq λ /pUC19)，依照布達佩斯條約進行國際寄存，Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19)以 FERM BP-5629、Escherichia coli JM109 (hMBCILq λ /pUC19)以 FERM BP-5630 於平成 8 年 8 月 15 日寄存 於工業技術生命工學工業技術硏究院所(茨城縣築波市東1 丁目1-3 號），亦於1997年9月24日寄存於中華民國臺灣新竹食科所，分 別編號爲 CCRC940178 (Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA/pUC19))及 CCRC940177 (Escherichia coli JM109 (hMBClLqA/pUC19))。 (5)對COS-7細胞之轉移感染 為了評價融合瘤抗體及人型化#23-57-137-1抗體之坑 原結合活性及中和活性，乃令前述表現質體於C0S-7細胞 中一次性地表現。即，於L鏈雜交抗體之一次性表現， 為以質-(hMBCIHcDHA/pCOSI 和 h/fnMBClL(X )/neo、 hMBCIHcDNA/pCOSI和 M/h MBCILaA/neo、 hMBCIHcDHA /pCOSl 和 B»/h HBCILdX/neo、 hMBCIHcDNA/pCOSI 和 hsiniMBClL ( λ ) / neo、 gd hMBCIHcDNA/ pCOSlfO mhmMBClKX ) / n e o的組合，使用G e n e P u 1 s e r裝置（B i o R a d )依電穿 孔作用，同時轉形至COS-7細胞。於PBS(-)中以1X107 細胞/ ml細胞濃度所懸浮之C0S-7細胞0.8ml中，加入各 質體DHA ΙΟ/ig,並以U00V、25/iF之靜電容量賦予脈 衝。於室溫下10分鐘之回復期間之後，令經電穿孔處理 之細胞懸浮於含有2% Ultra Lov IgG牛始兒血清（GIBC0) 之DMEM培養基（GIBC0),並使用10公分培養皿於C02培 -8 6 ~ 本紙张尺度通用中國國家標準（CNS)A4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（π ) 養箱中培養。72小時培養後，收集培養上清液，並依離 心分離除去細胞碎片，作為ELISA之試料。 於人型化#23-57- 137-1抗體之一次性表現，為以質體 hMBCIHcDNA/pCOSI和 hMBCILxX / pC0S1(x = a〜t)之任 一種組合，使用Gene Pulser裝置（Bio Rad),經由輿前 述雑交抗體之情形同樣之方法，轉移感染至C0S-7細胞， 並將所得之培養上清液用於ELSIA。 又，由COS-7細胞之培養上清液精製雑交抗體或人型 化抗體，可使用 AffiGel Protein MAPSII套件（Bio Rad) 依所附配方進行。
(6) ELISA (i)抗體濃度之測定 用於測定抗體濃度之ELISA平板為如下調製。於ELISA 用之96孔穴平板（Maxisorp, NUNC)之各孔穴，以固相化 緩衝液（O.lMHaHCOs、0.02% HaH3)調製成 1 /ig/ail 濃度之山羊抗人IgG抗體（TAGO)lOOiu 1予以固相化。以 20β 1 之稀釋緩衝液（例如 50aMTris-HCl、ImM MgCla、 0·1Μ HaCl、 0.05%Tween20、 0.02%NaN3 、 1% 牛血 清白蛋白（BSA)、pH7.2)封阻後，將表現出雑交抗體或 人型化抗體之C0S-7細胞的培養上清液或精製之雜交抗 體或人型化抗體予以階段稀釋並加至各孔穴。於室溫中 培養1小時，並以PBS-TWeen20洗淨後，加人齡性磷酸 酶所結合之山羊抗人IgG抗體（TAGO)lOOiul。於室溫中 培養1小時，並以PBS-Tween20洗淨後，加人lng/®l之 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------_裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填^^頁) 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 受質溶液（Sigma 104,對-硝苯基磷酸、SIGMA)、其次 以微平板讀數器（Bio Rad)測定405nm下之吸光度。測定 濃度之標準品可使用 Hu IgGlXPurified(The Bing Site)。 (ii)抗原結合能力之測定 用以测定抗原結合之ELISA平板，為如下調製。於ELISA 用96孔穴平板之各孔穴中，以固相化緩衝液調製成l//g /通1濃度之人PTHrP(卜34)100w 1予以固相化。以200α 1 之稀釋緩衝液封阻後，將表現出雜交抗體或人型化抗體 之C0S-7細胞的培養上清液或精製嵌合型抗體予以階段 稀釋並加至各孔穴。於室溫中培養1小時，以PBS-Tween 20洗淨後，加入鹼性磷酸酶所結合之山羊抗人IgG抗體 (TAGO)IOOmI,於室溫中培養，以PBS-Tween20洗淨後 ，加入lmg/®l之受質溶液（Sigma 104、對-硝苯基磷酸、 SIGMA)、其次以撤平板讀數器（Bio Rad)測定定405nn下 之吸光度。 (7)活性確認 (i)人型化Η鏞之評價 組合人型化Η鏈型式「a」和嵌合型L鏈之抗體，為 與嵌合型抗體和PTHrP結合能力同等（第5圖）。其結果 ，顯示Η鏈V區以型式「a」為充分地人型化0以下， 將人型化Η鏈型式「aj作為人型化抗體之Η鏈。 (i i)雜交抗體之活性 (ii-a) FR1.2/FR3、 4雜交抗體 L鐽為h/aMBClUX)之情形時，完全無活性，但以 -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填頁) -裝· 訂 509697 A7 _B7_ _ 五、發明説明（幻） m/hMBClLaX或m/h MBCILdX之情形則均顯示出與嵌合 型#23-57-137-1抗體同等之結合活性（第6圖）。此些 結果提示，FR3、4於作為人型化抗體無問題，但在FR1 、2内則霈存在該取代之胺基酸殘基。 (i i -b) FR1/FR2雜交抗體 L鐽為ffih_MBClLU)之情形時，完全無活性，但以 hatiuMBClLU )之情形則顯示出與嵌合型#23-57-137-1抗 體同等之結合活性（第7画）。此些結果提示FR1、2中， FR1於作為人型化抗體無問題，但在FR2内侧霈存在該取 代之胺基酸殘基。 (i ί i)人型化抗體之活性 對於由型式「a」至「t」使用各一傾作為L _之人型 化抗體，測定抗原結合活性。其結果，具有L鏈型式 「《)」、 「1」、 「m」、 「〇」、「<1」、rrj、 rs」、 「t」之人型化抗體為顯示出與嵌合型抗體同等之PTHrP 結合能力（第8〜11画）。 (8) CH0安定産生細胞株之建立 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填1¾頁) -線· 為了建立嵌合型抗體之安定産生細胞株，乃令前述表 現質體導入CH0細胞（DX B11) 即，嵌合型抗體之安定産生細胞株之建立，為令CH0 細胞用表現質體 MBCIHcDNA/pCHOI 和 hMBClLaiA /pCOSI 或 hMBCIHcDNA/pCHOl 和 hMBCILqA/pCOSK 或 hMBCIHcDNA/ PCH01 和 hMBCILrA/pCOSI 之組合，使用 Gene Pulser裝 置（Bio Rad)經由電穿孔作用，同時轉形至CH0細胞中。 -89" 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（# ) 各表現載體以限制酶Pvul切斷作成直鏈DNA,以苯酯及 氯仿萃取後，以酒精沈澱回收DH A並用於電穿孔作用。 於PBS(-)中以lx 107細胞/ rol之細胞濃度懸浮之CH0細 胞0.81〇1中，加入各質體0以10//容，並以1,500¥、25以「 之靜電容量賦予脈衝。於室溫中10分鐘回復期間之後， 令經電穿孔處理之細胞懸浮於添加10%牛胎兒血清（GIBC0) 之MEM-ot 培養基（GIBC0)中，使用96孔穴平板（Falcon) 並於C0 2培養箱中培養。於培養開始隔天，以添加10% 牛胎兒血清（GIBC0)及 500mg/Bil GEHETICIN (G418 Sulfate ,GIBC0)、但不含核糖核甘及去氣核糖核苜之ΕΗΕ-α培 養基（GIBC0)之選擇培養基予以更換，並選出經抗體基因 導入之細胞，選擇培養基更換後，於2週前後以顯撤鏡 下觀察細胞，並於察見讕順之細胞增殖後，以上述測定 抗體濃度ELISA,測定抗體産生量，並選出抗體産生量 多之細胞。 令建立之抗體的安定産生細胞株的培養擴大，於滾動 瓶中使用添加2% Ultra Law IgG牛胎兒血清、但不含 核糖核苜及去氧核耱核甘之MEM培養基，進行大量培養 。培養第3至4日，_收培養上清液，並以0.2μβι濂紙 (Millipore)除去細胞碎片。由CH0細胞之培養上清液精 製人型化抗體，為使用P0R0S蛋白質A柱（PerSeptive Biosysteas),以 ConSep LClOO(Millipore)依所附配方 進行，並用於中和活性之測定及高鈣血症模型動物之藥 效試驗。所得之精製嵌合型抗體之濃度及抗原結合活性 -90- 本秀氏張尺度適用中國國家標準（(：：!^)八4規格（210';<；297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填€頁) -裝· 、τ 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（朽） ，為於上述ELISA条中測定。 〔實施例4〕 中和活性之測定 鼠抗體，嵌合型抗體及人型化抗體之中和活性的测定 ，可使用大鼠骨肉鼴細胞株R0S17/2.8-5細胞進行。即 ，令R0S17/2.8-5細胞於含有10%牛胎兒血清（GIBCO) 之Ham’s F-12培養基（GIBC0)中，以C02培養箱培養。 將R0S17/2.8-5細胞於96孔穴平板中以1〇4細胞/ ι〇〇Μ 1 /孔穴置入，培養1日，並以含有4ιιΜ氫基膠吡啶和10% 牛胎兒血清之Ham’s F-12培養基（GIBC0)更換。再培養 3至4日後，以260// 1之Ham’s F-12培養基（GIBC0)洗 淨，並加入含有ΙιιΜ異丁基-1-甲基黃瞟昤素（IBMX、 SIGMA)及 10% 牛胎兒血清和 10aM HEPES 之 80m 1 Ham’s F-12 ,且於37t!下培餐30分鐘。 將測定中和活性之鼠抗體、嵌合型抗體或人型化抗體 ，事先階段稀釋成 3.3jug/iel、1.1/ug/nl 及 0.37iug/ffil 群、l〇Mg/ffil、2/ug/nl、0.5/ig/ml 及 〇·〇1 u g / m 1 P ,或 10“g/ml、 5 u g / m K 1 . 25 u g/»K 2.63 M g/ml 及 0.31m g/ffil群，並與調製成 4ng/ml之 PTHrP(l-34) 等量混合，將各抗體和PTHrP(l-34)之混合液80m1添加 至各孔穴。各抗體之最終濃度變成上述抗體濃度的1/4 ,PTHrP(l-34)之濃度為變成lng/ffll。於室溫中處理10 分鐘後，充棄培養上清液，並以PBS洗淨3次後，以100 Ml之0.3%鹽酸95%酒精萃取細胞内之cAMP。以水流吸 氣器令鹽酸乙醇蒸發，添加cAMP EIA Kit(CAYMAN -91- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) •裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 _B7_____ 五、發明説明（％ ) CHEHICA，S>所附之EIA緩衝液120μ1將cAMP萃取後，依 cAMP EIA KiUCAYMAN CHEMICAL’S)所附之配方携I 定 cAMP。其結果，於輿嵌合型抗龌具有同等抗原結合之L 鏈型式中，具有第91位之酪胺酸以異酪胺酸取代之型式 「<1」、「r」、 「s」、「t」之人型化抗體為顯听出接 近嵌合型抗體之中和能力·其中亦以型式「q」顯示出 最強之中和能力（第12〜14圖>。 〔實施例5〕 於高鈣血症模型動物之藥效試驗（1) 使用人腫瘤-小裸鼠移檀条之高酹血症模型動物，檢 討鼸於對PTHrP之嵌合型抗體及具有L鏈型式「®」、「r」 及「q」人型化抗體，對於高鈐血症之治療效果。 使用人胰臓癌PAN-7(由（財）實驗動物中央研究所購入） 移植之小裸鼠作為高鈣血症模型動物。經人胰臓癌PAN-7 所移植之小裸鼠為伴隨箸腫瘤之增加而使用血中鈣濃度 上升，且發症出體重減少和蓮動量降低等之高鈣血症。 對於高鈐血症之治療效果之檢討，為以嵌合型抗體及人 型化抗體改善經人胰臓癌PAN-7所引起之高鈣血症、體 重及血中鈣濃度為指標予以評價。 人胰議癌PAH-7之繼代為使用BALB/c-nu/nu小裸鼠 (日本Charles River)以生體内進行。於藥效評價中， 為購入5週齡BALB/c-nu/nii小公裸鼠（日本Carles River)並於1週馴化後，使用6週齡之動物。高鈣血症 模型動物之製作及分群為如以下進行。即，摘出經繼代 之胰臓癌PAN-7,將細切成3βι®正方塊之腫瘤塊於小鼠之 -92- (請先閲讀背面之注意事項再填办 •裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（〜） 側腹皮下以每1隻1個移植。腫瘤塊移植後，於2至3 週確認#腫瘤體積充分變大後，以腫瘤體積、血中鈣濃度 及體重作為指標並令各指標平均化地分群，作為高鈐血 症模型動物。 對高鈣血症之治療效果的檢討為如下進行。即，於上 述製作，分群之高鈐血症模型動物中，令鼠每1隻以10 Mg或30iug之對PTHrP嵌合型抗體或具有L鍵型式屋、r 之人型化抗體於尾靜脈内單回投予。具有型式「g」之 人型化抗體為對鼠每1隻以20 m g或60 m g於尾靜脈内單 回投予。於嵌合型抗體及人型化抗體投予後、第1曰、 4曰、7日、11日測定血中鈐濃度及體重，並進行各抗 體之藥效評價。腫瘤體積為由測定腫瘤之長徑UmB)及 短徑（bun),並以格蘭之計算式ab2/2算出腫瘤體積。 血中鈣濃度為由眼窩以血球容量管採血，使用643自動 Ca+ /pH分析儀（CIBA-C0RNING)测定全血離子化鈣濃度。 其結果，經由投予嵌合型抗體及具有L鐽型式「nu、 「r」及「q」之人型化抗體，可察見髏重及血中鈣濃度 之迅速改善及持鑛性。由此，顯示本發明之嵌合型抗體 及人型化抗體之作為伴隨惡性腫瘤之高鈣血症治療藥的 有用性（第15〜16圔）。 〔實施例6〕 於高鈣血症模型動物之藥效試驗（2) 使用人腫瘤-小裸鼠移檀条之高鈣血症模型動物，檢 討關於對PTHrP之嵌合型抗體之具有L鏈型式「q」之人 型化抗體，對於高鈣血症之治療效果。 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填β頁) 、1Τ 509697 A7 _ _B7 ____- 五、發明説明（％ ) (請先閱讀背面之注意事項再填^^頁 對高鈣血症之治療效果的檢討為如下進行。卽，於上 述製作、分群之高鈣血症模型動物中，將鼠每1雙以 l〇teg或30jtig之對PTHrP嵌合型抗體或具有L鏈型式「q 之人型化抗體於尾靜脈内單回投予。於嵌合型抗艨及人 型化抗體投予後、第1日、3日、7日、1〇日_定血中 鈣濃度及體重，並進行各抗體之藥效評價。血中0濃度 為由眼窩以血球容量管採血，使用643自動Ca+ /pH分析 儀（CIBA-C0RHING)測定全血離子化鈣濃度。 其結果，於人胰臟癌PAN-7移植高鈣血症模型中，經 由投予嵌合型抗髏及具有L鏈型式「Q」之人型化抗艨 ，可察見體重及血中鈣濃度之迅速改善及持鑛性。由此 ，顯示本發明之嵌合型抗體及人型化抗體之作為伴隨惡 性腫瘤之高鈣血症治療藥的有用性（第17圏）。 〔實施例7〕 於高鈣血症模型動物之藥效試驗（3) 使用人腫瘤-小裸鼠移植条之高鈣血症模型動物，檢 討關於對PTHrP之嵌合型抗體之具有L鐽型式「q」之人 型化抗體，對於高鈣血症之治療效果。 使用人肺臓癌LC-6(由（財）實驗動物中央研究所購入） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 »e度 c 人重 LC濃症及體 癌鈐血體、 臓中鈣抗症 肺血高型血 人用之合鈣 經使等嵌高 。而低以之 物加降為起 動增量，引 型之動討所 。 模瘤蓮檢-6償 症腫和之LC評4-血著少果癌以-9 鈐隨減效臟予 高伴重療肺檫 為為體治人指 作鼠出之經為 鼠裸症症善度 裸小發血改濃 小之且鈣體鈣 之植，高抗中 植移升於化血 移所上對型及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（W ) 人肺臓癌LC-6之繼代為使用BALB/c-nu/nu小裸鼠 (日本Charles River)以生體内進行。於藥效評價中， 為購人5週齡BALB/c-nu/nu小公裸鼠（日本Carles River)並於1週馴化後，使用6週齡之動物。高鈣血症 模型動物之製作及分群為如以下進行。即，摘出經繼代 之肺臓癌PAN-7,將細切成3mm正方塊之腫瘤塊於小鼠之 侧腹皮下以每1隻1傾移植。腫瘤塊移植後，於2至3 週確認腫瘤體積充分變大後，以腫瘤體積、血中鈣濃度 及體重作為指標並令各指標平均化地分群，作為高鈣血 症模型動物。 對高鈣血症之治療效果的檢討為如下進行。即，於上 述製作，分群之高錚血症模型動物中》令鼠每1隻以1〇 Mg或3〇Mg之對PTHrP嵌合型抗體或具有L鏈型式麗、r 之人型化抗體於尾靜脈内犟回投予。具有型式「g」之 人型化抗體為對鼠每1隻以20/ig或60iug於尾靜脈内單 回投予。於嵌合型抗體及人型化抗體投予後、第1曰、 3曰、6日、11日测定血中鈣濃度及體重，並進行各抗 體之藥效評價。血中鈣濃度為由眼窩以血球容量管採血 ，使用643自動Ca+t/pH分析儀（CIBA-C0RHIHG)測定全血 離子化鈣濃度。 其結果，於人胰臓癌PAN-7移檀高鈣血症模型中，經 由投予嵌合型抗體及具有L鏈型式「qj之人型化抗體 ，可察見體重及血中鈐濃度之迅速改善及持缠性。由此 ，顯示本發明之嵌合型抗體及人型化抗體之作為伴隨惡 - 9 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填頁) -裝·
、1T '線 509697 A7 __ B7______ 五、發明説明（外） 性腫瘤之高麫血症治療藥的有用性（第18圖）。 〔實施例8〕 使用BIAC0RE解析PTHrP和抗PTHrP相互作 用中的速度論 使用BIAC0R,進行抗原抗體反應之速度論解析。使用 PTHrP(l-34 + Cys)作為抗原，於C終端部位專一性地感 應器蕊Η上固定化，並以調製成各種濃度之精製抗體作. 為被分析物。由所得之感應器克數，算出動力學參數（ 結合速度常數kass及解離速度常數kdiss)。關於速度解 析、參考文獻「Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor b a s e d a n a l y t i c a 1 s y s t e ni」（K a r 1 s s ο n，R ·等，（1 9 9 1) J · I _ m u η o 1 · M e t h o d s 1 4 5,2 2 9 _ 2 4 0 頁）〇 (1) PTHrP(l-34 + C)對感應器蕊H之固定化 將 PTHrP(l-34 + C)固定化至感應器蕊 H CM5(Pharnacia)。 使用 HBSUOmM HEPES ρΗ7·4, 0·15Μ NaCl, 3·4·Μ EDTA ,0.005% Surfactant Ρ20)作為移動緩衝液，流速為 5m 1/分。感應器蕊HCM5上之羧甲基葡聚糖的羧基， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —.----------裝^-- (請先聞讀背面之注意事項再填ιϋ頁) 線 經由IOOmI 0.05M H-羥基琥珀酸亞胺（NHS)/0.2鹽酸 N-乙基- Ν’-(3^二甲胺丙基）磺化二亞胺（EDC)之注入 ΙΟΟαΙ 80·Μ鹽酸2-(2-毗啶基二硫基）乙胺（PDEA)/ 0.1M硼酸緩衝液PH8.5之注入而活性化。接著注入10以1 之 5iug/nl 1^11艸（1-34 + (：)/1〇11»1醋酸納緩衝液？115.0, 並以PTHrP(l + 34-C)之C終端的Cys殘基專一性地固定化 。再者，經由注入1〇〇m1之50biM(L)-半胱胺酸/1M HaCl -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ /〇·1Μ甲酸鈉緩衝液pH 4·3,令過剩的活性基封阻。再 者，經由注入1〇ί/1之0·1Μ甘胺酸-鹽酸緩衝液ρΗ2.5及 1〇α1之10mM鹽酸，將非共價鍵之物質洗淨。此時之PTHrP (1-34 + C)之固定量為 226.4RU(resonance units)(第 19 圖）。 (2) 固定化PTHrP(l-34 + C)與鼠抗PTHrP精製抗體之相互 作用 使用HBS作為移動緩衝液，流速為20/il/分。抗體為 令融合瘤細胞於Balb/c鼠中腹水化，並將採集之腹水使 用蛋白質A柱予以精製。精製之H23-57 - 1 37 - 1抗體以MBC 表示，精製之3F5抗體以3F5表示。此些抗體，使用HBS 調製成 1·25、2.5、5、10、20ag/ml 之濃度。 分析為以注入抗塍溶液40 Ml 2分鐘作為結合相，其 後以HBS切換2分鐘作為解離相。解離相終了後，經由 注入lOiul之10m Μ鹽酸，令感應器蕊Η再生。以此結合 、解離、再生視為分析之1週期，注入各種抗體溶液， 取得感_器克數。 (3) 固定化PTHrP(l-34 + C)與人型化抗PTHrP精製抗體之 相互作用 使用HBS作為移動緩衝液，流速為20α1/分。抗體為 在CH0細胞中産生，並使用蛋白質A柱予以精製。精製 之嵌合型抗體以chMBC表示，精製之人型化抗體型式證 以hMBCn表示，型式<1以hMBCq表示。此些抗體，使用HBS 調製成 1.25、2.5、5、10、2〇Mg/ml 之濃度。 一97- (請先閲讀背面之注意事項再填— •裝·
、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（外） 分析為以注入抗體溶液40/il 2分鐘作為結合相，其 以H BS切換2分鐘作為解離相。解離相終了後，經由注 入10/il之10»M HC1,令感應器蕊Η再生。以此結合、 解離、再生視為分析之1週期，注入各種抗體溶液，取 得感應器克數。 (4)相互作用之速度論解析 讀入目的之資料檔案，對於目的之反窿區經由重叠書 寫，進行反應_樣之比較（第20〜24圖）。再者，經由曲 線配合進行動力學參數（結合速度常數k ass及解離速度 常數（kdiss)之算定並使用BIAC0RE專用之解析軟體 「BIAevaluation 2.1」 （pharnacia),進行相互作用之 速度論解析（表4〜5)。 尚，第20〜40圖中，各曲線由圖之上方至下方之方向 分別為1.25、2.5、5、10、20itig/Bil之抗體濃度者。 表4 MBC及3F5之動力學參數 (請先閱讀背面之注意事項再填命 裝·
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 MBC 3F5 k d i s s [1/s] 7 · 38 x 1(TS 1 . 22 x 1(T2 k a s s [1/ras] 7 . 23 X 10 5 6-55X 10 5 KD [M] 1 · 0 2 x 1 (T10 1 . 86 x 1(T8 -98- -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 表5某合型抗體及人型化抗膿之動力學參數 c h H _ c h λ h HBCm hHBCq k d i s s [1/s] ( X l〇·4 ) 1 . 66 3.16 2.32 k a s s [1/s] (x 10 6 ) 1 * 24 0.883 1 · 03 KD [M] (X 1 (T10 ) 1 . 34 3· 58 2.25 尚，於算出結合速度常 數時， 使用解析模 型第4型 (B I A e v a 1 u a t i ο n 2.1 Software Handbook, A1〜A5) 0 〔實施例9〕 於惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型之磷排 泄抑制作用。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 惡性腫瘤伴隨性高鈣血症（HHM)為以腫瘤所産生之 PTHrP為其原因物質，已知PTHrP為令骨吸收及腎尿小管 之錚的再吸收亢進，並引起高鈣血症。另一方面，闘於 磷為被PTHrP於腎尿小管中抑制其再吸收，結果顯示出 ***促進作用，而在臨床HHM患者屢次察見到低磷血症 。於是，使用大鼠惡性腫瘤伴隨性高錚血症模型，檢討 人型化抗PTHrP抗體於腎中對於磷***之效果。 使用人肺臓株LC-6 7(由（財）實驗動物中央研究所購入） 移檀之大裸鼠作為高鈣血症模型動物。經人肺臓株LC-6 所移檀之大裸鼠為伴隨箸腫瘤之增加而使用血中錚濃度 -99-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（W ) 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 上升，且呈現出髏重減少和蓮動量降低等之高鈣血症。 使用本模型，以腎肅清法，以人型化抗PTHrP抗體於腎 中對於磷***之效果作為磷***率（後述）之指標予以 評價。 人肺癌株LC-6之繼代為使用BALB/c-nu/nii大裸鼠（曰 本CLA)以生體内進行。於藥效評價中，為購入5週齡F34 4 /HJcl-rnu大公裸鼠（日本CLA)並於1週酬化後，使用6 週齡之動物。 惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型之製作為如以下進行。 即，摘出經繼代之人肺癌株LC-6腫瘤，將細切成3βιη正 方塊之腫瘤塊於大鼠之侧腹皮下以每1隻1値移植。腫 瘤塊移植後，於第30日確認腫瘤體積充分變大後，以腫 瘤體積、血中錚濃度及體重作為指標並令其作為惡性腫 瘤伴隨性高鈣血症模型動物。 依腎肅清法檢討磷***，為如下進行。 (1)腎肅清法 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型動物以戊巴必妥（ Nenbutal、大日本製藥股份有限公司）麻醉，於3710保 溫之墊子上以背位固定，並***採尿用之勝胱套管（聚 乙烯管、PE50、日本Becton Dickson)。其次於大腿靜 脈***灌注用套管（聚乙烯管、PE10、日本Becton Dickson),並將灌注溶液（組成：0.7%菊粉、5%甘露 糖醇、0.2%戊巴必妥、0.9氱化鈉）以灌注泵（尾部灌入 注射器泵、STC-525、Telnio)流速2ml/hr下灌注。於50 -100-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（打） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 分鐘平衡化後，以20分鐘之間隔由勝胱套管進行5次 (由期間1至期間5為止），採尿，並將其作為尿樣品。 又，於各採尿之中間黠，由右頸靜脈將血液樣品以肝素 處理之注射筒採集約〇·25β1。 (2)抗體之投予 於上述肅清實驗之期間2之採尿開始時點下，將人型 化抗PTHrP抗體予以lag/iel/kg靜脈内投予。 (i)尿中及血中菊粉和磷濃度之測定 將期間1至期間5所得之尿樣品測定尿董後，測定菊 粉及磷濃度。又將同樣所得之血液樣品於冷卻離心分離 後，作為血漿樣品並菊酚及磷濃度。菊粉濃度為以憩酬 -硫酸法（Roe, J· H.等，J.Biol Che· 178, 839-845, 1 949)測定。磷濃度為以日立自動分析裝置7170型使用 無機磷测定用試藥、Auto cera IP(第一化學藥品），依 測定手册予以測定（Fiske Sabro法）。 (4)菊粉肅清、磷肅清及磷***率之算出 菊粉肅清（inulin clearance、 Cin)、礙肅清（phosphate c 1 e a r a n c e、C p )及礎***率（f r a c t i ο n a 1 e x c r e t i ο η ο f phosphate、FEp)為依下式算出。 葡粉肅清（inulin clearance、Cin)之算出 Cin= Uin V/Pin Cin為表示菊粉肅清（ml/kg/ain)。Uin為表示尿中菊 粉濃度（Bg/®1)。V為表示每犟位畤間之尿量（al/kg/®U) 。Pin為表示血中菊粉濃度Ug/nl)。 •101- (請先閲讀背面之注意事項再填) •裝_ 訂 線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇XΜ?公釐） 509697 A7 B7 夂、發明説明（) 碟肅清（Phosphate clearance、Cp)之算出 Cp= Up V/Pp 請 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
Cp為表示磷肅清Ul/kg/min)。ϋρ為表示尿中磷濃度 (麗g/nl)。V為表示每單位時間之尿童（nl/kg/min)。
Pp為表示血中磷濃度Ug/Bl)。 礎***率（fractional excretion of phosphate、 PEp)之算出 FEp= Cp/Cin FEp為表示磷***率。Cin為表示菊粉肅清Ul/kg/nin) 。CP為表示磷肅清Ul/kg/®in)。實驗為使用4度動物 進行。結果為以其平均值士標準誤差表示。 之磷***率及血中磷濃度之結果示於第25圖及第26圖。 第25圖為示出肅清之各期間（1期間為20分鐘）和來自 瞀之磷***率（二磷肅清/菊粉肅清）鼸僳之圖示。尚， 人型化抗PTHrP抗體、lng/kg(i.V.)為在期間2開始投 予。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第26圖為示出肅清之各期間（1期間為20分鐘）和血漿 中磷濃度闘像之画示。人型化抗PTHrP抗體、lmg/fcg(i.v 為在期間2開始投予。 由以上之結果，顯示出相對於抗體投予前之磷***率 (期間1),抗體投予後之磷***率（由期間2至期間5)為 明顯的抑制。即，於投予中和抗體下，對於經由磷*** 亢進（FEP>〇.2)呈現出低磷血症狀態之病態，可令磷之 再吸收略微至正常濃度（磷再吸收率= 1-EFp>0.8%)附 -102-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 509697 \ A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（Μ ) 近，其結果，血中磷濃度顯示出正常化之傾向。如此， 顯示出本抗體作為PTHrP為其原因下所引起之磷***亢 進和低磷血症等之治療藥的有用性。 由於PTHrP為惡性腫瘤伴隨性高鈣血症之原因物質， 故預測經由PTHrP造成磷***之增加和組織中高能量有 機磷酸濃度之降低。因此，伴隨低磷血症之疾病，例如 於低磷向性佝僂病、低磷血性維生素D抵抗性佝僂病等 中，尿中磷***之增加乃為其主要病因，本抗體可用於 作為此些疾病之治療藥。 〔實施例10〕 惡性腫瘤伴隨性高鈣血症之臨床各症狀 之改善 惡性腫瘤伴隨性高錚血症為以腫瘤所産生之PTHrP為 其原因物質，已知PTHrP為令骨吸收及腎尿小管之錚再 吸收亢進，並引起超高鈣血症。又，於惡性腫瘤所伴隨 之高鈣血症中，可看見表現狀態的惡化，意識障礙、全 身倦怠感、口渴感和惡性、嘔吐（食欲不振）等之臨床症 狀的惡化。抗PTHrP抗髏對此些臨床症狀之效果，使用 人腫瘤-小裸鼠移植条及人腫瘤-大裸鼠移植条之高鈣血 症模型動物予以檢討。 使用人肺臓株LC-67(由（財）實驗動物中央研究所購人） 移植之小裸鼠及大鼠作為高鈣血症模型動物。經人肺癌 LC-6所移植之小裸鼠及大裸鼠為伴隨著腫瘤之增加而使 用血中鈣濃度上升，且發症出體溫降低、體重減少和蓮 動量降低等之高鈣血症。 -103- ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填||||頁) Φ 訂 -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (〆） 1 1 | 鼠 抗 PTHr Ρ抗體對於惡性腫瘤伴隨性高鈣血症之一般 1 1 1 臨 床 症 狀 的 改 善 效 果 % 使 用 人 肺 癌 LC-6-小裸鼠移植条 1 I > 以 照 Η 表 示 〇 又 % 蓮 動 量 之 改 善 體溫 改善 及攝食董 請 先 1 I 降 低 之 改 善 效 果 $ 為 使 用 人 肺 癌 LC -6 -大裸鼠予以評價。 閲 讀 背 1 1 1 . 高 鈣 血 症 所 伴 隨 之 外 觀 上 臨 床 症 狀 之改 善 面 之 1 注 1 人 肺 癌 LC -6之 繼 代 為 使 用 BALB/ c - n u / η u小裸鼠（日本 意 事 1 CLA) 以 生 勝 内 進 行 〇 於 藥 效 評 價 中 f 為購 入5 週齡F344 項 再 填 1 1 / Μ J cl -r η υ 小 公 裸 鼠 (日本CLA)並於1 週馴化後，使用6 * 百 裝 I 週 齡 之 動 物 〇 高 鈣 血 症 模 型 模 型 動 物 之製 作及 分群為如 貝 1 1 I 以 下 進 行 Ο 卽 9 摘 出 經 繼 代 之 人 肺 癌 LC-6 ，將 細切成 1 1 正 方 塊 之 腫 瘤 塊 於 小 鼠 之 側 腹 皮 下 以 每1 隻1 値移植。 1 1 腫 瘤 塊 移 檀 後 於 第 27 曰 確 認 腫 瘤 體 積充 分變 大後，以 訂 1 腫 瘤 體 積 血 中 m titt. 擴 度 及 證 重 作 為 指 標並 令其 作為惡性 1 1 腫 瘤 伴 隨 性 高 鈣 血 症 模 型 動 物 〇 1 1 腫 瘤 體 積 為 由 測 定 腫 瘤 之 長 徑 (a nn )及短徑（bnim),並 1 I 以 格 蘭 之 計 算 a b 2 /2 算 出 腫 瘤 體 積 〇 Φ 1 線 血 中 m 濃 度 為 由 眼 窩 以 血 球 容 量 管 採血 ，使 用643自 1 I 動 C a + / P Η分析儀（CIBA ^C0RHING)_定金血離子化鈣濃 1 度 〇 1 1 對 Sr 间 鈣 血 症 之 治 療 效 果 的 檢 討 為 如 下進 行。 即，於上 1 | 述 製 作 分 群 之 高 m 血 症 模 型 動 物 中 ,令 鼠每 1隻以 I 1 I U g之對PTH IrP之 鼠 抗 體 » 於 腫 瘤 移 植 後、 第27 、30、 34、 1 1 37 於 尾 靜 脈 内 投 予 〇 由 於 抗 體 投 予 群及 對照 群中分別 1 I 選 出 典 型 的 1 隻 $ 與 正 常 動 物 於 腫 瘤 移植 第41 曰進行照 1 1 I -104 t - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 像攝影。 其結果，於人肺癌LC-6移植高0血症模型中》抗體投 予動物（第27圓之中央及第28圔之中央）儘管保持與對照 動物（第27圖之右及第28圖之右）同程度之腫瘤塊，亦呈 現出輿正常動物（第27圖之左及第28圖之右）同等之外觀 ,可確認經由抗PTHrP抗體投予改善外觀上之臨床症狀 (第27及28圖）。 2.高錚血症所伴隨之蓮動量降低之改善 人肺癌株LC-6之繼代為使用BALB/c-nu/nu小裸鼠（日 本CLA)以生體内進行。於藥效評價中，為購入5週齡 F344/H Jc卜rnu大公裸鼠（日本CLA),並於1週騮化後 ，使用6週齡之動物。惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型之 製作為如下進行。即，摘出經繼代之人肺癌LC-6,將細 切成3mffl正方塊之腫瘤塊於鼠之側腹皮下以每1隻1個 移植。腫瘤塊移植後，於第30日確認腫瘤體積充分變大 後，以腫瘤體積、血中鈣濃度及體重作為指檫並令其作 為惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型動物。 血中0濃度為由眼窩以血球容量管採血，使/用643自 動Ca+ /pH分析儀（CIBA-C0RHIHG)测定全血離子化鈣濃 度。 (1)自發蓮動量測定法 自發蓮動量之測定為使用自發蓮動量測定裝置ANIMEX (AHIMEX activity meter type SE、 FERAD Electronics 、Sweden),並於每個個體所個別飼養之聚乙烯製籠（給 -105- (請先閲讀背面之注意事項再填· 裝· 訂 -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明卜+) 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 水、給飼料下）放置於裝置所指定之位置予以進行。因 為此裝置為計测大鼠之蓮動量，故記錄每一定時間之計 數。測定為在午後7點開始至隔日上午8點為止進行13 小時，測定結果為以每1小時之計數數目。 (2)抗體之投予 使用如上述之發症出高鈣血症之大鼠，並將人型化抗 PTHrP抗體以5mg/0.5ml/kg尾靜脈内投予。又，於對照 為將生理食理水同樣地以尾靜脈内投予。測定為對抗體 投予櫥體和對照個體交互地進行測定。测定日為在抗髏 投予値體以抗體投予〇(授予前日）、第2、4、7、14日進 行，於對照個體為於第1、3、5、8、15日進行。 其結果，對照個體之自發蓮動量為在實驗期間中無變 化或者顯示出減少傾向，但於抗體投予値體則可察見於 第4日以後自發蓮動量增加（第29圖）。 3.高鈣血症所伴隨之體溫降低之改善 人肺癌株LC-6之繼代及惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型 之製作，為與上述2所示之方法同樣地實施。 (1) 體溫測定法 體溫之测定為使用數字溫度計、嫡體為以戊巴必妥 (Nenbutal、大日本製藥股份有限公司）麻醉，並將溫度 感應器探針進行***直腸。 (2) 抗體之投予 使用如上述之發症出高0血症之大鼠，並將人型化抗 PTHrP抗體以lmg/ml/kg尾靜脈内投予。又，於對照為將 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 Φ 項 再 裝 頁 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（) 生理食鹽水同樣地以尾靜脈内投予。再者，亦同時測定 正常大鼠（無投予）之體溫。體溫測定於抗體投予値體、 對照個體及正常大鼠均於投予〇(投予當曰）、第1、2、 3日進行。 其結果，正常大鼠之體溫於實驗期間中，以34.2〜 3 4.41之幾乎無變化的推移。於惡性腫瘤伴隨性高鈐血 症大鼠中，可察見比正常大鼠，降低約2¾之體積。若 於此模型中投予人型化抗PTHrP抗體，則可確認在投予 第3日回復至正常大鼠之體。如此，顯示人型化抗 PTHrP抗體對惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型中之體溫降 低具有改善作用（第30圖）。 4.高鈣血症所伴隨之攝食量降低之改善 人肺癌株LC-6之繼代及惡性腫瘤伴隨性高》血症模型 之製作，為與上述2所示之方法同樣地實施。製作之模 型為以血中鈣濃度及體重作為指標並令各指標平均化地 分群，使用於以下之實驗。 (1) 攝食量測定法 大鼠為在實驗期間中，放入個別飼養用之代謝籠中， 並於給水、給飼料中飼養。攝食量為以當曰上午9點開 始至隔日上午9點為止之2 4小時攝食量，拥1定給飼料器 之重董，並將其與預測重量（風袋重量）之 之攝食量（克）。 (2) 抗體之投予 使用如上述之發症出高鈣血症之大鼠（ΗΗΜΛ ® ’ -107- 請 先 聞 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 裝 頁 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（) 並將人型化抗PTHrP抗體以5mg/0.5ml/kg尾靜脈内投予 。又，於對照群為將生理食鹽水同樣地以靜脈内投予。 再者，對於正常大鼠亦將生理食鹽水同樣地以尾靜脈内 投予。攝食量測定於抗體投予改良品種、對照群及正常 大鼠群均於投予0(由投予前日至當日、第1 (投予當曰 至隔日）、3 (投予第3日至隔日）、5日（投予第5日至 隔日）進行。 其結果，投予前值之攝食量於高鈣血症大鼠（値體5至 9 )中其平均為8.11克，正常大鼠為12.06克。如此可知 高鈣血症大鼠之攝食量降低。若於此模型中投予人型化 抗PTHrP抗體，則對照群於攝食量無大變化，但於抗體 投予群則可確認於投予第1日以後回復至正鼠大鼠之攝 食量。如此，顯示人型化抗PTHrP抗體對惡性腫瘤伴隨 性高鈣血症模型中之攝食量降低具有改善作用（表6)。 (請先閱讀背面之注意事項再填mr頁) •裝·
、1T 線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -10 8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509697 Β 五、發明説明（、^ ) 表6對攝食量所造成之影響 動物 個體編號 投予（註） 投予前曰 每個別攝食量（g) 第1日第3日 第5日 正常大鼠 個體1 生理食鹽水 13.7 16.7 18.63 18.71 個體2 生理食鹽水 14.27 15.3 19.55 19.39 個體3 生理食鹽水 9.83 15.3 20.72 19.88 個體4 生理食鹽水 10.42 15.04 20.28 22.03 ΗΗΜ大鼠 値體5 生理食鹽水 10.77 14.24 12.66 11,82 個體6 生理食鹽水 6.99 8.92 2.59 14.8 ΗΗΜ大鼠 個體7 抗PTHrP抗體 7.46 17.65 22· 52 17.99 個體δ 抗PTHrP抗體 12 12,38 20.94 23.1 個體9 抗PTHrP抗體 3.35 16·65 20.36 21,89 ----------_裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填頁)
、1T 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 註 1 生 理 食 鹽 水 投 予 量 為 0 . 5 m 1/kg 尾 靜 投 予 抗 體 投 予 量 為 5 η g/0 . 5祖 1 / k g 尾 靜 投 予 由 以 上 之 結 果 » 顯 示 出 本 發 明 之嵌 合 型 抗 體 及 人 型 化 抗體 於 作 為 惡 性 腫 瘤 所 伴 隨 高 鈣 血症 的 臨 床 各 症 狀 之 改 善藥的有用性。 5.高鈣血症所伴隨之血液pH之改善 -109- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7_ _ 五、發明説明（) 人肺癌株LC-6之繼代及惡性腫瘤伴隨性高鈣血症模型 之製作，為與上述2所示之方法同樣地實施。製作之模 型為以血中鈣濃度及體重作為指檫並令各指標平均化地 分群，使用於以下之實驗。 (1) 血液pH測定法 血液pH為使用肝素處理之注射筒，以心臟採血法採集 血液，並使用643自動Ca++/PH分析儀（CIBA-C0RNING)_ 定血液pH。 (2) 抗體之投予 使用如上述之發症出高鈣血症之大鼠（HH Μ大鼠）， 並將人型化抗PTHrP抗體以5Big/〇.5ml/kg尾靜脈内投予 (h = 3)。又，於對照群為將生理食鹽水同樣地以靜脈内 投予（n = 2)。血液pH測定於抗體投予群及對照群均為於 投予0(投予當日）、第1、7日進行。各群結果均以其平 均值表示。 其結果，高鈣血症大鼠於抗體投予前之血液pH為約7.49 (正常大鼠之血液pH為ρΗ7· 40 土 0.02),本模型顯示出明 顯地代謝性餘血症之病態。若於此模型中投予人型化抗 PTHrP抗體，則與對照群中血液pH幾乎無變化相比較，於 抗體投予群可確認在投予第7日乃改善至接近正常大鼠 之血液dH值。已報告於惡性腫瘤伴隨性高鈣血症（HHM) 臨床各症狀之一之基於腎臓之重磺酸離子（HC〇3_ )排 泄阻礙乃造成代謝性鹸血症。由於人型化抗PTHrP抗體 之投予於本模型中可令血液pH正常化，故顯示出具有改 -110- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填頁) •裝-
、1T 509697 A7 B7 五、發明説明（㈣） 善HHM所見之代謝性鹸血症之作用（第31圖）。 由以上之結果，顯示出本發明嵌合型抗體及人型化抗 體可用於作為改善德性腫瘤所伴隨高鈣血症臨床各症狀 之改善藥。 〔發明之效果〕 依據本發明，提供對PTHrP之抗體、嵌合型抗體及人 型化抗體。此些抗體由於對人之抗原性低，故可用於作 為高鈣血症，低磷血症等之治療藥。 (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（#) 〔序列表〕 序列編號：1 序列長度：2 0 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成D N A ) 序列： AAATA6CCCT TGACCAGGCA 20 序列編號：2 序列長度：3 8 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A) 序列： CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38 序列編號：3 序列長度：2 8 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A) 序列： -112- (請先閱讀背面之注意事項再填 -裝_ 頁)
、tT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（Μ Ο 6GATCCCG6G CCAGTGGATA GACAGATG 序列鏞號：4 序列長度：2 9 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA 序列编號：5 序列長度：17 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTTTTCCCAG TCACGAC 序列编號：6 序列長度：17 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： CAGGAAACAG CTATGAC -1 1 3- I---------琴 (請先閱讀背面之注意事項再填 頁)
、1T 線 7 ii 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
序列編號：7 序列長度：3 1 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGG6CT C 序列繡號：8 序列長度：3 0 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA 序列编號：9 序列長度：3 6 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGG6TTT GG6CTG -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 31 30 36 裝 頁 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（) 序列編號：1 〇 序列長度：4 1 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TTTCCCGGGC CCTT6GTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G 41 序列編號：1 1 序列長度：1 D 9 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A ) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60 CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109 序列編號：1 2 序列長度：1 1 〇 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： -1 1 5- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) -裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（μ ) GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60 ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110 序列編號：1 3 序列長度：9 8 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60 CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 98 序列編號：1 4 序列長度：1 〇 6 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60 CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC 106 序列纊號：15 序列長度：4 3 序列類型：核酸 股數：單股 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填¥頁)
、tT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（“Ο 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC 43 序列編號：16 序列長度：2 0 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TGTTGAATTC TTACTATGAA 20 序列編號：17 序列長度：3 9 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC 39 序列編號：18 序列長度：3 9 序列類型：核酸 股數：單股 -117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I---------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4 ) 拓蹼學：直鍵狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA 39 序列編號：1 9 序列長度：4 6 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC 46 序列編號：2 0 序列長度：3 4 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鍵狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34 序列編號：21 序列長度：3 5 序列類型：核酸 股數：單股 -1 18- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) -裝·
、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（^) 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT 35 序列編號：2 2 序列長度：4 8 序列類型：核酸 股數：犟股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC 48 序列編號：2 3 序列長度：1 2 8 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGGC GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128 序列编號：2 4 序列長度：1 2 5 119 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填頁) •裝· 訂 線 509697 A7
五、發明説明（d ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鍵狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC 60 ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG 120 GACAC 125 序列编號：2 5 序列長度：1 3 2 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCCAGGCT GG 132 序列繡號：2 6 序列長度：1 1 〇 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填頁) -裝-
、1T 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（“9 ) 序列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60 ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG 110 序列編號：2 7 序列長度：3 0 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG 30 序列編號：2 8 序列長度：3 0 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG 30 序列編號：2 9 序列長度：1 3 3 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鍵狀 -1 2 1 - (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 裝-
、1T 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（p ) 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60 GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120 CGGTCAAGCT CAC 133 序列編號：3 0 序列長度：1 1 8 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鍵狀 序列種類：其他之核酸《合成DNA) 序列： AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118 序列编號：3 1 序列長度：1 2 8 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A) 序列： CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60 TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC 120 GAGGCTCC 128 -122- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -------------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（㈤） 序列鏞號：3 2 序列長度：1 1 4 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A) 序列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114 序列編號：3 3 序列長度：1 7 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鍵狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： ACAAAGCTTC CACCATG 17 序列編號：3 4 序列長度：19 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： -1 2 3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I--------— II (請先閱讀背面之注意事項再頁)
、1T 線_ 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（a、） CTTGGATCCG GGCTGACCT 19 序列編號：3 5 序列長度：7 5 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成D N A ) 序列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGT 75 序列编號：3 6 序列長度：4 3 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG 43 序列編號：3 7 序列長度：4 6 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： -124- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) •裝·
、1T 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（Η ) ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA 46 序列編號：3 8 序列長度：1 1 1 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A) 序列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111 序列編號：3 9 序列長度：4 2 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DN A ) 序列： CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT 42 序列繡號：4 0 序列長度：2 6 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) -125- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) -裝-
、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明 序列： CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG 26 序列編號：41 序列長度：3 5 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA 35 序列編號：4 2 序列長度：3 5 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： CACGAATTCA CTATC6ATTC TGGAACCTTC AGAG6 35 序列編號：4 3 序列長度：18 序列類型：核酸 股數：單股 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） ------------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁)
、1T 線_ 509697 A7 B7 五、發明説明（^ ) 序列： GGCTTGGAGC TCCTCAGA 18 序列編號：4 4 序列長度：2 D 序列類型：核酸 股數：犟股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸（合成DNA) 序列： GACA6TGGTT CAAAGTTTTT 20 序列編號：4 5 序列長度：1 1 8 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：蛋白質 序列： I.---------—裝，-- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 、1Τ 線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -127« 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（丨4 )
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 15 10 15
Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30
Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 * 75
Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號：4 6 序列長度：118 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：蛋白質1 序列：
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） nn- m IB— i-3-3— 131_==m .............In 11 ·ϋϋ n (請先閲讀背面之注意事項再頁) 訂 -線 509697 A7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（β ) ♦ 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 序列编號：4 7 序列長度：1 1 6 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鐽狀 序列種類··蛋白質 序列： Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公犛） 一129- (請先閱讀背面之注意事項再^1^:頁) 裝· 訂 線 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明) § Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 1 5 10 1 15 Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin II is Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 · Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75 Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編 號 :4 6 序列長 度 :118 序列類 型 :胺基酸 拓蹼學 ♦ * 直鐽狀 序列種 類 :蛋白質 序列： Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2iyi^釐） -130- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（H )
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75
Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 110 115 序列編號：4 8 序列長度·· 1 1 8 序列類型：胺基酸 拓蹼學··直鏈狀 序列種類··蛋白質 序列：
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30
Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75
Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90
Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210:〜公釐） -131* ----------^-- (請先閱讀背面之注意事項再頁) 訂 線_ 509697 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（^ ) 95 * 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號：4 9 序列長度：11 8 序列類型··胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：蛋白質 序列： Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 -132- (請先閱讀背面之注意事項再頁) 裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X2·%公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（w) 序列編號：5 0 · 序列長度：1 1 8 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鍵狀 序列種類：蛋白質 序列： Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號：51 序列長度：1 1 8 序列類型：胺基酸 拓蹼學··直鐽狀 序列種類：蛋白質 (請先閱讀背面之注意事項再填HP：頁) -裝·
、1T 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X203公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（【》) 1 i Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 1 1 5 10 15 1 1 I Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 1 l 20 25 30 請 先 1 閱 1 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 讀 背 1 35 40 45 之 1 注 I Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 意 事 1 50 55 60 項 再 1 I 填 1 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 參 裝 65 70 75 頁 1 I Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 1 1 80 85 90 1 I Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 1 1 訂 I 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leo Gly Gin Pro 1 1 110 115 1 1 I 序列编 胁 m :5 2 1 1 線 1 序列長 度 :1 18 • 序列類 型 :胺基 酸 1 I 拓蹼學 ·· 直鏈狀 I 1 I 序列種 類 :蛋白 質 1 I 序列： 1 | Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 1 1 5 10 15 1 1 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 1 1 I 20 25 30 1 1 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ25>χ分釐） 一134- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（…） 35 # 40 45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75
Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號：5 3 序列長度：11 8 序列類型•·胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：蛋白質 序列：
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30
Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Giy Pro Arg 35 40 45
Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -135- -----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填►頁)
、1T 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（丨糾） Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號：5 4 序列長度：11 8 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：蛋白質 序列： Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr He Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Giy Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X么釐） 一136- (請先閲讀背面之注意事項再填HP頁) -裝· 訂 -線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（Μ) 110 * 115 序列編號：5 5 序列長度：1 1 8 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：蛋白質 序列：
Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30
Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45
Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60
Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75
Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號：5 6 序列長度：11 8 序列類型：胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210父29厂:翁） -137- I.---------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁 、1Τ 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（以） 拓蹼學：直鐽狀 序列種類：蛋白質 序列： Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 序列編號：5 7 序列長度：4 11 序列類型：胺基酸 股數：雙股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：c D N A至 m R N A 序列： ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45 (請先閱讀背面之注意事項再填I®：頁) 裝- 、?τ 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297，八鰲） -138- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明（A?)
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Ala Leu lie Leu Lys -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90
Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu 1 5 10 GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro 30 35 40 GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225
Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270
Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 60 65 70 AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu 75 80 85 AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405
Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCT GCA 411 Ser Ala ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X29yv鋒) -139- I.----------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 、1Τ 線· 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 ___B7_ 五、發明説明（W ) 參 序列编號：58 序列長度：4 1 1 序列類型：胺基酸 股數：雙股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：c D N A至 m R N A 序列： ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg -15 -10 _5 GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90 Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro 30 35 40 GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 60 65 70 AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297/^^ ) -140- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) •裝· 訂 線 509697 A7 B7________ 五、發明説明（Μ ) 75 * 80 85 AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405
Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA 411 Ser Ser 序列编號：5 9 序列長度：1 1 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜酞 序列：
Lys Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ---------^II (請先聞讀背面之注意事項再填頁) 序列編號：6 0 序列長度：7 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肱 序列：
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 -141- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） 509697 A7 B7 五、發明説明（) 序列編號：61 序列長度：9 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜酞 序列：
Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 序列纊號：6 2 序列長度：5 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肱 序列：
Pro Tyr Trp Met Gin 1 5 序列編號：6 3 序列長度：16 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜ife 序列：
Ser lie Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gin Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 -142- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填ί赢 -裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 _B7___ 五、發明説明（⑷） 序列編號：6 4 序列長度：1 1 序列類型•·胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列：
Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
序列编號：6 5 序列長度：4 1 1 序列類型：胺基酸 股數：雙股 拓蹼學：直鰱狀 序列種類：cDN A至 mRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I-----------^—— (請先閱讀背面之注意事項再填 線- GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu 30 35 40 AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 _143^ 經濟部中央檩準局員工消費合作杜印製 509697 A7 B7__ 五、發明説明（咖）
Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315
Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp 75 80 85 GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Met Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405
Phe Val Tyr Val Phe Giy Giy Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：6 6 序列長度：4 0 5 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學：直鏈狀
序列種類：cDNA至 fflRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 1^尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29X^釐) 輯:44麵 ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 509697 A7 B7______ 五、發明説明（l4))
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 序列編號：6 7 序列長度：4 1 1 序列類型：核酸 股數：雙股 _-145-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2糾公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填ίβ頁) .裝. 訂 經濟部中央檩準局員工消費合作杜印製 509697 A7 B7___ 五、發明説明（^ ) 拓蹼學：直鑲狀
序列種類：cDNA至 mRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 -146- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X及^釐） ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填B頁) 訂 線 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ΚΓ )
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：6 8 序列長度：4 1 1 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學：直鍵狀
序列種類：cDNA至 biRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 15 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297A蘑) -147- ----------批衣| (請先閲讀背面之注意事項再填頁 、?τ 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGG TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：6 9 序列長度：4 11 序列類型：核酸 股數·.雙股 拓蹼學：直鏈狀
序列種類：cDNA至 mRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29场釐） -148 (請先閲讀背面之注意事項再填頁) •裝- 訂 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（《7 ) 1 I Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val • Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 冊 1 應 15 20 25 1 | CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 1 I Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 請 1 1 30 35 40 閲 讀 1 | AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 背 面 1 1 之 1 I Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 注 意 1 I 45 50 55 事 項 1 | 再 I AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 1 裝 1 I Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 頁 60 65 70 I 1 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 1 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 1 1 75 80 85 訂 | GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 1 1 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 1 I 90 95 100 1 1 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 1 線 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly • 1 105 110 115 1 I CAG CCC 411 圓 1 Gin Pro 1 1 I 序列編 號 :7 0 1 1 1 序列長 度 ：4 11 1 I 序列類 型 :核酸 1 1 股數： 雙 股 1 I 拓蹼學 • 直鏈狀 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX29如簏） -149- 509697 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 A7 B7___五、發明説明（(4 ) 序列種類：cDN A至 ®RN A 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29；7公菝） -150 (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 裝· 訂 線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 ___B7____ 五、發明説明（W ) 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：7 1 序列長度：4 11 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學：直鐽狀
序列種類：cDNA至 ffiRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 _5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Giu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） -151- ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 -線 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 509697 A7 B7 五、發明説明) 60 * 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：7 2 序列長度：4 1 1 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學：直鍵狀
序列種類：cDNA至 fflRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29V^ ) -IS2- -----------_裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明) 15 * 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 50 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly IDS 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號：7 3 序列長度：4 1 1 序列類型：核酸 股數：雙股 拓蹼學·•直鏈狀 序列種類：CDNA至fflRNA 序列： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29J公參） -153- I.--------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 線· 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 五、發明説明 « ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315
Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360
Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405
Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X291分辞) ·154鑛 (請先閱讀背面之注意事項再填^^頁) 裝· 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509697 A7 B7 ___ 五、發明説明) CAG CCC 411 #
Gin Pro 序列編號：7 4 序列長度：4 11 序列類型··核酸 股數：雙股 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：cDNA至 fflRNA 序列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45
Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90
Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135
Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180
Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225
Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270
Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------装! (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 線 509697 A7 B7 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 ^GGG^Icf TAC? CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列繡號：7 5 序列長度：3 4 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直鏈狀 序列種類：胜肱 序列： Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser lie 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu lie Ala Glu 20 25 30 He His Thr Ala -156- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ----------^! (請先閲讀背面之注意事項再填頁) 訂 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) 〔圖面之簡單說明〕 〔第1圖〕 本發明抗體之模式圖。 〔第2圖〕 二出CDR -移植概要圏。 〔第3圖〕 示出V區之FR及CDR之評價圖。 〔第4圖〕 示出抗體結合活性之測定結果圔。 〔第5圖〕 示出抗體結合活性之測定結果圖。 〔第6圖〕 示出抗體結合活性之_定結果圖。 〔第7圖〕 示出抗體結合活性之测定結果圖。 〔第8圖〕 示出抗體結合活性之測定結果圓。 〔第9画〕 示出抗體結合活性之測定結果圖。 〔第1D圏〕 示出抗體結合活性之測定結果圖。 〔第11圖〕 示出抗體結合活性之測定結果圖。 -157- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) -裝- 訂 -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 509697 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4 ) 〔第12圖〕 示出人型化抗體之中和活性。 〔第13圈〕 示出人型化抗體之中和活性。 〔第14圖〕 示出人型化抗體之中和活性。 〔第15圖〕 示出本發明抗體對於高鈣血症模型動物之效果圖。 〔第16画〕 示出本發明抗體對於高鈐血症模型動物之效果圖。 〔第17圖〕 示出本發明抗體對於高鈣血症模型動物之效果圔。 〔第18圖〕 示出本發明抗體對於高鈣血症模型動物之效果圖。 〔第19圓〕 示出PTHrP對感應器蕊Η之固定化臧應器克數圏。 〔第20圖〕 示出本發明抗體之速度論解析結果画。 〔第21圏〕 示出本發明抗體之速度論解析結果圖。 〔第22圖〕 示出本發明抗體之速度論解析結果圖<> 〔第23圖〕 示出本發明抗體之速度論解析結果圖。 -158- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) •裝- 、1Τ 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 509697 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（) 〔第24圖〕 示出本發明抗體之速度論解析結果圖。 〔第25圖〕 示出本發明人型化抗體對磷***率所造成影響之試驗 結果圖。 〔第26圖〕 示出本發明人型化抗體對血漿中磷濃度所造成影響之 試驗結果圖。 〔第27圖〕 示出抗PTHrP抗體對高鈣血症鼠投予後之外觀上臨床 各症狀觀察結果之照Η (生物之形態 〔第28圖〕 示出抗PTHrP抗體對高鈣血症鼠投予後之外觀上臨床 各症狀觀察結果之照Η (生物之形態）。 〔第29圖〕 使用高鈣血症模型，與對照群（生理食鹽水投予）比較 抗ΡΤΗι*Ρ抗體投予後之自發蓮動量的經曰變化圖。 〔第30画〕 使用高鈣血症模型，與對照群（生理食鹽水投予）比較 抗PTHrP抗體投予後之體溫的經日變化圖。 〔第31圖〕 使用高鈣血症模型，與對照群（生理食鹽水投予）比較 抗PTHrP抗體投予後之血液pH的經日變化圖。 -1 59- (請先閱讀背面之注意事項再填^||^頁) •裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

  1. 509697
    六、申請專利範圍 第8 6 1 1 3 9 6 1號丄.對人畐ίί甲狀|泉激素關連、胜肽之人型化抗
    體」專利案 (91年6月〗9日修正） 六、申請專利範圍： 1· 一種嵌合型L鏈，其包含人抗體L鏈CA區，及對人 副甲狀腺激素關連胜肽之鼠單株抗體L鏈V區，該L 鏈V區爲如下列序列編號45所示之胺基酸序列。 序列編號45 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Ala Lys Leu· Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 .Gly lie Pro Asp.Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75 Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp Glu -Ala Met Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 509697 六、申請專利範圍 2.—種嵌合型Η鏈，其包含人抗體Η鏈Cri區，及對 人副甲狀腺激素關連胜肽之鼠單株抗體Η鏈V區，該 Η鏈V區爲如下列序列編號46所示之胺基酸序列。 序列編號46 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 3 · —種對人副甲狀腺激素關連胜肽之嵌合型單株抗體， 其含有如申請專利範圍第1項之嵌合型L鏈，及如申 請專利範圍第2項之嵌合型Η鏈。 509697 六、申請專利範圍 4. 一*種人型化抗體L鍵V區之多狀’其係由3有貫问人 抗體L鏈V區之骨架區1〜4 ’及對人副甲狀腺激素關 連胜肽之鼠單株抗體L鏈V區相同胺基酸序列之互補 性決定區1〜3所構成，其具有如下列序列編號4 8〜5 1 所示之任一種胺基酸序列之多肽。 序列編號48 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro GIu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Giu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 509697 t 六、申請專利範圍 序列編號49 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 ' 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號50 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45
    509697 六、申請專利範圍 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp , 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號51 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 - 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val iMet Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg . 65 70 75 •Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 509697 六、申請專利範圍 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 5. —種人型化抗體L鏈V區之多肽，其係由含有實同人 抗體L鏈V區之骨架區1〜4，及對人副甲狀腺激素關 連胜肽之鼠單株抗體L鏈V區相同胺基酸序列之互補 性決定區1〜3所構成，其具有如下列序列編號52〜55 所7K之任一種胺基酸序列之多肽。 序列編號52 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 * 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 509697 六、申請專利範圍 序列編號 53 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Giy Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu* Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Vai Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號 54 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 7- 509697 六、申請專利範圍 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115. 序列編號55 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115
    509697 六、申請專利範圍 6 · —種對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型抗體之L鏈， 其係由人抗體之L鏈C區之多肽，及如申請專利範圍 第4或5項之多肽所構成，該C區之胺基酸序列爲人 L鏈λ鏈C區之胺基酸序列。 7.如申請專利範圍第6項之L鏈，其中人L鏈λ鏈C區 之胺基酸序列爲人Meg + Ke + 0ζ -之胺基酸序列。 8 . —種對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型抗體之L鏈， 其係由人抗體之L鏈C區之多肽，及如申請專利範圍 第4或5項之多肽所構成，該C區之胺基酸序列爲人 L鏈/c鏈C區之胺基酸序列。 9 . 一種人型化抗體，其具有如申請專利範圍第6 - 8項任 一項之L鏈。 10. —種人型化抗體Η鏈V區之多肽，其係由實同人抗 體Η鏈V區骨架區1〜4，及對人副甲狀腺激素關連胜 肽之鼠單株抗體Η鏈V區相同胺基酸序列之互補性決 定區1 ~3所構成，具有如下列序列編號56所示之胺 基酸序列之多肽。 序列編號5 6 Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 15 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 509697 六、申請專利範圍 Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 1 1 . 一種對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型化抗體L 鏈，其係由人抗體之L鏈C區之多肽，及如申請專利 範圍第4或5項之多肽所構成。 I 1 2 . —種對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型化抗體Η 鏈，其係由人抗體之Η鏈C區之多肽，及如申請專利 範圍第10項之多肽所構成。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之人型化抗體Η鏈，其中C 區爲C τ 1區。 1 4 · 一種對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型化抗體，其 係由如申請專利範圍第1 1項之L鏈，及如申請專利 範圍第1 2或1 3項之Η鏈所構成。 1 5 · —種DNA，其爲編碼如下列序列編號45所示之胺基 酸序列之L鏈V區之鹼基序列。 -10- 509697 六、申請專利範圍 序列編號45 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75 Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 1 6 . —種DNA，其爲編碼如下列序列編號6 5所示之L鏈 V區之鹼基序列。 序列編號6 5 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 -11- 509697 六、申請專利範圍 GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT. Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Leu 30 35 40 AAG CCT CCT MG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser lie Ser Asn lie Gin Pro Glu Asp 75 80 85 GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Met Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 90 135 180 225 270 315 360 12- 405 509697 六、申請專利範圍 1 7 . 一種DNA，其爲編碼如下列序列編號46所示之H鏈 V區之鹼基序列。 序列編號46 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115 1 8 . —種DNA，其爲編碼如下列序列編號57所示之H鏈 V區之鹼基序列。 序列編號57 ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lie Phe Leu Ala Leu lie Leu Lys -15 -10 - 5 -13- 509697 六、申請專利範圍 GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA Gly Val Gin Cys Glu Val Gin 1 GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu 15 TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 30 GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 45 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 60 AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 75 AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 90 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp 105 TCT GCA 411 Ser Ala CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu 5 10 AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro 35 40 GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser 50 55 GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 65 70 CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu 80 85 TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT Phe Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 95 100 GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 90 135 180 225 270 315 360 405 -14- 509697 六、申請專利範圍 1 9 .一種DNA，其爲編碼如申請專利範圍第1項之嵌合型 L鏈。 20 .—種DNA，其爲編碼如申請專利範圍第2項之嵌合型 Η鏈。 2 1 . —種DNA，其爲編碼如申請專利範圍第4或5項之多 肽之鹼基序列。 22 .如申請專利範圍第2 1項之DNA，其爲如下列序列編 號6 6 ~ 7 4所示之任一種鹼基序列。 序列編號6 6 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55
    -15- 509697 六、申請專利範圍 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 序列編號67 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin'His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 270 315 360 405 45 90 135. -16- 180 509697 六、申請專利範圍 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號68 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 225 270 315 360 405 45 90 -17- 509697 六、申請專利範圍 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC .* Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 135 180 225 270 315 360 405 -18 - 509697 六、申請專利範圍 序列編號6 9 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 ~10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Giy Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 ,GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 45 90 135 180 225 270 315 -19- 360 509697 六、申請專利範圍 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號70 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 405 45 90 135 180 225 270 315 -20- 509697 六、申請專利範圍 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號71 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val.Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
    -21 - 509697 六、申請專利範圍 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號72 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 315 360 405 45 90 135 -22- 180 509697 六、申請專利範圍 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號73 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10
    -23- 509697 六、申請專利範圍 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90. 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 135 180 225 270 315 360 405 -24- 509697 六、申請專利範圍 序列編號74 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CM TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100
    -25- 509697 六、申請專利範圍 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 .CAG CCC 411 Gin Pro 23 . —種DNA，其爲編碼如申請專利範圍第1 0項之多肽 之鹼基序列。 24 .如申請專利範圍第23項之DNA，其爲如下列序列編 號58所示之鹼基序列。 序列編號58 ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro 30 35 40 GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 405 45 90 135 180 -26- 225 509697 六、申請專利範圍 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Va.1 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 60 65 70 AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 75 80 85 AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405^ Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA 411 Ser Ser 25 . —種DNA，其爲編碼如申請專利範圍第1 1項之L 鏈。 26 . —種編碼人型化抗體L鏈之DNA，其爲編碼如下列序 列編號47〜55所示任一種胺基酸序列之鹼基序列。 序列編號4 7 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 -27- 509697 六、申請專利範圍 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu. Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 110 115 序列編號48 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 -28- 509697 六、申請專利範圍 序列編號4 9 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號50 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 -29- 509697 六、申請專利範圍 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105. Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號51 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 -30-
    509697 六、申請專利範圍 序列編號52 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Giy Ala Glir Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 He Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號53 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45
    -31 - 509697 六、申請專利範圍 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 He Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 序列編號54 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 -32- 509697
    六、申請專利範圍 序列編號5 5 Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 丨 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gin His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 He Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 110 115 27.如申請專利範圍第 26 項之DNA， 其 中編碼 人型化抗 體L鏈之DNA爲如下列序列編 號66〜74所示之任一種 鹼基序列。 序列編號66 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser _15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 - 33- 509697 六、申請專利範圍 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp His Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 135 180 225 270 315 360 -34- 405 509697 六、申請專利範圍 序列編號67 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin·His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 45 90 135. 180 225 270 315 360 405 -35- 509697 六、申請專利範圍 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號6 8 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CM TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 45 90 135 180 225 270 315 -36- 509697 六、申請專利範圍 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號69 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 - 5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 360 405 45 90 135 180 -37- 225 509697 六、申請專利範圍 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號70 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40
    -38- 509697 六、申請專利範圍 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr( Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 225 270 315 360 405 序列編號71 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val.Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 45 -39- 90 509697 六、申請專利範圍 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 135 180 225 270 315 360 405 -40- 509697 六、申請專利範圍 序列編號72 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 45 90 135 180 225 270 315 -41 - 360 509697 六、申請專利範圍 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號73 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 405 45 90 135 180 225 -42· 270 509697 六、申請專利範圍 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gin Pro 序列編號74 ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT Gly Ser Phe Ser Gin Leu Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG Gin His Ser Thr Tyr Thr lie Glu Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu 30 35 40 315 360 405 45 90 135 -43- 180 509697 六、申請專利範圍 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT Ser Thr Gly Asp Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA Glu Ala Asp Tyr lie Cys Gly Val Gly Asp Thr lie Lys Glu Gin 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 .CAG CCC 411 Gin Pro 225 270 315 360 405 28 . —種DNA，其爲編碼如申請專利範圍第1 2或1 3項 之Η鏈。 29 . —種編碼人型化抗體Η鏈之DNA，其爲編碼如下列 序列編號56所示胺基酸序列之鹼基序列。 序列編號56 • 44 - 509697 六、申請專利範圍 Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 . 45 Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 30 .如申請專利範圍第29項之DMA，其中編碼人型化抗 體Η鏈之DNA爲如下列序列編號58所示之鹼基序 列0 序列編號58 ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg -15 -10 - 5 -45- 509697 六、申請專利範圍 GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90 Gly Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro 30 35 40 GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 60 65 · 70 AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 75 80 . 85 AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA 411 Ser Ser
    46- 509697 六、申請專利範圍 31 . —種對人副甲狀腺激素關連胜肽之嵌合型抗體之製 法，其特徵爲令經由含有如申請專利範圍第1 5、16 及1 9項任一項之DNA的重組載體，及含有如申請專 利範圍第17、18及20項任一項之DNA的表現載體所 轉形之轉形體進行培養，並由所得之培養物採集對人 副甲狀腺激素關連胜肽之嵌合型抗體。 32 . —種對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型化抗體之製 法，其特徵爲令經由含有如申請專利範圍第2 1、22 項及25-27項任一項之DNA的表現載體，及含有如申 請專利範圍第23、24及28、29項任一項之DNA的表 現載體所轉形之轉形體進行培養，並由所得之培養物 採集對人副甲狀腺激素關連胜肽之人型化抗體。 3 3 . —種高鈣血症抑制醫藥組成物，其含有如申請專利 範圍第9或14項之人型化抗體爲有效成分。 34 . —種惡性腫瘤所伴隨之高鈣血症之抑制劑醫藥組成 物，其含有如申請專利範圍第9或1 4項之人型化抗 體爲有效成分。 3 5.如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其中惡性腫 瘤爲至少一種選自胰臟癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、 舌癌、齒肉癌、食道癌、胃癌、膽管癌、乳癌、腎 癌、膀胱癌、子宮癌、***癌及惡性淋巴腫瘤。
    -47-
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