TW455591B - Lipopeptides from actinoplanes sp. with pharmacological action, process for their production and the use thereof - Google Patents
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Description
455591 A6 B6 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 五、發明説明(1 ) 本發明係關祕有細質祕基咖序但不顏肪酸 殘基(脂質部份)之脂壯類,其係於發酵期間,藉游動放 線菌種合成,並釋於培養基中;並關於自此培養基單離此 脂月太類及將其純化之方法;及關於此脂彳太類作爲藥理活性 物質之用途,特别是用以抵抗革蘭陽性細菌;以及關於產 生上述脂狀類之游動放線菌種DSM 7358。 得自微生物之次級代謝物,係成功地用於感染疾病之 治療上。次級代謝物爲低分子量化合物,其製造係發生於 與初級代謝作用分歧之、、生物合成單行道"上,且其對特 定製造者之功能爲未知。迄今,已知約8〇〇〇種次級代謝物 單離自不同微生物(尤其是鏈黴菌種之眞菌與細菌)之培 養物。 此等次級代謝物用途之主要範圍,係爲感杂疾病之治 療。但是,由於其廣泛使用,故不斷發展出抗藥性,以致 仍持績需要具有新穎作用機轉之新穎抗生素與活性物質 (Neu H.C” Science 257,1992,第 1064-1073 頁) 此外,關於微生物活性物質適應徵之範園,亦已擴大 至未包含在感染疾病中之疾病(例如,腫瘤治療,免疫調 節或關於脂質代謝作用之調節)及作物保護(除草劑與殺 蟲劑〉。但是,所採用之活性物質,仍經常伴隨著缺點, 其特徵是未令人滿意之作用程度、過量毒性及/或不期望 之副作用。 於文獻中描述之脂U類,其胺基酸内容物’在順序方 面係與根據本發明之脂舦類相同,或在胺基酸組成方面係 一請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公逄1 455591 A6 B6
五、發明説明(2 } 經濟部中央標毕局爵工消"合作社印製 相同於或類似於根據本發明之脂狀類。但是,此等脂爿太類 基本上與根據本發明之脂Η類之不同點,係在其脂質部份 上。 如上述之脂Π類,其實例爲: -安弗黴素(Amphoxnycin)抗生素[J· Antibiotics,拙,第 517 頁(1965)}; -谷路馬徽素(Glumamycin〉iJ. Antibiotics,38,第 517 頁(1965)]; -沙歐黴素(Zaomycin〉iJ. Antibiot· Ann·,第 194 頁 (I960)); -阿斯巴多黴素(Aspartocin) (Antibiot. Ann·,第 I94 頁 (I960)); -拉斯巴多黴素(Laspartomycin) U· Antibiotics 21,第 55 頁(1968)J 。 此等脂狀類(稱爲安弗黴素型之脂狀類),係由鏈徵 菌種之微生物合成。其顯示抵抗革蘭陽性細菌(例如,麵 球菌、葡萄球菌及腸球菌)之抗菌活性。於最近,已註實 特别是葡萄球菌及腸球菌種之品系,係爲漸增問題之有機 體。熟練之研究者明瞭有問題之有機體,係爲目前爲不可 能有效控制之微生物,因其對習用抗生素(例如内醯 胺抗生素或糖U抗生素,譬如凡可黴素(Vancomycin )或 達可普蘭徽素(teikoplanin ))之抗藥性所致。 己發展抗藥性之一群微生物菌株,其實例包括對二甲 氧基苯青黴素具抗藥性之金黄色葡萄球菌菌株,簡寫爲
{請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁J .裝 .訂‘ 0 :線 本紙張尺度適用中國@家標準(CNS)<p4規格(210父297公发)
455591 A7 B7 五、發明説明(3 專利申請案第82110700號 ROC Patent Λρρίη. No.82110700 „ 中文説明書修正頁-附件(三) Amended Pages of the Chinese Specification ~Encl.(lD) 7" ' e(民因0年12只I,曰送呈) (Amended & Submitted on December , 1995) 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 MRSA菌株。目前已發現此等MRSA菌株,經常已發展出 不僅是對二甲氧基苯青黴素而且對其他抗生素(例如凡可 黴素)之抗藥性。 除了上述得自鏈微菌之化合物以外,亦已知一種得自 曰本游動放線菌ATTCC 3114S之化合物,由於其作用圖譜 及所述之物化性質,故其與根據本發明之脂轴類具有結構 類似性,並稱爲化合物41.〇12 (美國專利4,001,397 )。日 本游動放線菌ATCC 31145於各種培養條件下之發酵,總 是導致相對較低產率之化合物41.012。 本發明之目的’係爲尋找具有改良性質之微生物天然 物質。 此目的係推據本發明而達成,其方式是將游動放線菌 種,在具有碳來源與氮來源以及習用有機鹽類之營養溶液 中發酵’直到脂Μ類(較佳爲脂壯類Α Η37 )蓄積於培養_ 基中爲止’接著自培養基中單離出此脂駄類,及於適當情 況下,將此混合物分離成其個别成份。此脂壯類具有藥理 活性,及因而具有療效,並可作爲抵抗革蘭陽性細菌之抗 生素使用,較佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之菌株。 因此,本發明係關於: Ob纟太類’其中係將游動放線菌種在培養基中發酵,直到 —或多種下式I脂壯類蓄積於該培養基中爲止,該式工 爲: -5 - 本紙張尺度適用中國闺家標準(CNS)A4il格(2丨0X297公漦} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本莨) 訂 — - · a修正 455591 A7 3補充 B7 P^R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R1爲一種具有6至22 (内含)個碳原子鏈長之單或多 未飽和,飽和或其獨立情況之分枝或未分枝脂肪酸或 m基脂肪酸, 及 R2 爲 Asp 或 Asn, 於適當情況下,自培養基中純化一或多種式I脂奴類, 但下式I脂U則除外,其中 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) ^ 訂 R1爲 經濟部中央標準局員工消費合作社印装
C
II 〇 及 R2 爲 Asp。 么脂U類,其中係將游動放線菌種在培養基中發酵,直到 得自下列族群之一或多種脂壯類蓄積於該培養基中爲止, 該族群爲: a) iC 丨 3-脂防酸-^ρ-Ε^ΙτΡΐρ-ΜοΑΒρ-Αερ-Μγ-Αερ-ΟΙγ-Ι^Ιί-νβ^ΡΓο L-------~~.___ b) iC】4-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro 1-------1 c) iCi3-腊肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro *----*--—~~-4 d) iCi4-脂肪酸-Asn-Dab-P ί P-Me Asp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 1 - Pro ------1 e) aiCi3-脂肪酸-Asi^Pab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro -6 本紙張尺度適用中國圉家樣準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 4 5 5 5 9 1, A7 B7 五、發明説明( 專利申請索第82110700 ROC Patent Αρρίη. No. 82110700 中文説明書修正頁-附件(_
Amended Pages of the Chinese Specification-Encl. (HI) (民国86年8月18日修正並送呈) (Amended & Submitted on August 18 ,1997) f) aiCi5_ 脂肪酸-Asp-Dgib-P〖p.-McAsp~Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-VahPi|〇 g) aiCi5~脂胺酸-Asn-DalrPip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab~Val-Pro於適當情況下,自培養基中純化一或多種此等脂壯類。 &式ϋ脂a類, R^-^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro It其中 R-
Asp C' IIο —l·-------4丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 或
Ri Cπo R2 = Asp或 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Π3 fl ^ ~~~ Asn或 R2 = Asn C IIo
cu0 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS ) A4規格(210Χ297公釐) 455691 五、發明说明( 或 A7 B7 P-j ^ R2 = Asn 或 = R2 = Asp 或 f^2 = Asn
C IIο
c IIο c SIο (請先閲讀背西之注意事項戽填寫本X) -νβ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 4, 或多種如1中定義之式Ϊ脂力太類,一或多種如2中定 義之脂臟’或-或多種如3中定義之式们旨賴之製 法,其包括將游動放線_種在培養基中發酵,直到一或 多種脂Π類蓄積於培養基中爲止,於適當情況下,自培 養基中純化一或多種脂駄類。 5. 式I脂u類作爲禁理活性物質之一項用途,特别是作爲 抵抗革蘭陽性細菌之抗生素,特佳爲抵抗對糖U具抗藥 性之細菌。 上式ΠΙ脂狀 Rl~R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-val-Pr〇 冚 其中 ^ R1 爲 II 0 本紙張 A4规格(210X297公釐) 4555 9 A7 B7 修if 牛月 日彳夕'u·、 84.12. 1 3^J Κχ 五、發明説明(7 及 R 爲 Asp 作爲藥理活性物質之用途,特别是作爲抵抗革蘭陽性細 菌之抗生素,特佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之細菌。 7.游動放射菌種DSM 7358。- 本發明係詳述於後文,尤其是詳述於其較佳具體實施 例中。本發明係藉申請專利範園之内容進一步界定。 術語之定義: 、 _ Dab意謂2,3-二胺基丁酸; "Ηρ意謂六氫卟啶羧酸(同意字==高脯胺酸); - MeAsp意謂乃_甲基天門冬胺酸酯; 'G1y意謂甘胺酸; -Asn 意謂天門冬醢胺; —Asp 意謂天門冬胺酸; -Val意謂胺基異戊酸及 Pro 意謂鋪胺酸。 縮寫1代表”異夕,然而,/ ai /,則意謂夕前異,,。 此等定義係爲熟練研究人員,在脂肪酸類之文脈中所習知 者(生物化學’ Zubay,魏敦,阿姆斯特丹,由Addis〇n Wesley 發行,1983 )。 . 除非另有指明,否则所有百分比數據,均與重量有關。 除非另有述及’否則液體之混合比,均與體積有關。 .. 根據本發明之方法,可祕實驗室規模(毫升至升範 _ 園)及用於工業規模(立方朱規模)之發酵。 '本紙張尺度適用 ---:____ y _ 455591 A6 B6 經濟部中央標準局W工消贽合作社印11 五、發明説明(8 ) 游動放線菌種係單離自一種土壤試樣。關於得自此土 壤之純化,係使用一種生理NaCl溶液(〇.9% ),將此土 壤懸浮,其中係製備一系列稀釋液。隨後,將各種稀釋液 (10G-106 )覆蓋在放線菌營養基上。將此培養物於30 eC 下培養2至14天,造成放線菌菌落,可將其覆蓋在平板上, 並藉多項連續純化步驟進行單離。 菌種測定,係以形態學及分類學準則爲基礎,使用熟 諳此藝者已知之方法進行,此游動放線菌種之獨特特徵爲 可游動孢子。 在以連績單離及純化步驟爲基礎下,可自游動放線菌 種中單離出一種菌落,此菌落係極有效地释出一或多種根 據本發之脂壯類化合物,較佳爲脂肽類A 1437 A,B,C,D,E, F,G及/或Η,進入培養基中,並稱之爲主要製造者。 此主要製造者係爲對一種單離物所賦予之名稱,該單 離物會產生或釋出一或多種根據本發之脂壯化合物,進入 培養基中,其產生量爲該相同游動放線菌種單離物之10至 100 倍。 將一種強烈產生之游動放線菌種菌落,加以繁殖。一 種單離物係放置在 Deutsche Sammking von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg IB, 3300 Braun-schweig,Germany,根據1990年6月18日布達佩斯條约之 規則,將其安排在下列編號下: 游動放線菌種DSM 7358。 游動放線菌種DSM 7358具有一種橘色菌絲體,且其 本紙張尺度適用中H凼家標毕(CNS)甲4規格[210x297公釐) 1 ° " ......................................................................... 裝......................訂............................線 <請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁1
455591 經濟部中央標準局員工消t合作社印製 A6 ' _________B6______ 五、發明説明(9 ) 特徵爲球形抱子囊。 於一種含有碳來源與氮來源以及習用無機鹽類之營養 溶液(亦稱爲培養基)中,游動放線菌種(較佳爲DSM 7358 )會產生一或多種根據本發明之脂戕類化合物。 亦可替代DSM 7358菌株,採用其突變種及變種,其 可合成一或多種根據本發明之脂釉類化合物。此類型之突 變種’可以本身已知之方式,藉物理方式產生,例如照射, 譬如使用紫外線或X-射線’或化學突變劑,例如,甲垸磺 酸乙酯(EMS ),2_羥基_4_甲氧基二苯甲酮(M〇B ) 或N-曱基f -硝基_N_亞硝基胍(丽NG )。 關於合成一或多種根據本發明脂戕類化合物之突變種 與變種之篩選,係根據下列綱要進行: -於發酵後,移除菌絲體; -此脂狀類於pH 1至2 ( 4)下之沉殿; -此沉澱物之溶SH20/Me0H ( 1:1 )中; -藉HPLC,TLC或抑制區域試驗之分析。 後文所述之發酵條件,係應用於游動放線菌種,存放 之單離物DSM 7358,及其突變種及變種。 於一種含有碳來源與氮來源以及習用無機鹽類之營養 溶液中’游動放線菌種(較佳爲DSM 7358 )會產生一或 多種根據本發明之脂壯化合物,但較佳爲脂壯類A 1437 A_ Η ° 供需氧性發酵用之適當與較佳碳來源,係爲可同化碳 水化合物,及糖醇類,例如葡萄糖,乳糖或甘露醇,以 本紙張尺度適用中國國家標觇格(210X 297公釐)"""汁1 " —--- t請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .裝 訂. '線. 經濟部中央標準局員工消伢合作社印製 ^55591 Α6 ___ Β6 五、發明説明(10 ) 及含碳水化合物之天然產物,例如,麥芽萃取物。適當含 氮營養物爲:胺基酸類,U類及蛋白質類,以及其分解產 物,例如蛋白料或胰蛋白酹水解棘,另外爲肉萃取物,種 子粉,例如玉米、小麥、豆類、大豆或棉花植物,得自醇 製造上之蒸餾殘留物,肉粉或酵母萃取物,或者銨鹽及硝 酸鹽。此營養溶液中可含有之無機鹽類爲例如鹼金屬或鹼 土金屬、鐵、鋅、鈷及短之氣化物、碳酸鹽、硫酸鹽或碑 酸鹽β 根據本發明之脂壯類,其製造係特别良好地發生在一 種營養溶液中,其中含有約0a至5%,較佳爲〇 3至2% 肉萃取物’ 〇.2至將,較佳爲Ο』至狹蔗糖,〇 〇5至5 克/升,較佳爲G.1至Q·5克/升酵母萃取物,0.05至2 克/升,較佳爲0.1至1克/升硫酸鐵,〇 〇5至1〇克/ 升,較佳爲0.1至1克/升二氫磷酸鉀或鈉,及q至1〇〇 /Z Μ ’較佳爲5至2〇μΜ氣化鐵()。百分比數據,於 各情況中均以全部營養溶液之重量爲基準。 於此營養溶液中,游動放線菌種,較佳爲游動放線菌 種DSM 7358,會產生根據本發明之脂戕類混合物。此混 合物較佳係由8種不同的可測得之脂肽類所組成。此等脂 月太類已%爲A,B,C,D,E,F,G及Η。其具有下列特性: {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝‘ 訂 本紙張尺度通用中國國家標準丨CNS)〒4规格(210x 297公楚)
分子量 1290 1304 1289 1303 1290 1289 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) ο 84· !2. i 3補充 45 55 9 1 α7 Β7
五、發明説明(W 名 稱 R!/R2 分子量 A 1437 G R1 1318 = Asp CII 0 A 1437 H R. 1317 ~ Asn CII 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -0 經濟郎中丸fpt -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消"合作社印级 4 5 5 5 9 1 A6 __B6_ 五、發明説明(13 ) 月g月太A 1437 A ( A 1437 C亦然〉係含有一種異-脂肪酸,迄今仍未知其係在安弗黴素型之脂彳太類中β A I437 A之胺基酸順序,係相應於安弗黴素之胺基酸順序, 但是其含有一種前-異-C13-脂肪酸。a 1437 C之胺基酸組 成與順序,並未得知自其他脂壯類。 A 1437 B ( A 1437 D亦然)係含有一種異-Cl4型脂 防酸’且因而是得知自津枝黴素(tsushimycin )之脂脉酸。 但是,A 1437 D與迄今已知自先前技藝之脂壯類,其不 同點在於其胺基酸组成與順序,而Α μ37 b則含有安弗 黴素之胺素及津枝黴素,於胺基酸組成中均相同。
得自游動放線菌種(特别是得自游動放線菌DSM 7358 )之A I437 E,係與已知得自鏈黴菌之安弗黴素相 同。 A I437 F包含一種前-異_Cl3_脂肪酸,因此含有與已 知得自安弗黴素相同之脂肪酸型式。其胺基酸順序與組成 並未得知自先前技藝。 脂壯類A I437 G與Α Η37 Η各具有(阿斯巴多黴素 亦然〉一種前-異-C1S-脂肪酸。a Μ” 〇之胺基酸順序, 係相應於安弗黴素之胺基酸順序,而A乜37 η之順序與 組成’未得知自先前技藝。 脂肽類A 1437 Α至Η,均具有一種鏈結,由〇未端 脯胺酸之羧基官能基,至位於胺基酸末端之Dab之乃—胺 基官能基。此鍵結係以L--1 #表示。 自一或多種根據本發明脂壯類之量之觀點見之,其内 '氏張A度-適用节固國家反和哪…規格(2冗^7公變)_15一 ------ ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 訂 455591 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6__. 五、發明説明(I4 ) 容物可依營養溶液之組成而定》此外,可藉培養基之組成, 控制個别脂狀類之合成,以致此微生物不會只產生一種脂 月太,或以低於债測範園之量產生。 得自游動放線菌種(較佳爲DSM 7358 )之培養基, 含有脂壯類,其具有單或多未飽和,飽和,或其獨立情況, 分枝或未分枝脂肪酸或羥基脂肪酸,其具有之鏈長爲6至 找(内含)個碳原子,較佳爲1〇至2〇 (内含)個竣原子, 特佳爲I3,Η或1S (内舍)個碳原子。 此等型式之脂肪酸爲熟諳此藝者所已知,例如得知自 R0mpp Chemie Lexikon,Falbe 敎授與 Regitz 敎授,第 9 版, Georg Thieme Verlag Stuttgart,紐約,或得知自化學百科 全書 ’ C_A. Hempel 與 G.G. Hawley,第 3 版,Van Nostrand ReinhoId 公司,紐約。 下列脂肪酸清單,僅爲舉例,並非聲稱係爲其完全描 述,且並非表示其限制。 於根據本發明脂u類上之飽和未分枝脂肪酸,其實例 爲己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、 —酸、月桂酸、十 三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕搁酸、十七酸、硬脂酸、十 九酸、花生酸及二十二酸。 於才艮據本發明脂U類上之飽和分枝脂肪酸,其實例爲 異丁酸或異戊酸,或呈"前-異,/構型之相應酸類。 於根據本發明脂壯類上之單未飽和未分枝脂肪酸,其 實例爲丙烯酸或巴豆酸。 於根據本發明脂肽類上之雙未飽和未分枝脂肪酸,其 :. '丨.η ......................-..................................Κ-----------------------------------------裝.....................訂........................:¾ (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁一 455591
五、發明說明(ls ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 實例爲花楸酸》 於根據本發明脂U類上之參未飽和未分枝脂肪酸,其 實例爲亞麻脂酸或油硬脂酸。 於根據本發明脂肽類上之四重未飽和未分枝脂肪酸, 其實例爲花生四歸酸。 於根據本發明脂牡類上之五重未飽和未分枝脂肪酸, 其實例爲鯡油酸。 於根據本發明脂壯類上之六重未飽和未分枝脂肪酸* 其實例爲廿二碳六婦酸。 對此脂狀類而言,更可能是具有多重分枝之脂肪酸, 例如2,4,6,s-四甲基癸酸,發生在此培養基中。 於根據本發明脂粘類上之羥基脂肪酸,其實例爲在位 置2與3及/或在碳鏈末端被麟基化且具有"異或"前-異’構型之脂肪'酸。 在將0.01至S%,較佳爲0.〇2至0.1% L-胺基異戊酸, 加入上述營養溶液中時,游動放線菌種係優先產生脂/}太類 A 1437 Β與D。在將〇·〇1至5%,較佳爲0.1至0,5%L-白胺酸,加入上述營養溶液中時,游動放線菌種係優先產 生脂U類A 1437 A與C。在將0_〇1至跡,較佳爲〇.〇5 至0.5%L-異白胺酸,加入上述營養溶液中時,游動放線菌 種係產生特别是脂U類Α Η37 E,F,G及Η。以相同方式 應用至較佳菌株DSM 7358。 除了此等胺基酸外,亦可採用適當濃度之L-正胺基異 戊酸與L-α-胺基丁酸,以及相應於該胺基酸之oc-酮基酸 ---------- 本纸張尺度適用中國S家標準丨CNS)甲4規格1210x297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 .訂. ο 線… 455591 A6 B6 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 五、發明説明(16 ) (〇ί-酮基異戊酸酯,α_酮基異己酸酯,α_酮基_乃_甲 基-戊酸酯’ α-酮基戊酸酯>,或其相應酸類(異丁酸酯, 異戊酸酷,α —甲基丁酸酯,正-丁酸酷,丙酸酯,戊酸酯) ,或其他可介入脂肪酸生物合物合成之物質。 此微生物培養作業係以需氧方式進行,意即例如,浸 沒在振盪燒瓶或發酵器中,並振爱或檀拌,於適當情況下, 並引進空氣或氧氣。其可在約ls至35亡溫度範園中進行, 較佳是在約25至35亡下,特别是在28至32亡下進行。 其PH範園應在e與s之間,較佳是在6 5與a之間。此 微生物一般係在此等條件下,培養24至3〇Q小時,較佳爲 36至140小時。 此培養作業可有利地以數個階段進行,意即首先在液 體營養培養基中製備一或多個預培養物,然後以例如1:1〇 之體積比,將其轉移至實際製造之培養基中,以獲得主要 培養物。獲得此預培養物之方式,例如,將一種菌絲體轉 移至營養溶液中,並使其生長约36至小時,較佳爲妨 至72小時。此菌絲體可以下述方式獲得,例如,在一種固 體或液體營養培養基上,例如酵母-麥芽瓊脂或營養肉湯 瓊脂(供微生物用之標準培養基,其主要成份爲蛋白n, 氣化鈉及瓊脂,例如由Difco供應)。 其發酵程序可以此培養物之pH値或菌絲體之體積爲 基礎,進行監測’以及藉層析方法監測,例如,薄層層析 或高壓液相層析或測試其生物活性。此菌絲體與体養物過 濾物,均含有根據本發明之化合物,但大部份(> 卯% ) I紙孟_尺度適用中國g家標準(CNS) ΐ4规格(210X 297公没)~ 1C '~~~~- {諳先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝 訂 4555 9 1 A6 B6 經濟部中央標準局g工消许合作社印鼓 五、發明説明(l7 ) 係位在培養物過遽物中。 後文所述之單離程序,係用以純化根據本發明之脂月太 類’但較佳係對脂狀類Α Η37 a-H而言。 得自培養基之根據本發明脂壯,其單離或純化,係考 慮天然物質之化學、物理及生物性質,藉已知方法進行。 於培養基中或於個别單離階段中,抗生素濃度可藉薄層層 析測試,例如於石夕膠上使用異丙醇us%濃度Nh3作爲移 動相,或藉HPLC測試。在藉薄層層析進行分餾時,其偵 測可藉例如顏色試劑(例如對-甲氧基苯甲醛)進行,於 此情況中,最好將所產生的物質之量,與校準溶液作比較。 爲單離根據本發明之脂耿,係首先藉習用方法,將菌 絲體與培養肉湯分離,接著調整(較佳是在4。〇下)此培 養物遽液之pH値’從pH 0·5至pH 4 (内舍),較佳係 從pH 1.5至pH 2.5 (内含)。此pH値之調整,且因而 是脂月燦Λ 1437之沉澱,可使用所有市購可得之酸類進行。 將此溶液培養至高I6小時,較佳爲至高4小時,接著藉離 心移除所形成之沉殿物。 將含有所有脂狀類之沉澱物,再懸浮於最初體積1/20 之二次蒸餾水,並使用NaOH調整至ρΗ 6至7。這會造 成殿物完全溶解;將此溶液冷卻至_2〇。(0並;東乾。此康 乾物,後文稱爲粗產物,係舍有5至3〇%脂胲類,並用於 隨後之單離中。 、 一或多種根據本發明之脂狀類,其進一步純化係於適 當物質上藉層析進行,較佳係在例如發膠、氧化紹、離子 ------ 本紙張尺度通用中國國家標準…邶)甲4規格 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂. 丨線. 4555 9 A6 B6 經濟部中夹檩芈局員工消赀合作社印製 五、發明説明(18 ) 交換劑或吸附劑樹脂上,及極特佳係在強或弱鹼性陰離子 交換劑上進行°含有Asp或Asn作爲位在其胺基末端之胺 基酸之脂壯類,係藉此層析分離。此脂壯類之層析,係使 用緩衝水溶液或含水與含醇溶液之混合物進行。 緩衝水溶液係意謂水’鱗酸鹽緩衝液,醋酸銨,檸樣 酸盤缓衝液’棚酸鹽缓衝液,其濃度爲〇至1M ’較佳爲1 至lOOmM,且特佳係採用具有濃度爲1至1〇〇mM之磷酸 鹽缓衝溶液。 含水或含醇溶液之混合物,係意謂所有可與水互混之 有機溶劑’較佳爲甲醇、乙胩,其濃度爲1〇至祕溶劑, 較佳爲4〇至6〇%溶劑,或者爲可與有機溶劑互混之所有 緩衝水溶液。欲使用之缓衝劑,均與上述相同。 此脂Π類在以其不同脂肪酸爲基礎下之分離,係藉助 於逆相層析進行,例如在MCI ® (得自曰本三菱公司之吸 收劑樹脂)上進行。於疏水性材料上之逆相層析,較佳爲 即_8或RP-1S相層析,係爲特佳者。此外,此分離作業可 藉助於矽膠層析進行。 此脂壯類之層析,係使用經緩衝或經酸化水溶液,或 水溶液與醇類或其他可與水互混之有機溶劑所形成之混合 物進行。較佳係使用乙料作爲有機溶劑。 經緩衝或經酸化水溶液,係意謂例如水,磷酸鹽緩衝 劑’醋酸銨,檸檬酸鹽緩衝劑,硼酸鹽緩衝劍,其濃度爲 0至〇·5Μ,以及甲酸、醋酸、三氟醋酸或熟諳此藝者已知 _ 之所有市購可得之酸類,其濃度較佳爲0至1%,特隹爲〇. ^^^®^S?TC^4^(210X297^^I—糾- (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝 .訂· 〕線 455591 A6
i^發明說明(19 ) 經濟部中央桴爭功員工消"合作社印奴 n 層析係以梯度進行,以100%水開始,並以1〇〇%溶劑 結束,且較佳係採用4〇至6〇%乙/}音之線性梯度。 此兩種上述層析之順序(層析以分離根據胺基酸Asp 或Asn及根據脂肪酸型式之脂壯類),可對調。較佳係在 第一個步驟中分離根據不同胺基酸之脂駄類,且隨後僅根 據脂肪酸型式分離之。 若上述粗製產物含有具有均句脂肪酸之脂狀類,則前 述層析(以不同脂肪酸爲基礎,分離腊壯類)係用於該脂 月太類之脱鹽作用及進一步純化。 另一種可行式爲凝膠層析或於疏水相上之層析。 凝膠層析係於聚丙烯醯胺或混合聚合體凝膠上進行, 例如,Bioge卜P2 ⑰(由 Biorad 供應)或 Fractogel TSK HW 4〇® (由德國Merck或美國Toso Haas供應)〇 根據本發明之脂壯類’於固態中及於pH範園在4與8 之間(特别是5與7之間)之溶液中很安定,因此,可摻 入習用醫藥配方中。 根據本發明之一或多種脂収類化合物,由於其有價値 之藥理性質,故適合作爲醫禁使用β 根據本發明之物質’具有藥理活性,特别是作爲抵抗 革蘭陽性細菌之抗生素,特佳爲抵抗對糖狀具有抗藥性之 菌株。 對於具青黴素-或二甲氡基笨青黴素_抗藥性之菌株 (MRSA菌株)(其已發展出對抗生素之進一步抗藥性) {請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁} -裝 訂 *線- 家標準(CNS丨甲4规格(210 X29 7公釐) 45 5 5 9 經濟部中央標毕局員工消t合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明(2〇 ) 一種治療上適當作用,經常僅藉糖壯進行’例如凡可黴素 或達可普蘭黴素。但是,甚至對此等抗生素具有抗藥性之 菌株’顯示正逐漸增加(FEMS Microbiol. Lett 109至 11〇。根據本發明之一或多種脂壯類化合物,亦具有抵 抗此等成問題的有機體之優越作用。 本發明亦關於根據本發明一或多種脂壯類化合物之醫 藥配方。 原則上可將根據本發明之一或多種脂壯類化合物進行 投禁,較佳爲以本身未經稀釋之一或多種脂壯類厶1437 A_ Η化合物進行投藥。與適當輔助物質或載體物質,呈混合 物形式使用係爲較佳者。可於獸醫藥物之情沉中使用之载 體物質,係包括習用飼料混合物,而於人類情況中,係包 括所有藥理上可相容之載體物質及/或輔助物質。 根據本發明之醫藥,通常係以口服或非經腸方式進行 投禁,但直腸用途原則上亦是可能的。適當固態或液態醫 藥形式之實例,係爲顆粒、粉末、片劑、塗層片劑、(微) 膠囊、栓劑、糖漿、乳液、懸浮液、氣溶膠,呈安瓶形式 之滴劑或可注射溶液,以及具有延期釋放活性物質之產物, 於其製造上,一般係使用媒質與添加劑及/或輔助劑,例 如崩解劑、黏結劑、塗制、膨麵、滑賊潤滑劑、墙 味劑、增甜劑或助溶劑。常被使用且可提及之媒質或輔助 物質’其實例爲竣酸鎂、二氧化鈥、乳糖、甘露醇及其他 糖類、滑石、乳清蛋白、白明膠、澱粉、維生素、纖維素 及其衍生物,動物或植物油,聚乙二醇類及溶劑,例如鼻 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 ..一叮. 本紙張尺度適/fl中目目家標準丨咖丨格丨^ 455591 A6 B6 經濟部中央樣準局Μ工消费合作社印製 五、發明説明(21 ) 菌水、醇類、甘油及多鲽醇。 在對劑量單位適當之情況下,可經微包膠以供口服投 蔡用,以延遲釋放或使其延長較長時間,例如,將呈微粒 子形式之活性物質,以適當聚合體、碟類等塗佈之,或埋 藏於其中β 此醫藥產物較佳係以劑量單位製造與投葯,其中各單 位係含有特定劑量之根據本發明之一或多種脂壯類化合物, 作爲活性成份》於固態劑量單位(例如片劑、膠囊及栓劑) 之情況中,此劑量可至高爲每天約2〇〇毫克,但較佳爲約 〇·1至100毫克,而在呈安瓶形式之注射溶液之情況中,係 每天可至高爲2〇〇毫克,但較佳爲約0 5至100毫克。 欲投予之曰服劑量,係依哺乳動物之體重、年齡、性 别及症狀而定。但是’在一些情況中,較高或較低日服劑 量,亦可能是適當的。日服劑量之投葯,可以下述任一種 方式進行,以單一劑量單位或者多個較小劑量單位之形式 進行一次投葯,以及在特定時間間隔下,以分割劑量進行 多次投葯。 根據本發明之醫葯係以下述方式製成,使用習用媒質, 以及於適當情況下使用添加劑及/或辅助物質,將根據本 發明之一或多種脂U類化合物,轉化成適當劑量形式。 本發明係於下述實例中進一步解釋。百分比數據係與 重量有關。除非另有述及’否則液體之混合比,係與體積 有關。 實例 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁> .裝 ..訂. --線- 本紙張尺度適用中园國家檑準規格(7^^297公釐)-23^ 455591 A6 B6 經濟部中央標毕局員工消赀合作社印製 五、發明説明(22 ) la) 游動放線菌種DSM 73邱之甘油培養物之製備: 於一個無菌3〇〇毫升錐形瓶中,將100毫升營養溶液 (4克/升酵母萃取物,15克/升可溶性澱粉,1克/ 升 K2HP〇4,〇.5 克 / 升 MgS〇4 X 7H20,以水補充至 1000 毫升,於殺菌之前pH値爲7.0 ),以游動放線菌種 DSM 7358接種,並於30。〇及150rPm下,在旋轉振盪器 上培養7天。接著將I.5毫升此培養物,以2.5毫升80% 濃度甘油稀釋,並儲存於-20 1Q下。 lb) 游動放線菌種DSM 7358在錐形瓶中之培養物或預培 養物之製備: 一個無菌3〇〇毫升錐形瓶,其中含有1〇〇毫升下列營 養溶液:30克/升蔗糖,2克/升KNOs,1克/升 K2HP〇4,0.5 克 / 升 MgS04 X 7Η2〇,0.5 克 / 升 KC1, 〇.〇1克/升FeS〇4 X 7H20,2克/升酵母萃取物,5 克/升蛋白0,將其以一種在斜管中成長之培養物(相 同營養溶液,但使用2%瓊脂)接種,或以1毫甘油培 養物(見實例la )接種,並於l8〇mp與3〇 °C下,在振 盪器中培養。根據本發明之一或多種脂U類化合物,其 最大產量係於約12〇小時後達成。一種得自此相同營養 溶液之48至96小時大之浸沒培養物(接種體約10% ), 係足以接種10與200升發酵器。 2)游動放線菌DSM 7358之比較特性: 籍 Shilling 與 Gottlieb ISP 方法(1)!1:.1.。{375· Bacteriol. lj,3(1966) 313 至 34〇 ),經由與密切相關之 {請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝_ -訂 :¾ 各紙張尺度適用中® ®家標準丨CNS)甲4规格〔210乂 297公釐1 A6 B6 Λ砂9' 五、發明説明(23 ) 菌株作比較,以顯示游動放線菌種DSM 7358之特性。其 結果(見表1 )顯示游動放線菌種DSM 7358,於形態學 上及其生理學上,與其他菌株不同。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消贽合作社印製 本紙張尺度適用中國凼家標準(CNS;甲4规格(210x297公釐) 4555 9 1 A6 B6 五、發明説明(24 ) 表1 : 經濟郏中央標準局員工消t合作社印製 游動放線菌種 游動放線菌種 游動放線菌種 游動放線菌種 DSM 7358 NRRL 12052 ATCC 25844 ATCC 311455 氣生菌絲體 - - + (ISP 3) - 孢子嚢 + + + + 培養基 ISP 2 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 3 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 4 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 5 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 6 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 紅 紅 紅 紅 外表色素 外表色素 外表色素 外表色素 黑色素 — 一 (+ ) (+) 葡軔糖 + + + + ***糖 + + + + 蔗糖 + 十 + + 木糖 + + (+ ) 肌醇 + 十 (+ ) (+) 甘露醇 + 十 + 果糖 + + + - 鼠李糖 + + + 十 植物蜜糖 + 十 (+ ) - 纖維素 + + (+ ) - 蜜二糖 - - 苦杏仁苷 - + + + 白明膠 (水解) + + + + 檸檬酸鹽 (水解) 十 屎素 (水解) 十 精胺酸 水解直每 + 偏 - - /?-半乳糖苷1每 - - - - 色胺酸西每 - - - - 離胺酸 脱羧百每 + - - - 3-羥丁酮 (形成) + + + + 口引口朵 (形成) - - - - H2S(形成) - - - - NaCl容許性 0-2.5% 0-2.5% 0-2.5% 0-2,5% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂. 本纸張尺度適用中Β固家標準(CNS)甲4规格(210X297公釐) 455591 經濟部中央標準局員工消伢合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明(25 ) 3a)脂U類A I437 B與D之製備: 將一個500升發酵器下列條件下操作: 營養培養基·· 11克/升蔗糖 6克/升肉萃耳又物 0.3克/升酵母萃取物 0.6 克/升 MgS04 0.1 克/升 ΚΗ2Ρ04 10 α μ FeCl3 X 6H20 0.6克/升L-胺基異戊酸 pH 7·3 (於殺菌之前) 培養時間:120小時 培養 溫度: 30 擾掉速度:50rpm 充氣: 150升/分鐘 可藉不斷添加舍乙醇多元醇溶液,以抑制起泡作用。 於約%至120小時後,達最大產量。 於完成游動放線菌種DSM 7358之發酵後,藉添加約2 %過濾助劑(例如Celite ® ),過濾此培養基,並將此培 養濾液冷卻至4 °C,及調整至pH 1.5。於4小時後,將混 合物於10,0G0克重力下離心,再將沉澱物再懸浮於蒸餾水 中。此懸浮液之中和作用,造成該物質形成溶液。將後者 冷漆並漆乾。其產量爲約I·5克/升粗產物(=75〇克)。 3b)粗產物(含有B + D )藉離子層析之分級分離: (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝 線. 本紙張尺度適用中國®家標芈(CNS)甲4規格(210x297公釐) 4 5 5 5 9 1 A6 B6 經濟部中夬標準局員工消"合作杜印製 五、發明説明(26 ) 於3·2升層析管柱(10公分内徑X 4〇公分高度)中, 充填 DEAE-® Sepharose Fast Flow,並以 10mM 鱗酸卸缓 衝劑(pH 7.0,於40%甲醇中)(缓_ A)達成平衡。 然後將已溶於3.5升水中之25克A 1437 B粗產物(如在 實例3a中所得者),裝塡在此管柱上,並以1升水,及接 著以6升緩衝劑A洗滕。於此粗產物中之雜質,係存在於 流動通道中及於含水洗液中。接著,採用從1〇至lOOmM 磷酸鉀(pH 7.0,於40%甲醇中)之梯度。a 1437 d月太 係使用25至35mM磷酸鉀溶離,而抗生素A 1437 B係使 用4〇至SSmM磷酸鉀而得。將甲醇於眞空中自適當溶離份 中移除。使用具有1升容積之® Dianion HP_2〇管柱(日 本三菱),以進行脱鹽作用。現在,將含有純B狀之9升 溶離份,裝填在此管柱上,接著以3升去離子水洗滌。藉 梯度方法使用水/異丙醇(0至50%醇含量),進行溶離。 使用I5至25%異丙醇,將純A I437 B洗離擔體。個别收 集得自管拄之此種溶離物,於眞空中濃縮並凍乾。其結果 爲具有97%純度之4.8克A 1437 B。含有A 1437 D之溶 離份,其相應之脱鹽作用,係產生3.1克此抗生素。純度 98% 〇 如)脂壯類A I437 A與C之製備: 按3a所述進行製備,惟以4克/升L-白胺酸替代製 造媒質中之L-胺基異戊酸,並在5〇升生物反應器中進行 發酵。產量爲1_3克/升粗狀(==65克)。 4b)脂壯類A I437 A與C之單離: 本紙张尺度通用中围標準(c邶)甲4规格(21〇 X 公釐)~~-·2ΰ^ —---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 .訂 ^ 455591 A6 B6 ®濟部中央標準局'*工消#合作社印製 五、發明説明(27 ) 將10克粗產物溶於100毫升蒸餾水中,並根據下文所 示綱要進行處理。 處理綱要: 10克粗壯,於100毫升蒸餾水中 Φ 吸附在快速流動Q-遭脂糖上(由Pharmacia供應)(5 X 2〇公分管柱)小 使用下列梯度液溶離: 緩衝劑 A : NaH2P04 ImM,於 50% 甲醇中,PH5.9 缓衝劍 B : NaH2P04 100mM,於 50% 甲醇中,PH5.3 2〇分鐘:缓衝劑A ;於60分鐘内至25%緩衝劑B,進一 步在25%緩衝劑B下30分鐘;小 A 1437 A與C溶離份之凍乾,並溶解於移動相中 在由Biorad供應之Biogel P2 ( 100-200網目)上進行脱鹽 (7 X 2〇公分管拄) 1.6克脂壯A 1437 A ( 80%純度) 1.2 克脂U A 1437 C ( 80% 純度) 於Nucle。sil⑬C18 ( 7微米)上之JRP層析 (2〇 X 25〇毫米管柱,裝塡2〇0毫克) _^_ 本紙張尺度適用中囤國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 一請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) .裝 .訂. 一線 455591 A6 B6 五、發明説明(28 經濟部中央標準局員工消赀合作社印^ 使用下列梯度液進行溶離 缓衝劑:二次蒸餾水, 0.1%TFA 缓衝劑:乙月青 10分鐘:緩衝劑B ~>於60分鐘内至90%缓衝劑B,流速 爲1〇毫升/分鐘小 小 A I437 A與C溶離份之凍乾 150 毫克 A 1437 A (純度>95% ) 154 毫克 a 1437 c (純度>95% ) 如)脂戕類a 1437 E,F,G及Η之製備: 按實例3a中所述進行製備,惟藉i·5克/升L-異白 胺酸,替代製造培養基中之L-胺基異戊酸,並於5〇升生 物反應器中發酵。其產量爲I.4克/升粗壯(7〇克)。 Sb)粗壯藉離子層析之分級分離: 將25克按實例如中所得之脂社粗產物,於實例3a中 所述之管柱上,相_據實例Sa進行分級分離。 將脂U A 1437 F (產量:1>8克),以14至i9mM緩衝 劑進行溶離, 將A I437 E (產量:玉3克),以ig至缓衝劑溶離, 將A Μ37 η (產量:2 7克),以邡至即以%緩衝劑溶雜, 將A 1437 G (產量:I·9克),以Q至82mM缓衝劑溶 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝 '訂 " A6 B6 455591 五、發明説明(29 ) <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 離。 合併相應之溶離份,並於眞空中移除甲醇。 5c)將得自實例Sb之成份,於逆相rp-18上純化: .裝 於具有5〇0毫升容積之預備HPLC管柱(5.1公分(ID) X 25 公分 Η )中,充填® LichrosorbG RP-18 ( 10 微米), 並將含有I.9克抗生素A I437 G之舍鹽溶液裝填於其上。 溶離係藉梯度方法進行,使用5%乙踐(在10mM麟酸鉀 缓衝劑中,pH 7.0 ),至沘%乙月音(在lOmM磷酸鉀緩衝 劑中,pH 7.0 )。脂狀A 1437 G係使用24至26%乙月音 獲得。於眞空中濃縮,於100毫升® Dianion HP-20吸附樹 脂上,在水/50%異丙醇系統中脱鹽,並凍乾造成1.1克 脂壯A 1437 G,純度99%。 按實例5b中所得之Α Η37 Η溶液,其相應之隨後純 化作業,係使用10至5〇%乙肢(在l〇mM磷酸鉀緩衝劑中, pH 7.0 )之溶劑梯度進行〇此抗生素係使用從37至39% 之溶劑含量進行溶離。 經濟部中央標準局員工消1Ϊ-合作社印製 適當溶離分之濃縮,及在® Dianion HP-2◦上之脱鹽, 以及凍乾,產生2.2克脂狀A I437 Η,純度係高於98%。 5d)將得自實例5b之脂壯抗生素A I437 Ε與F,於MCI 凝膠上純化: 將含有1.8克實例5b中所得之抗生素A 1437 F之舍 鹽溶液,裝填在1升MCI凝膠CHP 20P (三菱Kasei公司) 上。管柱尺寸爲6公分内徑X 35公分高。於欲被分離之物 質已装塡在擔體上之後,以缓衝劑A (具有20%乙|音之
本紙狀度適财_家棵旧哪丨f 4规格(2lQX 297公FT 455591 A6 B6 五、發明説明(30 ) 5raM磷酸鉀緩衝劑pH 7.0 )洗滌之,並藉梯度方法漸增 至缓衝劑B (具有7〇%乙Η之5mM磷酸鉀缓衝劑, pH 7.0 )。34至邪%溶劑含量,導致純抗生素之溶離。 於眞空中濃縮及在® Dianion HP_2〇上脱鹽,產生1.4克脂 月太Α Η37 E,純度高於98%。對於得自實例5a之A 1437 E粗產物,進行類似程序,產生1克脂狀A 1437 E,純度 高於98%。 6)偵測Α Η37脂U類之HPLC系統: 下述系統允許粗混合物中及培養物遽液中之脂壯類, 被分離及定量;其滯留時間係在II.5分鐘(A Η37 E ) 與約15.9分鐘(A 1437 Η )之間。 移動相:Α 磷酸鉀緩衝劑,pH 7.0,10mM B 乙月音 {請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝 .訂. 經濟部肀央標準局员工消"合作社印製
梯度液:t[分鐘] 流速[毫升/分鐘] A(%] Bt%] 0 1.5 80 20 15 1.5 50 50 15.5 2 00 100 16.5 2 00 100 17 1.5 80 20 22 1.5 80 20 管柱:Shandon ODS Hypersil RP 18 ( 120 X 4.6 毫米, 具有2〇 X 4·6毫米前管柱)或 Nucleosil 120 RP 18 ( 120 X 4.6 毫米,具有 20 X 本紙張尺度適用中國圍家標準(CNS)甲4規格! 210X297公釐)
經濟部中夹樣準局员工消Φ合作杜印製 A6 B6 4.6毫米前管柱)。 流速:I.5毫升/分鐘 俄測:210毫微米 注射:10微升 7) 曰本游動放線菌atcc m45與游動放線菌種dsm 7358間之比較。 首先將此兩種菌株,按實例lb中所述,產生預培養物, 並用以接種下列製造培養基。 培養基1 :如實例扣中所述 培養基2 :如培養基1,但未使用1_胺基異戊酸 培養基3 :葡萄糖3〇克/升;大豆粉2〇克/升; Fe2(S04)3 0.3 克 / 升;MnCl2 X 扭2〇 〇‘3 克 / 升及 C〇Cl2 X 6h2〇,pH 7.3。 於各情況中’均爲100毫升培養基在3〇〇毫升錐形瓶中。 於3〇 °C下,在旋轉振盪器中進行培養。a 1437脂月太 類於培養物ϊ慮液中之濃度,係於48、%及U4小時後, 藉HPLC (見實例6 )測定。無論如何,在使用日本游動 放線菌種ATCC 31145時,在培養基2與培養基3中均未 測得脂Η。於培養基1中,可於I44小時後,測出極少量 之少數壯類。假設此等化合物之比消光係數係與A U37月太 相同,則所產生之量,係爲至少100之因素(< i毫克/ 升)低於藉游動放線菌種DSM 7358在培養基1中,於相 同時間後合成而得之A 1437 B濃度。 8) A 1437脂U類之作用: (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中固闼家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 455591 A6 B6 五、發明説明(32 ) 相關有機體對A I437脂壯類之敏感性,係藉瓊脂稀釋 試驗測定。所用之瓊脂爲MiiUer-Hinton瓊脂,於釀腺鍵球 菌與腸球菌之情況下,在其中添加10%馬血。將含有抗生 素之板接種,利用一種多通道接種器(5 χ 1〇4cfu/特定 菌株之固定培養物之接錄⑸。於37trFft|MIe値 (最低抑織度)。此職係定義爲抗生素之濃度,於此 濃度下,於培養24小時後,未測得有機體之可見成長。其 結果係轉於表2中。作爲對照物使用之安綠素,係得 自 Boehringer Mannheim (待固、 . 、仏國)。安弗黴素可自其中,以 精製化學品獲得。 表2 : A順物質:於活體外活性(AB圖譜);濃度以微克/ 毫升表示
0.195 0.049 ).391 3.13 0.781 0.781 0.391 3.13 —- 0.781 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. —订 經濟部中夬悖準局SE工消伢合作社印製 A 1437 A ---- 0.391 0.781 A 1437 B ---—_ 0-098 0.195 A 1437 C 0.195 0*781 A 1437 D 0.049 0.195 A 1437 E —---- 0.098 0.195 A 1437 F ---- 0.098 0.391 A 1437 G — 0*098 0.195 A 1437 H 0.049 0.098 安弗黴素 0.195 0.781
1.56 0.088 0.195 0.098 0.025 0.781 0.025 0.049 0.391 線· 0.195 1.56 -----— 0.195 0,195 L56 4555 9 1 A6 B6 五、發明説明(33 ) A I437物質:於活體外活性(對凡可黴素具抗性之菌株); 濃度以微克/毫升表示 faecium VR1 腸球菌 faecium VR2 腸球菌 釀膿鏈球菌 A 1437 A 未測定 A 1437 B 1 1 0.5 A 1437 C 4 4 4 A 1437 D 2 2 1 A 1437 E 4 4 1 A 1437 F 4 4 A 1437 G 0.25 0.25 0.125 A 1437 H 1 1 0.5 安弗黴素 4 4 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 .訂 經濟部肀央標準局員工消货合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 84. 12. 1 3 年月曰 修正 A7 B7 經濟部中央榇準局員工消費合作社印製 HP万説明(34) 實例9a : A 1437 D之特徵 脂U A I437 D係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+35 ° ( C=0_1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:15.1分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 - 1個天門冬醯胺 1個/δ-甲基天門冬胺酸酯 ν 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫毗啶羧酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS:m/e= 1303.6952((Μ + Η) + ] 分子量:1302.6S84(C59H94N14019) IR(KBr): y =3420 (br) cm'1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9b : A 1437 B之特徵 此脂Πα Η37 b係以非晶質固體單離而得 旋光度:+27 ° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:12.8分鐘 胺基酸:3個天門冬胺酸 1個/5-曱基夭門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 本紙張尺度適用中國國家標举—(CNS ) A4規格(210X297公釐) 36 ----------^表 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 84位3條if一 補尤; 4 5 5 5 9 1 A7 B7 ' 五、發明説明( 3 5) 1個六氫此交談酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS:m/e=((M + H) + ) 分子量:13Q3(C59H93N13O20) IR(KBr): y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9c : A 1437 C之特徵 此脂U A l437 C係以非晶質固體單離而得。 -旋光度:+30。( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:14.1分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個/3-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 _ 1個六氫吨啶羧綾 1個胺基異戊酸 分子量:1288(C5sH92M14019) IR(KBr): v =3420 (br) cm"1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9d : A I437 A之特徵 此脂U A l437 A係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+30 ° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:11.8分鐘 ' 胺基酸:3個天門冬胺酸 本紙張尺度適用中lii冢羅萃(CNS )Α4ΐ〇|Γ(——5ΐ 0X297公釐) _ 37 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-
-tT 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 年 β 日 4 § 5 5 9 1 A7 84 J3補无丨_B7_-__ 五、發明説明(36) 1個曱基天門冬胺酸酉旨 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫吡啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量:1289 (C58H91N13O20) IR(KBr): y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1400. 實例9e : A 1437 F之特徵 此脂肽A l437 F係以非晶質固體單離而得。 旋光度:十31 ° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:13.8分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 1個夭門冬醯胺 1個ζδ-甲基天門冬胺酸酯 _ 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫α Α啶羧酸 1個胺基異戊酸 ‘ 分子量 U288(C58H92N14019) m(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2930, 1660, 1530, 1450,1400. 實例Μ : A 1437 E之特徵 此脂U A l437 E係以非晶質固體單離而得。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2! Ο X 297公釐) -3 8 - 裝 訂 絲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 ^ .f-jj 46 55 9 1 A7 84. 12. I 3 Β7 ——U ------ ΐ__ 五、發明説明(3?) 旋光度: HPLC :滯留時間:11.5分鐘 胺基酸:3個天門冬胺酸 1個召-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 , 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫ΠΑ啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量:l289(C58H91N13O20) IR(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9g : A I437 H之特徵 此脂壯A 1437 H係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+32° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:15.9分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個乃-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 - 1個脯胺酸 1個六氫盹啶羧酸 1個胺基異戌酸 分子量 -----------批衣------ΐτ-------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2!〇X29_7公釐) -39 - A6 B6 4 5 5 591 五、發明説明(38 ) IR(KBr): V =3420 (br) cm"1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9h : A 1437 G之特徵 此脂U A 1437 G係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+34° ( C = 0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:13.6分鐘 胺基酸:3個天門冬胺酸 1個>5-曱基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫盹。定羧酸 1個胺基異戊酸 分子量:1317(C6QH95N13O20) IR(KBr): V =3420 (br) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 一請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 袭 -線. 經濟部t央標準局員工消t合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS}甲4規格丨210x297公釐)
Claims (1)
- 年月日雙正 88. 12.3 充_ 六、申請專利範圍455591 、A8 -]-B8 口' 專利申請案第82110700號 ROC Patent Appln. No. 82110700 中文說明書修正頁-附件(一) Amended Pages of the Chinese Specificatim- Hhcl. (I CX國肋年月31日修正並送Μ ) (Amended & Submitted on December. 31, 1999) h—種式I之脂肽: R^-R^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R〗爲一具有10至20(含上下限)個碳原子鏈長之不飽和分 枝脂肪酸, R2 爲 Asp 或 Asn, Dab為2,3-二胺基丁酸,以及 Pip為六氫吼咬觀酸, 但其中 R1爲‘Π 0 ---------袭.— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 且 R2 爲 Asp 之式I脂肽除外。 2.根據申請專利範圍第1項之脂鈥,其中代表13、14 或15個碳原子之鏈長。 本紙乐尺度適用中國國家操準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 4¾ 4¾ R ~R -Dab_Pip*-MeAsp''Asp~GIy-Asp_GlyDab~Val-Pro *-------------------------------- -jΑ8 Be- CS D8 申請專利範圍 3.拫據申請專利範園第1項之脂肽「其係選自於以下者 a) iCi3-脂防酸,Asp-Dp b-P i p-MeAsp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 卜 Pro b) iC!4-脂肪酸-Asp-Dab-Pi p-MeAsp-Asp-Gly-Asp,Gly-Dab-Va 卜 Pro 1---—_-j c) 〖C13-脂防殖-AsivDab-iHp-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Glr'Dab-Val-Pro <-;—_____ ___I d) iCir 脂肪酸-Asn-Dab-P i p-MeAsp-Asp-G 丨 y ~Asp-G 1 y-Dab-Va 卜 Pro '------4 e) a i Ci3-脂标较-Asn-Dab-P i p-MeAsp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 卜 Pro '___________I f) a iCis** 脂膀酸-Asp-Dab-Pi p-MeAsp-Asp-Gl y-Asp-G 1 y-Dab,Va 卜 Pro i------------- I g) aiCis-脂防狡-Asti-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro 4,. 一種式ϋ之脂肽, π 其中 Rt = R2 = Asp 或 _-------、:装------訂.------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁).; . __ Βι 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 R7 = Asp 或 R1 R2 = AsnC U 0C il 0 本紙張尺度通用令國國家標準(CMS ) A4規格(21〇Χ297公瘦) 45 55 9 A8 B8 C8 D8 申請專利範園 或 RiC IIο 或 R, = Asn或 Ri = 闩2 = Asp 或 R1 =C II 0l·---------、.裝--.----訂------ί (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) _ R- Asn c II 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5·種製備根據申請專利範圍第i戒2項之一或多 種式I脂狀。或根據申請專利範面第3項之一或 多種如狀或拫據申請專利範圍第4項之一或多種式j 脂肽之方法’其包括將游動放線菌種!)別7358在培養 基令發酵’直到—或多種脂肽類’蓄積於該培養基中 -43 - 本紙張尺度適用中國國家榇準(CNS ) A4規格(2】似297公* ) 555591^、申請專利範圍 A8 B8 C8 DS 爲止,並於適當情況下,使用ρΗ0·5至pH4(含上下限) 下之-酸類,使脂肽類自培養基中沉澱,然後於適當情 況下’將得自此沉掇之脂肽純化,其方式是在陰離子 交換劑上層析或在—種疏水性基質上層析,此兩種層 折可佐選其一或以任柯期望順序連續進行,以自培養 基中純化一或多種脂肽。 & 一種製備脂肽之方法’其包括將游動放線菌種咖 7358在培養基中發酵,直到下式DI脂肽蓄積於該培養 基中爲止’該式Η爲 R、R2-Cj3b.Pip-MeAsp-Asp-(3ly-Asp-Gly-Dab-Val-P|〇 丨" 其中 .I - 1^— •丨 ^^1 -11 I I I—f -II I f锖先聞讀背面之注項再填寫本耳} 經濟部智慧財產局—工消費合作社印製 Π 0 及R2 爲 Asp, 且於適當情況下’使用pHO.5至pH4(含上下限)下之酸 類,使脂肽類自培養基中沉澱,然後於適當情況下, 將仔自此沉殿之脂狀純化,其方式是在陰離子交換劑 -44 本紙張尺度適用中國國家樣準(CNS ) A4既格(210 X 297公釐) 線. 六、申請專利範圍 偷 Βδβ C8 D8 上層析或在一種疏水性基質上層析,此兩種層析可)任 選其一或以任何期望順序連續進行,以自培養基中純 化式ΙΠ脂肽〇 7.-種用於抗革蘭陽性細菌之醬镔纽成物.,其中含有根 據申請專利範圍第1項之一或多種式I脂肽,並於適 當情况下,含有醫镔用載體β —種用於抗革蘭陽性細菌之醫镔組成物,其中含根據 申請專利範圍第6項之方法所製得之式)π脂肽,並於 適當情泥下,含有醫镔用載體。 认根據申請專利範圍第1項之式I脂肽,其係做爲抵抗 针糖肽具技性之細菌的抗生素使用。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i —裝. "' •丨-4 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 45 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X:297公釐)455591 A7 B7 五、發明説明(3 專利申請案第82110700號 ROC Patent Λρρίη. No.82110700 „ 中文説明書修正頁-附件(三) Amended Pages of the Chinese Specification ~Encl.(lD) 7" ' e(民因0年12只I,曰送呈) (Amended & Submitted on December , 1995) 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 MRSA菌株。目前已發現此等MRSA菌株,經常已發展出 不僅是對二甲氧基苯青黴素而且對其他抗生素(例如凡可 黴素)之抗藥性。 除了上述得自鏈微菌之化合物以外,亦已知一種得自 曰本游動放線菌ATTCC 3114S之化合物,由於其作用圖譜 及所述之物化性質,故其與根據本發明之脂轴類具有結構 類似性,並稱爲化合物41.〇12 (美國專利4,001,397 )。日 本游動放線菌ATCC 31145於各種培養條件下之發酵,總 是導致相對較低產率之化合物41.012。 本發明之目的’係爲尋找具有改良性質之微生物天然 物質。 此目的係推據本發明而達成,其方式是將游動放線菌 種,在具有碳來源與氮來源以及習用有機鹽類之營養溶液 中發酵’直到脂Μ類(較佳爲脂壯類Α Η37 )蓄積於培養_ 基中爲止’接著自培養基中單離出此脂駄類,及於適當情 況下,將此混合物分離成其個别成份。此脂壯類具有藥理 活性,及因而具有療效,並可作爲抵抗革蘭陽性細菌之抗 生素使用,較佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之菌株。 因此,本發明係關於: Ob纟太類’其中係將游動放線菌種在培養基中發酵,直到 —或多種下式I脂壯類蓄積於該培養基中爲止,該式工 爲: -5 - 本紙張尺度適用中國闺家標準(CNS)A4il格(2丨0X297公漦} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本莨) 訂 — - · a修正 455591 A7 3補充 B7 P^R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R1爲一種具有6至22 (内含)個碳原子鏈長之單或多 未飽和,飽和或其獨立情況之分枝或未分枝脂肪酸或 m基脂肪酸, 及 R2 爲 Asp 或 Asn, 於適當情況下,自培養基中純化一或多種式I脂奴類, 但下式I脂U則除外,其中 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) ^ 訂 R1爲 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 C II 〇 及 R2 爲 Asp。 么脂U類,其中係將游動放線菌種在培養基中發酵,直到 得自下列族群之一或多種脂壯類蓄積於該培養基中爲止, 該族群爲: a) iC 丨 3-脂防酸-^ρ-Ε^ΙτΡΐρ-ΜοΑΒρ-Αερ-Μγ-Αερ-ΟΙγ-Ι^Ιί-νβ^ΡΓο L-------~~.___ b) iC】4-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro 1-------1 c) iCi3-腊肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro *----*--—~~-4 d) iCi4-脂肪酸-Asn-Dab-P ί P-Me Asp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 1 - Pro ------1 e) aiCi3-脂肪酸-Asi^Pab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro -6 本紙張尺度適用中國圉家樣準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 4 5 5 5 9 1, A7 B7 五、發明説明( 專利申請索第82110700 ROC Patent Αρρίη. No. 82110700 中文説明書修正頁-附件(_ Amended Pages of the Chinese Specification-Encl. (HI) (民国86年8月18日修正並送呈) (Amended & Submitted on August 18 ,1997) f) aiCi5_ 脂肪酸-Asp-Dgib-P〖p.-McAsp~Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-VahPi|〇 g) aiCi5~脂胺酸-Asn-DalrPip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab~Val-Pro於適當情況下,自培養基中純化一或多種此等脂壯類。 &式ϋ脂a類, R^-^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro It其中 R- Asp C' IIο —l·-------4丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 或 Ri Cπo R2 = Asp或 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Π3 fl ^ ~~~ Asn或 R2 = Asn C IIocu0 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS ) A4規格(210Χ297公釐) 4555 9 A7 B7 修if 牛月 日彳夕'u·、 84.12. 1 3^J Κχ 五、發明説明(7 及 R 爲 Asp 作爲藥理活性物質之用途,特别是作爲抵抗革蘭陽性細 菌之抗生素,特佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之細菌。 7.游動放射菌種DSM 7358。- 本發明係詳述於後文,尤其是詳述於其較佳具體實施 例中。本發明係藉申請專利範園之内容進一步界定。 術語之定義: 、 _ Dab意謂2,3-二胺基丁酸; "Ηρ意謂六氫卟啶羧酸(同意字==高脯胺酸); - MeAsp意謂乃_甲基天門冬胺酸酯; 'G1y意謂甘胺酸; -Asn 意謂天門冬醢胺; —Asp 意謂天門冬胺酸; -Val意謂胺基異戊酸及 Pro 意謂鋪胺酸。 縮寫1代表”異夕,然而,/ ai /,則意謂夕前異,,。 此等定義係爲熟練研究人員,在脂肪酸類之文脈中所習知 者(生物化學’ Zubay,魏敦,阿姆斯特丹,由Addis〇n Wesley 發行,1983 )。 . 除非另有指明,否则所有百分比數據,均與重量有關。 除非另有述及’否則液體之混合比,均與體積有關。 .. 根據本發明之方法,可祕實驗室規模(毫升至升範 _ 園)及用於工業規模(立方朱規模)之發酵。 '本紙張尺度適用 ---:____ y _分子量 1290 1304 1289 1303 1290 1289 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) ο 84· !2. i 3補充 45 55 9 1 α7 Β7 五、發明説明(W 名 稱 R!/R2 分子量 A 1437 G R1 1318 = Asp CII 0 A 1437 H R. 1317 ~ Asn CII 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -0 經濟郎中丸fpt -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 84. 12. 1 3 年月曰 修正 A7 B7 經濟部中央榇準局員工消費合作社印製 HP万説明(34) 實例9a : A 1437 D之特徵 脂U A I437 D係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+35 ° ( C=0_1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:15.1分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 - 1個天門冬醯胺 1個/δ-甲基天門冬胺酸酯 ν 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫毗啶羧酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS:m/e= 1303.6952((Μ + Η) + ] 分子量:1302.6S84(C59H94N14019) IR(KBr): y =3420 (br) cm'1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9b : A 1437 B之特徵 此脂Πα Η37 b係以非晶質固體單離而得 旋光度:+27 ° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:12.8分鐘 胺基酸:3個天門冬胺酸 1個/5-曱基夭門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 本紙張尺度適用中國國家標举—(CNS ) A4規格(210X297公釐) 36 ----------^表 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 84位3條if一 補尤; 4 5 5 5 9 1 A7 B7 ' 五、發明説明( 3 5) 1個六氫此交談酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS:m/e=((M + H) + ) 分子量:13Q3(C59H93N13O20) IR(KBr): y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9c : A 1437 C之特徵 此脂U A l437 C係以非晶質固體單離而得。 -旋光度:+30。( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:14.1分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個/3-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 _ 1個六氫吨啶羧綾 1個胺基異戊酸 分子量:1288(C5sH92M14019) IR(KBr): v =3420 (br) cm"1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9d : A I437 A之特徵 此脂U A l437 A係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+30 ° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:11.8分鐘 ' 胺基酸:3個天門冬胺酸 本紙張尺度適用中lii冢羅萃(CNS )Α4ΐ〇|Γ(——5ΐ 0X297公釐) _ 37 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- -tT 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 年 β 日 4 § 5 5 9 1 A7 84 J3補无丨_B7_-__ 五、發明説明(36) 1個曱基天門冬胺酸酉旨 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫吡啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量:1289 (C58H91N13O20) IR(KBr): y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1400. 實例9e : A 1437 F之特徵 此脂肽A l437 F係以非晶質固體單離而得。 旋光度:十31 ° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:13.8分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 1個夭門冬醯胺 1個ζδ-甲基天門冬胺酸酯 _ 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫α Α啶羧酸 1個胺基異戊酸 ‘ 分子量 U288(C58H92N14019) m(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2930, 1660, 1530, 1450,1400. 實例Μ : A 1437 E之特徵 此脂U A l437 E係以非晶質固體單離而得。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2! Ο X 297公釐) -3 8 - 裝 訂 絲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 ^ .f-jj 46 55 9 1 A7 84. 12. I 3 Β7 ——U ------ ΐ__ 五、發明説明(3?) 旋光度: HPLC :滯留時間:11.5分鐘 胺基酸:3個天門冬胺酸 1個召-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 , 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫ΠΑ啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量:l289(C58H91N13O20) IR(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9g : A I437 H之特徵 此脂壯A 1437 H係以非晶質固體單離而得。 旋光度:+32° ( C=0.1 ;甲醇) HPLC :滯留時間:15.9分鐘 胺基酸:2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個乃-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 - 1個脯胺酸 1個六氫盹啶羧酸 1個胺基異戌酸 分子量 -----------批衣------ΐτ-------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2!〇X29_7公釐) -39 - 年月日雙正 88. 12.3 充_ 六、申請專利範圍455591 、A8 -]-B8 口' 專利申請案第82110700號 ROC Patent Appln. No. 82110700 中文說明書修正頁-附件(一) Amended Pages of the Chinese Specificatim- Hhcl. (I CX國肋年月31日修正並送Μ ) (Amended & Submitted on December. 31, 1999) h—種式I之脂肽: R^-R^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R〗爲一具有10至20(含上下限)個碳原子鏈長之不飽和分 枝脂肪酸, R2 爲 Asp 或 Asn, Dab為2,3-二胺基丁酸,以及 Pip為六氫吼咬觀酸, 但其中 R1爲‘Π 0 ---------袭.— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 且 R2 爲 Asp 之式I脂肽除外。 2.根據申請專利範圍第1項之脂鈥,其中代表13、14 或15個碳原子之鏈長。 本紙乐尺度適用中國國家操準(CNS ) A4規格(210X297公釐)
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